專利名稱：生物降解性生物體高分子材料，其制造方法，與該高分子材料構(gòu)成的功能性材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及受酶的作用分解、降解，其結(jié)果進(jìn)行低分子化的生物降解性生物體高分子材料及其制造方法，以及由該生物降解性生物體高分子材料構(gòu)成的金屬離子吸附材料、有用物質(zhì)的緩釋性載體、生物體細(xì)胞增殖基材及生物降解性吸水性材料等的功能性材料。
背景技術(shù)：
具有生物降解功能的有機(jī)高分子材料上市已很久。醫(yī)用領(lǐng)域往往使用受酶作用的影響而生物分解、降解進(jìn)行低分子化的材料。最近，在生物降解性有機(jī)高分子中，實(shí)用上較多使用的代表是聚乳酸或聚乙醇酸等的多縮含氧酸，這些的材料廣泛作為植入生物體內(nèi)材料、向生物體內(nèi)的輸送用材料或醫(yī)藥品的緩慢釋放載體使用。
這些的聚乳酸或聚乙醇酸顯示良好的耐藥性。因?yàn)榫廴樗峄蚓垡掖妓釤o(wú)毒、容易水解，故廣泛作為生物體內(nèi)降解吸收性材料活性。另外，聚乙醇酸由于可獲得高聚合物，所以可作為要求強(qiáng)度等力學(xué)特性的材料利用。聚乳酸或聚乙醇酸，具體地例如作為生物體內(nèi)降解吸收性縫合線利用。
另外，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為外科用手術(shù)縫合線長(zhǎng)期使用來(lái)自家蠶的絹絲。家蠶絹絲開始作手術(shù)用縫合線可追溯到11世紀(jì)初。日本的縫合線市場(chǎng)一年約60億日元(1985年)，其中46％是絹絲制縫合線。絹絲抗張力或結(jié)節(jié)強(qiáng)度好且容易滅菌，所以作為縫合線很受歡迎。即使從過(guò)去有關(guān)絹絲制縫合線的使用實(shí)體來(lái)判斷，絹絲具有殺菌容易，植入生物體內(nèi)短期間不生物降解，或移值到體內(nèi)時(shí)，與生物體組織產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)也輕的優(yōu)點(diǎn)。
成熟的蠶吐絲作出的蛋白質(zhì)纖維是蠶繭纖維(絹絲)。蠶有農(nóng)家飼養(yǎng)的家蠶與野生型野蠶二種。用堿處理除去覆蓋該蛋繭纖維表面膠粘物質(zhì)的絲膠蛋白后是絹絲蛋白纖維。
所謂野蠶絹絲，通常是指柞蠶(Antheraea pernyi)、天蠶(Antheraeayamamai)、達(dá)薩魯蠶(Antheraea militta)、姆卡蠶(Antheraea assama)、石楠蠶、橒蠶等吐絲形成的絹絲。
上述絹絲制縫合線因?yàn)槭欠俏招圆牧?、短期間不進(jìn)行分解、縫合后殘留在生物內(nèi)，所以是與數(shù)周后在體內(nèi)被吸收、與分解成水和二氧化碳的聚乳酸或聚乙醇酸等的多縮含氧酸的縫合是不同的目的使用。
有關(guān)上述的生物降解性生物體高分子構(gòu)成的金屬離子吸附材料與有用物質(zhì)的緩慢釋放性載體，還沒有提出具有令人滿意特性的材料。
如上所述，聚乳酸廣泛作為生物體內(nèi)降解吸收性材料使用，但存在制造成本高的問(wèn)題。另外，聚乙醇酸由于具有如上述的優(yōu)點(diǎn)故可用作生物體內(nèi)降解吸收性材料，但其價(jià)格高、結(jié)晶性高、太硬，軟組織適合性低。另外，降解速度難控制，此外，對(duì)該材料即使進(jìn)行化學(xué)修飾，也存在難調(diào)節(jié)生物降解性的問(wèn)題。
另外，纖維狀聚乳酸的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，例如，由于與聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯纖維的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度類似，所以聚乳酸纖維顯示出與聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯纖維很相似的機(jī)械性能。但由于聚乳酸等結(jié)晶化速度比聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯慢，故經(jīng)過(guò)通常的紡絲工序或拉伸工序分子充分取向，不進(jìn)行結(jié)晶化，因此，聚乳酸的拉伸強(qiáng)度或尺寸穩(wěn)定性不充分等成為實(shí)用功能上的問(wèn)題。
另外，上述多縮含氧酸分子量越高降解速度越慢。因此要想控制降解速度在制造控制分子量的聚乳酸或聚乙醇酸時(shí)，需要很多的工夫或高度熟練的技術(shù)。為此，現(xiàn)在，多縮含氧酸的利用僅限定于吸收性縫合線之類的醫(yī)療用途或化妝品用途，強(qiáng)烈要求確定經(jīng)濟(jì)上價(jià)廉且可用簡(jiǎn)單的技術(shù)實(shí)施的制造工藝。
絹絲制縫合線，如上所述，與在生物體內(nèi)最終分解成水和二氧化碳的聚乳酸或聚乙醇酸等縮含氨酸的縫合線不同。因此強(qiáng)烈要求開發(fā)可控制生物體內(nèi)的生物降解性，生物體安全上沒問(wèn)題，制造價(jià)格便宜的生物降解性材料，生物降解的結(jié)果在降解產(chǎn)物中沒有細(xì)胞毒性，且作為副產(chǎn)物不產(chǎn)生甲醛等的有害物質(zhì)，對(duì)生物體組織安全的生物降解性材料。
上述絹絲制縫合線原料、即昆蟲生物體高分子的絹絲蛋白質(zhì)是通過(guò)蠶生物合成制成的天然高分子材料，對(duì)生物體組織的生體適合性好，成型性也好。若使用生絲或絹制品生產(chǎn)過(guò)程中獲得的絹絲副產(chǎn)物作為起始物質(zhì)則可廉價(jià)獲得原材料，由于絹絲蛋白質(zhì)大量含有富化學(xué)反應(yīng)性的活性部位，如果能采用混合加工或化學(xué)修飾加工等可控制絹絲蛋白的生物降解性或生物化學(xué)特性的技術(shù)，則可擴(kuò)寬作為醫(yī)用材料等的利用范圍。因此，強(qiáng)烈期望出現(xiàn)這種昆蟲生物體高分子為起始物質(zhì)，使第二物質(zhì)復(fù)合(以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱混合)在起始物質(zhì)中可在醫(yī)用領(lǐng)域有效利用的生物降解性的新材料。
本發(fā)明的課題在于解決上述以往技術(shù)的問(wèn)題、提供作為高分子基質(zhì)的作用性好的絹絲蛋白質(zhì)組成的生物降解性生物體高分子材料及將該絹絲蛋白質(zhì)與特定的第二物質(zhì)混合化的、賦予單一絹絲蛋白質(zhì)所沒有的特性，可控制生物降解的混合化生物降解性生物體高分子材料，同時(shí)提供其制造方法，以及這些生物降解性生物體高分子材料構(gòu)成的金屬離子吸附材料、有用物質(zhì)的緩釋性載體、生物體細(xì)胞增殖基材與生物降解性吸水性材料等的功能性材料。

發(fā)明內(nèi)容
家蠶絹絲或野蠶絹絲是蠶吐絲形成的纖維狀試料，X射線衍射分析具有纖維結(jié)構(gòu)，所以即使受化學(xué)試劑或酶的作用也顯示出強(qiáng)的耐藥性。所以分類時(shí)將家蠶絹絲歸屬生物體內(nèi)的非吸收性材料。而本發(fā)明者們利用絹絲蛋白具有的良好生物化學(xué)特性，著眼于提供兼具生物降解性的材料，以家蠶絹絲蛋白作為起始物質(zhì)，通過(guò)使其復(fù)合特定的第二物質(zhì)，進(jìn)行制造可控制生物降解程度用的技術(shù)開發(fā)。使酶與其過(guò)程中獲得的新型復(fù)合體作用，探素分解過(guò)程，發(fā)現(xiàn)了可提供具有生物降解性的生物體高分子材料，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，其特征是由只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的復(fù)合體、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的任一種與從纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白與聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的復(fù)合體構(gòu)成。
該生物降解性高分子材料是使用由蛋白酶、膠原酶、膠乳蛋白酶中選出的至少一種的酶進(jìn)行生物降解的高分子材料。
該生物降解性生物體高分子材料的形態(tài)可以是纖維狀、膜狀、粉末狀、凝膠狀、多孔狀。
本發(fā)明的生物降解性物生體高分子材料的制造方法，其特征是將只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液的混合水溶液、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液的任一種水溶液與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的水溶液的混合水溶液涂布在基板，使之蒸發(fā)干燥固化，制造膜狀生物降解性生物體高分子材料的方法，該混合水溶液，在使各水溶液進(jìn)行混合的水溶液彼此之間進(jìn)行混合時(shí)，通過(guò)攪拌不產(chǎn)生凝膠化、沉淀、凝固反應(yīng)而均勻混合進(jìn)行調(diào)制。
另外，粉末狀的生物降解性生物體高分子材料是使上述只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液、或混合水溶液凍結(jié)后，在減壓環(huán)境下使之干燥制得。調(diào)制該混合水溶液時(shí)的混合方法如上述地進(jìn)行。此外，凝膠狀的生物降解性生物體高分子材料，通過(guò)將上述來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液、來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液、或混合水溶液的pH調(diào)節(jié)到酸性域，使水溶液全部凝固進(jìn)行凝膠化制得。再者，通過(guò)將這樣制得的生物降解性生物體高分子材料的凝膠狀物凍結(jié)干燥可制造多孔狀物質(zhì)。
調(diào)制上述混合水溶液時(shí)的，來(lái)自家蠶的絹絲蛋白水溶液、來(lái)自野蠶的絹絲蛋白水溶液及第二物質(zhì)水溶液的濃度分別優(yōu)選是0.1～5重量％。濃度低于0.1重量％時(shí)，調(diào)制復(fù)合體需要的水溶液量多作業(yè)效率低，而濃度超過(guò)5重量％時(shí)，2液混合時(shí)很難均勻混合，結(jié)果產(chǎn)生實(shí)際上不能制造均勻復(fù)合體等的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的金屬離子吸附材料，由只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的復(fù)合體、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)野蠶的絹絲蛋白的任一種與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的復(fù)合體的這種生物降解性生物體高分子材料構(gòu)成。該金屬離子可以是銀、銅、鈷等的抗菌性金屬或廢水中的金屬離子。
本發(fā)明有用物質(zhì)的緩釋性載體，其特征是由只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的復(fù)合體、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的任一種與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的復(fù)合體的這類生物降解性生物體高分子材料構(gòu)成，不僅被蛋白酶、膠原酶、胰凝乳蛋白酶生物降解，而且緩慢釋放生物降解性生物體高分子材料所載附的有用物質(zhì)。該生物降解性高分子材料優(yōu)選是多孔體。
本發(fā)明的生物體細(xì)胞增殖基材由來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白復(fù)合體、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的任一種與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的復(fù)合體的這類生物降解性生物體高分子材料構(gòu)成，為了使生物體細(xì)胞有效地、經(jīng)濟(jì)地增殖而使用。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，由只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的復(fù)合體、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的任一種與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的復(fù)合體的這類生物降解性生物體高分子材料構(gòu)成。
本發(fā)明中所說(shuō)的所謂“生物降解”，是指包括酶與絹絲蛋白或第二物質(zhì)作用，將這些消化或者水解而低分子化，或者水解成氨基酸的反應(yīng)或酶與第二物質(zhì)作用使之低分子化的反應(yīng)全部過(guò)程。因此，本發(fā)明中在水解以外的反應(yīng)中也可能有酶將基質(zhì)進(jìn)行低分子化的情況，為了方便起見有時(shí)該酶簡(jiǎn)稱蛋白質(zhì)水解酶。
發(fā)明的實(shí)施方案根據(jù)本發(fā)明，作為由絹絲蛋白質(zhì)纖維調(diào)制絹絲蛋白水溶液用的原料，例如，可以使用來(lái)自家蠶或野蠶的絹絲。作為由家蠶所得絹絲本身的絹絲蛋白，例如，可利用來(lái)自農(nóng)家飼養(yǎng)的家蠶(Bombyx Bori)幼蟲、家蠶近緣種的桑蠶幼蟲的絹絲蛋白質(zhì)之類絹絲蛋白，作為野蠶絹絲蛋白，例如，可利用來(lái)自柞蠶(Antheraea pernyi)、天蠶(Antheraea yamamai)、達(dá)薩魯蠶(Antheraea militta)、姆卡蠶(Antheraea assama)、石楠蠶、橒蠶等幼蟲的絹絲蛋白。另外，作為調(diào)制絹絲蛋白水溶液用的原料，除絹絲以外，也可以利用來(lái)自家蠶或野蠶產(chǎn)生的副產(chǎn)物、絹絲纖維、絹絲纖維制品及其織絲纖維集合體。
與家蠶絹絲蛋白或野蠶絹絲蛋白混合用的第二物質(zhì)、如上所述，是從纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白以及聚乙烯醇中選出的至少一種。
將家蠶絹絲蛋白水溶液或野蠶絹絲蛋白水溶液混合，或者將家蠶絹絲蛋白水溶液或野蠶絹絲蛋白水溶液與第二物質(zhì)的水溶液混合，將該混合水溶液涂布在聚乙烯等基板的表面上，通過(guò)干燥固化可制造家蠶絹絲蛋白與野蠶絹絲蛋白的復(fù)合體(混合物)家蠶絹絲蛋白或野蠶絹絲蛋白與第二物質(zhì)的復(fù)合體之類生物降解性生物體高分子材料。也可只由家蠶絹絲蛋白水溶液或只由野蠶絹絲蛋白水溶液，同樣地分別制造生物降解性生物體高分子材料。
以下，對(duì)家蠶絹絲蛋白水溶液與野蠶絹絲蛋白水溶液的調(diào)制，以及家蠶絹絲蛋白膜與野蠶絹絲蛋白膜的制造進(jìn)行說(shuō)明，同時(shí)還對(duì)用家蠶絹絲蛋白水溶液或野蠶絹絲蛋白水溶液與纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白與聚乙烯醇的各水溶液的混合水溶液制造混合物(復(fù)合體)的方法進(jìn)行說(shuō)明。(A)家蠶絹絲蛋白水溶液與家蠶絹絲蛋白膜的制造純家蠶絹絲蛋白水溶液如下地制得。
首先，用碳酸鈉等中性鹽的堿水溶液把蠶吐絲的家蠶蠶繭絲煮沸，除去絲膠蛋白，制備家蠶絹絲本身的絹絲蛋白纖維。然后，把該絹絲蛋白纖維溶解于濃中性鹽水溶液中，加熱制得絹絲蛋白水溶液。該絹絲蛋白水溶液中除了絹絲蛋白外由于還大量含有基于中性鹽的離子，故注入纖維素制的透析膜中，用縫合絲扎住兩端，通過(guò)在自來(lái)水或純水中用2～5天的時(shí)間進(jìn)行設(shè)定的時(shí)間透析處理，制造純的家蠶絹絲溶液。從該絹絲蛋白水溶液中蒸發(fā)掉一部分水，或者加入水可制得濃度不同的絹絲蛋白水溶液。
把這樣調(diào)制的家蠶絹絲蛋白水溶液涂布在聚乙烯膜等的基板上，通過(guò)在室溫下蒸發(fā)干燥固化可制得家蠶絹絲膜。
另外，把家蠶絹絲蛋白質(zhì)纖維(絹絲)進(jìn)行溶解調(diào)制家蠶絹絲蛋白水溶液，采用在氯化鈣、硝酸鈣、溴化鋰、硫氰酸鋰等濃中性鹽水溶液中加入絹絲進(jìn)行加熱的方法進(jìn)行。中性鹽濃度是5～9M左右，溶解溫度是25～70℃左右，優(yōu)選是25～60℃左右。溶解溫度變成超過(guò)70℃的高溫時(shí)，絹絲蛋白質(zhì)的分子量降低，失去材料的高分子性，結(jié)果有成型性降低的危險(xiǎn)。溶解時(shí)間優(yōu)選設(shè)定在1～20分鐘左右。使家蠶絹絲蛋白質(zhì)纖維良好溶解的中性鹽，在中性鹽中是對(duì)家蠶絹絲蛋白纖維溶解力好的鋰鹽，通常優(yōu)選溴化鋰。例如，若是8M以上，優(yōu)選8.5M以上的溴化鋰，在55℃以上處理15分鐘以上，則家蠶絹蛋白質(zhì)纖維進(jìn)行溶解。(B)野蠶絹絲蛋白水溶液與野蠶絹絲蛋白膜的制備由柞蠶絹絲或天蠶絹絲等的野蠶絹絲調(diào)制野蠶絹絲蛋白水溶液，首先，把野蠶蠶繭絲浸漬在相對(duì)于其重量為設(shè)定量的過(guò)氧化鈉水溶液中，進(jìn)行設(shè)定時(shí)間的煮沸處理，把制得的野蠶絹絲蛋白纖維溶解在溶解性高的中性鹽水溶液中。然后與家蠶絹絲時(shí)同樣地對(duì)所得的水溶液進(jìn)行透析處理，調(diào)制純的野蠶絹絲蛋白水溶液。以下，對(duì)該調(diào)制法詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明。
溶解野蠶絹絲調(diào)制野蠶絹絲蛋白水溶液，必須采用與精練家蠶絹絲膠蛋白不同的方法除去野蠶蠶繭絲表面覆蓋的絹絲膠蛋白。這是因?yàn)橐靶Q絹絲的表面除了絲膠蛋白以外還附著丹寧、由于丹寧的交聯(lián)作用使絲膠蛋白不溶化的緣故。為了除去這些的絲膠蛋白與丹寧，例如，必須將野蠶蠶繭絲浸漬在相對(duì)于蠶繭絲重量50倍重左右的0.1％過(guò)氧化鈉水溶液中，在98℃例如煮沸處理1小時(shí)。把預(yù)先除去的絲膠蛋白和丹寧的野蠶絹絲蛋白纖維溶解在硫氰酸鋰等溶解性高的中性鹽水溶液中。把該野蠶絹絲纖維的中性鹽水溶液注入纖維素制造析膜中，用縫線扎住兩端，放入室溫的自來(lái)水或純水中2～5天，完全除去鋰離子，可制得純野蠶絹絲蛋白水溶液。
將這樣制得的野蠶絹絲蛋白水溶液涂布在聚乙烯膜等的基板上，通過(guò)在室溫下進(jìn)行蒸發(fā)干燥固化可制得野蠶絹絲蛋白膜。
若來(lái)自家蠶的絹絲蛋白質(zhì)與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白質(zhì)兩者可在水溶液狀態(tài)下充分地混合，則通過(guò)使兩者的混合水溶液蒸發(fā)干燥固化可制得復(fù)合體，著眼于制得的混合膜估計(jì)呈現(xiàn)與只是家蠶絹絲或只是野蠶絹絲的材料不同的生物分解性、透明性、粘附穩(wěn)定性、其他的生物化學(xué)特性，以下對(duì)使用如上述制得的家蠶絹絲蛋白水溶液與野蠶絹絲蛋白水溶液制備家蠶絹絲蛋白與野蠶絹絲蛋白的混合膜的方法進(jìn)行說(shuō)明。(C)家蠶絹絲蛋白與野蠶絹絲蛋白的混合膜把如上述制得的家蠶絹絲蛋白水溶液與野蠶絹絲蛋白水溶液設(shè)定量地加到燒杯中，用玻動(dòng)棒小心慢慢地進(jìn)行攪拌·混合使水溶液不凝膠化。把這樣制得的混合水溶液涂布在聚乙烯膜等的基板上，通過(guò)在室溫下使之蒸發(fā)干燥固化，可制得透明的混合膜。家蠶絹絲蛋白水溶液，野蠶絹絲蛋白水溶液的濃度均優(yōu)選0.1～3重量％，最優(yōu)選0.4～2重量％。
以下所述的家蠶絹絲蛋白水溶液或野蠶絹絲蛋白水溶液與第二物質(zhì)的水溶液的混合也同樣地進(jìn)行。
再者，家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白的混合物的制造方法本發(fā)明者已進(jìn)行報(bào)道(M.Tsueada et al.，Journal of Applied PolymerScience，32，1175-1181(1994))。但該論文有關(guān)生物降解性的描述完全沒提到。(D)家蠶或野蠶絹絲蛋白與纖維素的混合膜家蠶絹絲蛋白與纖維素構(gòu)成的混合膜，如下述可通過(guò)將上述的家蠶絹絲蛋白水溶液與纖維素水溶液混合進(jìn)行制備。
首先，使家蠶絹絲蛋白纖維與沒有特別精制的市售粉末纖維素(Fluka公司制)分別溶解在銅銨水溶液([Cu(NH3)4](OH2))中，調(diào)制各自的水溶液。然后，家蠶絹絲蛋白纖維與纖維素配成設(shè)定的混合比特別小心慢慢地進(jìn)行攪拌·混合，使2種水溶液不產(chǎn)生凝膠化、沉淀、凝固反應(yīng)。把這樣制造的混合水溶液輕輕地涂布在設(shè)置成水平面的玻璃板等的基板上，在涂布的混合水溶液表面特別小心地加入由丙酮與醋酸組成的混合溶液，使家蠶絹絲蛋白與纖維素邊凝固邊除去混合水溶液中含的金屬配位化合物。然后，用甘油與水混合溶液和水進(jìn)行洗滌，通過(guò)在室溫下干燥制造絹絲蛋白與纖維素的混合膜。
野蠶絹絲蛋白的情況可與上述家蠶絹絲蛋白的情況同樣地制造混合膜。
另外，家蠶絹絲蛋白與纖維素的混合的制造方法本發(fā)明者已作了報(bào)道(G.Freddi et al.，Journal of Applied PolymerScience，Vol.56，1537-1545(1995))。但，該論文有關(guān)生物降解性的描述一點(diǎn)也沒透露。(E)家蠶或野蠶絹絲蛋白與甲殼質(zhì)、殼聚糖及殼聚糖衍生物的混合膜家蠶絹絲蛋白與甲殼質(zhì)或殼聚糖或殼聚糖衍生物構(gòu)成的混合膜，可如下述通過(guò)將家蠶絹絲蛋白水溶液與甲殼質(zhì)、殼聚糖或殼聚糖衍生物的水溶液進(jìn)行混合制備。本發(fā)明可使用的殼聚糖衍生物沒有特殊限制，例如，可以是甲殼質(zhì)、殼聚糖衍生的羧基化的羧甲基甲殼質(zhì)(以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱(CMK)、羧甲基甲殼質(zhì)的Na鹽、乙二醇?xì)ぞ厶堑取?br> 本發(fā)明用的甲殼質(zhì)可以是來(lái)自大蝦、黑蝦等海洋性甲殼類的甲殼質(zhì)，昆蟲外皮覆蓋的甲殼質(zhì)同樣地可利用。因?yàn)榧讱ゎ惢蚶ハx的外皮含有碳酸鈣等的無(wú)機(jī)物或蛋白質(zhì)，所以分離甲殼質(zhì)可用過(guò)去公知的方法除去甲殼質(zhì)以外的夾雜物。另外，為了簡(jiǎn)便起見可以使用粉末狀的甲殼質(zhì)商品(和光純藥工業(yè)有限公司制)。
為了使甲殼質(zhì)成為水溶性，首先，將粉末狀的甲殼質(zhì)懸浮在濃苛性堿(例如，氫氧化鈉等)水溶液中，減壓下攪拌設(shè)定的時(shí)間。然后，把所得的粉末甲殼質(zhì)加到含十二烷基硫酸鈉等表面活性劑的濃苛性堿水溶液中，通過(guò)攪拌，在低溫(例如，-20℃)放置一夜，或者把所得的粉末甲殼質(zhì)懸浮在液體氨中(-33℃)，通過(guò)在其中添加金屬鉀，制造甲殼質(zhì)的C6與C3位羥基的氫被鈉或鉀置換的堿性甲殼質(zhì)。壓榨這樣制得的堿性甲殼質(zhì)，使其分散在細(xì)粉碎的冰中，向其中加入二硫化碳等進(jìn)行硫化、制得甲殼質(zhì)硫化物?？捎迷摿蚧镎{(diào)制水溶液。
另外，通過(guò)使堿性甲殼質(zhì)與環(huán)氧化合物或烯丙基或堿金屬鹵化物反應(yīng)，可調(diào)制鄰烯丙基衍生物或鄰-烷基衍生物。此外，使氯乙醇(2-氯乙醇)與堿性甲殼質(zhì)反應(yīng)可調(diào)制乙二醇甲殼質(zhì)或者使氯乙酸與堿性甲殼質(zhì)反應(yīng)可調(diào)制鄰-(羧甲基)甲殼質(zhì)。在濃苛性堿水溶液(例如，40％氫氧化鈉水溶液)中設(shè)定的反應(yīng)條件下(例如，100℃5小時(shí))邊攪拌乙二醇甲殼質(zhì)邊反應(yīng)，甲殼質(zhì)分子上的乙酰胺基被水解成游離的氨基，可制得水溶性的乙二醇?xì)ぞ厶?。含這種乙二醇?xì)ぞ厶呛?，殼聚糖容易溶解在酸水溶液，例如濃度范圍寬的醋酸水溶液中?br> 把在上述乙二醇?xì)ぞ厶撬芤褐刑砑蛹倚Q絹絲蛋白水溶液制的混合水溶液涂布在聚乙烯膜等的上面，使之蒸發(fā)干燥固化，可制造乙二醇?xì)ぞ厶桥c家蠶絹絲蛋白的透明且柔軟膜狀的復(fù)合體(混合膜)。在用其他的殼聚糖衍生物的水溶液或水溶性的殼聚糖的水溶液代替乙二醇?xì)ぞ厶菚r(shí)，也同樣地可制造混合膜。
野蠶絹絲蛋白時(shí)，也與上述家蠶絹絲的情況同樣地制造混合膜。(F)家蠶或野蠶絹絲蛋白與羊毛角蛋白的混合膜。
本發(fā)明可利用的是羊毛角蛋白纖維為代表，以及如下述調(diào)制的角蛋白水溶液與5-羧甲基角蛋白(CMK)水溶液。這些的水溶液可用過(guò)去公知的方法調(diào)制。
首先，為了溶解羊毛纖維，在氮?dú)猸h(huán)境中，使用還原劑(例如，巰基乙醇、硫甘醇酸等)切斷分子間的Cys鍵，將角蛋白還原進(jìn)行可溶化。使用巰基乙醇時(shí)，可在尿素溶液中進(jìn)行還原處理。此時(shí)，尿素的濃度一般是7.5～8.8M、優(yōu)選是7.8～8M。而使用硫甘醇酸時(shí)可添加1-4％的NaCl。
例如，使用作為還原劑作用的巰基乙醇時(shí)，將羊毛纖維浸漬在上述濃度的尿素水溶液中，脫氣后，在氮?dú)猸h(huán)境下，45℃以下，優(yōu)選20～25℃的溫度，相對(duì)于10g的羊毛纖維按3～5ml的比例加入巰基乙醇，進(jìn)行設(shè)定時(shí)間(例如，約3小時(shí))的攪拌。這樣羊毛角蛋白分子被還原，獲得有SH基的角蛋白。然后將其加到纖維素制的透析膜中，用縫線扎住兩端，在純水中充分透析，除去尿素、過(guò)量的巰基乙醇，獲得羊毛角蛋白水溶液。這種羊毛角蛋白水溶液，作為本發(fā)明的第二物質(zhì)的水溶液，可與上述同樣地利用。
另外，再把如上述制得有SH基的羊毛角蛋白與烷基化劑，例如，(置換)烷基鹵化物等的已知烷基化劑反應(yīng)，成為S-(置換)烷基角蛋白，則該水溶液也可在本發(fā)明中利用。該烷基化可按照公知的方法進(jìn)行。作為一例，對(duì)作為烷基化劑使用碘乙酸的情況進(jìn)行說(shuō)明。在上述的還原角蛋白中。氮?dú)猸h(huán)境下，20～25℃的溫度，邊攪拌，邊加入相對(duì)于10g的羊毛纖維按10～17g的比例加入碘乙酸(分子量185.95)。1～2小時(shí)后，把pH調(diào)節(jié)到大約8.5，在純水中進(jìn)行透析除去過(guò)量的碘乙酸、獲得S-羧甲基角蛋白水溶液。
在如上述調(diào)制的還原角蛋白水溶液或S-羧甲基角蛋白水溶液中添加家蠶絹絲蛋白水溶液，調(diào)制混合水溶液，把該混合水溶液涂布在聚乙烯膜等的基板上，進(jìn)行干燥固化，可制造還原角蛋白或S-羧甲基角蛋白與家蠶絹絲蛋白構(gòu)成的混合膜。
野蠶絹絲蛋白的情況，也與上述家蠶絹絲蛋白的情況同樣地可制造混合膜。(G)家蠶或野蠶絹絲蛋白與聚乙烯醇的混合膜把聚乙烯醇(PVA.和光純藥工業(yè)有限公司制，平均聚合度約2000)放到熱水中，用攪拌裝置小心仔細(xì)地使其溶解、調(diào)制設(shè)定濃度的PVA水溶液(例如，0.5重量％的PVA水溶液)。在該P(yáng)VA水溶液中加入適當(dāng)量家蠶絹絲蛋白水溶液，在室溫下靜置30分鐘以上，調(diào)制家蠶絹絲蛋白與聚乙烯醇的復(fù)合水溶液。將該復(fù)合水溶液涂布在聚乙烯膜等的基板上，用一晝夜的時(shí)間蒸發(fā)水分后，可制成由PVA與家蠶絹絲蛋白構(gòu)成的透明混合膜。
野蠶絹絲蛋白的情況，也與上述家蠶絹絲蛋白的情況同樣地可制得混合膜。
再者，PVA與家蠶絹絲蛋白的混合物的制造方法，本發(fā)明者已作了報(bào)道(M.Tsukada et al.，Journal of Applied Polymer Science，32，243-248(1994))。但是，該論文有關(guān)生物降解性的描述完全沒有提到。
如上所述，來(lái)自家蠶的絹絲蛋白質(zhì)、來(lái)自野蠶的絹絲蛋白質(zhì)、第二物質(zhì)在水溶液狀態(tài)下充分地混合，可由該混合水溶液制造混合膜。該混合膜可呈現(xiàn)與只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白或只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的材料不同的生物降解性、透明性(光線透過(guò)性)、細(xì)胞增殖性、其他的生物化學(xué)特性?；旌夏み€具有良好的金屬離子吸附性或耐剝離性。這種情況由家蠶絹絲蛋白水溶液、野蠶絹絲蛋白水溶液、第二物質(zhì)的水溶液制得混合膜，各種水溶液的濃度若是上述的0.1～5重量％，優(yōu)選是0.4～3重量％的范圍，則可制得質(zhì)量上均勻的混合膜。再者，家蠶絹絲蛋白水溶液與野蠶絹絲蛋白水溶液、家蠶絹絲蛋白水溶液或野蠶絹絲蛋白水溶液與第二物質(zhì)的水溶液由于可用任意的比例混合，故可根據(jù)要求任意設(shè)定復(fù)合體的組成比。
為了將家蠶絹絲蛋白與野蠶絹絲蛋白，或者家蠶絹絲蛋白水溶液或野蠶絹絲蛋白水溶液與第二物質(zhì)水溶液進(jìn)行混合，可以用玻璃棒將這些的水溶液小心輕輕地進(jìn)行攪拌·混合。2液混合激烈、或攪拌狀態(tài)過(guò)于激烈時(shí)，對(duì)絹絲蛋白分子施予剪切應(yīng)力，使水溶液產(chǎn)生凝固，有時(shí)不能均勻混合。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，可以是片狀或膜狀，也可以是粉末狀、球珠狀、凝膠狀、纖維狀、管狀或中空纖維等任意的形態(tài)。
本發(fā)明中，生物降解性生物體高分子材料的生物降解性，可用含設(shè)定濃度蛋白質(zhì)水解酶的緩沖液通過(guò)一定時(shí)間的處理來(lái)評(píng)價(jià)。即，使用把具有設(shè)定活性的酶溶解在設(shè)定的緩沖液中調(diào)制的酶分解水溶液，在37℃進(jìn)行一定時(shí)間的酶分解處理，進(jìn)行消化(加水分解)。由試料的重量變化求生物降解性生物體高分子材料被酶消化的程度，對(duì)生物降解程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。
該加水分解的程度，由于所用酶的種類、酶濃度、酶分解處理時(shí)間、或被處理材料的不同影響很大。另外，材料也因絹蛋白質(zhì)纖維或絹蛋白質(zhì)膜的不同而有很大差別。蠶制造的絹蛋白質(zhì)纖維具有纖維結(jié)構(gòu)，由于纖維分子間的氫鍵密度大，所以即使放到水解酶水溶液中也很難分解。因此，絹蛋白質(zhì)纖維可直接作為生物降解實(shí)驗(yàn)用的試料使用。另一方面，作為纖維一旦在中性鹽中溶解調(diào)制的絹蛋白質(zhì)膜的絹絲蛋白膜等，吸水后膨潤(rùn)，最后溶解掉。生物降解實(shí)驗(yàn)為了搞清在含酶緩沖液中的分解行為，由于所調(diào)制的絹絲蛋白膜不能直接做生物降解實(shí)驗(yàn)，所以為了作為實(shí)驗(yàn)試料使用必須進(jìn)行水不溶化處理。為了成為水不溶性，例如，通過(guò)在甲醇、乙醇等醇的水溶液中進(jìn)行浸漬處理，或者可通過(guò)使用過(guò)去公知的環(huán)氧化物、甲醛水等的醛進(jìn)行。例如，通常在20～80％甲醇水溶液中浸漬5～10分鐘、優(yōu)選在40～60％甲醇中浸漬5～10分鐘可以進(jìn)行水不溶化。具體的例如，可在50％v/v甲醇水溶液等中室溫下浸漬處理1分鐘以上，在室溫下風(fēng)干。
另外，除絹絲蛋白膜以外，在蒸發(fā)干燥固化過(guò)程中剛制得的復(fù)合體基本上在水中可溶。通常許多使用情況希望是水不溶性，所以這種情況可用甲醇處理成為水不溶性。家蠶絹絲蛋白與纖維素的復(fù)合體或家蠶絹絲蛋白與聚乙烯醇的復(fù)合體，剛制得時(shí)是水可溶性。通過(guò)對(duì)該復(fù)合體進(jìn)行甲醇處理，絹絲蛋白成為水不溶化，纖維素成分或聚乙烯醇成分在甲醇中變成水不溶性。對(duì)這樣的復(fù)合體可用甲醛水等有強(qiáng)度交聯(lián)作用的試劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。
本發(fā)明中，作為蛋白質(zhì)水解酶(消化酶)可利用任意的酶?；|(zhì)的切斷部位可以是搞清楚的酶，切斷部位也可以是不能特定的酶均同樣地可利用。本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，例如，使用蛋白酶、膠原酶、胰凝乳蛋白酶等進(jìn)行生物降解。如上所述，用這些的酶評(píng)價(jià)生物降解性，優(yōu)選使用設(shè)定pH的緩沖液使之可最大限度地維持酶活性。酶降解用的酶與緩沖液的組合沒有特殊限定。作為酶與緩沖液的理想組合，例如、有膠原酶中有50ml TES(緩沖液)或50mM CaCl2(pH7.4)，胰凝乳蛋白酶中有50mM Tris(緩沖液)或5mM CaCl2(pH7.8)，蛋白酶中有40mM磷酸鈣(緩沖液)(pH7.5)等。緩沖液優(yōu)選使用低離子強(qiáng)度的硼酸緩沖液，其pH范圍大致是pH7～8。
水解酶水溶液的濃度，依賴于作為基質(zhì)的蛋白質(zhì)的種類，通常是0.1～0.8mg/ml、優(yōu)選是0.2～0.5mg/ml.酶濃度不滿0.1mg/ml時(shí)水解效率不好，而超過(guò)0.8mg/ml時(shí)不能進(jìn)行經(jīng)濟(jì)性的生物降解實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明者中的1人，首先用蛋白酶使溶解家蠶絹絲蛋白纖維制作的家蠶絹絲蛋白膜與家蠶絹絲進(jìn)行生物降解，搞清了經(jīng)時(shí)生物降解行為(Minoura et al.，Biomaterials，1990，Vol 11(8月)，430-434)。判明該家蠶絹絲蛋白膜在蛋白酶溶液中大量地進(jìn)行水解，而家蠶絹絲不進(jìn)行水解。然而，在具有與該家蠶絹絲化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同的一次結(jié)構(gòu)的絹蛋白質(zhì)中有來(lái)自野蠶的絹材料，對(duì)野蠶絹絲或野蠶絹絲蛋白膜的生物降解性并沒有報(bào)道。
根據(jù)本發(fā)明，用已知方法將單一家蠶絹絲蛋白水溶液、單一野蠶絹絲蛋白水溶液、家蠶絹絲蛋白水溶液與野蠶絹絲蛋白水溶液的混合水溶液，或者家蠶絹絲蛋白水溶液或野蠶絹絲蛋白水溶液與纖維來(lái)等第二物質(zhì)的水溶液組成的混合水溶液凍結(jié)干燥可制得粉未狀的生物降解性生物體高分子材料。即，在-10℃左右使這些的水溶液凍結(jié)后，通過(guò)在減壓環(huán)境下放置除去試料的水分，可制得粉末狀材料。另外，通過(guò)使上述各試料水溶液的pH成為酸性范圍、例如pH4.4以下，使水溶液全部凝固進(jìn)行凝膠化可制凝膠狀的生物降解性生物體高分子材料。通過(guò)將上述各試料水溶液涂布在玻璃板或聚乙烯膜等的基板上，用一定時(shí)間使水分蒸發(fā)可制得膜狀的生物降解性生物體高分子材料。
上述的粉末狀、凝膠狀、膜狀的生物降解性生物體高分子材料任一種均是水可溶性材料，所以要根據(jù)要求制成水不溶性，可通過(guò)如上述在醇的水溶液中進(jìn)行浸漬處理。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料受水解酶的作用進(jìn)行生物降解的容易程度，取決于酶濃度、緩沖液、水解時(shí)間、水不溶化程度、及家蠶絹絲蛋白含有率。因此，易生物降解的材料若使對(duì)水的不溶化程度成為輕微地水可溶性時(shí)，可通過(guò)使家蠶絹絲蛋白的含量增多制得。沒有如絹絲蛋白膜的纖維結(jié)構(gòu)的絹絲材料與絹絲蛋白纖維不同容易受酶的水解。尤其是，復(fù)合體(混合物)易生物降解的程度，由于取決于家蠶絹絲蛋白或野蠶絹絲蛋白不溶化的程度、作為第二物質(zhì)選擇哪種化合物、或家蠶絹絲蛋白或野蠶絹絲蛋白與第二物質(zhì)的組成比、酶的種類、酶濃度、處理時(shí)間，所以可按照期望的目的適當(dāng)?shù)馗淖兓旌衔锏闹圃鞐l件、組成比或生物降解條件實(shí)施。
通過(guò)使對(duì)生物體組織親合性好而對(duì)蛋白質(zhì)水解酶難分解的有機(jī)高分子(第二物質(zhì))與絹絲蛋白混合化，可制得生物體適合性好的生物降解性生物體高分子材料。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，可以是蛋白酶、膠原酶、胰凝乳蛋白酶等酶的作用成為基質(zhì)的材料之間的混合，也可以是使不能成為基質(zhì)的第二物質(zhì)與可成為基質(zhì)的高分子材料混全化的材料?？沙蔀檫@3種類酶進(jìn)行作用的基質(zhì)的蛋白質(zhì)有家蠶絹絲蛋白、野蠶絹絲蛋白、羊毛角蛋白。不能成為基質(zhì)的纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、聚乙烯醇等的天然高分子與可成為這些基質(zhì)的材料進(jìn)行混合化時(shí)，如果混合物中天然高分子的含量增多，則存在生物降解量逐漸減少的傾向。
例如，家蠶絹絲蛋白與纖維素所構(gòu)成膜狀混合物的情況，由于家蠶絹絲蛋白容易被蛋白質(zhì)分解酶分解，所以家蠶絹絲蛋白的含有率愈多愈容易控制生物降解程度。然而，家蠶絹絲蛋白對(duì)纖維素酶卻成為與此相反的結(jié)果。纖維素含量愈多，整體生物降解量降低。這樣通過(guò)改變成為酶基質(zhì)的蛋白質(zhì)與不能成為基質(zhì)的第二物質(zhì)的比例，可制造符合要求的生物降解率的生物降解性生物體高分子材料。
作為本發(fā)明可利用的生物體高分子沒有特殊限制，如上所述，可以是來(lái)自家蠶、野蠶的絹蛋白質(zhì)(例如，絹絲蛋白、絹絲膠蛋白)或來(lái)自動(dòng)物的角蛋白(羊毛角蛋白)、膠原、明膠。例如，可以用來(lái)自家蠶或桑蠶的絹蛋白質(zhì)，或來(lái)自作為野蠶的天蠶、柞蠶、石楠蠶、橒蠶的絹蛋白質(zhì)。也可以是來(lái)自家蠶、野蠶的絲纖維、絹絲纖維制品或其纖維集合體，或動(dòng)物纖維的角蛋白纖維、角蛋白纖維制品。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料可作為金屬離子吸附材料有效使用。尤其是將本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料的這種復(fù)合體(混合物)浸漬在含銀離子、銅離子、鈷離子等的抗菌性金屬離子的水溶液中，由于大量吸附這種金屬離子、所以吸附金屬離子的復(fù)合體可作為抗菌性材料使用。另外，若把這種生物降解性生物體高分子材料浸漬在廢水中，由于吸附廢水中的各種金屬離子(例如，Cu2+、Ni2+、Vo2+、Zn2+、Co2+、Al3+等價(jià)廉金屬、以及Yb、Nb、Pr、La等的稀土類元素)，故作為廢水中金屬離子的吸附材料使用。被吸附的金屬離子可適當(dāng)回收、或進(jìn)行廢棄處理。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分材料，尤其是使復(fù)合體包覆或固定水溶性的醫(yī)藥品或生理活性物質(zhì)等有用物質(zhì)的材料，例如，植入生物體內(nèi)時(shí)，通過(guò)體液中的蛋白質(zhì)分解酶等作用，可將該材料水解性地邊進(jìn)行分解·降解、邊慢慢釋放出醫(yī)藥品或藥理成分。因此，可把這種材料作為有用物質(zhì)的緩釋性載體使用。此時(shí)，為了使生物降解性變得輕微，可以使用來(lái)自家蠶或野蠶的絹絲蛋白纖維，為了成為易分解性材料，可用在中性鹽中溶解家蠶絹絲或野蠶絹絲，再用纖維素制透析膜將其脫鹽的水溶液干燥固化制得的膜狀試料。因?yàn)榧倚Q絹絲蛋白膜比野蠶絹絲蛋白膜容易生物降解，所以要制成生物降解難的家蠶絹絲蛋白與野蠶絹絲蛋白的復(fù)合體，可以增加野蠶絹絲蛋白含量。
如上所述的本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，尤其是將復(fù)合體植入生物體內(nèi)使用時(shí)，在借助蛋白酶、膠原酶、胰凝乳蛋白酶等體內(nèi)所有在酶的作用下，最后分解成水和二氧化碳等的低分子排到體外。與易生物降解的家蠶絹絲的混合膜，與難生物降解的家蠶絹絲蛋白纖維不同，即使植入生物體內(nèi)也具有在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行生物降解的性質(zhì)，所以用于可修復(fù)的損傷生體組織治愈的暫時(shí)補(bǔ)助，或如上所述的也可作為藥物的釋放載體使用。這樣的生物體內(nèi)降解吸收性材料可在切開創(chuàng)傷部縫合、止血、骨固定、組織再生用腳手架、防止粘連等用途方面使用。
通過(guò)使家蠶絹絲蛋白或野蠶絹絲蛋白與第二物質(zhì)進(jìn)行混合，發(fā)現(xiàn)在混合物(復(fù)合體)表面，出現(xiàn)單一家蠶絹絲蛋白或單一野蠶絹絲蛋白的表面或單一第二物質(zhì)表面所沒有的良好生物化學(xué)特性的顯著效果。例如，生體細(xì)胞的增殖率，復(fù)合體表面的特性比單一家蠶絹絲蛋白、單一野蠶絹絲蛋白、或單一第二物質(zhì)的表面優(yōu)異。另外，通過(guò)在家蠶絹絲蛋白中混合野蠶絹絲蛋白，或者在家蠶絹絲蛋白或野蠶絹絲蛋白中混合纖維素等的第二物質(zhì)，可比單一家蠶絹絲蛋白或單一野蠶絹絲蛋白膜成型性、透明性提高，同時(shí)成為細(xì)胞附著性好的材料。此外，復(fù)合體耐磨損性也高，而且復(fù)合體表面生體細(xì)胞的增殖性比單一蛋白質(zhì)的情況提高，所以也可作為生物領(lǐng)域的細(xì)胞增殖基材利用。
另外，由于纖維素衍生物也用于食品添加劑、化妝品、醫(yī)藥品添加劑、抗血栓劑之類的醫(yī)藥品、所以家蠶絹絲蛋白與纖維素構(gòu)成的復(fù)合體可期待與纖維素同樣的用途。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，還具有可作為一次性衛(wèi)生材料制品或家庭用品、堵水材料、土壤改良劑、防結(jié)露劑、農(nóng)業(yè)園藝用保水劑等吸水性樹脂利用的吸水特性，不經(jīng)過(guò)復(fù)雜的工序便可廉價(jià)地提供具有這種生物降解性的吸水性材料。因此，可適用于過(guò)去所知的吸水性樹脂的全部用途。例如，紙尿布或生理用品所代表的衛(wèi)生領(lǐng)域、貼附劑用途等醫(yī)療領(lǐng)域、作為廢泥凝膠化劑等的土木、建筑領(lǐng)域、食品領(lǐng)域、工業(yè)領(lǐng)域、作土壤改良劑或保水劑的農(nóng)業(yè)、園藝領(lǐng)域等多種多樣的領(lǐng)域均可利用。
以下，通過(guò)實(shí)施例與比較例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明不受這些例子的限定。再者，以下表示的％，若沒有特殊說(shuō)明則是重量％。
首先，對(duì)各種試驗(yàn)方法進(jìn)行說(shuō)明。
(1)機(jī)械性能的測(cè)定使用島津制Instron(Autograph AGS-5D)，在被測(cè)定試料長(zhǎng)50mm、拉伸速度10mm/分、全刻度圖表(chart full scale)250g的測(cè)定條件下，測(cè)定切斷時(shí)絹絲的強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率的值。再者，測(cè)定值意味著重復(fù)20次試驗(yàn)的平均值。
(2)金屬離子在生物降解性生物體高分子材料上的吸附性與定量方法將被測(cè)定試料在含硝酸鉀的0.5mM的金屬鹽水溶液(加氨水將pH調(diào)節(jié)到11.4)中室溫下浸漬30小時(shí)使試料吸附金屬離子。再者，金屬離子在試料上的吸附通過(guò)在金屬鹽水溶液(pH調(diào)節(jié)到8.5)中的浸漬進(jìn)行。
用Perkin-Elmer公司制的等離子體原子吸收光譜分析儀(ICP-AES)分析被測(cè)定試料吸附的金屬離子。使用微波水解爐(MDS-81DCCEM)用2ml的65％硝酸將5～10mg的試料完全水解，實(shí)驗(yàn)時(shí)再加10ml的水，進(jìn)行ICP-AES分析。金屬離子的吸附量用mmol表示單位試料重量的金屬離子量。
(3)酶降解處理把生物降解處理實(shí)驗(yàn)用的酶溶解在最適于水解的緩沖液中。將其加到滅過(guò)菌的100ml玻璃制燒杯中，投入被測(cè)定試料后，在37℃進(jìn)行設(shè)定時(shí)間的酶降解處理。不論酶的有、無(wú)，進(jìn)行一定時(shí)間處理后的生物降解程度均用重量殘留率表示。生物降解實(shí)驗(yàn)前后的試料重量分別為W1、W2，重量殘留率用{(W1-W2)/W1}×100％表示。
因此，所謂“重量殘留率”是表示水解后的試料殘留重量相對(duì)于生物降解前的試料重量的百分比。該值愈小意味著試料水解后大量地減少重量，容易受生物降解。
(4)生物降解速度對(duì)用酶將被測(cè)定試料水解時(shí)的水解速度的程度如下地進(jìn)行評(píng)價(jià)。生物降解實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的試料重量為100，把生物降解開始50小時(shí)后被生物降解的試料重量表示為％的數(shù)作為生物降解速度。因此，愈是容易被酶引起物生降解的試料，生物降解速度的值愈大。
(5)傅里葉變換紅外吸收光譜用Perkin-Elmer公司制的FT-IR(傅里葉變換紅外吸收光譜)測(cè)定裝置，觀察有關(guān)被測(cè)定試料分子形態(tài)的吸收光譜。測(cè)定波數(shù)是2000-400cm-1，測(cè)定重復(fù)次數(shù)是20次。
(6)耐磨損試驗(yàn)
作為摩擦試驗(yàn)裝置使用學(xué)振型染色物摩擦堅(jiān)牢度試驗(yàn)機(jī)II型，把用各種絹絲蛋白質(zhì)等的薄膜試料被覆的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜固定在該摩擦試驗(yàn)機(jī)上，荷重500g的摩擦件往復(fù)運(yùn)動(dòng)10次，進(jìn)行摩擦試驗(yàn)使安裝在摩擦件上的試料與試驗(yàn)臺(tái)上的試料在一定的荷重下輕輕地磨合。測(cè)定試料安在摩擦試驗(yàn)機(jī)上前后的FT-IR光譜，評(píng)價(jià)吸收峰的吸收波數(shù)。摩擦處理后FT-IR的吸收強(qiáng)度減少的情況評(píng)價(jià)為PET膜表面上的試料薄膜容易剝離。
(7)家蠶絹絲蛋白膜的結(jié)晶度指數(shù)對(duì)用各種酶進(jìn)行水解的家蠶絹絲蛋白膜的結(jié)晶度指數(shù)，用以下的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。作為傅里葉變換紅外吸收光譜(FT-IR)，使用ATR金剛石件(SPECAC)裝備的Nicolet Instruments，Madison，WI制的Nicolet-150p測(cè)定裝置。IR光譜分別測(cè)定酰胺III譜帶的波數(shù)1230cm-1和1260cm-1的峰強(qiáng)度，用下式求結(jié)晶度指數(shù)(CI)。再者，因?yàn)镃I是強(qiáng)度比對(duì)應(yīng)的數(shù)值，沒有單位。
CI＝I[1230cm-1]/I[1260cm-1](8)氨基酸分析進(jìn)行與各種生物降解時(shí)間相應(yīng)的蛋白質(zhì)材料的氨基酸分析。被測(cè)定試料使用在105℃用6N鹽酸水解24小時(shí)的試料。氨基酸分析用RP-HPLC進(jìn)行。
(9)對(duì)植物性病原細(xì)菌的抗菌性試驗(yàn)作為植物性病原細(xì)菌，是普遍的植物性病原細(xì)菌的代表，容易出現(xiàn)耐性菌，是侵害許多植物的多犯性腐敗病菌，在植物性病原細(xì)菌中作為為數(shù)不多的革蘭氏陽(yáng)性菌選西紅柿腐爛病細(xì)菌(學(xué)名Corynebacteriummichiganese pv.michiganese)，用對(duì)復(fù)合體膜的植物病原細(xì)菌增殖帶來(lái)的防礙效果進(jìn)行抗菌性評(píng)價(jià)。
用下述的方法進(jìn)行對(duì)實(shí)施例中細(xì)菌的抗菌活性評(píng)價(jià)。
對(duì)細(xì)菌的抗菌活性檢定法將加熱溶解后保持在55℃的半合成脅本培養(yǎng)基或金氏B培養(yǎng)基25ml與檢定菌(濃度109/ml)2ml進(jìn)行混合，把該混合物通入玻璃皿中固化成平板狀。在該菌液混合平板培養(yǎng)基上放置約1cm正方形的試料膜，使試料全部貼合在培養(yǎng)基上。將其保持在20～25℃，對(duì)每經(jīng)過(guò)設(shè)定時(shí)間檢定試料附近培養(yǎng)基中菌增殖阻礙程度，用mm單位實(shí)測(cè)試料周圍出現(xiàn)的阻止圓的大小，由阻止圓尺寸的變化評(píng)價(jià)抗菌活性的有無(wú)、優(yōu)劣。
(10)昆蟲細(xì)胞的增殖試驗(yàn)用含蠶的粉末體液(日本農(nóng)產(chǎn)工業(yè)公司制)5％、牛胎兒血清5％(Gibco公司制)的Grace培養(yǎng)基(Sigma公司G8142)與含1％青霉素·鏈霉素混合抗生物質(zhì)的培養(yǎng)基，進(jìn)行來(lái)自柞蠶的Ae細(xì)胞，或來(lái)自家蠶的Bm細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)狀況用血球計(jì)算板法觀察第二天細(xì)胞培養(yǎng)液中的昆蟲細(xì)胞，觀察絹絲蛋白含有量不同的各種復(fù)合體表面的Ae細(xì)胞與Bm細(xì)胞的增殖狀態(tài)。
(11)分子量測(cè)定使生物降解用的纖維試料或膜狀試料在少量的50％(W/V)硫氰酸鋰水溶液中40℃下溶解30分鐘。然后，用50mM的磷酸鈉緩沖液，pH7.2的0.15M氯化鉀水溶液，再用5M尿素水溶液進(jìn)行稀釋，用相同的緩沖液透析48小時(shí)，用Spectrum公司制的纖維素制透析膜(Spectra/por6，MW10＝3.5KDa)進(jìn)行透析。透析后加蒸餾水直到絹絲蛋白濃度為1mg/ml，立刻用0.2μm的多孔過(guò)濾器過(guò)濾，用Size exclusion質(zhì)譜分析儀進(jìn)行分析。水色譜系統(tǒng)(Waters chromatograghic system)備有裝載溫度控制裝置的泵(mod.510)、注射器(mod.U6K)、折射測(cè)量器(mod.410)。該系統(tǒng)裝載質(zhì)譜軟件(Maxima 820(Waters))和GPC隨機(jī)軟件。在色譜柱溫度30℃下進(jìn)行測(cè)定。所用的色譜柱使用Shodex Protein kW-8.4(Waters8×300mm)，用親水性O(shè)H基被覆的多孔硅膜(precolumn，Shodex ProteinKW-G 6×50mm)。注入量50～100ml，流出速度0.5mK/分。流動(dòng)相用蒸餾水、50mM磷酸鈉緩沖液、pH7.2的0.15M氯化鉀、5M的尿素，或者不用進(jìn)行分析。
分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識(shí)器用HMW與LMW凝膠過(guò)濾修正用附件(PharmaciaBiotech.)。再者，用254nm進(jìn)行UV檢測(cè)。
分子量測(cè)定相關(guān)的用語(yǔ)說(shuō)明如下。
分子量是重均分子量，是通過(guò)對(duì)熔融分離曲線包圍的面積進(jìn)行積分求出的分子量的值，依賴于試料中具有各種分子量的肽整體的結(jié)果。
峰分子量是與熔融分離曲線的峰位置相對(duì)應(yīng)的分子量，符合試料中存在的最大多數(shù)肽的分子量。此時(shí)沒考慮分子量分布。(實(shí)施例1家蠶絹絲蛋白水溶液與家蠶絹絲蛋白膜的制造)首先，把家蠶蠶繭絲放入含絲光皂0.2％與碳酸鈉0.05％的混合水溶液中，在98℃煮沸30分鐘，除去家蠶蠶繭絲外層膠著的絲膠蛋白，調(diào)制絹絲蛋白纖維。把所得絹絲蛋白纖維10g浸漬在8.5M溴化鋰水溶液中，在55℃以上處理15分鐘使絹絲蛋白纖維溶解。把該中性鹽水溶液注入纖維素制的透析膜中，用縫線扎住兩端，放入5℃的自來(lái)水中2天完全除去鋰離子，調(diào)制純的家蠶絹絲蛋白水溶液。從該絹絲蛋白水溶液中蒸發(fā)掉一部分水，或者加入水，調(diào)制濃度不同的絹絲蛋白水溶液，在以下的實(shí)施例中使用。
把這樣制得的家蠶絹絲蛋白水溶液涂布在聚乙烯膜的上面，在室溫下使之蒸發(fā)干燥固化制備家蠶絹絲蛋白膜。(實(shí)施例2柞蠶絹絲蛋白水溶液與柞蠶絹絲蛋白膜的調(diào)制)首先，把柞蠶蠶繭絲浸漬在相對(duì)于其重量50倍量的0.1％過(guò)氧化鈉水溶液中，在98℃處理1小時(shí)，除去覆蓋柞蠶蠶繭絲周圍的絹絲膠蛋白與丹寧，調(diào)制柞蠶絹絲蛋白纖維。把預(yù)先除去絹絲膠蛋白或丹寧的柞蠶絲蛋白纖維溶解于硫氰酸鋰水溶液中，把該溶液注入纖維素制透析膜中，用縫線扎住兩端，放到室溫的自來(lái)水中2天，完全除去鋰離子，調(diào)制純的柞蠶絹絲蛋白水溶液。
把這樣制得的柞蠶絹絲蛋白水溶液涂布在聚乙烯膜的上面，在室溫下使之蒸發(fā)干燥固化調(diào)制柞蠶絹絲蛋白膜。(實(shí)施例3家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白的混合膜)把實(shí)施例1與實(shí)施例2制得的家蠶絹絲蛋白水溶液與柞蠶絹絲蛋白水溶液的設(shè)定量加到燒杯中，用玻璃棒十分小心輕輕地進(jìn)行攪拌·混合，使水溶液不凝膠化(沉淀)。把這樣制得的混合水溶液涂布在聚乙烯膜的上面，在室溫下使其蒸發(fā)干燥固化調(diào)制透明的混合膜。
家蠶絹絲蛋白水溶液、柞蠶絹絲蛋白水溶液的濃度，兩者均是0.1～3重量％的范圍。若是該范圍內(nèi)，調(diào)制混合膜時(shí)的水溶液量適度，可有效地進(jìn)行作業(yè)。還有，可均勻地進(jìn)行2液的混合，其結(jié)果可制造質(zhì)量均勻的混合膜。(實(shí)施例4家蠶絹絲蛋白與纖維素的混合膜)首先，把家蠶絹絲蛋白纖維與沒特別精制的市售品的粉末纖維素(Fluka公司制)、分別溶解在銅銨溶液([Cu(NH3)4](OH2))中，調(diào)制各自的水溶液。然后將2種的水溶液輕輕地?cái)嚢琛せ旌?，使家蠶絹絲纖維與纖維的重量比為80/20，60/40、40/60、20/80。把這樣制得的混合水溶液涂布在設(shè)置成水平的玻璃板上，在所涂布的混合水溶液表面十分小心地加由丙酮與醋酸組成的混合溶液(4∶1(V/V))，使家蠶絹絲蛋白與纖維素邊凝固邊除去混合水溶液中含的金屬配位化合物。然后，用甘油與水的混合溶液(7∶13(V/V))與水進(jìn)行洗滌，在室溫下干燥，制造家蠶絹絲蛋白與纖維素的混合膜，所得膜的膜厚是大約10～30μm。(實(shí)施例5家蠶絹絲蛋白與甲殼質(zhì)、殼聚糖衍生物的混合膜)將實(shí)施例1制得的家蠶絹絲蛋白水溶液與作為第二物質(zhì)的甲殼質(zhì)或殼聚糖衍生物的水溶液進(jìn)行混合，調(diào)制家蠶絹絲蛋白與第二物質(zhì)甲殼質(zhì)、殼聚糖衍生物的混合膜。
首先，把粉末狀的甲殼質(zhì)懸浮在42％氫氧化鈉水溶液中，減壓下攪拌4小時(shí)。然后，把所得的粉末甲殼質(zhì)加到含十二烷基硫酸鈉的60％氫氧化鈉水溶液中，攪拌，在-20℃放置一夜，或者，通過(guò)把所得粉末甲殼質(zhì)懸浮在液體氨中(-33℃)，再向其中添加金屬鉀，制造烷基甲殼質(zhì)。壓榨這樣制得的烷基甲殼質(zhì)。分散在細(xì)粉碎的冰中，向其中加入二硫化碳進(jìn)行硫化，制得甲殼質(zhì)硫化物。該硫化物的水溶液作為第二物質(zhì)的水溶液使用。
另外，使烷基甲殼質(zhì)與氯乙醇(2-氯乙醇)在已知的反應(yīng)條件下反應(yīng)調(diào)制乙二醇甲殼質(zhì)，使該甲殼質(zhì)在40％氫氧化鈉溶液中100℃下攪拌5小時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，制得水溶性的乙二醇甲殼質(zhì)。使該乙二醇甲殼質(zhì)溶解于醋酸水溶液中作為第二物質(zhì)的水溶液使用。
然后，在上述制得的硫化物水溶液與乙二醇甲殼質(zhì)水溶液中分別添加按照實(shí)施例1調(diào)制的家蠶絹絲蛋白水溶液，調(diào)制混合水溶液。把該混合液涂布在聚乙烯膜的上面，使之蒸發(fā)干燥固化，制造甲殼質(zhì)硫化物與乙二醇甲殼質(zhì)分別與家蠶絹絲蛋白的透明且柔軟的膜狀復(fù)合體。(實(shí)施例6家蠶絹絲蛋白與羊毛角蛋白的混合膜)為了溶解羊毛纖維，在氮?dú)猸h(huán)境中，用巰基乙醇或硫甘醇酸切斷分子間的Cys鍵，將角蛋白分子還原進(jìn)行可溶化。使用巰基乙醇時(shí)，在8M濃度的尿素溶液中進(jìn)行還原處理，使用硫甘醇酸時(shí)，添加4％的NaCl進(jìn)行還原處理。
即，把羊毛纖維浸漬在8M濃度的尿素水溶液中，脫氣后，在氮?dú)猸h(huán)境下，25℃的溫度下，相對(duì)于10g的羊毛纖維添加巰基硫醇5ml，攪拌3小時(shí)，使羊毛角蛋白分子還原制得有SH基的羊毛角蛋白。然后，用純水透析、除去尿素、過(guò)量的巰基乙醇，制得羊毛角蛋白水溶液。該羊毛角層蛋白水溶液作為第二物質(zhì)的水溶液使用。
另外，在如上述制得的還原羊毛角蛋白10g中，氮?dú)猸h(huán)境下，25℃的溫度下，邊攪拌邊加入15g的磺乙酸使之反應(yīng)。2小時(shí)后，把pH調(diào)節(jié)到大約8.5，將其注入纖維素制透析膜中，用縫線扎住兩端，通過(guò)用純水進(jìn)行透析降去過(guò)量的磺乙酸。制得S-羧甲基角蛋白水溶液。該水溶液作為第二物質(zhì)的水溶液使用。
在這樣調(diào)制的還原羊毛角蛋白水溶液與S-羧甲基角蛋白水溶液中分別添加按照實(shí)施例1調(diào)制的家蠶絹絲蛋白水溶液，調(diào)制混合水溶液。把該混合水溶液涂布在聚乙烯膜的上面，干燥固化后，制得還原角蛋白與S-羧甲基角蛋白分別與家蠶絹絲蛋白構(gòu)成的混合膜。(實(shí)施例7家蠶絹絲蛋白與聚乙烯醇的混合膜)把聚乙烯醇(PVA)加到85℃的熱水中，用攪拌裝置小心仔細(xì)地使之溶解，在室溫下靜置30分鐘以上，制得0.5％的PVA水溶液。在該P(yáng)VA水溶液中加入按照實(shí)施例1調(diào)制的0.3重量％的家蠶絹絲蛋白水溶液，把制得的混合水溶液涂布在聚乙烯膜的上面，放置一晝夜使水分蒸發(fā)，制造PVA與家蠶絹絲蛋白構(gòu)成的透明混合膜。(實(shí)施例8絹絲蛋白膜對(duì)PET膜的耐剝離性)用以下的方法使絹絲蛋白膜粘附在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)(商品名Tetoron(滌特綸))膜表面。在按照實(shí)施例1調(diào)制的5％的家蠶絹絲蛋白(BF)水溶液、按照實(shí)施例2調(diào)制的3％柞蠶絹絲蛋白(TF)水溶液、或該5％的家蠶絹絲蛋白(BF)水溶液與5％柞蠶絹絲蛋白(TF)水溶液的等量混合水溶液中浸漬上述滌特綸，然后取出，在室溫進(jìn)行干燥。對(duì)各種膜(簡(jiǎn)稱PET/BF、PET/TF、PET/(BF+TF))測(cè)定ATR(AtenuatedTotal Reflection)光譜。該ATR光譜測(cè)定使用日本分光公司制的ATR紅外分光光度計(jì)(FT-IR5300)進(jìn)行(用分辨物2，掃描次數(shù)32、增益100、Apdization CS)。另外，用摩擦試驗(yàn)機(jī)，使摩擦件在膜試料上往復(fù)運(yùn)動(dòng)10次后，再測(cè)定膜試料的ATR光譜。把有關(guān)摩擦試驗(yàn)前的試料所得的結(jié)果示于表1。
表1

表1中，v s.s.w分別意味著光譜的強(qiáng)度非常強(qiáng)、強(qiáng)、弱。
由表1可以看出，PET/BF的ATR光譜中，歸屬PET的吸收(1408、1338cm-1)和歸屬家蠶絹絲蛋白的吸收(1657、650cm-1)重復(fù)出現(xiàn)。而在PET/TF的ATR光譜中，除了歸屬PET的吸收外還重復(fù)出現(xiàn)歸屬柞蠶絹絲蛋白的吸收(1655、620cm-1)，使摩擦件往復(fù)運(yùn)動(dòng)10次后的PET/BF與PET/TF的ATR光譜與粘附這些絹絲蛋白膜前的PET本身的光譜相同。
以上的結(jié)果表明，PET/BF、PET/TF置于摩擦試驗(yàn)上時(shí)，在摩擦件往復(fù)之間PET表面的BF或TF被剝落掉。然而，PET/(BF+TF)的情況，置于摩擦試驗(yàn)機(jī)上，除了歸屬PET的吸收光譜外，還殘存歸屬BF的吸收光譜與歸屬TF的吸收光譜。由此表明BF+TF牢固地粘附在PET的表面，即使是摩擦件機(jī)械摩擦也難以剝落。
另外，在單一家蠶或柞蠶絹絲蛋白水溶液，和家蠶絹絲蛋白水溶液與柞蠶絹絲蛋白水溶液成為特定的組成比，在室溫下用玻璃棒十分小心仔細(xì)地輕輕攪拌混合所得混合水溶液的各種水溶液中，將2cm×3cm尺寸的PET膜在25℃浸漬10分鐘。然后，取出被覆的PET膜，在室溫下使其干燥，為了使PET膜表面的絹絲蛋白質(zhì)膜不溶化，將被覆的PET膜在50％甲醇水溶液中浸漬5分鐘，取出在室溫干燥，對(duì)這樣制得的處理膜與不進(jìn)行上述不溶化處理的膜時(shí)同樣地進(jìn)行ATR光譜的分析測(cè)定。
其結(jié)果確認(rèn)，單一家蠶絹絲蛋白膜的情況，除了基于PET膜的吸收外，還有家蠶絹絲蛋白膜的吸收，另外，單一柞蠶絹絲蛋白膜的情況，除了基于PET膜的吸收外，還有柞蠶絹絲蛋白膜的吸收，而，混合膜的情況，除了基于PET的吸收外，還有家蠶絹絲蛋白膜與柞蠶絹絲蛋白膜的吸收。這意味著家蠶絹絲蛋白膜、柞蠶絹絲蛋白膜、混合膜已被覆在PET膜的表面上。
然后，使用PET膜表面用家蠶絹絲蛋白膜、柞蠶絹絲蛋白膜、及家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白的混合膜被覆的被覆膜，采用上述方法評(píng)價(jià)各被覆膜對(duì)PET膜的耐剝離性。
其結(jié)果，單一家蠶絹絲蛋白膜、單一野蠶絹絲蛋白膜的情況，顯示稍易剝落的傾向，而混合膜的情況難剝落，顯示膜的粘附穩(wěn)定性好的傾向。說(shuō)明PET膜表面與混合膜(BF+TF膜)的相互作用比PET膜表面與BF膜的相互作用及PET膜表面與TF膜的相互作用強(qiáng)。即，說(shuō)明單一BF或單一TF膜與PET膜通過(guò)機(jī)械磨耗易剝離，而BF和TF的混合膜與PET膜由于強(qiáng)的相互作用在起作用，故難剝離。(實(shí)施例9復(fù)合膜表面的細(xì)胞增殖性)對(duì)按照實(shí)施例1、2與3分別調(diào)制的家蠶絹絲蛋白膜(BF膜)、柞蠶絹絲蛋白膜(TF膜)及混合膜(BF+TF膜)，按照上述方法觀察家蠶細(xì)胞(Bm細(xì)胞)與柞蠶細(xì)胞(Ae細(xì)胞)的增殖狀態(tài)。所得的結(jié)果，兩種細(xì)胞都出現(xiàn)相同的傾向。將Bm細(xì)胞的結(jié)果示于表2。
表2

表2中，±意味著細(xì)胞增殖程度與對(duì)照區(qū)的聚苯乙烯表面大致相同或稍好。+意味道著目視觀察細(xì)胞增殖程度比聚苯乙烯表面好。
由表2看出，用BF與TF的混合膜被覆培養(yǎng)基表面時(shí)表面的細(xì)胞增殖狀態(tài)比用家蠶絹絲蛋白膜(BF膜)與野蠶絹絲蛋白膜(TF膜)被覆培養(yǎng)基表面時(shí)表面的昆蟲細(xì)胞增殖狀態(tài)好。(實(shí)施例10最佳生物降解條件)本實(shí)施例的目的是確定以下實(shí)施例中的最佳生物降解條件。這是因?yàn)楸仨氝x擇緩沖液，調(diào)節(jié)pH等才能即使改變酶的種類或濃度也能最大限度地保持酶活性的緣故。
評(píng)價(jià)酶對(duì)生物降解性生物體高分子材料的降解行為用的最佳條件如下。把酶、酶活性與最佳的緩沖液pH等的最佳條件匯于表3。生物降解溫度為37℃。作為酶使用胰凝乳蛋白酶、膠原酶與蛋白酶三類。緩沖液量為生物體材料的250倍，研究了570小時(shí)以內(nèi)的生物降解行為。用每1ml培養(yǎng)液的酶重量mg表示酶濃度。胰凝乳蛋白酶、膠原酶(F型)、以及蛋白酶都使用Sigma Aldrich日本有限公司制的酶。
用膠原酶進(jìn)行生物降解實(shí)驗(yàn)用的緩沖液，使用TES(N-三(羥基甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(和光純藥工業(yè)有限公司制)，使用胰凝乳蛋白酶時(shí)的緩沖液用三(羥基甲基)氨基甲烷(2-氨基-2-羥基甲基-1，3-丙二醇，和光純藥工業(yè)有限公司制)，而使用蛋白酶時(shí)的緩沖液用磷酸鉀。
表3

(實(shí)施例11)本實(shí)施例研究家蠶絹絲蛋白膜或柞蠶絹絲蛋白膜的生物降解行為。
把家蠶的蠶繭層切斷成1/4尺寸，用乙醇/苯的混合溶液(體積比1∶2)，用索克斯累特(Soxhlet)提取器除去試料中含的蠟、色素。然后，把蠶繭絲試料加到絲光皂0.2％、碳酸鈉0.05％的混合溶液中，在98℃煮沸30分鐘，除去蠶繭絲外層的膠粘物質(zhì)的絲膠蛋白。此時(shí)，試料與混合溶液的比設(shè)為1∶100。把這樣調(diào)制的家蠶絹絲蛋白纖維10g浸漬在8.5M的溴化鋰水溶液中，在55℃以上處理15分鐘，使絹絲蛋白質(zhì)纖維溶解。把該中性鹽水溶液注入纖維素制的透析膜中，用縫線扎住兩端，在室溫的純水中放4天，完全除去鋰離子，調(diào)制濃度0.2％的家蠶絹絲蛋白水溶液。
另外，把來(lái)自柞蠶的柞蠶繭絲，浸漬在相對(duì)于蠶繭絲重量50倍量的0.1％過(guò)氧化鈉水溶液中，在98℃處理1小時(shí)除去絲膠蛋白與丹寧。使除去絲膠蛋白與丹寧的柞蠶絹絲蛋白纖維溶解于55℃的硫氰酸鋰水溶液中，注入纖維素制透析膜中，用線扎住兩端，用純水透析，調(diào)制濃度0.3％的柞蠶絹絲蛋白水溶液。
把如上述調(diào)制的0.2的家蠶絹絲蛋白水溶液與0.3％的相等蠶絹絲蛋白水溶液分別涂布在聚乙烯膜的上面，在室溫下干燥固化，調(diào)制家蠶絹絲蛋白膜(BF膜)、柞蠶絹絲蛋白膜(TF膜)。
對(duì)如上述調(diào)制的家蠶絹絲蛋白膜與柞蠶絹絲蛋白膜，研究各種酶的生物降解行為與生物降解時(shí)間(0、24、72、240、576小時(shí))的關(guān)系。把試料相對(duì)于生物降解時(shí)間的重量殘留率(％)的結(jié)果示于表4。還有，酶濃度設(shè)為0.2與0.5mg/ml的2個(gè)區(qū)。
表4

表4中的酶濃度是用mg表示每1ml生物降解培養(yǎng)基中加的酶量。
由表4看出，家蠶絹絲蛋白膜使用蛋白酶易受水解作用，在蛋白酶濃度0.2mg/ml的生物降解實(shí)驗(yàn)中，生物降解時(shí)間是576小時(shí)時(shí)試料重量殘留率為54.5％。而使相同濃度的蛋白酶作用的柞蠶絹絲蛋白膜試料的重量殘留率在生物降解時(shí)間是576小時(shí)時(shí)為86.2％。說(shuō)明家蠶絹絲蛋白膜在蛋白酶的作用下比柞蠶絹絲蛋白膜容易水解。(實(shí)施例12結(jié)晶度指數(shù))家蠶絹絲蛋白膜進(jìn)行生物降解時(shí)，隨著生物降解的經(jīng)過(guò)時(shí)間，膜的重量發(fā)生變化或進(jìn)行水解反應(yīng)。本實(shí)施例為了搞清在這種生物降解過(guò)程中家蠶絹絲蛋白膜自身有什么樣的微細(xì)結(jié)構(gòu)的變化而研究膜的結(jié)晶度。
對(duì)用各種酶進(jìn)行設(shè)定時(shí)間生物降解的家蠶絹絲蛋白膜，按照上述方法求出結(jié)晶度指數(shù)(CI)。再者，CI沒有單位。將所得結(jié)果示于表5。
表5

由表5看出，在采用酶的水解反應(yīng)中，家蠶絹絲蛋白膜的非晶部分流出，其結(jié)果結(jié)晶范圍增加。(實(shí)施例13絹絲的生物降解行為)與實(shí)施例11同樣地根據(jù)試料的重量殘留率研究家蠶絹絲與柞蠶絹絲的生物降解行為。將所得結(jié)果示于表6。
表6

由表6的結(jié)果看出，從重量殘留率的觀點(diǎn)看，不論是家蠶絹絲還是柞蠶絹絲基本上都不生物降解。但，在生物降解過(guò)程中，除重量變化外，還進(jìn)行微細(xì)結(jié)構(gòu)變化，老化的可能性。而且，如以下所述，從強(qiáng)度與伸長(zhǎng)率方面對(duì)生物降解過(guò)程中家蠶絹絲的老化進(jìn)行了研究。
在含蛋白酶、膠原酶、胰凝乳蛋白酶各種酶的培養(yǎng)基中加入家蠶絹絲進(jìn)行設(shè)定時(shí)間的生物降解，測(cè)定各經(jīng)過(guò)時(shí)間生物降解后的絹絲強(qiáng)度與伸長(zhǎng)率。將所得結(jié)果示于表7。
表7

表7中，酶后的( )內(nèi)表示酶濃度，代表每1ml培養(yǎng)基的酶量(mg)。另外，由家蠶絹絲的強(qiáng)度單位(N)變換成kg，按照式(強(qiáng)度的值)/9.8換算。表中，例如4.68N相當(dāng)于477.1g。
由表7可以看出，家蠶絹絲隨著生物降解時(shí)間的經(jīng)過(guò)其強(qiáng)度，伸長(zhǎng)率都降低。表6的結(jié)果中粗觀察似乎沒有生物降解，但家蠶絹絲通過(guò)生物降解在進(jìn)行老化。(實(shí)施例14混合膜的生物降解性)對(duì)按照實(shí)施例3調(diào)制的家蠶絹絲蛋白(BF)與柞蠶絹絲蛋白(TF)的混合膜試料，與按照實(shí)施例4調(diào)制的家蠶絹絲蛋白(BF)與纖維素(Cell)的混合膜試料，研究用蛋白酶進(jìn)行水解時(shí)的生物降解時(shí)間與試料重量殘留率(％)的關(guān)系。將所得結(jié)果示于表8。
表8

表8中“酶的有無(wú)”欄中，寫為記號(hào)“無(wú)”的區(qū)意味著用不含蛋白酶只由緩沖液組成水溶液的降解實(shí)驗(yàn)，寫為記號(hào)“有”的區(qū)意味著用含蛋白酶和緩沖液的酶降解水溶液的降解實(shí)驗(yàn)。另外，BF∶TF(4∶6)意味著家蠶絹絲蛋白水溶液與柞蠶絹絲蛋白水溶液混合使之含家蠶絹絲蛋白40％、柞蠶絹絲蛋白60％，將其干燥固化制得的混合膜，BF∶Cell(8∶2)意味著使之含家蠶絹絲蛋白80％，纖維素20％調(diào)制的混合膜。
由表8看出，家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白的混合膜(BF∶TF膜)中，通過(guò)增加柞蠶絹絲蛋白含量，混合膜整體難生物降解。另外，家蠶絹絲蛋白與纖維素構(gòu)成的混合膜(BF∶Cell)中纖維素含量增加也難生物降解。(實(shí)施例15家蠶絹絲蛋白與羊毛角蛋白的混合膜)首先，如下地調(diào)制羊毛角蛋白水溶液。
用苯/乙醇(50/50容體％)的混合溶劑，使用索克斯累特提取器處理2.5小時(shí)除去美利奴(Merino)羊毛(64’S)中含的色素、脂肪成分。
準(zhǔn)備三口燒瓶，在其中的一個(gè)口連接通過(guò)三通閥來(lái)自干燥氮?dú)怃撈康南鹉z管，在另一個(gè)口經(jīng)常插入調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH用的pH電極，在剩余的口作為投入所需藥劑利用，將切斷成為纖維長(zhǎng)度約1cm的8.18g美利奴種羊毛纖維投入三口燒瓶中，再加入450ml的8M尿素水溶液。用氮?dú)庵脫Q，用抽氣器15分鐘的時(shí)間將三口燒瓶?jī)?nèi)減壓到45mmHg程度，然后迅速返回到大氣壓，將這種操作重復(fù)3-4次。這樣完全除去三口燒瓶?jī)?nèi)羊毛纖維間含的空氣。使之有效地進(jìn)行尿素水溶液與角蛋白分子的反應(yīng)。氮?dú)庵脫Q結(jié)束后，在三口燒瓶?jī)?nèi)加入4.8ml的巰基乙醇作為還原劑，在8M尿素水溶液中放置2～3小時(shí)。然后，一點(diǎn)一點(diǎn)地加約100ml的5N KOH水溶液，將三口燒瓶?jī)?nèi)的混合水溶液的pH調(diào)節(jié)到10.5。在室溫下用3小時(shí)等待羊毛纖維完全溶解。溶解的纖維狀態(tài)羊毛纖維的部分是角蛋白水溶液。將該角蛋白水溶液注入纖維素透析膜，用線扎住兩端，用純水透析2天。對(duì)制得的角蛋白水溶液送風(fēng)干燥，或根據(jù)需要加入純水，調(diào)到設(shè)定濃度的角蛋白水溶液。
在如上述調(diào)制的0.01％的角蛋白水溶液450ml中室溫下加入9.5g的碘乙酸，進(jìn)行角蛋白的S-羧甲基化反應(yīng)1小時(shí)。用5N的KOH水溶液將角蛋白水溶液的pH調(diào)節(jié)到8.5，制得S-羧甲基角蛋白水溶液。把該水溶液注入纖維素制透析膜，用線扎住兩端，在純水中透析2天。(實(shí)施例16家蠶絹絲蛋白膜與家蠶絹絲的重均分子量)將家蠶絹絲蛋白膜與家蠶絹絲進(jìn)行酶降解，充分水洗，對(duì)干燥的試料進(jìn)行HPLC測(cè)定，求重均分子量，將所得結(jié)果示于表9。
表9

表9中的酶欄的( )內(nèi)是酶濃度，所謂0.2意味著每1ml培養(yǎng)基含酶0.2mg。
由表9看出，家蠶絹絲蛋白膜，隨著酶處理時(shí)間的經(jīng)過(guò)，分子量從12萬(wàn)D逐漸降低。即，通過(guò)膠原酶、蛋白酶的作用，在生物降解時(shí)間408小時(shí)時(shí)，重均分子量大約為9.4萬(wàn)D、10萬(wàn)D，而通過(guò)胰凝乳蛋白酶的作用，在相同生物降解時(shí)間內(nèi)重均分子量從12萬(wàn)D變?yōu)?.4萬(wàn)D，確認(rèn)進(jìn)行急劇的低分子化。未處理的家蠶絹絲的分子量大約是23萬(wàn)D，即使受酶作用，重均分子量的降低也輕微。(實(shí)施例17隨生物降解處理的重均分子量變化)把按照實(shí)施例1調(diào)制的家蠶絹絲蛋白膜用膠原酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶三種酶進(jìn)行設(shè)定時(shí)間(72、240、408小時(shí))水解后，充分水洗調(diào)制試料。評(píng)價(jià)各個(gè)生物降解經(jīng)過(guò)時(shí)間的水解試料的重均分子量與峰分子量。還有，重均分子量采用高速液相色譜儀(HPLC)進(jìn)行測(cè)定，將所得結(jié)果示于表10。
表10

表10中，酶欄的( )內(nèi)的時(shí)間表示生物降解的經(jīng)過(guò)時(shí)間。
由表10可以看出，家蠶絹絲蛋白膜受酶的作用時(shí)，其重均分子量從12萬(wàn)D隨生物降解時(shí)間的經(jīng)過(guò)而降低，但生物降解時(shí)間72小時(shí)以后的變化變小。尤其是，膠原酶與胰凝乳蛋白酶的場(chǎng)合，重均人子量與峰分子量隨生物降解時(shí)間的經(jīng)過(guò)降低。另一方面，蛋白酶的場(chǎng)合，雖然重均分子量隨生物降解時(shí)間的經(jīng)過(guò)降低，但其降低的程度小，而峰分子量出現(xiàn)與胰凝乳蛋白酶相同程度的降低。(比較例1家蠶絹絲隨生物降解的分子量變化)用高速液相色譜儀對(duì)用膠原酶、胰凝乳蛋白酶與蛋白酶將家蠶絹絲進(jìn)行水解，家蠶絹絲試料的分子量隨生物降解時(shí)間的經(jīng)過(guò)進(jìn)行如何變化進(jìn)行評(píng)價(jià)。將所得結(jié)果示于表11。
表11

表11中的酶欄的( )內(nèi)的時(shí)間表示生物降解的經(jīng)過(guò)時(shí)間。
由表11可以看出，家蠶絹絲為家蠶絹絲蛋白膜的情況(實(shí)施例17)相比，即使酶作用也難以引起重均分子量與峰分子量的降低。因此絹不適用于要求生物降解的用途，作為生物降解性的材料，家蠶絹絲蛋白膜或柞蠶絹絲蛋白膜等優(yōu)異。(實(shí)施例18生物降解速度)對(duì)家蠶絹絲與柞蠶絹絲、按照實(shí)施例1調(diào)制的家蠶絹絲蛋白膜(BF膜)、按照實(shí)施例2調(diào)制的柞蠶絹絲蛋白膜(TF膜)、按照實(shí)施例3調(diào)制的家蠶絹絲蛋白/柞蠶絹絲蛋白構(gòu)成的混合膜(BF+TF膜)、按照實(shí)施例4調(diào)制的家蠶絹絲蛋白/纖維素構(gòu)成的混合膜(BF+Cell膜)、以及按照上述方法調(diào)制的家蠶絹絲蛋白/羧甲基甲殼質(zhì)構(gòu)成的混合膜(BF+CMK膜)，試算出膠原酶或胰凝乳蛋白酶進(jìn)行水解時(shí)的生物降解速度。將所得結(jié)果示于表12。再者，所謂生物降解速度是生物降解50小時(shí)后的試料重量除生物降解前的重量的值表示為％的結(jié)果。因此，試料完全不生物降解時(shí)，生物降解速度是0％/50小時(shí)。
表12

表12中，BF∶TF與BF∶Cell分別表示家蠶絹絲蛋白(BF)與柞蠶絹絲蛋白(TF)的混合膜，及家蠶絹絲蛋白(BF)與纖維素(Cell)的混合膜。各()內(nèi)的數(shù)值表示BF與TF的組成比及BF與Cell的組成比分別是100/0、80/20、60/40、40/60、20/80、0/100。
由表12可以看出，家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白構(gòu)成的混合膜用蛋白酶進(jìn)行生物降解時(shí)，含柞蠶絹絲蛋白60-80％的混合膜，與實(shí)施例13所示試料的重量殘留率的情況同樣地，從生物降解速度方面看實(shí)質(zhì)上也不發(fā)生生物降解。是單一家蠶絹絲蛋白或單一柞蠶絹絲蛋白所見不到的性質(zhì)。(實(shí)施例19形態(tài)不同的復(fù)合體)把家蠶絹絲蛋白水溶液與柞蠶絹絲蛋白水溶液的混合水溶液加到燒杯中，一點(diǎn)一點(diǎn)少量地向其中加入稀醋酸水溶液，將水溶液整體的pH調(diào)節(jié)到2.5，調(diào)制家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白的凝膠狀物。
另外，這樣制得的凝膠狀物不除去水分，按公知的方法凍結(jié)干燥，調(diào)制家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白的多孔體。
此外，把家蠶絹絲蛋白水溶液與柞蠶絹絲蛋白水溶液的混合水溶液涂布在聚乙烯膜的上面，蒸發(fā)水分干燥固化，制造透明的復(fù)合膜。
此外，還在家蠶絹絲蛋白水溶液與柞蠶絹絲蛋白水溶液的混合水溶液中加入醋酸，把pH調(diào)整到3.0后，按照公知的方法凍結(jié)干燥，制得家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白構(gòu)成的混合粉末。(實(shí)施例20氨基酸分析)家蠶絹絲蛋白膜用蛋白酶水解，進(jìn)行生物降解試料的氨基酸分析，研究氨基酸分析的結(jié)果與生物降解時(shí)間的關(guān)系。將所得結(jié)果示于表13。表13中，氨基酸殘基的量用mol％單位表示。
表13

表13中，所謂合計(jì)是用mol％表示氨基酸分析求出的全部的氨基酸殘基的合計(jì)。所謂合計(jì)-1意味道著構(gòu)成結(jié)晶領(lǐng)域的Gly、Ala、Ser的合計(jì)，而所謂合計(jì)-2意味著Glu、Asp等的酸性氨基礎(chǔ)酸殘基(Acid)、Lys、Arg、Hist等的堿性氨基酸殘基(Basic)以及其他的氨基酸的合計(jì)。
由表13可以看出，生物降解處理的家蠶絹絲蛋白膜的氨基酸分析中出現(xiàn)明了的一定的傾向。即，絹絲蛋白作為構(gòu)成結(jié)晶領(lǐng)域的主要氨基酸的Gly、Ala、Ser的合計(jì)量隨水解處理時(shí)間逐漸增加，而Tyr、酸性氨基酸與堿性氨基酸等的體積大極性側(cè)鏈的氨基酸的合計(jì)量減少。因此，進(jìn)行生物降解處理時(shí)，絹絲蛋白的氨基酸組成如上述從向類似于構(gòu)成結(jié)晶領(lǐng)域的組成變化來(lái)看，估計(jì)酶對(duì)絹絲蛋白作用，首先，對(duì)酶容易浸入的非結(jié)晶領(lǐng)域作用引起水解。酶難浸入的結(jié)晶領(lǐng)域生物降解后依然殘存，結(jié)晶性氨基酸向主要的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化。(實(shí)施例21金屬離子的吸附)作為按照上述金屬離子的吸附方法調(diào)制的金屬鹽水溶液，使用0.5mM的硝酸銀(AgNO3)水溶液與硝酸銅(Cu(NO3)2)水溶液。在各水溶液中，25℃下浸漬按照實(shí)施例1調(diào)制的家蠶絹絲蛋白膜(BF膜)、按照實(shí)施例2調(diào)制的柞蠶絹絲蛋白膜(TF膜)、按照實(shí)施例3調(diào)制的家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白的復(fù)合膜(重量比80∶20與50∶50的BF+TF膜)30分鐘，使之吸附銀離子、銅離子，測(cè)定各試料吸附的金屬離子量。
另外，評(píng)價(jià)吸附上述吸附銀離子的各種生物降解性高分子膜對(duì)西紅柿腐爛病細(xì)菌的抗菌活性。
將有關(guān)所得金屬離子吸附量及抗菌活性的結(jié)果示于表14。
表14

由表14看出，家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白復(fù)合的情況吸附金屬離子比單一家蠶絹絲蛋白、單一柞蠶絹絲蛋白的情況多，其結(jié)果可有效地阻止植物病原細(xì)菌的增殖。這樣，絹絲蛋白的復(fù)合物可作為金屬吸附體，或作為抗菌性材料利用。熔融，加入0.02％由合成例(1)或(2)得到的有機(jī)錫催化劑，攪拌均勻后，倒入涂有脫模劑的模具中，按150℃/1h+180℃/3h+200℃/2h的固化工藝進(jìn)行固化，最后在250℃后固化2h，得到厚度為4mm的平板狀固化樹脂，性能列于下表。

表16

由表16可以看出，從吸光度的增加量隨生物降解時(shí)間經(jīng)過(guò)的變化來(lái)看，說(shuō)明含乙酰水楊酸的復(fù)合多孔體，比含乙酰水楊酸的單一家蠶絹絲蛋白或單一柞蠶絹絲蛋白的多孔體長(zhǎng)時(shí)間地緩釋藥物。這表明復(fù)合膜有藥物緩釋功能。(實(shí)施例24復(fù)合膜的FT-IR)對(duì)按照實(shí)施例1調(diào)制的家蠶絹絲蛋白膜(BF膜)、按照實(shí)施例2調(diào)制的柞蠶絹絲蛋白膜(TF膜)、按照實(shí)施例3調(diào)制的家蠶絹絲蛋白與柞蠶絹絲蛋白構(gòu)成的復(fù)合膜(BF+TF膜)、實(shí)施例18用的家蠶絹絲蛋白與羧甲基甲殼質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合膜(BF+CMK膜)、柞蠶絹絲蛋白與羧甲基甲殼質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合膜(TF+CMK膜)、單一CMK的膜、家蠶絹絲蛋白與聚乙烯醇構(gòu)成的復(fù)合膜(BF+PVA膜)進(jìn)行FT-IR測(cè)定。研究波數(shù)2000-500cm-1范圍出現(xiàn)的吸收光譜的波數(shù)位置。將所得結(jié)果示于表17。再者，也有省略吸收光譜強(qiáng)度微少的情況。
表17

表17中，TF+CMK(2∶8)意味著柞蠶絹絲蛋白與羧甲基甲殼質(zhì)混合成20∶80重量比調(diào)制的復(fù)合膜。而，BF+PVA(2∶8)意味著家蠶絹絲蛋白與聚乙烯醇混合成20∶80重量比調(diào)制的復(fù)合膜。
由表17可以看出，家蠶絹絲蛋白與第二物質(zhì)的復(fù)合體、野蠶絹絲蛋白與第二物質(zhì)的復(fù)合體的IR光譜，在家蠶絹絲蛋白、野蠶絹絲蛋白、野蠶絹絲蛋白與第二物質(zhì)的復(fù)合體中，只重復(fù)出現(xiàn)2類構(gòu)成成分的光譜，不出現(xiàn)構(gòu)成成分以外的光譜。這暗示在家蠶絹絲蛋白與第二物質(zhì)的之間不產(chǎn)生新的鍵。
以上的情況，在家蠶或野蠶絹絲蛋白、與纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白、聚乙烯醇等組成的第二物質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體中，家蠶或野蠶絹絲蛋白與第二物質(zhì)都沒有化學(xué)鍵、共價(jià)鍵形成的鍵，保有兩成分的分子間的氫鍵形成的凝聚作用。這是因?yàn)檎{(diào)制復(fù)合體時(shí)，不僅考慮各水溶液急激地混合不凝固，而且靜置，根據(jù)要求輕輕攪拌使兩分子不凝聚的水溶液涂布在基板表面上，不用特殊的交聯(lián)劑只進(jìn)行蒸發(fā)干燥固化而形成的復(fù)合體的緣故。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，是昆蟲生物體高分子的單一家蠶絹絲蛋白、單一野蠶絹絲蛋白、或者家蠶或野蠶的絹絲蛋白與從纖維素、羊毛角蛋白、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物及聚乙烯醇中選出的至少一種化合物的第二物質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體，這些材料的生物降解控制是可能的。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，在生物降解處理實(shí)驗(yàn)中首先必須進(jìn)行水不溶化處理，但也可用甲醛或環(huán)氧化物等過(guò)去公知的蛋白質(zhì)的分子間交聯(lián)劑。而，絹絲蛋白質(zhì)膜在甲醇、乙醇等的醇水溶液中輕輕浸漬處理后，通過(guò)室溫下進(jìn)行干燥等的簡(jiǎn)單處理則復(fù)合體成為水不溶性。
混合物易生物降解的程度由于取決于家蠶絹絲蛋白膜或野蠶絹絲蛋白膜的不溶化程度，作為第二物質(zhì)選用何種的化合物、或者家蠶或野蠶絹絲蛋白與第二物質(zhì)的組成比、酶的種類、酶濃度、處理時(shí)間，所以可根據(jù)要求適當(dāng)改變混合的制造條件、組成比、或者生物降解條件實(shí)施。
通過(guò)第二物質(zhì)與家蠶或野蠶絹絲蛋白進(jìn)行混合估計(jì)混合物表面出現(xiàn)單一家蠶或野蠶絹絲蛋白的表面或單一第二物質(zhì)的表面所沒有的良好生物化學(xué)特性的顯著效果。例如，混合物表面的生體細(xì)胞增殖率比單一家蠶絹絲蛋白或單一第二物質(zhì)變好。另外，通過(guò)使用混合材料，被覆PET等一般有機(jī)高分子表面的被覆性能好，皮膜的耐機(jī)械磨損性能提高。
使本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料包含水溶性的醫(yī)藥品或藥理成分等的有用物質(zhì)時(shí)，生物降解性生物體高分子材料不僅在體內(nèi)被生物降解，而且可慢慢緩釋醫(yī)藥品或藥理成分，所以這種材料可作為緩釋性材料使用。
要使生物降解性小，可使用來(lái)自家蠶或野蠶的絹絲蛋白纖維，要成為易降解的材料，可使用家蠶絹絲或野蠶絹絲用中性鹽溶解，用纖維素透析膜將其脫鹽的水溶液干燥固化制得的膜狀試料。因?yàn)榧倚Q絹絲蛋白膜比野蠶絹絲蛋白膜容易生物降解，所以要制成生物降解難的家蠶絹絲蛋白與野蠶絹絲蛋白的復(fù)合體，可以使增加野蠶絹絲蛋白含量。
在生物體內(nèi)植入本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料體時(shí)，在體內(nèi)存在的蛋白酶等酶的作用下，最終分解成水和二氧化碳等的低分子，最后排泄到體外。易生物降解的家蠶絹絲蛋白膜與難生物降解的家蠶絹絲蛋白纖維不同，因?yàn)榫哂兄踩肷矬w內(nèi)也在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行生物降解的性質(zhì)，所以可用于暫時(shí)性輔助治愈可修復(fù)的損傷生體組織，或者如上述也可用于藥物的緩釋化。吸收性材料可用于切開創(chuàng)傷部分縫合、止血、骨固定、組織再生用腳手架、防止粘連等的用途。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，由于利用蛋白質(zhì)分解酶水解性地進(jìn)行分解降解，所以使生物降解性生物體高分子包覆或固定醫(yī)藥品、生理活性物質(zhì)等有用物質(zhì)的材料植入生物體時(shí)，生物體高分子不僅利用體液所含的酶進(jìn)行分解，而且也可作為緩釋醫(yī)藥品等的緩釋載體利用。
由于纖維素衍生物也有效用于食品添加劑、化妝品、醫(yī)藥品添加劑、抗血栓劑之類的醫(yī)藥品，所以可期待家蠶絹絲蛋白與纖維素構(gòu)成的復(fù)合體與纖維素同樣的用途。另外，采用使家蠶絹絲蛋白混合纖維素的方法，尤其是可改善干燥時(shí)的家蠶絹絲蛋白的機(jī)械特性。此外，使家蠶或野蠶絹絲蛋白混合纖維素等的第二物質(zhì)，可比單一家蠶或野蠶絹絲蛋白膜提高成型性或透明性，同時(shí)成為細(xì)胞粘附性良好的材料。
家蠶絹絲蛋白膜采用蛋白酶比較容易生物降解。因此，通過(guò)將該家蠶絹絲蛋白與難生物降解的野蠶絹絲蛋白混合，可比單一家蠶絹絲蛋白膜易控制生物降解程度，而且可提高膜形成性、透明性。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子膜，可用簡(jiǎn)單的處理控制生物降解程度。另外，混合物由于牢固附著在第二物質(zhì)表面，耐磨損性也高，基質(zhì)表面所被覆的材料表面生體細(xì)胞的增殖性也比單一蛋白質(zhì)提高，所以作為生物領(lǐng)域可利用的細(xì)胞增殖基材使用。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料浸漬在含有抗菌性金屬離子水溶液中時(shí)，由于大量吸附這種金屬離子，所以吸附金屬離子的材料可作為抗菌性纖維材料使用。另外，該生物降解性生物體高分子材料浸漬在廢水中時(shí)，由于吸附廢水中的金屬離子，故也可作為吸附廢水中金屬離子的纖維材料使用。
本發(fā)明的生物降解性生物體高分子材料，還具有可作為一次性衛(wèi)生材料制品或家庭用品、堵水材料、土壤改良材料、防結(jié)露劑、農(nóng)園藝用保水劑等的吸水性樹脂利用的吸水特性，可不經(jīng)過(guò)復(fù)雜的工序而廉價(jià)地提供具有這類生物降解性的吸水性材料。因此，可適用于過(guò)去已知吸水性樹脂的全部用途。例如，可在紙尿布或生理衛(wèi)生用品所代表的衛(wèi)生領(lǐng)域、貼附劑用途等的醫(yī)療領(lǐng)域、作為廢泥凝膠化劑等的土木·建筑領(lǐng)域、食品領(lǐng)域、工業(yè)領(lǐng)域、作土壤改良劑或保水劑的農(nóng)業(yè)·園藝領(lǐng)域等多種多樣領(lǐng)域中利用。
權(quán)利要求
1.生物降解性生物體高分子材料，其特征在于，由只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的復(fù)合體、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的任一種與從纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白與聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的復(fù)合體構(gòu)成。
2.權(quán)利要求1所述的生物降解性生物體高分子材料，其特征在于前述生物降解性生物體高分子材料是使用由蛋白酶、膠原酶、胰凝乳蛋白酶中選出的酶進(jìn)行生物降解的高分子材料。
3.權(quán)利要求1或2所述的生物降解性生物體高分子材料，其特征在于前述生物降解性生物體高分子材料具有纖維狀、膜狀、粉末狀、凝膠狀、多孔狀的形態(tài)。
4.生物降解性生物體高分子材料的制造方法，其特征在于，是將只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液的混合水溶液、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液的任一種的水溶液與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的水溶液的混合水溶液涂布在基板上，使之蒸發(fā)干燥固化，制造膜狀生物降解性生物體高分子材料的方法，該混合水溶液的情況時(shí)，在使各水溶液進(jìn)行混合的水溶液彼此之間進(jìn)行混合時(shí)，通過(guò)攪拌不產(chǎn)生凝膠化、沉淀、凝固反應(yīng)而均勻地混合進(jìn)行調(diào)制。
5.生物降解性生物體高分子材料的制造方法，其特征在于，是使只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液的混合水溶液，或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液的任一種水溶液與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的水溶液的混合水溶液凍結(jié)后，在減壓環(huán)境下使之干燥，獲得粉末狀生物降解性生物體高分子材料的生物降解性生物體高分子材料的制造方法，該混合水溶液的情況時(shí)，在使各水溶液進(jìn)行混合的水溶液彼此之間進(jìn)行混合時(shí)，通過(guò)攪拌不產(chǎn)生凝膠化、沉淀、凝固反應(yīng)而均勻地混合進(jìn)行調(diào)制。
6.生物降解性生物體高分子材料的制造方法，其特征在于，將只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液的混合水溶液、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白的水溶液與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的水溶液的任一種水溶液與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的水溶液的混合水溶液的pH調(diào)節(jié)到酸性域，使水溶液全部凝固進(jìn)行凝膠化獲得凝膠狀生物降解性生物體高分子材料。
7.生物降解性生物體高分子材料的制造方法，其特征在于采用權(quán)利要求6所述的制造方法獲得凝膠狀生物降解性生物體高分子材料后，將所得凝膠狀物凍結(jié)干燥獲得多孔體。
8.權(quán)利要求4～7的任一項(xiàng)所述的生物降解性生物體高分子材料的制造方法，其特征在于調(diào)制前述混合水溶液時(shí)的該來(lái)自家蠶的絹絲蛋白水溶液、來(lái)自野蠶的絹絲蛋白水溶液及該第二物質(zhì)水溶液的濃度分別是0.1～5重量％。
9.金屬離子吸附材料，其特征在于，是由只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的復(fù)合體、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的任一種與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的復(fù)合體的生物降解性生物高分子材料構(gòu)成。
10.權(quán)利要求9所述的金屬離子吸附材料，其特征在于前述金屬離子是抗菌性金屬或廢水中的金屬離子。
11.有用物質(zhì)的緩釋性載體，其特征在于，由只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的復(fù)合體、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的任一種與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的復(fù)合體的生物降解性生物體高分子材料構(gòu)成，不僅被蛋白酶、膠原酶、胰凝乳蛋白酶生物降解，而且緩慢釋放生物降解性生物體高分子材料載附的有用物質(zhì)。
12.權(quán)利要求11所述的有用物質(zhì)的緩釋性載體，其特征在于前述生物降解性生物體高分子材料是多孔體。
13.生物體細(xì)胞增殖基材，其特征在于，由來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的復(fù)合體、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的任一種與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的復(fù)合體的生物降解性生物體高分子材料構(gòu)成，使生物體細(xì)胞增殖的高分子材料。
14.生物降解性吸水性材料，其特征在于，由只來(lái)自家蠶的絹絲蛋白、只來(lái)自野蠶的絹絲蛋白、來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的復(fù)合體、或者來(lái)自家蠶的絹絲蛋白與來(lái)自野蠶的絹絲蛋白的任一種與由纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的至少一種的第二物質(zhì)的復(fù)合體的生物降解性生物體高分材料構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明提供具有良好生物化學(xué)特性的生物降解性生物體高分子材料，其制造方法，及由該高分子材料構(gòu)成的功能性材料。該生物降解性生物體高分子材料是由單一絹絲蛋白、或來(lái)自家蠶或野蠶的絹絲蛋白與從纖維素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖衍生物、羊毛角蛋白及聚乙烯醇中選出的第二物質(zhì)的復(fù)合體構(gòu)成。利用蛋白質(zhì)降解酶等進(jìn)行生物降解。把來(lái)自家蠶或野蠶的絹絲蛋白水溶液與第二物質(zhì)水溶液的混合水溶液涂布在基板上，使之蒸發(fā)干燥固化，制造膜狀的生物降解性生物體高分子材料。此時(shí)，各水溶液的濃度為0.1～5重量％，攪拌水溶液使之不產(chǎn)生凝膠化、沉淀、凝固反應(yīng)而均勻地混合調(diào)制混合水溶液。
文檔編號(hào)C08L5/08GK1467248SQ0314109
公開日2004年1月14日 申請(qǐng)日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月19日
發(fā)明者塚田益裕, 田益裕, 之, 新居孝之 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所