專利名稱：再生性骨植入物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種再生性骨植入物、其制備及其應(yīng)用。
本文提到的術(shù)語“基質(zhì)”是可用無機(jī)化合物(如羥基磷灰石)或用有機(jī)聚合物(如聚乳酸(polylactic acid)或聚乙醇酸(polyglycolicacid))制備的材料，具有擬被替代的骨的機(jī)械強(qiáng)度。本文提到的術(shù)語“生物聚合物”是一種蛋白(如膠原)或含有蛋白的大分子(如蛋白多糖)，其可以作為細(xì)胞附著和遷移的支架以利于新生骨組織的再生。生物聚合物排列于基質(zhì)的孔中，使細(xì)胞更有效的遷移和向內(nèi)生長。骨生成刺激物是一種促進(jìn)骨組織生長和維持骨質(zhì)量的因子，如骨生成素(osteoprotegerin)。
本發(fā)明還描述了制備再生性骨植入物的方法。該方法涉及提供上述具孔的基質(zhì)和含有上述生物聚合物的液體，將基質(zhì)浸入液體中從而使聚合物排列在孔中。該方法可進(jìn)一步包括將生物聚合物共價(jià)結(jié)合于基質(zhì)上。液體還可含有排列于基質(zhì)孔中的骨生成刺激物。任選地，骨生成刺激物共價(jià)結(jié)合于基質(zhì)上。
用上述再生性骨植入物取代病人體內(nèi)受損骨的治療方法也屬于本發(fā)明范圍。
本發(fā)明的其他特點(diǎn)或優(yōu)點(diǎn)將通過下述幾個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)說明及所附權(quán)利要求進(jìn)行闡明。
用于制備本發(fā)明植入物的一種基質(zhì)的實(shí)例是基于羥基磷灰石的基質(zhì)，其主要成分是羥基磷灰石。羥基磷灰石天然存在于，例如，骨，釉質(zhì)，或牙本質(zhì)中，多年來已用于骨替代物或包被材料。參照，例如，F(xiàn)rame(1987)國際口上頜面外科學(xué)雜志16642-55，及Parsons等(1988)紐約科學(xué)院年報(bào)523190-207?？梢允褂檬熘姆椒ㄖ苽淞u基磷灰石或從供貨商處購買。它可以是一種分子式為Ca10(PO4)6(OH)2的純化合物，或是一種含有其它離子，例如碳酸鹽，氟離子，氯離子，或鋇離子的組合物。在使用基于羥基磷灰石的基質(zhì)制備本發(fā)明骨植入物時(shí)，基質(zhì)可進(jìn)行熱液處理以獲得目的孔徑，例如直徑150μm至350μm，或200μm至300μm。為了使生物聚合物共價(jià)結(jié)合于基于羥基磷灰石的基質(zhì)上，基質(zhì)表面、尤其是孔的內(nèi)表面要先用官能團(tuán)例如氨基或羥基修飾?？梢酝ㄟ^等離子沉積或化學(xué)引發(fā)(chemical priming)引入官能團(tuán)。用于等離子沉積的材料包括，但不局限于，氨等離子，烯丙胺等離子，烯丙醇等離子，和任何含有氨基、羥基或其它活性基團(tuán)的氣體等離子。用于化學(xué)引發(fā)的化合物可以是氨基硅烷，羥基硅烷，或含有氨基、羥基或其它活性基團(tuán)的其它硅烷。參照，例如，Sano等(1993)生物材料14817-822；及Wang和Hsiue(1993)聚合物科學(xué)雜志，A部分聚合物化學(xué)312601-2607。
一種用于制備本發(fā)明植入物的生物聚合物的實(shí)例是膠原。膠原，例如I型膠原，能夠從人體或動物組織中，例如腱、皮膚、骨或韌帶中分離。參照，例如，Miller和Rhodes，(1982)酶學(xué)方法8233-64。膠原可以用保留端肽的方法進(jìn)行純化(例如，美國專利號3,114,593)，或選用去除端肽的方法進(jìn)行純化(例如，美國專利號4,233,360)。還可以使用化學(xué)試劑(例如，美國專利號5,876,444和6,177,514)或使用其它方法(例如，紫外光照)進(jìn)行交聯(lián)而重建。膠原可以與基于羥基磷灰石的基質(zhì)共價(jià)結(jié)合?？梢栽谀z原的官能團(tuán)(例如羧基)和修飾的羥基磷灰石的官能團(tuán)(例如，氨基)之間直接形成共價(jià)鍵，也可以通過第三種分子例如一種交聯(lián)劑間接形成共價(jià)鍵。交聯(lián)劑是一種具有兩個(gè)官能團(tuán)的試劑。其中的一個(gè)官能團(tuán)可與生物聚合物形成鍵而另一個(gè)與基質(zhì)形成鍵。交聯(lián)劑的例子包括，但不局限于，戊二醛，tresyl氯化物，及N-羥基琥珀酰亞胺。
骨生成素是骨生成刺激物的一個(gè)實(shí)例，其可以排列于上述基質(zhì)的孔中。骨生成素是腫瘤壞死因子(TNF)超家族中的一種蛋白。其活性與骨代謝有關(guān)，尤其具有抑制骨吸收從而增加骨密度的活性。Simonet等(1997)細(xì)胞89(2)；309-19。大鼠骨生成素為401個(gè)氨基酸的蛋白，與小鼠和人的骨生成素分別有85％和94％的同源性。本文中術(shù)語“骨生成素”是指具有全部或部分大鼠、小鼠或人骨生成素氨基酸序列的多肽(參照，例如，美國專利號6,015,938)或其衍生物，并具有抑制骨吸收的活性。在植入物用于替代骨缺損時(shí)，優(yōu)選含有足夠量的骨生成刺激物(例如，0.02％至0.1％重量百分比)以刺激骨生長并抑制骨吸收。骨生成刺激物可通過本領(lǐng)域熟知的方法共價(jià)結(jié)合于基質(zhì)上。
本領(lǐng)域的骨植入物可以如下制備根據(jù)，例如，Roy和Linnehan(1974)自然247220-222中所述的熱液處理方法，或根據(jù)，例如，Liu(1996)生物材料171955-57，和Liu(1997)陶瓷國際23135中所述的有機(jī)顆粒方法制備多孔羥基磷灰石。制備過程中，將多孔羥基磷灰石制成目的形狀以獲得基于羥基磷灰石的基質(zhì)。接著，成形基質(zhì)浸入含有具兩個(gè)官能團(tuán)的交聯(lián)劑的溶液中。其中一個(gè)官能團(tuán)與基質(zhì)反應(yīng)，在交聯(lián)劑和基質(zhì)間形成共價(jià)鍵。制備含有生物聚合物和任選的骨生成刺激物的另一種溶液。尤其是，可以將含生物聚合物的溶液與含骨生成刺激物的溶液混合形成同質(zhì)溶液。然后將含交聯(lián)劑的基質(zhì)浸入上述溶液一段足夠的時(shí)間，以通過交聯(lián)劑的第二官能團(tuán)在交聯(lián)劑和生物聚合物(及骨生成刺激物，如果存在)間形成另一個(gè)共價(jià)鍵。接著從溶液中取出基質(zhì)并凍干。
如果在如上獲得的骨植入物中不包括骨生成刺激物，可將骨植入物浸入含這種刺激物的溶液中使刺激物與基質(zhì)結(jié)合，接著在空氣中干燥或凍干。使用任一種方法，均可將骨生成刺激物排列于多孔基質(zhì)外表面和內(nèi)表面。
這樣制備的再生骨植入物能夠用于普通外科手術(shù)替代骨缺損。
下述特定實(shí)施例僅用于舉例說明，并非限以任何方式限制本發(fā)明。根據(jù)本文詳述無須進(jìn)一步說明，本領(lǐng)域任何熟練技術(shù)人員均可最大程度的應(yīng)用本發(fā)明。本文引用的出版物，包括專利，以其全文引入作為參考。材料的制備制備多孔羥基磷灰石基質(zhì)。羥基磷灰石粉末使用濕化學(xué)法制備，包括如下反應(yīng)。多孔羥基磷灰石基質(zhì)按如下步驟制備(i)制備含有羥基磷灰石粉末，碳化硅，氯化鎂，和水的漿料；(ii)將網(wǎng)狀基材(例如，聚氨基甲酸酯，聚氯乙烯，或聚乙二醇)模塑成目的形狀；(iii)用漿料包被網(wǎng)狀基材；及(iv)通過離心去除多余的漿料。如果有必要，可以重復(fù)步驟(i)-(iv)。將這樣獲得的含羥基磷灰石基材在1200℃燒結(jié)，接著冷卻。溫度緩慢上升使網(wǎng)狀基材逐漸分解而不形成裂縫。這樣，即可獲得多孔羥基磷灰石基質(zhì)，孔平均大小200-350μm。洗滌后，基質(zhì)用γ射線照射(20kGy)消毒。
提取及純化I型膠原。I型膠原從新西蘭白兔腱中提取并純化。分割腱，切成片狀，并用冷蒸餾水多次清洗去除血漿蛋白，接著用溶解于50mM Tris-HCl pH7.4的0.5M NaCl在4℃持續(xù)攪拌過夜而提取。輕輕倒出上清，剩余物用冷蒸餾水清洗，換水幾次除鹽，然后在4℃與pH2.5的HOAc孵育過夜獲得水相提取物。在提取物中加入鹽溶液(0.9M NaCl)，形成沉淀。13,000rpm離心30分鐘收集沉淀，用0.05M HOAc溶解形成含有膠原的溶液。在24到48小時(shí)內(nèi)在該含有膠原的溶液中兩次加入另一種鹽溶液(0.02M Na2HPO4)形成沉淀。離心收集沉淀，溶解于50mM HOAc獲得另一種含膠原的溶液。該含膠原的溶液對5mM HOAc透析，最后凍干。
表達(dá)重組骨生成素。表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為本領(lǐng)域熟知。參照Simonet等(1997)細(xì)胞89(2)309-19。例如，人全長(2.4kb)骨生成素(OPG)-Fc融合蛋白通過PCR擴(kuò)增，克隆于質(zhì)粒載體pCEP4(Invitrogen，圣地亞哥，加州)。然后根據(jù)廠商推薦方法將pCEP4OPG-Fc載體脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，例如，293-EBNA-1細(xì)胞(Invitrongen，圣地亞哥，加州)，或中國倉鼠卵巢細(xì)胞。表達(dá)OPG-Fc融合蛋白，并進(jìn)一步使用蛋白A/G-親和層析柱純化。制備骨植入物純化膠原(I型)，用胃蛋白酶消化去除端肽，通過幾步修飾形成戊二醛-聚合物胺復(fù)合物而重建(參照，例如美國專利號5,876,444)。膠原和骨生成素均由γ射線照射消毒，并分別溶解于5mMHOAc和磷酸鈉緩沖液中。輕輕混合含有膠原和含有骨生成素的溶液，如果有必要加熱至30-40℃以促進(jìn)混合。獲得含有重建的膠原和骨生成素的溶液，其包括0.2-1％(重量)的骨生成素，及99.8％(重量)的膠原。
如上所述制備多孔羥基磷灰石基質(zhì)。通過氨等離子將氨基基團(tuán)引入多孔羥基磷灰石基質(zhì)的表面。接著，將基質(zhì)浸入含有戊二醛的溶液中，在氨基基團(tuán)和戊二醛間形成共價(jià)鍵。將如此獲得的基質(zhì)再浸入上述含重建的膠原和骨生成素的溶液中，足夠的時(shí)間后，在戊二醛和膠原間以及戊二醛和骨生成素間形成另一個(gè)共價(jià)鍵。最后，從溶液中取出基質(zhì)凍干形成骨植入物。骨植入物中膠原的孔徑為50μm-200μm。
其它實(shí)施方案本說明書中描述的所有特征可以以任何方式相互組合。本說明書中的每一種特征可以由達(dá)到相同的，相當(dāng)?shù)?，或相似的目的的另一種特征取代。因此，除非另有說明，每一個(gè)描述的特征僅僅是這一類相當(dāng)?shù)幕蛳嗨频南盗刑卣鞯囊粋€(gè)實(shí)例。
根據(jù)上文詳述，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠輕易確定本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離本發(fā)明的主旨和范疇之下對本發(fā)明做出各種變動和修改使其適用于各種用途和條件。所以，其它實(shí)施方案也屬于權(quán)利要求范圍。
權(quán)利要求
1.再生性骨植入物，包括生物相容性和生物降解性多孔基質(zhì)，和排列于孔內(nèi)并與所述基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的生物相容性和生物降解性生物聚合物。
2.權(quán)利要求1的再生性骨植入物，還包括一種骨生成刺激物，它也排列于孔中。
3.權(quán)利要求2的再生性骨植入物，其中所述的骨生成刺激物與所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)結(jié)合。
4.權(quán)利要求2的再生性骨植入物，其中所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)是一種基于羥基磷灰石的基質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的再生性骨植入物，其中所述的生物相容性和生物降解性生物聚合物是膠原。
6.權(quán)利要求5的再生性骨植入物，其中所述的骨生成刺激物是骨生成素。
7.權(quán)利要求2的再生性骨植入物，其中所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)是一種基于羥基磷灰石的基質(zhì)。
8.權(quán)利要求2的再生性骨植入物，其中所述的生物相容性和生物降解性生物聚合物是膠原。
9.權(quán)利要求1的再生性骨植入物，其中所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)是一種基于羥基磷灰石的基質(zhì)。
10.權(quán)利要求9的再生性骨植入物，其中所述的生物相容性和生物降解性生物聚合物是膠原。
11.權(quán)利要求1的再生性骨植入物，其中所述的生物相容性和生物降解性生物聚合物是膠原。
12.制備再生性骨植入物的方法，包括提供一種生物相容性和生物降解性多孔基質(zhì)，提供一種含有生物相容性和生物降解性生物聚合物的液體，將基質(zhì)浸入液體中，從而使生物聚合物排列于孔中。
13.權(quán)利要求12的方法，還包括使孔中的生物聚合物與所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)共價(jià)結(jié)合。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)是一種基于羥基磷灰石的基質(zhì)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的生物相容性和生物降解性生物聚合物是膠原。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述的生物相容性和生物降解性生物聚合物是膠原。
17.權(quán)利要求12的方法，其中的液體還含有一種待排列于孔中的骨生成刺激物。
18.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括使孔中的生物相容性和生物降解性生物聚合物與所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)共價(jià)結(jié)合。
19.權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括使骨生成刺激物與孔中的生物相容性和生物降解性基質(zhì)共價(jià)結(jié)合。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)是一種基于羥基磷灰石的基質(zhì)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的生物相容性和生物降解性生物聚合物是膠原。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的骨生成刺激物是骨生成素。
23.權(quán)利要求18的方法，其中所述的生物相容性和生物降解性生物聚合物是膠原。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的骨生成刺激物是骨生成素。
25.權(quán)利要求18的方法，其中所述的骨生成刺激物是骨生成素。
26.治療個(gè)體骨缺損的方法，包括用一種再生性骨植入物替代缺損骨，其中該植入物包括一種生物相容性和生物降解性多孔基質(zhì)，和排列于孔中并與所述基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的一種生物相容性和生物降解性生物聚合物。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述再生性骨植入物還包括一種骨生成刺激物，它也位于孔中。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述骨生成刺激物與所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)共價(jià)結(jié)合。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)是一種基于羥基磷灰石的基質(zhì)。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述的生物相容性和生物降解性生物聚合物是膠原。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述的骨生成刺激物是骨生成素。
32.權(quán)利要求26的方法，其中所述的生物相容性和生物降解性基質(zhì)是一種基于羥基磷灰石的基質(zhì)。
33.權(quán)利要求26的方法，其中所述的生物相容性和生物降解性生物聚合物是膠原。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種再生性骨植入物。該植入物包括一種生物相容性和生物降解性多孔基質(zhì)，及排列于孔中并與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的一種生物相容性和生物降解性生物聚合物。任選地，該植入物進(jìn)一步包括也排列于孔中并可與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的一種骨生成刺激物。
文檔編號C08L89/06GK1440731SQ0213191
公開日2003年9月10日 申請日期2002年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月5日
發(fā)明者賴文福, 鄧文炳, 蔡郁惠, 陳榮邦, 楊維中, 威靈頓·潘 申請人:臺北生物科技股份有限公司