專利名稱：玄參多糖、生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從中藥材中提取的多糖同系混合物，特別是涉及從生藥玄參中提取的玄參多糖SnPS-1、其生產(chǎn)方法和用途。
背景技術(shù)：
玄參是一種傳統(tǒng)的中藥材，具有“涼血滋陰、降火、生津、解毒”之功效。文獻(xiàn)報道，[張雯潔等，云南植物研究，16(4)，407(1994)]，[李醫(yī)明，蔣山好，高文運(yùn)，朱大元，藥學(xué)學(xué)報，34(6)，448(1999)]，[鄒臣亭，楊秀偉，中草藥，31(4)，241(2000)]，其化學(xué)成分主要有生物堿、黃酮甙、甾醇、氨基酸、脂肪酸、揮發(fā)油、胡蘿卜素、環(huán)烯醚萜甙類成分以及微量元素等，而有關(guān)玄參中多糖類的研究尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種玄參多糖SnPS-1及其生產(chǎn)方法和用途。
本發(fā)明是從生藥玄參中提取獲得的多糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征為SnPS-1是以→2)Galf(1→，→2)Araf(1→為主鏈，以及少量糖鏈→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和極少量的分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖為Galp(1→。由此可見，SnPS-1是一條以直鏈為主，分支極少的雜多糖。
本發(fā)明的制備方法是將生藥用水浸泡，采用有機(jī)溶劑沉淀，透析或膜分離，濃縮干燥獲得總多糖。玄參總糖用活性炭處理，再經(jīng)離子交換柱和凝膠柱層析純化得多糖純品SnPS-1。
該多糖由完全酸水解、還原、乙?；虶C分析得知由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比推薦為1.8∶6.4∶1∶1.2∶2.8∶12.7，平均分子量推薦在90～105萬道爾頓，由HPLC分析得知分子量例如105萬道爾頓，進(jìn)一步推薦的平均分子量在100萬道爾頓。其譜圖數(shù)據(jù)如下面所述109.49ppm信號為→2)Araf(1→產(chǎn)生的，108.089ppm信號為→5)Araf(1→產(chǎn)生的，103.74ppm信號為→3)Glcp(1→產(chǎn)生的，103.87ppm信號為→3)Rhap(1→產(chǎn)生的，103.93ppm信號為→6)Manp(1→產(chǎn)生的，98.387ppm信號為→2)Galf(1→產(chǎn)生的；5.300ppm信號為→2)Araf(1→產(chǎn)生的，5.193ppm信號為→5)Araf(1→產(chǎn)生的，4.742ppm信號為→3)Glcp(1→產(chǎn)生的，5.118ppm信號為→6)Manp(1→產(chǎn)生的，5.013ppm信號為→2)Araf(1→產(chǎn)生的。
從SnPS-1甲基化、還原、乙酰化衍生物的GC-MS圖譜分析得知，SnPS-1含有碎片→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，Galp(1→，→3)Rhap(1→，→2，4)Xylp(1→，→3)Araf(1→，→2)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→2)Galf(1→，其摩爾比為4∶2∶3∶5∶3∶2∶15∶9∶35。根據(jù)甲基化、NMR等分析，可以得知SnPS-1具有以下的結(jié)構(gòu)SnPS-1是以→2)Galf(1→，→2)Araf(1→為主鏈，以及少量糖鏈→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和極少量的分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖為Galp(1→。
本發(fā)明的制備方法包括將生藥玄參干燥用水浸泡，采用有機(jī)溶劑沉淀，透析或膜分離，濃縮干燥獲的玄參總糖。玄參總糖經(jīng)活性炭處理，再經(jīng)離子交換柱和凝膠柱層析純化可的玄參多糖純品SnPS-1。
具體來說，將干燥后的生藥玄參粉碎或切片，用水浸泡，其中生藥玄參與水浸泡的重量比推薦是玄參∶水＝1∶10～15，尤其推薦用10～12倍重量或更多的水，浸泡24～36小時。所述水推薦為無離子水。浸泡液的pH值推薦保持在5.0～8.0。
過濾，濾液經(jīng)或不經(jīng)濃縮，用有機(jī)溶劑沉淀后離心。離心所得沉淀用水溶解，推薦用1-5倍重量的水溶解。
離心，上清液透析或膜分離，透析時間推薦為24-72小時，透析用透析膜、透析袋，其孔徑推薦截留分子量在1000以下。
濃縮干燥獲得總糖，其中干燥或減壓濃縮溫度推薦低于60℃進(jìn)行，最好采用低溫真空濃縮或冷凍干燥，例如在30～60℃干燥或濃縮，壓強(qiáng)推薦控制在0.08～0.1M Pa。
所述玄參總糖加水溶解，其中推薦1～5倍重量的水溶解。然后用活性炭處理，再經(jīng)凝膠柱層析作進(jìn)一步純化，用水或稀鹽溶液洗脫，收集糖峰，純度可達(dá)99.6％。凝膠柱層析所采用的凝膠為Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，選用的分離范圍為1×103～5×104道爾頓。推薦凝前述的用有機(jī)溶劑沉淀，所述有機(jī)溶劑推薦與水互溶的有機(jī)溶劑，可以是低碳鏈的醇或酮，例如C1～C6的醇或酮等，尤其推薦乙醇，例如用2～6倍體積的75％～95％的乙醇；沉淀時間推薦為12～72小時。
經(jīng)生物活性試驗(yàn)，研究結(jié)果表明玄參多糖SnPS-1具有腦缺血保護(hù)作用。
本發(fā)明首次從玄參中提取玄參多糖SnPS-1。本發(fā)明的提取分離方法簡便，產(chǎn)率高和適于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明取得到的玄參多糖粗品或純品能夠有效的用于制備具有腦缺血保護(hù)作用的藥物。


圖1是玄參多糖SnPS-1的HPLC圖。分析柱為Bio-sep，洗脫液水，流速1mL/min，檢測器RI，分析得到單一對稱峰，表明其具有均一性。
圖2是玄參多糖SnPS-1的GC-MS圖譜中的GC圖譜。其表明有8個碎片峰，具體碎片質(zhì)量見圖5-12。
圖3是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應(yīng)于GC圖中的13.216min峰，表明有→6)Manp(1→。
圖4是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應(yīng)于GC圖中的13.397min峰，表明有→5)Araf(1→。
圖5是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應(yīng)于GC圖中的15.421min峰，表明有Galp(1→。
圖6是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應(yīng)于GC圖中的15.540min峰，表明有→3)Rhap(1→。
圖7是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應(yīng)于GC圖中的16.126min峰，表明有→2，4)Xylp(1→。
圖8是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應(yīng)于GC圖中的18.078min峰，表明有→2)Araf(1→。
圖9是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應(yīng)于GC圖中的19.290min峰，表明有→3)Glcp(1→。
圖10是玄參多糖SnPS-1的MS圖譜，其對應(yīng)于GC圖中的22.150min峰，表明有→2)Galf(1→。
圖11是不同劑量的玄參多糖SnPS-1對大鼠腦缺血梗死體積的影響，各給藥組通過大鼠尾靜脈注射。初步結(jié)論不同劑量給藥組與缺血對照組差異顯著(p＜0.01)，各個劑量組之間無明顯差異。
圖12是0.2％劑量的玄參多糖SnPS-1對大鼠缺血及再灌注各時間點(diǎn)腦血流量圖，其中R 30min表示再灌注后30min，R 2h表示再灌注后2h。
圖13表示玄參多糖SnPS-1對大鼠缺血及再灌注各時間點(diǎn)腦血流量圖，其中R 30min表示再灌注后30min，R 2h表示再灌注后2h。初步結(jié)論0.2％劑量組除了缺血后即刻，其余各時間點(diǎn)均與對照組差異顯著(p＜0.05)，0.04％和0.4％劑量組除了缺血后2小時與對照組有顯著差異(p＜0.05)，再灌注后半小時及兩小時均無顯著差異。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將生藥玄參500g洗凈干燥，粉碎，用5升無離子水室溫浸泡24小時，過濾。殘渣用2.5升無離子水繼續(xù)浸泡12小時，過濾，合并濾液，60℃減壓濃縮至1～2升。然后用95％的乙醇沉淀，乙醇終濃度為80％，沉淀24小時。離心，沉淀用1.25升水溶解，離心，無離子水透析48～72小時。60℃減壓濃縮后冷凍干燥，即獲得玄參總糖8.9g。加水2升溶解，加活性炭處理，反復(fù)脫三次，然后減壓濃縮，離心，冷凍干燥，獲得玄參總糖3.0g，純度為80％。
實(shí)施例2將生藥玄參500g洗凈干燥，粉碎，用5升無離子水室溫浸泡36小時，過濾。殘渣用2.5升無離子水繼續(xù)浸泡12小時，過濾，合并濾液，50℃減壓濃縮至2升。然后用95％的乙醇沉淀，乙醇終濃度為82％，沉淀48小時。離心，沉淀用2升水溶解，離心，無離子水透析72小時。50℃減壓濃縮后冷凍干燥，即獲得玄參總多糖9.5g。加水2升溶解，加活性炭處理，反復(fù)脫三次，然后減壓濃縮，離心，冷凍干燥，獲得玄參總多糖3.1g，純度為80％。
實(shí)施例3
玄參總糖經(jīng)DEAE-Cellulose柱層析精制，純度為85～90％，再經(jīng)SephadexG-25和Sephadex G-75柱層析，即獲得純度為99.6％的玄參多糖SnPS-1。具體的分離方法稱取玄參總糖100mg，溶于1～2mL蒸餾水中，離心(4500r/min，10min)。取上清液上Sephadex G-25柱(1.5cm×100cm)，用0.1mol/LNaCl洗脫，流速為0.5mL/min，每管收集3～5mL，大約37～47管為吸收峰。收集后再經(jīng)Sephadex G-75柱純化，冷凍干燥，即獲得純多糖SnPS-150mg。
實(shí)施例4玄參總糖經(jīng)DEAE-Cellulose柱層析精制，純度為85～90％，再經(jīng)SephadexG-25和Sephadex G-75柱層析，即獲得純度為99.6％的玄參多糖SnPS-1。具體的分離方法稱取玄參總糖120mg，溶于2～3mL蒸餾水中，離心(4500r/min，10min)。取上清液上Sephadex G-25柱(1.5cm×100cm)，用0.1mol/L NaCl洗脫，流速為0.5mL/min，每管收集3～5mL，大約38～48管為吸收峰。收集后再經(jīng)Sephadex G-75柱純化，冷凍干燥，即獲得純多糖SnPS-160mg。
權(quán)利要求
1.一種玄參多糖SnPS-1，其結(jié)構(gòu)特征為SnPS-1是以→2)Galf(1→，→2)Araf(1→為主鏈，以及糖鏈→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖為Galp(1→組成，
2.如權(quán)利要求1所述的玄參多糖，其特征是鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖的組成摩爾比為1.8∶6.4∶1∶1.2∶2.8∶12.7。
3.如權(quán)利要求1所述的玄參多糖，其特征是其中→6)Manp(1→，→5)Arraf(1→，Galp(1→，→3)Rhap(1→，→2，4)Xylp(1→，→3)Araf(1→，→2)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→2)Galf(1→，摩爾比依次為4∶2∶3∶5∶3∶2∶15∶9∶35。
4.如權(quán)利要求1所述的玄參多糖，其特征是分子量范圍為90～105萬道爾頓。
5.如權(quán)利要求1所述的玄參多糖的生產(chǎn)方法，其特征是包括將干燥后的生藥玄參用水浸泡，用有機(jī)溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液經(jīng)透析或膜分離后，濃縮干燥獲得總糖。玄參總糖加水溶解后，經(jīng)活性炭處理以及凝膠柱層析純化可得玄參多糖純品SnPS-1。
6.如權(quán)利要求5所述的玄參多糖的生產(chǎn)方法，其特征是所采用的凝膠為Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，選用的分離范圍為1000道爾頓。
7.如權(quán)利要求5所述的玄參多糖的生產(chǎn)方法，其特征是生藥玄參與水浸泡的重量比玄參∶水＝1∶10～15，水浸泡時間24～36小時，浸泡液的pH＝5～8。
8.如權(quán)利要求4所述的玄參多糖的生產(chǎn)方法，其特征是所述的有機(jī)溶劑是與水互溶的有機(jī)溶劑。
9.如權(quán)利要求5所述的玄參多糖的生產(chǎn)方法，其特征是所述的有機(jī)溶劑是乙醇。
10.如權(quán)利要求5所述的玄參多糖的生產(chǎn)方法，其特征是透析或膜分離所采用的膜，其孔徑控制在截留分子量1000道爾頓。
11.如權(quán)利要求1所述的玄參多糖，其特征在于所述的玄參多糖可以制備具有腦缺血保護(hù)作用的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從中藥玄參中提取的多糖、其生產(chǎn)方法和用途。本發(fā)明采用水浸泡獲得玄參水提液，有機(jī)溶劑沉淀、沉淀用水溶解，上清液經(jīng)透析或膜分離，濃縮干燥獲得總糖，玄參總糖經(jīng)活性炭處理和柱層析獲得玄參多糖SnPS－1，其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征為SnPS－1是以→2)Gal/(1→，→2)Araf(1→為主鏈，以及少量糖鏈→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和極少量的分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖為Galp(1→。由此可見，SnPS－1是一條以直鏈為主，分支極少的雜多糖。本發(fā)明方法工藝簡單、產(chǎn)率高，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)生物活性試驗(yàn)表明，該多糖無毒副作用，具有腦缺血保護(hù)的作用。
文檔編號C08B37/00GK1486991SQ0314229
公開日2004年4月7日 申請日期2003年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月15日
發(fā)明者田庚元, 鄧軍娥 申請人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 浙江京新藥業(yè)股份有限公司