專利名稱：新纖維素材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由細(xì)菌產(chǎn)生的具有新結(jié)構(gòu)和特征的纖維素材料和多糖，其培養(yǎng)方法和用途。
背景技術(shù)：
作為纖維素材料產(chǎn)生細(xì)菌，已知的有醋桿菌屬(Acetobacter)菌株例如以BPR2001菌株為代表的木醋桿菌蔗糖發(fā)酵亞種(Acetobacter xylinumsubsp.sucrofermentans)、木醋桿菌ATCC23768、木醋桿菌ATCC23769、巴斯德醋桿菌(Acetobacter pasteruianus)ATCC10245、木醋桿菌ATCC14851、木醋桿菌ATCC11142以及木醋桿菌ATCC10821、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、八疊球菌屬(Sarcina)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、無色桿菌屬(Achromobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、產(chǎn)氣桿菌屬(Aerobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、Zeuglare、利用NTG(亞硝基胍)等通過已知的方法改變這些細(xì)菌所產(chǎn)生的各類變體。
用于改善醋桿菌的纖維素生產(chǎn)效率的方法已在大量專利申請(qǐng)中提出，包括Bioplymer Research Co.，Ltd.遞交的那些專利申請(qǐng)。獲得突變體的方法以及利用昂貴的特定活性劑的方法在例如，JP-A-62-265990、JP-A-63-202394、JP-A-63-74490、JP-A-2-238888、JP-B-6-43443、JP-B-5-1718、JP-A-7-184677和JP-A-7-184675中有描述?？刂茢嚢柘碌呐囵B(yǎng)條件的方法公開在例如，JP-A-9-94094、JP-A-9-514136等中。
在上文所描述的已知的培養(yǎng)方法中，同時(shí)產(chǎn)生非常小量的水溶性多糖，但幾乎所有的作為主產(chǎn)物的纖維素材料被認(rèn)為具有β-1，4-糖苷鍵，并且纖維素結(jié)晶學(xué)中所用的Iα-結(jié)晶與Iβ-結(jié)晶的比率((Iα/Iβ)×100，以下稱之為Iα分?jǐn)?shù))被認(rèn)為是64到72％(SCIENCE，Vol.223，283(1984))。Iα結(jié)晶本質(zhì)上具有低的表面活力如潤濕性，因?yàn)楫?dāng)特定的晶面，尤其是(11-0)晶面取向時(shí)，該晶面中的羥基密度低于Iβ結(jié)晶中的密度。因而，由傳統(tǒng)微生物例如醋桿菌產(chǎn)生的纖維素材料(其中Iα分?jǐn)?shù)高達(dá)64到72％并且(11-0)晶面取向)本質(zhì)上具有低的表面活力。
在有些專利文獻(xiàn)公開的實(shí)例中，在醋桿菌培養(yǎng)方法下生產(chǎn)纖維素為基礎(chǔ)的物質(zhì)時(shí)，相對(duì)于作為碳源的糖的纖維素轉(zhuǎn)化效率為30％或更高。不過，可以認(rèn)為實(shí)際水平的纖維素轉(zhuǎn)化效率是大約20％幾。這些已知的培養(yǎng)方法就其操作而言很復(fù)雜，因?yàn)榭紤]到所用的是需氧的醋桿菌菌株的事實(shí)，旋動(dòng)培養(yǎng)需要特殊的特性。
一般地，利用旋動(dòng)培養(yǎng)作為工業(yè)生產(chǎn)方法，而且產(chǎn)生的纖維素材料的基本形態(tài)公開在美國專利5,144,021(1992)中。根據(jù)該美國專利，所述纖維素具有球形或橢圓形、大小約為0.1到10mm的宏觀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)為交織的網(wǎng)絡(luò)，因此認(rèn)為所述纖維素材料具有在高濕時(shí)抗壓性高的特征。然而，高抗壓性也意味著難以排水，因而干燥困難。此外，由于上述球形或橢圓形宏觀結(jié)構(gòu)的四周不存在放射狀延伸的原纖(fibril)，可以想到使該宏觀結(jié)構(gòu)彼此均一地分散開需要相當(dāng)?shù)哪芰?。此外，根?jù)美國專利5,144,021，結(jié)晶度不是太高，即70％或更低，因而可以想到該纖維素本身的強(qiáng)度以及當(dāng)與其它聚合材料組合時(shí)的性能會(huì)較差。
具有0.12到0.20的沉降壓縮度(Sedimentaion compression degree)的細(xì)菌纖維素松散物質(zhì)公開在JP-B-2,877,676中。以0.1％細(xì)菌纖維素水懸液具有動(dòng)態(tài)粘度1000cp或更高(30℃，10rad/s)為特征的細(xì)菌纖維素公開在JP-B-2,971,024中。這些公開，如JP-B-6-43443，表明細(xì)菌纖維素容易截留住水，并且這種傳統(tǒng)的纖維素材料具有高的增稠和分散效果，但缺點(diǎn)是將所述材料加工成固體產(chǎn)品時(shí)需消耗相當(dāng)能量。在另一方面，由醋桿菌菌株產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素在商業(yè)上僅用作聲音振蕩板。
已研究了作為食品添加劑的細(xì)菌纖維素的開發(fā)，但未導(dǎo)致真正的商業(yè)化。這被認(rèn)為部分地歸因于雖然醋桿菌菌株產(chǎn)生的纖維具有直徑細(xì)至幾個(gè)nm的突出特點(diǎn)，但它的宏觀形態(tài)卻僅是橢圓形，因而與其它纖維材料相比遠(yuǎn)不利于加工的事實(shí)。此外，作為另一個(gè)原因，還認(rèn)為可歸因于細(xì)菌纖維素未以真正有功能的形式在培養(yǎng)物中生產(chǎn)的事實(shí)。
本發(fā)明人通過16s-rRNA的基因分析發(fā)現(xiàn)與腸桿菌屬(Entero bacter)高度同源的微生物(CJF002菌株)產(chǎn)生纖維素樣物質(zhì)，并遞交了將該微生物用于石油三次回采的方法發(fā)明的專利申請(qǐng)(JP-A-2001-321164)。在該專利申請(qǐng)中，將靜止培養(yǎng)描述為優(yōu)選的培養(yǎng)方法，并公開了利用該微生物的產(chǎn)物封閉石油基巖中的水掠通道(water weeping channel)的方法，但未公開與產(chǎn)生的纖維素樣物質(zhì)有關(guān)的各種碳源及所述纖維素樣物質(zhì)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)、功能等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用腸桿菌屬纖維素產(chǎn)生細(xì)菌的培養(yǎng)物可產(chǎn)生新的纖維素材料。這種新的纖維素材料幾乎是球形的，最大直徑為幾個(gè)毫米，其中大原纖(macrofibril)自中心向四周放射狀形成，不同于傳統(tǒng)微生物生產(chǎn)的纖維素的橢圓形態(tài)。這種形狀很容易從培養(yǎng)液中分離，通過過濾器洗滌純化，并分散形成次級(jí)產(chǎn)品。它可提供低能耗的生物方法，并具有表現(xiàn)出由區(qū)別于傳統(tǒng)材料的特殊形狀引起的新功能的可能性。此外，本發(fā)明的新纖維素材料具有非常高的結(jié)晶度，因而纖維素本身的強(qiáng)度以及與其它聚合材料組合時(shí)的性能都很出色。
(1)本發(fā)明涉及球形纖維素材料，其中纖維素材料為通過β-1，4-型糖鏈鍵構(gòu)成的水不溶性多糖，結(jié)晶度為70％或更高，并且從中央向四周放射狀地形成大原纖。
(2)此外，本發(fā)明涉及纖維素材料，其中纖維素材料為通過β-1，4-型糖鏈鍵構(gòu)成的水不溶性多糖，葡萄糖單位在該水不溶性多糖中的組成比為85％到100％，而且纖維素結(jié)晶多形的Iα分?jǐn)?shù)不小于45％且不大于63％。
(3)此外，本發(fā)明涉及根據(jù)上文第(1)或(2)項(xiàng)的纖維素材料，其中通過粘度測(cè)量方法確定的纖維素cadoxene溶液的粘度平均聚合度為3500或更高。
(4)此外，本發(fā)明涉及根據(jù)上文第(1)至(3)中任何一項(xiàng)的纖維素材料，它通過培養(yǎng)腸桿菌屬微生物、其突變體或其微生物傳代培養(yǎng)物獲得。
(5)此外，本發(fā)明涉及根據(jù)上文第(4)項(xiàng)的纖維素材料，其中上文描述的腸桿菌屬微生物是CJF002菌株。
(6)此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)根據(jù)上文第(1)至(3)中任何一項(xiàng)的纖維素材料的方法，包括用選自由腸桿菌屬微生物、其突變體和其微生物傳代培養(yǎng)物組成的組中的至少一種微生物以103到107/ml的量接種培養(yǎng)基，然后在攪拌在不低于20℃且不高于45℃的溫度下利用糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物。
(7)此外，本發(fā)明涉及根據(jù)上文第(1)至(3)項(xiàng)的纖維素材料和其它聚合物材料和/或金屬和/或金屬氧化物的復(fù)合材料。
(8)此外，本發(fā)明涉及一類以葡萄糖、半乳糖和巖藻糖而非羧化糖作為主成分的水溶性多糖，它通過用選自由腸桿菌屬微生物、其突變體和其微生物傳代培養(yǎng)物組成的組中的至少一種微生物以103到107/ml的量接種培養(yǎng)基，然后在不低于4℃且不高于30℃的溫度下利用糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物獲得。
附圖的簡短說明

圖1是通過攪拌(轉(zhuǎn)子攪拌)培養(yǎng)獲得的本發(fā)明的纖維素材料的光學(xué)顯微照片(比例尺代表1mm)。
圖2是通過攪拌(鼓泡通氣)培養(yǎng)獲得的本發(fā)明的纖維素材料的光學(xué)顯微照片(比例尺代表1mm)。
圖3是本發(fā)明的纖維素材料的掃描電鏡照片(比例尺代表3μm)。
圖4是添加氧化鋁時(shí)通過攪拌培養(yǎng)獲得的本發(fā)明的纖維素材料/無機(jī)材料復(fù)合材料的光學(xué)顯微鏡照片(比例尺代表5mm)。
圖5是添加氧化鋁時(shí)通過攪拌培養(yǎng)獲得的本發(fā)明的纖維素材料/無機(jī)材料復(fù)合材料的掃描電鏡照片(比例尺代表3μm)。
圖6顯示本發(fā)明的纖維素材料的固態(tài)13C-NMR光譜；而圖7顯示本發(fā)明的纖維素材料的廣角X-射線衍射光譜。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式作為優(yōu)選的方面，本發(fā)明的新材料是纖維素材料，其特征在于該纖維素材料是通過β-1，4-型糖鏈鍵構(gòu)成的水不溶性多糖，由腸桿菌屬微生物如CJF002菌株、其突變體或微生物傳代培養(yǎng)物產(chǎn)生，葡萄糖單位的組成比為85到100％，結(jié)晶度為70％或更高，與由醋桿菌菌株產(chǎn)生的傳統(tǒng)細(xì)菌纖維素相比，纖維素結(jié)晶學(xué)中所用的Iα分?jǐn)?shù)保持在低水平，并且形態(tài)為球形，其中大原纖自中央向四周放射狀地形成。
本發(fā)明的纖維素材料除了β-1，4-型糖鏈鍵，還可具有1，2-鍵、1，3-鍵和1，6-鍵。這些化學(xué)鍵可以包括在一個(gè)分子鏈中，或者存在于通過氫鍵等與不是纖維素(由β-1，4-吡喃葡萄糖重復(fù)鏈組成的聚合物)的水不溶性多糖的混合態(tài)中。非葡萄糖的結(jié)構(gòu)糖無特殊限制，并且包括各種類型的己糖、戊糖和羧化糖，但常為半乳糖和甘露糖。
對(duì)于本發(fā)明優(yōu)選的水不溶性纖維素材料，從結(jié)構(gòu)上進(jìn)行詳細(xì)描述，其Iα分?jǐn)?shù)在45到63％的范圍內(nèi)，通常50％左右，這比醋桿菌菌株產(chǎn)生的纖維素的Iα分?jǐn)?shù)(即64到72％)小，并且結(jié)晶度為70％或更高，尤其是在某些情況下，大于90％。
此外，本發(fā)明的纖維素材料由具有數(shù)10nm的非常小直徑的原纖構(gòu)成，因而由該纖維素材料制備的片狀材料具有非常大量的纏結(jié)點(diǎn)，因此它的機(jī)械強(qiáng)度非常高。由醋桿菌菌株產(chǎn)生的纖維素的結(jié)構(gòu)描述在美國專利5,144,021中，但根據(jù)其權(quán)利要求，它的結(jié)晶度為70％或更小，因此可以想到它的機(jī)械強(qiáng)度比本發(fā)明的纖維素材料低。本文所述的結(jié)晶度是由固態(tài)13C-NMR測(cè)定的數(shù)值，并且其定義和測(cè)量的細(xì)節(jié)將在下文描述。結(jié)晶度通常通過X-射線衍射測(cè)定，但對(duì)于傳統(tǒng)上以及本發(fā)明的微生物產(chǎn)生的纖維素，通過X-射線衍射測(cè)量結(jié)晶度不合適，因?yàn)檫@些情況下選擇性地采取了特定的晶面取向。
如果培養(yǎng)物中的碳源為糖蜜，葡萄糖單位的組成比下降，但不低于85％。此外，如果碳源為單獨(dú)的蔗糖或葡萄糖，有極少數(shù)情況下葡萄糖單位的組成比為100％，并且在大多數(shù)情況下，為大約98％。
因?yàn)镮α分?jǐn)?shù)低并且在分子鏈中引入了半乳糖和甘露糖殘基，本發(fā)明的纖維素材料具有諸如提高的可加工性、與其它聚合物的合金形成、與金屬和金屬氧化物的合金形成及與其它材料的粘著和識(shí)別或不識(shí)別蛋白的能力等特征，這在以諸如透明性和機(jī)械強(qiáng)度為應(yīng)用特征的傳統(tǒng)細(xì)菌纖維素中是根本不可能預(yù)期的。當(dāng)然，這并不意味著本發(fā)明的纖維素材料不可以應(yīng)用于傳統(tǒng)領(lǐng)域。
此外，本發(fā)明的纖維素材料具有纖維素II的晶體成分。纖維素II的晶體表面具有其上選擇性地出現(xiàn)羥基的晶面(11-0)以及其上選擇性地出現(xiàn)氫原子的晶面(110)，從而形成在本質(zhì)上適于合金形成的晶體類型。
本發(fā)明的纖維素材料的葡萄糖單位的組成比可由作為碳源利用的糖組分的比率以及培養(yǎng)條件來控制。原則上，如果用作為碳源的糖類型的數(shù)目增加，在所得的纖維素材料中結(jié)構(gòu)糖組分多樣化。為增加葡萄糖組分的量，可以利用葡萄糖作為碳源。
此外，本發(fā)明的纖維素材料可以通過應(yīng)用同步培養(yǎng)制備成幾乎具有相同的聚合度。取出產(chǎn)品時(shí)的聚合度無特殊限制，但優(yōu)選約300或更高。
如果需要本發(fā)明的纖維素材料具有機(jī)械強(qiáng)度，優(yōu)選調(diào)整聚合度至3500或更高。不過，本發(fā)明描述的聚合度是通過對(duì)纖維素應(yīng)用cadoxene法獲得的數(shù)值，并且尤其當(dāng)葡萄糖組成比低時(shí)，它是一個(gè)近似值。
本發(fā)明的纖維素材料的特征在于可以獨(dú)立存在或連結(jié)在一起的、最大直徑為幾毫米的基本上球體，它自中心向四周放射狀地形成大原纖。每個(gè)球體的大小和每個(gè)大原纖的形式可通過攪拌培養(yǎng)的條件控制。
對(duì)于攪拌培養(yǎng)，可以應(yīng)用旋動(dòng)培養(yǎng)(其中攪拌漿旋轉(zhuǎn))、搖床培養(yǎng)(其中容器往復(fù)運(yùn)動(dòng)或旋轉(zhuǎn))以及通過鼓泡通氣的攪拌培養(yǎng)。
本發(fā)明的纖維素材料的球體的一個(gè)實(shí)例是由球芯和自球芯放射狀延伸的錐形組分構(gòu)成的，如圖1所示。錐形組分和球芯在錐形組分的頂端結(jié)合，并且在錐形組分的底端觀察到纖維狀物質(zhì)。錐形組分的高度幾乎與球芯的半徑相等。這種形式通過低速攪拌培養(yǎng)獲得。低速攪拌培養(yǎng)條件取決于裝置，尤其是攪拌槳的大小和形狀，因而無法絕對(duì)限定。如果攪拌速度太低，則引起問題，以至于所得的纖維素材料形成整個(gè)的凝膠狀物質(zhì)，并與攪拌槳糾纏在一起。如果攪拌速度太高，則得到細(xì)片樣的纖維素材料，但其形狀可以是漿狀、鱗片狀等不確定形式，且大小不均一。作為一個(gè)實(shí)例，當(dāng)利用直徑為60mm的攪拌槳時(shí)，在50rpm到200rpm的旋轉(zhuǎn)速度下獲得圖1所示的形態(tài)。另一個(gè)實(shí)例示于圖2中。大原纖自具有略小于1mm的直徑的球芯放射狀線性延伸約1mm長度。這種形態(tài)通過鼓泡通氣獲得，并且吹氣量為每1m3培養(yǎng)液1m3/分的空氣。
球體的球芯大小為0.1mm到數(shù)毫米，但如果生產(chǎn)條件相同的話可以變得非常一致，如圖1所示。球體通過粗的網(wǎng)孔很容易被分離和純化。例如，球體可以由簡單壓縮被相當(dāng)可觀地脫水，以致它可以就此被加工成產(chǎn)品(包含或多或或少的水)，或者燒蝕(ablate)時(shí)容易被干燥。根據(jù)最終的用途，蛋白去除操作可能是非必需的，這導(dǎo)致相當(dāng)可觀的費(fèi)用減少。如果需要蛋白去除操作，可以通過蛋白酶、表面活性劑處理或通過氧化漂白除去蛋白。在某些情況下，可以利用低濃度的堿性水溶液。此外，由醋桿菌菌株產(chǎn)生的傳統(tǒng)纖維素是鱗片狀的細(xì)片樣凝膠物質(zhì)，因而會(huì)容易地導(dǎo)致網(wǎng)篩阻塞，這樣難以實(shí)施上文所述的步驟。
微觀上，球體由各具有20到100nm大小的微纖維組成。因?yàn)榍蝮w由這些微纖維組成，球體的表面積很大。由氮吸收法(BET法)測(cè)量的表面積大至約50到150m2/g，這約為普通漿表面積大小的100倍。由于非常大的表面積，本發(fā)明的纖維素材料的球體由于它的毛團(tuán)樣形式適于用作載體、吸附劑等，并且可直接填充到柱子等中。本發(fā)明的水不溶性纖維素材料在形態(tài)上顯著不同于由醋桿菌菌株產(chǎn)生的傳統(tǒng)纖維素，后者實(shí)質(zhì)上為凝膠，需要相當(dāng)?shù)哪芰繜g和干燥，因此，本發(fā)明材料從工業(yè)觀點(diǎn)看是有價(jià)值的。
具有毛團(tuán)樣形式作為基礎(chǔ)形態(tài)的球體的直徑可以根據(jù)接種細(xì)菌的初始濃度、培養(yǎng)溶液的大小和攪拌速度憑經(jīng)驗(yàn)確定。
可以選擇接種細(xì)菌合適的初始濃度，合適的濃度為大約103到107/ml。培養(yǎng)基的pH無特殊限制，范圍為2.2到9.5，優(yōu)選5.0到8.0。合適的溫度范圍為20到45℃。在培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明的纖維素材料的過程中，下文所述的本發(fā)明的水溶性多糖同時(shí)得以生產(chǎn)，并且優(yōu)選將培養(yǎng)維持在高溫如20℃或更高，以提高纖維素材料的產(chǎn)率。
微觀水平(如通過電子顯微鏡觀察)上球體形態(tài)為特征性的形態(tài)，其中大量的扁平微纖維高度交織在一起，并且相分離結(jié)構(gòu)中的圓孔相互連接(圖3)。這里，相分離中的圓孔是指在聚合物顆粒能夠形成之前，即當(dāng)聚合物濃度為臨界濃度或更低時(shí)，在不良溶劑中形成的扁平孔結(jié)構(gòu)。當(dāng)不良溶劑中聚合物濃度大于臨界濃度時(shí)，產(chǎn)生聚合物的初級(jí)顆粒，形成顆粒連接在一起的結(jié)構(gòu)。美國專利5,144,021(1992)中描述的細(xì)菌纖維素具有與上述結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)，初級(jí)顆粒連接在一起。
由于此種特征性的形態(tài)，純化的本發(fā)明的纖維素材料特點(diǎn)在于當(dāng)它重新分散在水中時(shí)，該物質(zhì)具有非常低的漿液粘度，并且在二次加工中能夠被容易地處理，與傳統(tǒng)上來源于醋桿菌菌株的所謂細(xì)菌纖維素不同。例如，對(duì)于來源于醋桿菌菌株的細(xì)菌纖維素的水分散體(0.1wt％)，沉降壓縮度為0.12到0.20，而本發(fā)明的纖維素材料的沉降壓縮度低至僅為小于0.12。這意味著濕壓縮性高。因此，例如，本發(fā)明的纖維素材料在產(chǎn)生非常薄的片層方面很有利，并且僅需要低能干燥。這里的沉降壓縮度是漿液在1700G離心30分鐘后的纖維素沉降體積(Bml)與漿液原始體積(Aml)的比率(B/A)。此外，對(duì)于來源于醋桿菌菌株的細(xì)菌纖維素，其燒蝕后物質(zhì)的0.1％水懸液的動(dòng)態(tài)粘度為1000cp或更高(30℃，10rad/S)，而本發(fā)明的纖維素材料低至僅為200cp。由于此類特點(diǎn)，本發(fā)明的纖維素材料能夠非常容易地加工成各類片和分離器。這些特點(diǎn)被認(rèn)為主要由它的特征性形態(tài)引起，但它們也可能與OH基團(tuán)在微纖維表面的取向以及50到60％的小Iα分?jǐn)?shù)有關(guān)。
本發(fā)明的新纖維素材料適于作為與非纖維素聚合材料或無機(jī)物例如金屬或金屬氧化物形成復(fù)合材料的材料。
可用于形成復(fù)合材料的聚合物包括，但不限于，例如，一般的疏水聚合物例如聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)和聚苯乙烯(PS)，親水聚合物例如聚環(huán)氧烷烴(PAO)，以及超級(jí)工程塑料例如聚砜(PSu)、聚酰胺(PA)、聚酯(PET)、聚酰亞胺(PI)?？梢灾苽渑c這些聚合物的合金。尤其是，可以調(diào)整本發(fā)明的纖維素材料使之具有比來源于醋桿菌菌株的纖維素更低的Iα分?jǐn)?shù)，從而改善纖維素材料的OH基團(tuán)的取向平衡，并且原則上它可以容易地與各類聚合物組合。半乳糖被認(rèn)為可以選擇性地識(shí)別蛋白等，因而半乳糖作為結(jié)構(gòu)糖的存在使得與蛋白等的組合更容易。因而，所述纖維素材料在存在小量親水溶劑和/或疏水溶劑時(shí)相對(duì)容易與各類聚合物組合，并且可以開發(fā)作為有用的功能性材料或工業(yè)材料。當(dāng)然，來源于本發(fā)明所用的細(xì)菌的蛋白可用作為組合材料，由此有助于材料以及組合方法的費(fèi)用降低并同時(shí)達(dá)到培養(yǎng)系統(tǒng)的有效利用。此外，本發(fā)明的纖維素材料具有大小約50nm的微纖維作為結(jié)構(gòu)單位，因而可能在納米水平形成復(fù)合材料。
用于與本發(fā)明的纖維素材料、水溶性多糖或這些混合物形成復(fù)合材料的無機(jī)物例如金屬和金屬氧化物的實(shí)例包括金、銀、銅、鉑、鈀、鋁、鐵、鉍和鎂或其合金及其氧化物，它們可以是磁性材料、電介質(zhì)材料、反應(yīng)催化劑等。形成復(fù)合材料的方法可以包括，但不具體限于，利用高加速度球磨機(jī)的方法、利用班伯里混合器的方法、實(shí)施多次反復(fù)的高壓擠壓的反復(fù)滾動(dòng)法、以及在聚合物溶液中形成復(fù)合材料的濕分散法。
作為形成復(fù)合材料的合適的方法，最初將無機(jī)物分散于培養(yǎng)液中，或在開始培養(yǎng)后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)向培養(yǎng)液中添加無機(jī)物，由此產(chǎn)生新的由微生物產(chǎn)生的基本上保留本發(fā)明的形態(tài)的纖維素/無機(jī)物復(fù)合材料。適于使用的無機(jī)物的實(shí)例包括能夠在pH7或更高的的電荷零點(diǎn)時(shí)形成膠體的無機(jī)氧化物或氫氧化物，例如α-氧化鋁、γ-氧化鋁、勃姆石、三羥鋁石、氧化鈹、一氧化鎘、氫氧化鎘、氫氧化鈷、氧化銅、氫氧化鐵、α-氧化鐵、γ-氧化鐵、纖鐵礦、氫氧化鉛、氧化鎂、氫氧化鎂、氫氧化錳、氧化鉈、氧化釩、氧化鋅和氧化鑭。此外，作為其它實(shí)例，能夠在pH7或更低的電荷零點(diǎn)時(shí)形成膠體的無機(jī)氧化物和氫氧化物也是適用的，例如鋁化合物象水鋁石和三水鋁石、氫氧化鐵例如getite、氧化硅、氧化錫、氧化鈦、氧化鋯、非堿金屬鈦酸鹽、非堿金屬鋯酸鹽等。由于它們幾乎不增加培養(yǎng)基的粘度，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入時(shí)它們的量和顆粒大小不受限制，并可以由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員依據(jù)培養(yǎng)技術(shù)適當(dāng)?shù)卮_定。不過，如果量或顆粒大小很大，并且期望與所產(chǎn)生的纖維素材料均一分散地混合時(shí)，應(yīng)當(dāng)增強(qiáng)透氣性和攪拌。這些復(fù)合材料可使無機(jī)物特異性的功能有效展示。如果這些無機(jī)材料與纖維素材料以復(fù)合材料的形式混合，不僅具有促進(jìn)細(xì)微分散的效果，并可將無機(jī)材料的加強(qiáng)作用賦予纖維素材料。例如，與氧化鋁的復(fù)合材料可用作為研磨材料、催化劑載體、氣體凈化過濾器、液體凈化過濾器、分離膜、用于有機(jī)溶劑(尤其是基于有機(jī)氯的溶劑)的吸附及分離材料、油墨吸附材料、濕度控制材料等的原料。與氧化鈦的復(fù)合材料可用作為UV吸收劑和光催化劑材料。與碳酸鋇的復(fù)合材料可用作為X-射線遮蔽體和鐵電物質(zhì)的原料。與氧化鋯的復(fù)合材料可用作為低熱導(dǎo)材料和高折射材料的原料。與氧化鈷的復(fù)合材料可用作為順磁/低電導(dǎo)材料的原料。與鈦酸鋇的復(fù)合材料可用作為鐵電物質(zhì)的原料。與γ鐵酸鹽的復(fù)合材料可用作為鐵電物質(zhì)的原料。此外，與氧化鋅的復(fù)合材料可用作為催化劑的原料、感光材料的基材以及橡膠硫化加強(qiáng)材料的原料。
在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法中獲得的纖維素材料/無機(jī)物復(fù)合材料可以以復(fù)合材料的形式從培養(yǎng)基中分離，并且能夠以原復(fù)合材料的狀態(tài)用作為最終的原料，即使是在最后階段。因此，每單位質(zhì)量產(chǎn)品的廢液處理費(fèi)用被相當(dāng)可觀地降低了。
這些復(fù)合材料能夠更有效地表現(xiàn)出添加的無機(jī)氧化物的功能。例如，與α-氧化鋁、γ-氧化鋁、氫氧化鈷、氧化釩等的復(fù)合材料能夠用作為水介質(zhì)中使用的各類催化劑載體和納米分散研磨基材；與氧化鋅的復(fù)合材料可用作為場(chǎng)致發(fā)光分散基材；與氧化鈦的復(fù)合材料可用作為光催化劑基材；而與鈦酸鋇的復(fù)合材料可用作為高電介質(zhì)基材。
本發(fā)明的纖維素材料具有多種特點(diǎn)，例如精細(xì)的大小為50到100nm的微纖維結(jié)構(gòu)，極高的比表面積，出色的蛋白吸收性、小的線性膨脹系數(shù)和高的彈性因子，因此除了此處所述的合金形成以外，還可用于多種用途。例如，作為應(yīng)用，它可開發(fā)成無紡織品、吸收劑、緣于與蛋白的尤其強(qiáng)的相互作用的蛋白吸收劑、分離膜、人造皮膚、載體、水保持劑、增稠劑、分散/懸浮穩(wěn)定劑、食品材料等。它也可以用于微孔膜、泡沫、橡膠、乳膠、粘合劑等中作為復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)組分。對(duì)于這些應(yīng)用，由醋桿菌產(chǎn)生的傳統(tǒng)纖維素可在一定程度上使用。不過，由于本發(fā)明纖維素材料具有低的Iα分?jǐn)?shù)，由此在表面具有高密度的OH基團(tuán)并具有高的表面活性，而且含有半乳糖殘基和甘露糖殘基，顯然，根據(jù)本發(fā)明的纖維素材料可以與其它材料強(qiáng)烈地相互作用，因而在上文所述的應(yīng)用中比傳統(tǒng)纖維素更為有效。
下文將描述生產(chǎn)本發(fā)明的纖維素材料的方法。
屬于腸桿菌屬的纖維素產(chǎn)生細(xì)菌可用作為本發(fā)明的纖維素材料產(chǎn)生細(xì)菌。例如，可以利用CJF002菌株、其微生物傳代培養(yǎng)物、通過公知的方法利用NTG(亞硝基胍)等突變這些微生物產(chǎn)生的各類突變體等。這里，CJF002菌株是指以“腸桿菌種CJF-002”最初于2000年3月29日保藏在國立高級(jí)工業(yè)科技研究院，國際專利微生物保藏所(IPOD)(位于Central6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)的腸桿菌屬微生物菌株，該菌株于2002年11月1日從最初保藏轉(zhuǎn)為根據(jù)布達(dá)佩斯條約的保藏，保藏號(hào)“FERM BP-8227”。
有利的是，能夠產(chǎn)生本發(fā)明的纖維素材料的細(xì)菌為兼性需氧菌，因而不論存在或不存在氧氣(空氣)都能夠培養(yǎng)。對(duì)于培養(yǎng)基，可以利用各類合成及天然培養(yǎng)基。優(yōu)選含糖的培養(yǎng)基。碳源包括葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、果聚糖、甘露醇、山梨糖醇、赤蘚糖醇、甘油、乙二醇、淀粉、糖漿、玉米漿、麥芽汁和淀粉水解物。在尤其是CJF002菌株的情況下，可以將傳統(tǒng)醋桿菌菌株不能利用的、廉價(jià)的、作為所謂糖蜜的柑橘糖蜜、甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、甜菜汁、糖蔗汁、柑橘類植物等的各種果汁有機(jī)酸，單獨(dú)使用或者使用其兩種或多種的混合物。對(duì)于氮源，以下物質(zhì)可以單獨(dú)使用或者使用其中兩種或多種的混合物無機(jī)氮源例如銨鹽和硝酸鹽，有機(jī)氮源例如發(fā)酵培養(yǎng)基、蛋白胨、大豆粉、肉膏、酪蛋白、尿素和豆?jié){。
對(duì)于培養(yǎng)基，適當(dāng)時(shí)可以單獨(dú)使用以下物質(zhì)或者使用其中兩種或多種的混合物氨基酸、維生素及脂肪酸作為有機(jī)痕量營養(yǎng)，或者磷酸鹽、鐵鹽、錳鹽及其它金屬鹽作為無機(jī)鹽。
由于用于本發(fā)明的腸桿菌屬微生物如CJF002菌株微生物、其突變體或傳代培養(yǎng)物為兼性需氧菌，由此不論有氧或厭氧條件，培養(yǎng)都得以發(fā)生，產(chǎn)生本發(fā)明的纖維素材料。培養(yǎng)形式不受限制，并且原則上，培養(yǎng)微生物的公知方法可用于實(shí)施所述培養(yǎng)。例如，可以任意選擇、組合并使用各種手段和裝置，例如攪拌罐，它包括如發(fā)酵缸和罐、帶擋板的搖瓶、Sakaguchi搖瓶和氣升式攪拌罐、泵驅(qū)動(dòng)的發(fā)酵液循環(huán)及搖瓶培養(yǎng)(其中容器本身被往復(fù)運(yùn)動(dòng)和旋轉(zhuǎn))。此外，根據(jù)需要可以進(jìn)行攪拌培養(yǎng)同時(shí)吹氣。對(duì)于吹氣，可以使用例如含氧氣體如空氣，或者使用例如無氧氣體如氬氣或氮?dú)?。此類氣體可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)培養(yǎng)系統(tǒng)的條件適當(dāng)選擇。
此外，在培養(yǎng)方法中，可以使用公知的方法，例如，分批發(fā)酵法、反復(fù)分批發(fā)酵法、連續(xù)發(fā)酵法等。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的培養(yǎng)方法是攪拌下的有氧培養(yǎng)。在靜止培養(yǎng)中，本發(fā)明的纖維素材料通常以凝膠形式產(chǎn)生，因而其純化和燒蝕困難。不過，應(yīng)當(dāng)特別強(qiáng)調(diào)的優(yōu)點(diǎn)是在用CJF002菌株微生物、其突變體或傳代培養(yǎng)微生物生產(chǎn)纖維素材料時(shí)，不同于醋桿菌菌株，細(xì)菌埋于所產(chǎn)生的凝膠中的可能性很低，因此與醋桿菌菌株的生產(chǎn)相比，純化相對(duì)容易。
當(dāng)攪拌培養(yǎng)低速進(jìn)行時(shí)，這種特殊特點(diǎn)提供了優(yōu)勢(shì)?？梢援a(chǎn)生圖1的照片中所示的非常特殊的獨(dú)立釋放的材料(毛團(tuán)樣形式)。這高度有利，因?yàn)橹煌ㄟ^漂洗就可以除去細(xì)菌，根據(jù)最終用途這導(dǎo)致費(fèi)用的顯著降低。
在實(shí)際培養(yǎng)中，適當(dāng)時(shí)細(xì)菌的初始濃度可以選擇，但合適的濃度為約103到106/ml，優(yōu)選約103到106/ml。培養(yǎng)基的pH不受限制，但優(yōu)選為2.2到9.5，更優(yōu)選7左右。合適的溫度范圍為20到45℃。在本發(fā)明中，尤其是，如果利用CJF002菌株，在培養(yǎng)生產(chǎn)所述纖維素材料的過程中同時(shí)形成一類水溶性多糖，并且優(yōu)選將培養(yǎng)維持在高溫如30℃或更高，以提高纖維素材料的產(chǎn)率。
根據(jù)本發(fā)明的另一種新材料為一類以葡萄糖、半乳糖和巖藻糖(它們各自的含量為30％左右)而非羧化糖作為主成分的水溶性多糖。產(chǎn)生此類水溶性多糖是本發(fā)明所用微生物的培養(yǎng)中的特征之一。例如，通過單純降低培養(yǎng)溫度到約30℃或更低，可產(chǎn)生作為主要產(chǎn)物的水溶性多糖類。為何使用術(shù)語“水溶性多糖類”的原因在于如果進(jìn)行更精確的溶解性分離，它可以再分為數(shù)種水溶性多糖。不過，實(shí)踐中，由于精細(xì)分離可能是非必需的，并且在許多場(chǎng)合下以混合態(tài)利用這些多糖就費(fèi)用減少而言更為有利，所以有意識(shí)地將所述材料描述為水溶性多糖類。術(shù)語“水溶性”包括表現(xiàn)出高膨脹性質(zhì)的材料。
象本發(fā)明的水溶性多糖(類)一樣，在鏈中摻入C6位由甲基取代的脫氧衍生物例如巖藻糖的情況是獨(dú)一無二的。如果該水溶性多糖用普通的交聯(lián)劑交聯(lián)，它們可以高度吸收水等而成凝膠，并且通過被施加到另一種材料的表面或者被摻入到另一種材料中然后被鑄型，它們可容易地用于生物相容性材料、藥物遞送系統(tǒng)(DDS)的介質(zhì)以及能夠/不能夠識(shí)別細(xì)胞的藥劑中。此外，本發(fā)明的水溶性多糖類具有分散不同材料的出色能力，并在鹽存在時(shí)具有強(qiáng)的分散保持力，而這是基于纖維素的分散劑經(jīng)常遇到的問題。因而，這類水溶性多糖可用于包括美容在內(nèi)的廣泛的工業(yè)應(yīng)用。當(dāng)然，基本地，它可以與其它材料如聚合材料形成合金，如所描述的水不溶性纖維素材料那樣。
本發(fā)明的水溶性多糖類可以在與先前描述的用于培養(yǎng)產(chǎn)生纖維素材料的培養(yǎng)基實(shí)質(zhì)上相同的培養(yǎng)基中產(chǎn)生，但是如果培養(yǎng)在低的培養(yǎng)溫度如低于20℃的溫度下進(jìn)行，它作為主要產(chǎn)物產(chǎn)生。對(duì)于碳源，蔗糖比葡萄糖更優(yōu)選。在這種情況下，纖維素材料或多或少地產(chǎn)生。水溶性多糖類與纖維素材料的生產(chǎn)比率在低溫下升高，但在低于4℃的溫度下，任何一種產(chǎn)物幾乎都不產(chǎn)生。由于分離/產(chǎn)生此類溶解在培養(yǎng)基中的多糖需要巨大的能量和費(fèi)用，該類多糖有必要高濃度地存在于培養(yǎng)基中。
對(duì)于從培養(yǎng)液中純化通過本發(fā)明的方法獲得的纖維素材料、復(fù)合材料以及水溶性多糖類的方法，可以應(yīng)用各種方法，并非限制性的，有例如通過過濾凈化以及通過離心沉降傾析。純化程度可根據(jù)應(yīng)用適當(dāng)選擇，并且根據(jù)應(yīng)用可以存在來源于微生物的蛋白、培養(yǎng)基成分等。在某些情況下，來源于微生物的蛋白的存在可為提高與其它成分的粘著或?yàn)槠渌康膸砀鼮橛行У慕Y(jié)果。纖維素材料和水溶性多糖類可以混合。
現(xiàn)在將通過實(shí)施例進(jìn)一步具體描述本發(fā)明。此外，下文將描述鑒定和評(píng)價(jià)由本發(fā)明的培養(yǎng)方法產(chǎn)生的纖維素材料等的方法。
(1)分析纖維素材料和水溶性多糖類的凍干品的糖組分用商業(yè)上可獲得的纖維素酶水解纖維素材料的凍干品(水解度約75％)。同時(shí)，用無機(jī)酸降解水溶性多糖類的凍干品，并用纖維素酶進(jìn)一步水解殘余物。所得的降解物根據(jù)下文所描述的條件分析中性糖和糖醛酸。
(i)中性糖利用Shimadzu公司生產(chǎn)的HPLC裝置(LC-9A)和Tosoh公司生產(chǎn)的柱子(TSK-gel Sugar AXGφ4.6mm×150mm)，注射樣品，然后利用0.5mM的硼酸鉀緩沖溶液作為洗脫劑以0.4ml/分洗脫。利用1％精氨酸和3％硼酸作為柱后標(biāo)記。流速為0.5ml/分并且反應(yīng)溫度為150℃。
(ii)糖醛酸分析以與分析中性糖相同的方式進(jìn)行，除了使用Shimadzu公司生產(chǎn)的柱子(Shinpal ISA-07φ4.6mm×250mm)，并且洗脫和柱后標(biāo)記的流速均變?yōu)?.8ml/分。
(2)纖維素材料的結(jié)構(gòu)糖的鍵合形式根據(jù)常規(guī)方法使纖維素材料的凍干品充分甲基化，用三氟乙酸水解成單糖單位，然后通過乙酸酐-吡啶法還原乙酰化，以轉(zhuǎn)化成部分甲基化的糖醇的乙酰衍生物(部分甲基化的乙酸糖醇酯)。利用氣相色譜(Hewlett-Packard生產(chǎn)的HP 5890A，Supelco日本有限公司生產(chǎn)的SPB-5柱子，載氣He，檢測(cè)模式FID)和氣相色譜-質(zhì)譜分析(JEOL有限公司生產(chǎn)的JMS DX-303，電離，EI法)由甲基化分析估計(jì)纖維素材料的鍵合形式。
(3)纖維素材料的Iα分?jǐn)?shù)固態(tài)13C-NMR光譜測(cè)量利用Bruker有限公司生產(chǎn)的DSX 400分光計(jì)和CP/MAS法進(jìn)行。接觸時(shí)間為1ms，脈沖間隔5s，90°脈沖4.8μs，累積數(shù)目3000并且旋轉(zhuǎn)速度4000Hz。由所得的固態(tài)13C-NMR光譜(圖6)和下列公式(參見Macromolecules，17，1465(1984))計(jì)算Iα分?jǐn)?shù)。圖6顯示了利用葡萄糖作為碳源獲得的實(shí)施例1中纖維素材料的固態(tài)13C-NMR光譜。該光譜顯示作為纖維素材料的結(jié)構(gòu)糖單位的葡萄糖單位在C4-碳處的碳。Iα組分出現(xiàn)在峰2(Iα/2+Iβ/2)和峰3(Iα/2)，并且Iα組分的分布比如括號(hào)中所示各為0.5。Iβ組分出現(xiàn)在峰1(Iβ/2)和峰2(Iα/2+Iβ/2)，并且Iβ組分的分布比如括號(hào)中所示各為0.5。因此，Iα分?jǐn)?shù)可由下列公式確定Iα分?jǐn)?shù)＝(I3×2/(I1+I2+I3))×100I1峰1的積分強(qiáng)度，I2峰2的積分強(qiáng)度，I3峰3的積分強(qiáng)度。
(4)纖維素材料的晶面取向晶面取向由廣角X-射線衍射(圖7)和下列公式(Polymer Journal，7，157(1975))計(jì)算晶面取向＝(I11-0/I200)×100I11-0(11-0)晶面的衍射強(qiáng)度，I200(200)晶面的衍射強(qiáng)度。
(5)纖維素材料的聚合度分子量M由通過cadoxene溶液的粘度測(cè)量方法獲得的特性粘數(shù)(η)和下列公式(參見European Polymer Journal，1，1，(1965))計(jì)算，然后除以165以確定聚合度。圖7顯示了利用葡萄糖作為碳源獲得的實(shí)施例1中纖維素材料的廣角X-射線衍射模式。
＝3.85×10-2M0.76(6)結(jié)晶度固態(tài)13C-NMR光譜利用Bruker有限公司生產(chǎn)的DSX 400分光計(jì)通過CP/MAS法測(cè)量。接觸時(shí)間為1ms，脈沖間隔5s，90°脈沖4.8μs，累積數(shù)目3000并且旋轉(zhuǎn)速度4000Hz。在所得的固態(tài)13C-NMR光譜的C4-碳峰中，高場(chǎng)側(cè)的峰被定義為非晶形組分(峰面積A)，而低場(chǎng)側(cè)的峰被定義為結(jié)晶組分(峰面積B)。結(jié)晶度χc由下列公式(參見Polymer Journal，17，707(1985)(K.Kamide，K.Okajima，K.Kowsaka，T.Matsui)確定χc＝(B/(A+b))×100實(shí)施例1使含有4.0％蔗糖、葡萄糖或中國制造的甜菜糖蜜的多糖生產(chǎn)培養(yǎng)基(下文稱之為PPM培養(yǎng)基。Polysaccharide-production-medium，AkihikoShimada，Viva Origino，23，1，52-53，1995)經(jīng)受高壓蒸氣滅菌處理。然后，將1000ml培養(yǎng)基投入內(nèi)體積為2000ml的發(fā)酵缸中，以104CFU/ml的量接種CJF 002菌株，并在低速(70rpm)攪拌下于30℃在溫和吹泡通氣下培養(yǎng)2天。在所有類型的培養(yǎng)中，獲得了如圖1所示的具有自中心向四周放射狀地形成的大原纖的球形纖維素材料。具體的，它由球芯和自球芯放射狀延伸的錐形組分構(gòu)成。錐形組分和核在錐形組分的頂端接合，并在錐形組分的底端觀察到纖維狀物質(zhì)。錐形組分的高度幾乎與球芯的半徑相等。將它們用網(wǎng)篩(50目)過濾、漂洗、壓縮、然后浸入1％的NaOH溶液中、滅菌、再中和、漂洗和壓縮，由此可容易地得到含水的白色絮凝體。由葡萄糖培養(yǎng)獲得的纖維素材料具有圖1所示的形狀，并且直徑一般是均一的，并且液體滲透性出色。上述的過濾、漂洗、壓縮等步驟非常令人滿意。如下文所述，由醋桿菌菌株產(chǎn)生的傳統(tǒng)纖維素是具鱗的細(xì)片形凝膠物質(zhì)，因而導(dǎo)致網(wǎng)篩容易堵塞，從而難以實(shí)施上述步驟。發(fā)現(xiàn)只通過漂洗即可除去幾乎所有的細(xì)菌，而無需浸泡在1％的NaOH溶液中。
結(jié)構(gòu)糖組分、結(jié)晶度、Iα分?jǐn)?shù)以及晶面取向分析的結(jié)果顯示在表1中。顯然，β-1，4-鍵占主導(dǎo)地位，結(jié)構(gòu)糖中葡萄糖含量為87.8到99.6％，結(jié)晶度為80％或更高，而Iα分?jǐn)?shù)至多為62％，且平均57％。Iα分?jǐn)?shù)低于比較實(shí)施例2中由醋桿菌菌株產(chǎn)生的纖維素的事實(shí)可歸因于共同存在結(jié)構(gòu)與僅由葡萄糖構(gòu)成的真正纖維素相近的水不溶性多糖。非葡萄糖的糖組分主要是半乳糖和甘露糖。基于糖的水不溶性纖維素材料的產(chǎn)率為10到15％。
實(shí)施例2將經(jīng)過高壓蒸氣滅菌操作的含2.0％葡萄糖的一立方米(1m3)多糖生產(chǎn)培養(yǎng)基(Polysaccharide-production-medium，Akihiko Shimada，VivaOrigino，23卷1期，52-53頁，1995)投進(jìn)3m3的培養(yǎng)罐中，以2×104CFU/ml的量接種CJF 002菌株，以1m3/分的通氣速率由培養(yǎng)罐底部吹氣，并于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。每隔1小時(shí)用稀釋的NaOH溶液調(diào)節(jié)，從而培養(yǎng)物中的pH為7。培養(yǎng)完成后，通過向培養(yǎng)基中吹入高壓蒸氣滅菌，粗網(wǎng)過濾，進(jìn)行離心脫水處理，然后用1％苛性鈉在90℃溶菌處理數(shù)小時(shí)，中和，漂洗并脫水以獲得含大約10wt％的纖維素的濕餅。餅直接用水稀釋，并用光學(xué)顯微鏡觀察它的宏觀結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示在表2中。圖2顯示了與圖1中基本上相同的球形，其中大原纖自中心向四周放射狀地形成，但由于培養(yǎng)條件不同，它們?cè)谠w的形狀和大小上有差別。具體地，這種從球芯以約1mm的長度放射狀地線性延伸的大原纖的直徑略微小于1mm。與通過攪拌培養(yǎng)醋桿菌菌株獲得的鱗狀細(xì)片形或不確定形式(K.Watanabe，Cellulose 5，187(1998))相比，本發(fā)明微生物產(chǎn)生的纖維素具有獨(dú)立的或者某種程度上連接的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，其中大原纖從中心放射狀延伸，因而它絕對(duì)是一種新的由微生物產(chǎn)生的纖維素材料。
此外，用電子顯微鏡觀察了通過凍干上述濕餅獲得的樣品的微觀結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示于圖3。通過攪拌培養(yǎng)醋桿菌菌株獲得的細(xì)菌纖維素是網(wǎng)狀的，但它的微纖維本身是圓形的，結(jié)構(gòu)與其中產(chǎn)生的聚合物的瞬時(shí)粒子通過相分離連接的結(jié)構(gòu)(參見美國專利5,144,021，圖2)接近。在另一方面，如圖3所示，本發(fā)明的產(chǎn)品一般是扁平的，并具有特征性形態(tài)，其中圓孔如在相分離結(jié)構(gòu)中那樣互相連接，而且在微纖維之間具有高得多的相互連接程度。此外，分析了本發(fā)明的纖維素材料的結(jié)構(gòu)糖的鍵合形式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-1，4-糖苷鍵占總鍵的96％或更多，并且纖維素在結(jié)構(gòu)糖中占主導(dǎo)地位。此外，結(jié)晶度為90％或更高，并且從X-射線衍射中發(fā)現(xiàn)II-型結(jié)晶形式或多或少地存在。
實(shí)施例3將具有3％葡萄糖濃度的1000毫升PMM投進(jìn)總體積為5000ml的小發(fā)酵缸中，然后無菌接種CJF002菌株(2×104CFU/ml)，并向其中加入α-氧化鋁(平均粒徑0.5μm，300mg)，并在100rpm的攪拌轉(zhuǎn)速和600ml/分的通氣速率下攪拌培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)基滅菌、脫水、用堿洗滌、中和、洗滌并脫水，獲得纖維素材料/無機(jī)物復(fù)合材料。其光學(xué)顯微照片顯示于圖4中。對(duì)于具有添加的氧化鋁的復(fù)合材料，清楚地觀察到相似的形態(tài)，即在巨大球芯周圍具有放射狀大原纖的新形態(tài)。該球體的大小為不存在氧化鋁時(shí)球體的兩倍或更大。在本實(shí)施例中，如果氧化鋁完全摻入到產(chǎn)生的纖維素材料中，氧化鋁的含量以體積分?jǐn)?shù)計(jì)約為1/25。纖維素/無機(jī)物復(fù)合材料凍干品的電鏡照片顯示在圖5中。發(fā)現(xiàn)不確定形狀的氧化鋁固定在高度蜘網(wǎng)般的結(jié)構(gòu)區(qū)域上。對(duì)這種凍干品進(jìn)行數(shù)次再分散處理，并用電子顯微鏡再次觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定的氧化鋁幾乎未從纖維素微纖維中分離或脫離。
實(shí)施例4、5和6分別獨(dú)立混合5克α-氧化鋁(實(shí)施例4)(平均粒徑0.5μm)、5g銳鈦礦型氧化鈦(實(shí)施例5)(粒徑0.5μm)和5g金紅石型氧化鈦(實(shí)施例6)(粒徑0.5μm)并各自分散于500ml具有2％葡萄糖濃度的PMM中，然后無菌裝進(jìn)總體積為2000ml的各自的燒瓶中，接種CJF002菌株(2×104CFU/ml)。振蕩培養(yǎng)以200rpm的搖速進(jìn)行18小時(shí)。不進(jìn)行通氣和pH調(diào)整。滅菌后馬上測(cè)量葡萄糖消耗量，發(fā)現(xiàn)葡萄糖消耗量有很大差別，α-氧化鋁為94％、銳鈦礦型氧化鈦為36％而金紅石型氧化鈦為21％。這可能歸因于后兩種材料的表面是堿性的，而前一種材料的表面是酸性的。用光學(xué)顯微鏡觀察所得的纖維素材料/無機(jī)物復(fù)合材料，結(jié)果在每個(gè)實(shí)施例中均觀察到具有自中心向四周放射狀形成的大原纖的球形。在較少消耗葡萄糖的氧化鈦的情況下，纖維素的量幾乎與氧化鋁的情況相等。因此，葡萄糖向纖維素的轉(zhuǎn)化效率似乎提高了。
實(shí)施例7和比較實(shí)施例1實(shí)施例2中獲得的微生物產(chǎn)生的新纖維素材料濕餅用水稀釋，使纖維素含量為0.1wt％，并用TK勻漿機(jī)以簡單方式分散以獲得分散體(實(shí)施例7)。商業(yè)上可獲得的由Fujicco有限公司生產(chǎn)的Nata de coco(由醋桿菌菌株通過靜止培養(yǎng)獲得的細(xì)菌纖維素pericle)同樣地用TK勻漿機(jī)以簡單方式分散以獲得0.1wt％的纖維素分散體(比較實(shí)施例1)。這些分散體的沉降壓縮度通過本說明書描述的方法測(cè)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)比較實(shí)施例1中的沉降壓縮度為0.20或更高，而本發(fā)明實(shí)施例7中的產(chǎn)品為0.08。這意味著后者更容易壓縮。類似地，利用B-型粘度計(jì)在10/SEC的旋轉(zhuǎn)速度下測(cè)量動(dòng)態(tài)粘度。本發(fā)明的產(chǎn)品具有200cp的動(dòng)態(tài)粘度，而比較實(shí)施例1的產(chǎn)品具有600cp的動(dòng)態(tài)粘度。也就是說，可以認(rèn)為本發(fā)明的新微生物產(chǎn)生的纖維素材料在干燥能力和次次加工性能方面比已知的所謂細(xì)菌纖維素更為有利。
實(shí)施例8根據(jù)實(shí)施例1中描述的培養(yǎng)方法，利用逐步添加葡萄糖溶液使培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度為1％的方法，于15℃進(jìn)行4天培養(yǎng)。在15℃的溫度下，幾乎沒有纖維素材料產(chǎn)生。在培養(yǎng)液高壓滅菌后，用網(wǎng)篩(50目)分離并取出些許產(chǎn)生的纖維素材料，并通過離心分離沉淀除去細(xì)菌。濃縮培養(yǎng)濾出液至原始體積的一半，然后投入三倍于濃縮濾出液體積的丙酮溶液中，同時(shí)攪拌。所得的沉淀用網(wǎng)篩過濾。濾出的物質(zhì)以10％的濃度再次溶于水中。添加甲醇和乙醇后該溶液不容易產(chǎn)生沉淀。從重溶的溶液中除去殘?jiān)Ｈ缓笥萌队谠撊芤后w積的丙酮再次析出沉淀。濾出的物質(zhì)用水/甲醇混合物(30％甲醇)洗滌獲得期望的材料。期望材料的結(jié)構(gòu)糖組成顯示于表2。發(fā)現(xiàn)期望的材料含有半乳糖、巖藻糖和葡萄糖作為主成分，并含有糖醛酸成分。
實(shí)施例9利用中國制造的甜菜糖蜜作為碳源按照與實(shí)施例1中相同的方式進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為30℃。培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)基于120℃高壓滅菌20分鐘。原樣干燥滅菌的培養(yǎng)液以獲得纖維素材料和水溶性多糖類的混合物?；旌衔镏欣w維素材料與水溶性多糖類的比率(纖維素材料/水溶性多糖類)為6/5。
實(shí)施例10和比較實(shí)施例2除了利用葡萄糖作為碳源并且培養(yǎng)溫度為40℃之外，以與實(shí)施例1中相同的方式獲得具有與圖1所示的相似形態(tài)的纖維素材料(實(shí)施例10)。以與實(shí)施例1中相同的方式，將所獲得的纖維素材料用網(wǎng)篩過濾，漂洗，壓縮，然后浸入1％的NaOH溶液中，滅菌，然后再中和，漂洗和壓縮，獲得含水的絮凝體。該纖維素材料在網(wǎng)篩中的液體滲透性出色，因此這些過濾、漂洗、壓縮等步驟可以相當(dāng)容易地進(jìn)行。之后，用雙軸捏和機(jī)(Kurimoto有限公司生產(chǎn)的KRC Kneader(商標(biāo)))在200rpm于140℃同時(shí)干燥并壓碎絮凝體。將所得的干粉分散在四氫呋喃(THF)中，然后將聚砜(分子量5,000)溶解在其中。聚砜占THF、纖維素材料和聚砜總量的百分比為8wt％，而纖維素材料的百分比為0.8wt％。將所得的聚砜溶液/纖維素材料分散體液體以500μm的厚度澆鑄到玻璃板上，并干燥以獲得纖維素/聚砜膜。所得的膜的線性膨脹系數(shù)為19ppm，它約為聚砜線性膨脹系數(shù)(即55ppm)的1/3。纖維素材料本身的線性膨脹系數(shù)為5ppm，而且隨復(fù)合材料在令人滿意的水平形成，合金材料的線性膨脹系數(shù)下降并變得接近5ppm。
作為比較實(shí)施例2，培養(yǎng)醋桿菌菌株以獲得纖維素。利用標(biāo)準(zhǔn)條件和Hestrin-Schramm培養(yǎng)基(參見S.Hestrin和M.Schramm，Biochem，J.，58，345(1954))，培養(yǎng)在pH為6，溫度為28℃且通氣攪拌下進(jìn)行。比較實(shí)施例2中所獲得的纖維素材料為不確定的鱗狀細(xì)片形并且部分地凝膠化，因此它堵塞網(wǎng)篩，因而難以通過過濾、沖洗、壓縮等步驟。比較實(shí)施例2中所獲得的纖維素材料的結(jié)構(gòu)和組成顯示于表1。對(duì)于糖組成，葡萄糖含量為100％，且鏈鍵全是β-1，4-鍵。該纖維素材料具有高的Iα分?jǐn)?shù)(即69％)和高的晶面取向。利用比較實(shí)施例2中獲得的纖維素材料，以與實(shí)施例10中相同的方式得到了纖維素/聚砜膜。該膜的線性膨脹系數(shù)為35ppm，這明顯大于本發(fā)明的膜。這歸因于比較實(shí)施例的纖維素材料的表面活性(OH基團(tuán)的密度)太低以至于不足以形成復(fù)合材料的事實(shí)。


Glc葡萄糖，Gal半乳糖，Man甘露糖，Ara阿拉伯糖[表2]

Rha鼠李糖，Rib核酮糖，Man甘露糖，Ara阿拉伯糖，F(xiàn)uc巖藻糖，Gal半乳糖，Xyl木糖，Glc葡萄糖工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的纖維素材料具有高的纖維狀原纖表面活性，并且由于它的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，是出色的復(fù)合材料的原料，可用作為組合成分的穩(wěn)定性賦予劑、微量過濾的分離介質(zhì)和具有穩(wěn)定形態(tài)結(jié)構(gòu)的片/粒狀材料。此外，本發(fā)明的纖維素材料/無機(jī)物復(fù)合材料在基本形態(tài)上與非復(fù)合纖維素材料等同，并且不僅可表現(xiàn)出所含無機(jī)物的特異性功能，而且提供由于它的形態(tài)所產(chǎn)生的新功能，從工業(yè)角度看極其有意義。
在如同本發(fā)明的水溶性多糖類的鏈中摻入葡萄糖的C6-甲基基團(tuán)脫氧衍生物例如巖藻糖的情況是獨(dú)一無二的。如果該水溶性多糖用普通的交聯(lián)劑交聯(lián)，它們將高度吸收水或其它溶劑變成凝膠，并且如果它們被施加到另一種材料的表面或者被摻入到另一種材料中然后被鑄型后，可容易地用于生物相容性材料、DDS介質(zhì)以及能夠/不能夠識(shí)別細(xì)胞的試劑中。此外，本發(fā)明的水溶性多糖類具有分散不同材料的出色能力，并在鹽存在時(shí)具有強(qiáng)的分散保持力，而這是基于纖維素的分散劑經(jīng)常遇到的問題。因而，此水溶性多糖類可用于包括美容在內(nèi)的廣泛的工業(yè)應(yīng)用。
纖維素材料和水溶性多糖類可以與其它材料如聚合材料、金屬和金屬氧化物組合用于制備合金。
權(quán)利要求
1.球形纖維素材料，其中纖維素材料是由β-1，4-型糖鏈鍵構(gòu)成的水不溶性多糖，結(jié)晶度為70％或更高，并且自中央向四周放射狀地形成大原纖。
2.纖維素材料，其中纖維素材料是由β-1，4-型糖鏈鍵構(gòu)成的水不溶性多糖，葡萄糖單位在該水不溶性多糖中的組成比為85％到100％，而且纖維素結(jié)晶多形的Iα分?jǐn)?shù)為45％到63％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的纖維素材料，其中對(duì)纖維素的cadoxene溶液通過粘度方法確定的粘度平均聚合度為3500或更高。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的纖維素材料，它通過培養(yǎng)腸桿菌屬微生物、其突變體或其微生物傳代培養(yǎng)物獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的纖維素材料，其中所述腸桿菌屬微生物是CJF002菌株微生物。
6.球形纖維素材料，其中纖維素材料是由β-1，4-型糖鏈鍵構(gòu)成的水不溶性多糖，通過培養(yǎng)腸桿菌屬微生物、其突變體或其微生物傳代培養(yǎng)物獲得，結(jié)晶度為55％或更高，并且自中央向四周形成大原纖。
7.纖維素材料，其中纖維素材料是由β-1，4-型糖鏈鍵構(gòu)成的水不溶性多糖，通過培養(yǎng)腸桿菌屬微生物、其突變體或其微生物傳代培養(yǎng)物獲得，葡萄糖單位在該水不溶性多糖中的組成比為85％到100％，而且纖維素結(jié)晶多形的Iα分?jǐn)?shù)為45％到63％。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的纖維素材料，其中對(duì)纖維素的cadoxene溶液通過粘度方法確定的粘度平均聚合度為3500或更高。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7的纖維素材料，其中所述腸桿菌屬微生物是CJF002菌株微生物。
10.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的纖維素材料的方法，包括用選自由腸桿菌屬微生物、其突變體和其微生物傳代培養(yǎng)物組成的組中的至少一種微生物以103到107/ml的量接種培養(yǎng)基，然后在攪拌及20℃到45℃的溫度下利用糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述腸桿菌屬微生物是CJF002菌株微生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述糖為糖蜜。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述糖為糖蜜。
14.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求6至8中任何一項(xiàng)的纖維素材料的方法，包括用選自由腸桿菌屬微生物、其突變體和其微生物傳代培養(yǎng)物組成的組中的至少一種微生物以103到107/ml的量接種培養(yǎng)基，然后在攪拌及20℃到45℃的溫度下利用糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述腸桿菌屬微生物是CJF002菌株微生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述糖為糖蜜。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述糖為糖蜜。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的纖維素材料和其它聚合材料和/或金屬和/或金屬氧化物的復(fù)合材料。
19.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求18的復(fù)合材料的方法，包括用選自由腸桿菌屬微生物、其突變體和其微生物傳代培養(yǎng)物組成的組中的至少一種微生物以103到107/ml的量接種培養(yǎng)基，然后在攪拌下用非纖維素材料的聚合材料和/或金屬和/或金屬氧化物在20℃到45℃的溫度下利用糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述糖為糖蜜。
21.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任何一項(xiàng)的纖維素材料和其它聚合材料和/或金屬和/或金屬氧化物的復(fù)合材料。
22.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求21的復(fù)合材料的方法，包括用選自由腸桿菌屬微生物、其突變體和其微生物傳代培養(yǎng)物組成的組中的至少一種微生物以103到107/ml的量接種培養(yǎng)基，然后在攪拌下用非纖維素材料的聚合材料和/或金屬和/或金屬氧化物在20℃到45℃的溫度下利用糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述糖為糖蜜。
24.以葡萄糖、半乳糖和巖藻糖而非羧化糖作為主成分的水溶性多糖類，它通過用選自由腸桿菌屬微生物、其突變體和其微生物傳代培養(yǎng)物組成的組中的至少一種微生物以103到107/ml的量接種培養(yǎng)基，然后在4℃到30℃的溫度下利用糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物獲得。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的水溶性多糖類，其中所述腸桿菌屬微生物是CJF002菌株微生物。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25的水溶性多糖類，其中所述糖為糖蜜。
27.根據(jù)權(quán)利要求24或25的水溶性多糖類和其它聚合材料和/或金屬和/或金屬氧化物的復(fù)合材料。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的水溶性多糖類和其它聚合材料和/或金屬和/或金屬氧化物的復(fù)合材料。
全文摘要
本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N球形纖維素材料，其中纖維素材料是由β－1，4－型糖鏈鍵構(gòu)成的水不溶性多糖，結(jié)晶度為70％或更高，并且從中央向四周放射狀地形成大原纖。
文檔編號(hào)C08B15/08GK1602318SQ0282451
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2002年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月8日
發(fā)明者山根千弘, 岡島邦彥, 大冢牧子 申請(qǐng)人:旭化成株式會(huì)社