專利名稱：制備嵌段共聚物－藥物復(fù)合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，制得在聚合物膠束中包含藥物的嵌段共聚物-藥物復(fù)合物無需透析和超濾方法，所述聚合物膠束用由親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分組成的嵌段共聚物制得。
背景技術(shù)：
在JP-A No.7-69900等中說明了大分子嵌段共聚物-藥物復(fù)合物，它通過將阿霉素包含在聚合物膠束中來制得，所述聚合物膠束用由聚乙二醇結(jié)構(gòu)部分和聚天冬氨酸衍生物部分組成的嵌段共聚物制得，并提到相比游離的阿霉素，它具有更高的抗癌效果，且毒性低。這種嵌段共聚物-藥物復(fù)合物通過將嵌段共聚物和藥物溶解在水和二甲基甲酰胺(DMF沸點153℃(101.3kPa))的混合溶劑中，然后，通過透析操作用水代替有機溶劑二甲基甲酰胺，并通過透析和超濾操作純化所述混合物。但是，當(dāng)進行透析和超濾操作時，一部分所含的藥物(例如，阿霉素)也會被除去(Drug Delivery System，16，No.5，401-408(2001))，因此，所述藥物不能有效利用，嵌段共聚物中的藥物含量不能提高，并且所述含量連續(xù)變化，因此，也難以使藥物含量恒定。此外，透析和超濾操作均是實驗室用簡便方法，但是，工業(yè)制造則需要專門的設(shè)備，對于實際制造，這些方法需要長時間，并且這些并不是工業(yè)可行性高的實際制造方法。
JP-A No.2001-226294說明了一種制造大分子嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，該方法包括如下步驟通過機械攪拌、超聲波照射等方式乳化嵌段共聚物和水溶性差的藥物的氯仿溶液，并通過蒸發(fā)除去氯仿，但是，在工業(yè)上使用氯仿等受到限制，即由于包括使用和水不混溶的鹵代烴等原因，這并不是工業(yè)實用的方法。

發(fā)明內(nèi)容
目前還未知不使用透析和超濾操作并且不使用鹵代烴制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的工業(yè)切實可行方法，也沒有找到了提高嵌段共聚物中藥物含量的可行方法，因此，需要一種制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的可行的新方法。
為了解決上述問題，本發(fā)明人已經(jīng)作了深入細致的研究，并完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及(1)一種制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，包括如下步驟將由親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分組成的AB型嵌段共聚物和藥物溶解在水或水與能和水混溶的低沸點有機溶劑的混合溶劑中，并濃縮所得的溶液；(2)(1)中所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，在制備方法中不使用透析和超濾方法；(3)(1)或(2)中所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其中，所述AB型嵌段共聚物中的親水聚合物結(jié)構(gòu)部分是聚環(huán)氧乙烷衍生物，所述AB型嵌段共聚物中的疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分是聚天冬氨酸，它包含具有通過蒽環(huán)霉素(anthracycline)-基抗癌劑連接的側(cè)鏈羧基的天冬氨酸；(4)(1)或(2)中所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其中，所述AB型嵌段共聚物中的親水聚合物結(jié)構(gòu)部分是聚環(huán)氧乙烷衍生物，所述AB型嵌段共聚物中的疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分是聚谷氨酸，它包含具有通過蒽環(huán)霉素-基抗癌劑連接的側(cè)鏈羧基的谷氨酸；(5)(3)或(4)中所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其中，和所述疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分上的側(cè)鏈羧基連接的蒽環(huán)霉素-基抗癌劑是阿霉素；(6)(1)-(5)中任一項所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其中，所述藥物是蒽環(huán)霉素-基抗癌劑；(7)(6)中所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其中，所述蒽環(huán)霉素-基抗癌劑是阿霉素或其鹽；(8)一種制備包含嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的凍干制劑的方法，所述方法包括如下步驟將由親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分組成的AB型嵌段共聚物和藥物溶解在水或水與能和水混溶的低沸點有機溶劑的混合溶劑中，濃縮所得的溶液，再將其凍干。
具體實施例方式
本發(fā)明的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法包括如下步驟將由親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分組成的AB型嵌段共聚物和藥物溶解在水或水與能和水混溶的低沸點有機溶劑的混合溶劑中，并濃縮所得的溶液；尤其無需進行透析和超濾操作。
在本發(fā)明中，透析是使用半滲透膜通過基于濃度差的擴散來除去低分子量組分(包括有機溶劑和鹽)的操作。超濾是使用超濾膜(分級分子量5000-50000)除去嵌段共聚物-藥物復(fù)合物中低分子量組分并濃縮溶液的操作。
對本發(fā)明所用的藥物沒有特別限制，由于本發(fā)明復(fù)合物基于血管滲透性的腫瘤積聚性質(zhì)優(yōu)良，較好是抗癌劑，并提到了各種臨床使用的抗癌劑，尤其較好是蒽環(huán)霉素-基抗癌劑。蒽環(huán)霉素-基抗癌劑的例子包括紅比霉素、阿霉素、吡喃阿霉素、acrarubicin、表柔比星、依達比星等，尤其較好是阿霉素。
在所述由親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分組成的嵌段共聚物中，所述親水聚合物結(jié)構(gòu)部分包括所有通常已知的具有親水性的聚合物，其具體的例子包括聚環(huán)氧乙烷、多糖、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等，及其衍生物，尤其較好是聚環(huán)氧乙烷衍生物。至于所述聚環(huán)氧乙烷衍生物，例如，具體提到了通式I中所述的親水聚合物結(jié)構(gòu)部分。
本發(fā)明中疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分沒有特殊限制，只要它選自α-氨基酸、β-氨基酸等，或其衍生物等，較好是包含氨基酸的聚氨基酸，上述氨基酸具有通過蒽環(huán)霉素-基抗癌劑連接的側(cè)鏈羧基。所述聚氨基酸的具體例子包括聚天冬氨酸、聚谷氨酸等。至于連接到側(cè)鏈羧基上的蒽環(huán)霉素-基抗癌劑殘基，作為本發(fā)明所用藥物的蒽環(huán)霉素-基抗癌劑的殘基如上所述，尤其較好作為疏水聚氨基酸的是聚天冬氨酸，它包含通過阿霉素連接的天冬氨酸。一個分子嵌段共聚物中，蒽環(huán)霉素-基抗癌劑在疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分中的重量比較好為20％-70％，更好25％-60％。
本發(fā)明所用的由親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分組成的AB型嵌段共聚物可以是按照JP-A Nos.7-69900，5-955等中所述方法制造的。即，使一端為甲氧基，一端為氨基丙基的聚乙二醇和β-芐基-L-天冬氨酸酯-N-羧酸酐或γ-芐基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐反應(yīng)，將所得嵌段共聚物的氨端基酰化，并用堿水解側(cè)鏈芐酯，使用縮合劑和反應(yīng)輔劑縮合所得側(cè)鏈游離羧酸和蒽環(huán)霉素-基抗癌劑。估計該公報中所述方法制得的嵌段共聚物具有例如以下通式(I)所示的結(jié)構(gòu) 通式(I)所示聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分中，構(gòu)成部分的連接順序沒有特殊限制，可以是無規(guī)的或有規(guī)律的。在通式中，R較好表示羥基或蒽環(huán)霉素-基抗癌劑殘基，R1較好表示氫原子或低級烷基，更好低級烷基；R2較好表示低級亞烷基；R3較好表示亞甲基或亞乙基；R4較好表示氫原子或低級丙烯酰基，更好低級?；較好表示5-1000的整數(shù)，m較好表示2-300的整數(shù)，x+y較好表示0-300的整數(shù)，更好的是，n＝80-300，m＝20-50，x+y＝0-50，但是，x+y不大于m。x和y可以是包括0的任意值，只要能滿足上述條件。
在R所示的蒽環(huán)霉素-基抗癌劑殘基中，蒽環(huán)霉素-基抗癌劑和上述用作本發(fā)明藥物的蒽環(huán)霉素-基抗癌劑相同，所述較好的蒽環(huán)霉素-基抗癌劑也是阿霉素，如上所述。
R1所示的低級烷基較好包括具有1-4碳原子的直鏈或支鏈烷基，其具體的例子包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基等，更好是甲基。
R2所示的低級亞烷基較好包括具有1-4碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，其具體的例子包括亞甲基、亞乙基、三亞甲基、2-甲基三亞甲基、四亞甲基等，更好是三亞甲基。
R3較好表示亞甲基或亞乙基，更好是亞甲基。
R4所示的低級?；^好包括具有1-4碳原子的?；渚唧w的例子包括甲?；⒁阴；?、丙?；?、丁?；龋檬且阴；?。
通式(I)中，蒽環(huán)霉素-基抗癌劑殘基和聚氨基酸側(cè)鏈的連接方式并沒有特殊限制，較好是蒽環(huán)霉素-基抗癌劑的氨基或羥基和聚氨基酸的側(cè)鏈羧酸形成的酰胺鍵或酯鍵，尤其較好是蒽環(huán)霉素-基抗癌劑的氨基糖部分的伯氨基和聚氨基酸的羧酸側(cè)鏈形成的酰胺鍵。
通式(I)所示由親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分組成的嵌段共聚物中，尤其較好是其中R1是甲基，R2是三亞甲基，R3是亞甲基，R4是乙?；?，n＝80-300，m＝20-50，x+y＝0-50(但不大于m)的嵌段共聚物。
接著，說明本發(fā)明的制造方法。將由親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分組成的AB型嵌段共聚物溶解在水或水與能和水混溶的低沸點有機溶劑的混合溶劑中。至于本發(fā)明所述的低沸點有機溶劑，提到了沸點為100℃(101.3kPa)或以下的有機溶劑，較好是沸點為50℃-100℃(101.3kPa)的有機溶劑，和水混溶的低沸點有機溶劑的具體例子包括甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮等，尤其較好是能以高濃度溶解嵌段共聚物的乙醇?；旌先軇┲杏袡C溶劑和水的比率沒有特殊限制，只要溶解嵌段共聚物即可，其比率較好為1∶9到9∶1，更好是1∶3到3∶1。加熱所述溶劑，以促進溶解。加熱的溫度可以在嵌段共聚物不會分解且保持穩(wěn)定性的范圍內(nèi)，較好是30℃-100℃，更好是30℃-60℃。
在本發(fā)明的制造方法中，嵌段共聚物在水或水與能和水混溶的低沸點有機溶劑的混合溶劑中的濃度沒有特殊限制，只要溶解共聚物即可，通常濃度較好是2％-10％。
之后，當(dāng)把藥物，例如鹽酸阿霉素加入所得嵌段共聚物溶液中時，使之溶解制得均勻的溶液。并且，根據(jù)穩(wěn)定性及其它要求控制這種溶液的pH。這種情況下，所述pH范圍沒有特殊限制，只要藥物不會分解，在藥物為鹽酸阿霉素的情況下，pH較好為4-7。
若溶液中包含有機溶劑，則當(dāng)所得復(fù)合物溶液濃縮時，蒸餾這種有機溶劑如乙醇，制得嵌段共聚物-藥物復(fù)合物，其中，藥物包含在嵌段共聚物制成的聚合物膠束的內(nèi)核中。因此，無需進行如透析和超濾的常用方法的操作。在由此制得的嵌段共聚物-藥物復(fù)合物中，通過激光散射證實粒度為數(shù)十nm，并確定形成了聚合物膠束，而且通過使用凝膠過濾柱量化包于膠囊內(nèi)的藥物，證實本發(fā)明所用的80％或以上的藥物包于膠囊內(nèi)。
而且在本發(fā)明中，所得嵌段共聚物-藥物復(fù)合物可以進一步凍干，制得凍干制劑。在凍干時，可以加入具有緩沖作用的鹽，例如，磷酸鈉、乙酸鈉等，使pH恒定。
若這種凍干制劑例如再次溶解在注射溶劑、生理鹽水和具有緩沖作用的生理鹽水中，可以制得嵌段共聚物-藥物復(fù)合物溶液。
在本制造方法中，加入的藥物不會如用常用的制造方法那樣在制造過程中損失，因此，藥物不會浪費，此外，可以提高嵌段共聚物中包于膠囊中的藥物的比率。例如，按照JP-A No.7-69900的實施例中所述的制造方法，制造過程中所用阿霉素的利用率和藥物含量比率如表1所示，然而，在按照以下所述本發(fā)明的制造方法的實施例中，藥物利用率和藥物含量比率明顯提高，如表1所示。


嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的特征在于藥物包含于嵌段共聚物制得的膠束中，并相比游離的藥物，它具有高的抗癌效果，且毒性低；藥物膠囊化比率提高可以相對降低所需嵌段共聚物的量；因此，從經(jīng)濟的角度來看，本發(fā)明的復(fù)合物實際上也是優(yōu)良的。
以下實施例說明了本發(fā)明，但決不是用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1往20.00g上述通式(I)所示的嵌段共聚物(R1＝甲基，R2＝三亞甲基，R3＝亞甲基，R4＝乙?；?，R＝羥基或阿霉素殘基(阿霉素連接的平均比率45％)，聚乙二醇的平均分子量＝5287，天冬氨酸的平均單元數(shù)＝28.1)中加入100mL注射溶劑，在35℃下加熱所述混合物，形成懸浮液。往其中加入6.0mL 0.5N氫氧化鈉溶液并攪拌，然后加入100mL無水乙醇。確定嵌段共聚物溶解之后，加入3.906g鹽酸阿霉素，并溶解。加入5.9mL 0.5N氫氧化鈉，將pH控制到6，并加入188mL注射溶劑。1小時之后，通過膜過濾器(Millipore；GV型0.22μm)過濾所述溶液，然后，在減壓條件下蒸餾除去溶劑，制得嵌段共聚物-藥物復(fù)合物溶液，再將其凍干制得22.96g嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的凍干物質(zhì)。這種復(fù)合物的藥物含量為16.31％。
試驗例1將實施例1制得的凍干物質(zhì)溶解在磷酸鹽緩沖的生理鹽水(pH 7.4)中，制得1mg/mL的溶液。將這種樣品溶液靜置在5℃下過夜，然后用于分析。在玻璃柱中充滿約2mL用水溶脹的Sephadex G-25(Farmacia制造；級別細)。往該柱中加入200μL所述樣品溶液。通過用水展開，取出一部分包含藥物的膠束，然后用等量的二甲基甲酰胺(DMF)稀釋，然后加入水-DMF(1∶1)溶液(溶液1)至5mL。另外，將200μL所述樣品溶液置于5mL的量瓶中，并加入水-DMF(1∶1)溶液(溶液2)至5mL。通過分解膠束結(jié)構(gòu)的反相HPLC分析溶液1和2，計算所得圖譜中阿霉素的峰面積比率(溶液1中游離阿霉素的量/溶液2中游離阿霉素的量)。實施例1所得嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的藥物含量比率為94.9％。這一結(jié)果表明嵌段共聚物-藥物復(fù)合物中的藥物包含于嵌段共聚物所得膠束的內(nèi)核中。
柱Waters Symmetry C84.6×250mm柱溫40℃洗提液(A)0.05％MS-3+0.01％ TFA(MS-3是GL Science制得的離子對試劑，TFA是三氟乙酸)(B)CH3CN梯度時間(min) 0 20 25 35 50 51 60B(％) 20 40 40 90 90 20 20檢測器UV(485nm)流速 0.8mL/min注射量20μL應(yīng)用例1將結(jié)腸26腺癌細胞皮下移植到各CDF1雌性小鼠的腋下區(qū)域中。當(dāng)腫瘤體積達到約100mm3時，靜脈注射實施例1所得的嵌段共聚物-藥物復(fù)合物或鹽酸阿霉素。所述已經(jīng)凍干并儲存在陰冷處的嵌段共聚物-藥物復(fù)合物溶解在用磷酸作緩沖的生理鹽水(pH 7.4)中，根據(jù)復(fù)合物中的藥物量確定這種情況下的劑量。從移植60天之后腫瘤消失(治愈)的小鼠數(shù)以及注射14天之后腫瘤增殖抑制比率來判斷藥物的抗癌效果。結(jié)果列于表2中。
小鼠結(jié)腸癌Colon 26的效果

a)注射14天之后和對照組相比腫瘤的體積比b)觀察60天之后治愈的小鼠數(shù)/一組中的數(shù)量c)中毒死亡的小鼠數(shù)/一組中的數(shù)量相比注射鹽酸阿霉素本身的情況，當(dāng)注射本發(fā)明嵌段共聚物-藥物復(fù)合物時，在所有服藥組中顯示了更強的減小腫瘤效果。當(dāng)觀察期(60天)結(jié)束時治愈的小鼠數(shù)比注射鹽酸阿霉素本身的情況多，并證實，相比游離的藥物，所述嵌段共聚物-藥物復(fù)合物在較低的毒性范圍內(nèi)顯示了更高的抗癌效果。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明制造膠束型嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，由于不使用透析操作和超濾操作，其操作性顯著提高，并且藥物的利用率優(yōu)良，藥物含量可以提高并成功地重現(xiàn)，相比常用的制造方法，可以在更短的時間內(nèi)制造所述復(fù)合物。由于并不需要專門的設(shè)備，無需使用大量的水，這種制造方法容易進行，且可以成功地工業(yè)化。根據(jù)本發(fā)明，可以經(jīng)濟且簡單地提供在較低毒性范圍內(nèi)具有更高抗癌效果的嵌段共聚物-藥物復(fù)合物。
權(quán)利要求
1.一種制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，所述方法包括如下步驟將包含親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分的AB型嵌段共聚物和藥物溶解在水或水與能和水混溶的低沸點有機溶劑的混合溶劑中，并濃縮所得的溶液。
2.權(quán)利要求1所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其特征在于，在制備方法中不使用透析和超濾方法。
3.權(quán)利要求1或2所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其特征在于，所述AB型嵌段共聚物中的親水聚合物結(jié)構(gòu)部分是聚環(huán)氧乙烷衍生物，所述AB型嵌段共聚物中的疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分是聚天冬氨酸，它包含具有通過蒽環(huán)霉素-基抗癌劑連接的側(cè)鏈羧基的天冬氨酸。
4.權(quán)利要求1或2所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其特征在于，所述AB型嵌段共聚物中的親水聚合物結(jié)構(gòu)部分是聚環(huán)氧乙烷衍生物，所述AB型嵌段共聚物中的疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分是聚谷氨酸，它包含具有通過蒽環(huán)霉素-基抗癌劑連接的側(cè)鏈羧基的谷氨酸。
5.權(quán)利要求3或4所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其特征在于，和所述疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分上的側(cè)鏈羧基連接的蒽環(huán)霉素-基抗癌劑是阿霉素。
6.權(quán)利要求1-5中任一項所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其特征在于，所述藥物是蒽環(huán)霉素-基抗癌劑。
7.權(quán)利要求6所述的制備嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的方法，其特征在于，所述蒽環(huán)霉素-基抗癌劑是阿霉素或其鹽。
8.一種制備包含嵌段共聚物-藥物復(fù)合物的凍干制劑的方法，所述方法包括如下步驟將包含親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分的AB型嵌段共聚物和藥物溶解在水或水與能和水混溶的低沸點有機溶劑的混合溶劑中，濃縮所得的溶液，再將其凍干。
全文摘要
一種制備嵌段共聚物－藥物復(fù)合物的工業(yè)化方法，它無需進行透析和超濾，也不使用鹵代烴。制備嵌段共聚物－藥物復(fù)合物的方法的特征在于包括如下步驟將由親水聚合物結(jié)構(gòu)部分和疏水聚氨基酸結(jié)構(gòu)部分組成的AB型嵌段共聚物和藥物溶解在水或水與能和水混溶的低沸點有機溶劑的混合溶劑中，并濃縮所得的溶液。
文檔編號C08G73/10GK1662259SQ0381424
公開日2005年8月31日 申請日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月19日
發(fā)明者中西健, 清水和久 申請人:日本化藥株式會社, 獨立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機構(gòu), 櫻井靖久