專利名稱：生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物及透明質(zhì)酸的純化方法
背景技術(shù)：
a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株以及一種純化透明質(zhì)酸的方法，具體而言涉及鏈球菌KL0188以及一種使用芳族吸附樹脂和活性碳純化透明質(zhì)酸的方法。
b)相關(guān)技術(shù)描述透明質(zhì)酸是一種無色高粘性的多糖，其分子量為50,000～13,000,000Da，重復(fù)單元為以(1-3)和(1-4)鍵交替鍵接的葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖。透明質(zhì)酸具有潤膚作用(moisturizingeffect)，優(yōu)良的減少物理摩擦的潤滑作用，并且還提供優(yōu)良的抗細(xì)菌入侵的保護作用等。透明質(zhì)酸廣泛用作化妝品的添加劑、關(guān)節(jié)炎的治療劑、眼科手術(shù)的補助劑以及外科手術(shù)后的粘附抑制劑等。奶牛的眼球、公雞雞冠、動物的緩沖組織、胎盤、癌細(xì)胞及皮膚等均含有大量透明質(zhì)酸。
透明質(zhì)酸可從上述生物組織中提取(美國專利No.4,141,973和美國專利No.4,303,676)，或通過發(fā)酵微生物作為發(fā)酵產(chǎn)品收集。然而，提取獲得的透明質(zhì)酸含有諸如硫酸軟骨素、硫酸葡糖胺聚糖等雜質(zhì)，從而需要復(fù)雜的純化流程除去所述雜質(zhì)，因此生產(chǎn)成本高。但是，按照使用微生物的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其生產(chǎn)成本相對較低，并且可通過較簡單的方法獲得高分子量的透明質(zhì)酸(日本專利早期公開No.58-056692，美國專利86-00066)。
用于生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物包括膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、獸瘟鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)、馬鏈球菌(Streptococcus equi)、類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)等。根據(jù)伯吉氏手冊(Bergy’smanual)，上述微生物屬于蘭氏(Lancefield)血清A組或C組。該微生物是溶血性鏈球菌，并且據(jù)報道具有β-溶血功能。
由于使用鏈球菌微生物(日本專利早期公開No.58-566922、美國專利早期公開No.60-500997、韓國專利注冊公開No.10-250573和韓國專利早期公開No.10-250573)生產(chǎn)的透明質(zhì)酸平均分子量較低，僅為300,000～3,500,000Da，因此難以用作醫(yī)療劑或補助劑，并且對于化妝品其潤膚力不足。此外，美國專利No.6,090,596描述了一種生產(chǎn)分子量為6,300,000～9,500,000Da的高分子量透明質(zhì)酸的方法，但透明質(zhì)酸的生產(chǎn)率相當(dāng)?shù)?，僅為每升培養(yǎng)液0.35g。
已知的使用微生物分離并純化透明質(zhì)酸的方法如下美國專利No.4,157,296公開的一種純化透明質(zhì)酸的方法包括用三氯代乙酸處理膿鏈球菌的培養(yǎng)液以除去菌株，然后用有機溶劑使其沉淀。然而，由于使用有機溶劑的沉淀法需要大量重復(fù)操作，因此其成本較高并且非常耗時。
美國專利No.4,782,046描述的純化方法包括向馬鏈球菌的培養(yǎng)液中加入0.01％的硫酸月桂酯表面活性劑以分離附著在細(xì)胞壁上的透明質(zhì)酸，然后加入非離子表面活性劑溴化十六烷基三甲銨以形成透明質(zhì)酸沉淀，并用醇使其沉淀。
美國專利No.4,784,990描述的純化方法包括向獸瘟鏈球菌的培養(yǎng)液中加入乙醇使透明質(zhì)酸從微生物中分離出來，然后用氯代十六烷基吡啶使其沉淀。
日本專利早期公開No.63-012293描述了一種通過使用大網(wǎng)狀陰離子交換樹脂(Dianion HPA-25、HPA-75、IRA-900、IRA-904)處理含透明質(zhì)酸的溶液以除去分子量等于或小于1,500,000Da的低分子量透明質(zhì)酸及發(fā)熱物質(zhì)的方法。
日本專利早期公開No.13-131503描述的一種純化透明質(zhì)酸的方法包括用氧化鋁或硅膠等處理含透明質(zhì)酸的溶液以除去發(fā)熱物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、金屬雜質(zhì)等，并用有機溶劑使其沉淀。
日本專利早期公開No.06-199656描述的一種純化透明質(zhì)酸的方法包括使含透明質(zhì)酸的溶液通過在pH為6～10的溶液中帶電荷的膜過濾器以除去發(fā)熱物質(zhì)并用醇使其沉淀。
韓國專利早期公開No.1994-2478描述了一種通過向生產(chǎn)透明質(zhì)酸的菌株培養(yǎng)液中加入鋁酸鐵粉末以純化透明質(zhì)酸的方法。
此外，韓國專利早期公開No.1997-42603描述的純化透明質(zhì)酸的方法包括用疏水性聚合物(聚乙烯、聚丙稀或聚苯乙烯)處理含透明質(zhì)酸的溶液，然后加入活性氧化鋁并用醇使其沉淀。
然而，上述方法涉及復(fù)雜的處理過程，從而加大了生產(chǎn)成本，并且難以完全除去發(fā)熱物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供可以高產(chǎn)量生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸的微生物菌株。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株，所述微生物菌株不表達透明質(zhì)酸酶并且不是溶血性的。
本發(fā)明的另一個目的在于提供由非溶血性微生物菌株生產(chǎn)的并經(jīng)純化的高分子量透明質(zhì)酸。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種由微生物生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的純化方法，該方法可以簡單直接的方式除去發(fā)熱物質(zhì)并分離出高純度的透明質(zhì)酸。
為達到上述目的，本發(fā)明提供鏈球菌KL0188(KCTC1024BP)，該鏈球菌不表達透明質(zhì)酸酶并且是非溶血性的。
本發(fā)明還提供一種純化透明質(zhì)酸及其鹽的方法，該方法包括如下步驟用芳族吸附樹脂處理生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株的培養(yǎng)液，用活性碳處理并用有機溶劑使其沉淀。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株和透明質(zhì)酸的純化方法。
根據(jù)本發(fā)明，提供一種通過在獸瘟鏈球菌中引起突變而制備的鏈球菌KL0188。鏈球菌KL0188已于2002年5月10日由韓國典型菌種保藏中心(Korean Collection for Type Culture)保藏，保藏號為KCTC10248BP。鏈球菌KL0188是一種非溶血性菌株，并且由于其沒有透明質(zhì)酸酶活性，因此可以高產(chǎn)量生產(chǎn)透明質(zhì)酸。
鏈球菌KL0188可在含有諸如碳源、氮源、無機鹽、維生素等微量成份的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖可用作碳源，并優(yōu)選使用葡萄糖。硝酸銨、硫酸銨、胰胨、蛋白胨、酵母提取物或酪蛋白氨基酸可用作氮源；氯化鈉、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵或硫酸鎂可用作無機鹽。
本發(fā)明所用的鏈球菌KL0188的培養(yǎng)基的實例包括20～80g/L的葡萄糖、5g/L的酵母提取物、17g/L的酪蛋白胨、7g/L的谷氨酸、0.7g/L的硫酸鎂、2.5g/L的磷酸鉀和5.0g/L的氯化鈉。
鏈球菌KL0188可在30～37℃的有氧條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)液的pH優(yōu)選維持在6.5～7.5的范圍內(nèi)，并且由于pH會在培養(yǎng)過程中變化，因此優(yōu)選通過人工手段控制pH?？墒褂?N的NaOH和1N的HCl溶液控制pH。如果pH超出上述范圍，透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量可能有變化。
由鏈球菌KL0188生產(chǎn)的透明質(zhì)酸可通過一般方法(J.Soc.Cosmet.Japan.22，35～42(1988))或通過本發(fā)明的純化方法分離和純化。鏈球菌KL0188產(chǎn)生約6.0～7.5g/L的透明質(zhì)酸，其平均分子量高達4,000,000Da或以上。
因此，根據(jù)本發(fā)明，鏈球菌KL0188可以低成本、高產(chǎn)量生產(chǎn)透明質(zhì)酸，并且透明質(zhì)酸還可通過較簡單的方法純化。此外，由此生產(chǎn)的透明質(zhì)酸可用于化妝品或醫(yī)療劑或補助劑。
與現(xiàn)有的使用表面活性劑的透明質(zhì)酸沉淀法不同，本發(fā)明的純化方法包括如下步驟生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株的培養(yǎng)液經(jīng)活性炭處理、芳族吸附樹脂處理、超濾作用及乙醇沉淀作用。
從三菱公司購得的苯乙烯二乙烯苯型樹脂可用作芳族吸附樹脂。具體地說，所述樹脂選自HP10、HP20(苯乙烯和二乙烯苯共聚物)、HP21、HP30、SP800、SP825、SP850、SP875、SP205、SP206和SP207(溴化聚苯乙烯)，并優(yōu)選使用HP20或SP207。
任何將透明質(zhì)酸作為代謝產(chǎn)物生成的菌株均可用作生產(chǎn)透明質(zhì)酸的菌株，并且典型地，可使用鏈球茵。鏈球菌微生物包括膿鏈球菌、糞鏈球菌、停乳鏈球菌、獸瘟鏈球菌、馬鏈球菌、類馬鏈球菌和鏈球菌KL0188(KCTC10248BP)。生產(chǎn)透明質(zhì)酸的菌株可通過一般的培養(yǎng)方法培養(yǎng)以制備含有透明質(zhì)酸的培養(yǎng)液。
更具體地，透明質(zhì)酸的純化方法包括如下步驟(a)由生產(chǎn)透明質(zhì)酸的菌株的培養(yǎng)液制備培養(yǎng)濾液；(b)向培養(yǎng)濾液中加入芳族吸附樹脂，攪拌，并進行超濾以制備透明質(zhì)酸溶液；以及(c)向透明質(zhì)酸的水溶液中加入有機溶劑以使透明質(zhì)酸或其鹽沉淀，并干燥沉淀。上述方法還包括在步驟(a)或(b)后向培養(yǎng)濾液中或透明質(zhì)酸的水溶液中加入活性炭并攪拌，然而除去活性炭。
在步驟(a)中，向培養(yǎng)液中加入硫酸月桂酯和福爾馬林并攪拌，由此從細(xì)菌表面分離透明質(zhì)酸并同時使細(xì)菌失活。然后，將培養(yǎng)液離心以分離上層清液或過濾以得到濾液。
將培養(yǎng)濾液滴定到pH為7.5～8.5后進行步驟(b)，并加入0.1～10wt％的芳族吸附樹脂。加入芳族吸附樹脂后，在4～10℃攪拌混合濾液以吸附內(nèi)毒素，然后過濾以獲得已除去吸附樹脂的濾液。濾液經(jīng)超濾除去各種培養(yǎng)基組分和無機鹽?？墒褂梅肿恿拷亓糁?cut-off)為10,000～100,000Da的濾膜進行超濾。
在步驟(c)中，通過一般的有機溶劑沉淀法使透明質(zhì)酸或其鹽沉淀。諸如丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或乙腈等水性有機溶劑可用作有機溶劑，并優(yōu)選使用乙醇。向透明質(zhì)酸的水溶液中加入NaCl使NaCl濃度為0.5～3M，溶液過濾并向濾液中加入1～5倍于濾液體積的有機溶劑以沉淀透明質(zhì)酸及其鹽。然后用70％的乙醇洗滌沉淀并干燥。
活性炭處理可在步驟(a)或(c)后進行。具體而言，向步驟(a)的培養(yǎng)濾液中或步驟(b)的透明質(zhì)酸中加入0.1～3(w/v)的NaCl，然后加入0.1～10(w/v)的活性炭?；钚蕴坑糜谖降鞍踪|(zhì)或核酸以將其除去。
與常規(guī)方法相比，本發(fā)明的透明質(zhì)酸的純化方法可有效除去發(fā)熱物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和金屬雜質(zhì)，并可將有機溶劑沉淀操作的頻率降到最低，從而通過簡單經(jīng)濟的純化方法制得高純度的透明質(zhì)酸。故而，由本發(fā)明的純化方法純化的透明質(zhì)酸純度高達99％，并因此可用于化妝品和藥品。
參考下列實施例描述本發(fā)明。然而，所述實施例僅用于示例本發(fā)明并且本發(fā)明并不受其限制。
實施例1突變菌株的篩選在獸瘟鏈球菌中引起突變以選擇出具有非溶血性能并且無透明質(zhì)酸酶活性的突變菌株。
將獸瘟鏈球菌(KCTC 3318)接種到50ml的從DIFCO公司購得的Baco Todd Hewitt Broth中并在37℃培養(yǎng)直至出現(xiàn)代數(shù)生長期(algebfaic growth period)。然后，取1ml的培養(yǎng)液在低溫下離心以回收沉淀下來的細(xì)胞，向其中加入50mM的Tris-馬來酸緩沖溶液(pH6.0)并洗滌兩次。
細(xì)胞以1×103個/ml的濃度分散在緩沖溶液中，使NTG(N-甲基-N’-亞硝基胍)以200μg/ml的濃度與上述溶液混合?；旌衔镌?7℃攪拌30分鐘，然后用50mM的Tris-馬來酸緩沖溶液(pH 6.0)洗滌細(xì)胞兩次。將細(xì)胞接種到Todd Hewitt Broth中并在37℃培養(yǎng)18小時。得到的培養(yǎng)液用無菌鹽水溶液稀釋到濃度為1×103個細(xì)胞/ml，然后取0.1ml稀釋溶液在血瓊脂(Blood Agar)中培養(yǎng)以選擇出不表現(xiàn)溶血性的菌落。
通過與上述相同的方法在選擇出的非溶血性突變菌株上引起突變以選擇無透明質(zhì)酸酶活性的菌株。將非溶血性突變菌株涂覆在含有400μg透明質(zhì)酸和1％白蛋白V組分的Todd Hewitt Agar Broth上以形成單菌落。在濕培養(yǎng)箱中于37℃靜置培養(yǎng)(standing culture)2～5天，然后加入10m12N的醋酸鹽溶液并靜置10分鐘。選擇出表現(xiàn)出快速生長并大量形成粘性物質(zhì)的菌落。
將選擇出的菌落分別接種到1.5L的透明質(zhì)酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中，并在35℃，pH為6.95～7.05下有氧培養(yǎng)20小時?；厥张囵B(yǎng)液并使用數(shù)字粘度計(Brookfield DVII+，4轉(zhuǎn)，30rpm)在25℃測量絕對粘度。部分溶液用有機溶劑沉淀后溶于蒸餾水中，通過咔唑法(Z.Dische，J.Biol.Chem.167，189(1949))確定透明質(zhì)酸的產(chǎn)量，從而選擇出其培養(yǎng)液絕對粘度高并且透明質(zhì)酸產(chǎn)量高的菌株。
通過分析16S rDNA的氨基酸序列(Jukes，T.H.&C.R.，(1969).In mammalian protein metabolism，21～132頁；H.N.Munro編輯.Saito，N.和Nei，M(1987)Mol Biol第4卷，406～425)鑒別選擇出的菌株。由此選擇出的菌株經(jīng)鑒別為鏈球菌，因而命名為鏈球菌KL0188。鏈球菌KL0188于2002年5月10日由韓國典型菌種保藏中心保藏，保藏號為KCTC10248BP。
實施例2透明質(zhì)酸生產(chǎn)率的檢驗培養(yǎng)鏈球菌KL0188以測量透明質(zhì)酸的生產(chǎn)效率以及所生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的分子量。
將分離出的微生物接種到100ml的Todd Hewitt Broth中并在35℃培養(yǎng)直至出現(xiàn)代數(shù)生長期，然后將其用作第一種子培養(yǎng)液。將第一種子培養(yǎng)液接種到1L的胰胨豆胨培養(yǎng)液(美國Difco)中并在35℃培養(yǎng)直至出現(xiàn)代數(shù)生長期，然后將其用作第二種子培養(yǎng)液。
在30L的發(fā)酵罐中，加入含有60g/L的葡萄糖、5g/L的酵母提取物、17g/L的酪蛋白胨、7g/L的谷氨酸、0.7g/L的硫酸鎂、2.5g/L的磷酸氫二鉀和5.0g/L的氯化鈉的透明質(zhì)酸生產(chǎn)培養(yǎng)基并滅菌，然后在其中接種1000ml的第二種子培養(yǎng)液。保持培養(yǎng)液的pH在6.95～7.05的范圍內(nèi)，溫度為35℃，換氣量為1.0VVM的同時進行有氧培養(yǎng)。
培養(yǎng)過程中，取部分樣品并測量培養(yǎng)液的粘度，繼續(xù)培養(yǎng)直至粘度不再增大。通過測量確定培養(yǎng)液的粘度在培養(yǎng)20小時后不再增大，然后停止培養(yǎng)。最大粘度為約20,000cps。
通過已知的分離和純化方法(J.Soc.Cosmet.Japan.22，35～42(1988))回收存在于培養(yǎng)液中的透明質(zhì)酸。通過咔唑法(Z.Dische，J.Biol.Chem.167，189(1947))測定透明質(zhì)酸的量并通過毛細(xì)管粘度計法(Narlin，Analytical Biochemistry 147，347～395(1985))測量所生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的平均分子量。結(jié)果，證實透明質(zhì)酸的產(chǎn)量為7.0g/L，其平均分子量為5,500,000Da。
比較例1獸瘟鏈球菌的透明質(zhì)酸生產(chǎn)率的檢驗通過實施例中2相同的方法培養(yǎng)獸瘟鏈球菌(KCTC3318)并測量透明質(zhì)酸的生產(chǎn)率和分子量。
24小時后，培養(yǎng)液的粘度不再增大并從而停止培養(yǎng)。測得的粘度為約4000cps，透明質(zhì)酸的生產(chǎn)率為3.0g/L，其平均分子量為2,500,000Da。
已證實與獸瘟鏈球菌相比，本發(fā)明的鏈球菌KL0188具有優(yōu)良的透明質(zhì)酸生產(chǎn)率并且所生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的分子量高。
本發(fā)明的鏈球菌KL0188是非溶血性菌株，并以高產(chǎn)量生產(chǎn)高分子量的透明質(zhì)酸。因此，由鏈球菌KL0188生產(chǎn)的透明質(zhì)酸可用于化妝品或藥品。
實施例3使用芳族吸附樹脂SP207純化透明質(zhì)酸3-1生產(chǎn)透明質(zhì)酸的菌株的制備將鏈球菌KL0188(KCTC10248BP)接種到100ml的Todd HewittBroth中并在35℃培養(yǎng)直至出現(xiàn)代數(shù)生長期，然后將其用作第一種子培養(yǎng)液。將第一種子培養(yǎng)液接種到1L的胰胨豆胨培養(yǎng)液(美國Difco)中并在35℃培養(yǎng)直至出現(xiàn)代數(shù)生長期，然后將其用作第二種子培養(yǎng)液。
向30L的發(fā)酵罐中加入20L含有60g/L的葡萄糖、5g/L的酵母提取物、17g/L的酪蛋白胨、7g/L的谷氨酸、0.7g/L的硫酸鎂、2.5g/L的磷酸氫二鉀和5.0g/L的氯化鈉的透明質(zhì)酸生產(chǎn)培養(yǎng)基并滅菌，然后在其中接種1000ml的第二種子培養(yǎng)液。在pH為6.95～7.05，溫度為35℃下培養(yǎng)20小時。
3-2培養(yǎng)濾液的制備稀釋透明質(zhì)酸培養(yǎng)液使透明質(zhì)酸的濃度變?yōu)?.1～0.2％。向其中加入0.02％的硫酸月桂酯和0.05％的福爾馬林溶液并攪拌3小時。然后，通過離心或過濾除去細(xì)菌以制備培養(yǎng)濾液。
3-3 SP207樹脂處理滴定培養(yǎng)濾液使其pH變?yōu)?.5～8.5，加入3(w/v)％的芳族吸附樹脂SP207，在4～10℃攪拌3小時以吸附發(fā)熱物質(zhì)。然后，過濾經(jīng)吸附樹脂處理過的溶液即得到已除去吸附樹脂的濾液，并進行超濾。
3-4活性炭處理向濾液中加入0.9(w/v)％的NaCl和3(w/v)％的活性炭并攪拌2小時以使蛋白質(zhì)和核酸等吸附到活性炭中。然后，過濾即得到已除去活性炭的透明質(zhì)酸水溶液。
3-5乙醇沉淀向透明質(zhì)酸水溶液中加入NaCl以使其濃度變?yōu)?M，然后用0.2μm的過濾器過濾溶液。接著，加入1.5～3倍于溶液體積的乙醇以沉淀透明質(zhì)酸及其鹽，然后用70％的乙醇洗滌數(shù)次。在無菌條件下干燥沉淀即得到透明質(zhì)酸及其鹽。
實施例4使用芳族吸附樹脂HP20純化透明質(zhì)酸通過實施例3中相同的方法純化透明質(zhì)酸及其鹽，但使用HP20作為吸附樹脂。
實施例5在活性炭處理后使用芳族吸附樹脂SP207純化透明質(zhì)酸通過實施例3中相同的方法純化透明質(zhì)酸及其鹽，但在活性炭處理后進行SP207吸附。
實施例6在活性炭處理后使用芳族吸附樹脂HP20純化透明質(zhì)酸通過實施例4中相同的方法純化透明質(zhì)酸及其鹽，但在活性炭處理后進行HP20吸附。
實施例7使用SP207純化透明質(zhì)酸通過實施例3中相同的方法純化透明質(zhì)酸及其鹽，但使用獸瘟鏈球菌(KCTC3318)作為生產(chǎn)透明質(zhì)酸的菌株。
比較例2
通過實施例3中相同的方法純化透明質(zhì)酸及其鹽，但省略芳族樹脂吸附步驟。
實驗例透明質(zhì)酸純化產(chǎn)量的測量測量由實施例3～7及比較例的方法純化的透明質(zhì)酸及其鹽的純度。
A.透明質(zhì)酸的產(chǎn)量通過改進的咔唑法測定透明質(zhì)酸的產(chǎn)量，并對初始體積和最終體積進行比較。
B.發(fā)熱物質(zhì)的測量將透明質(zhì)酸及其鹽溶于含有等于或小于0.001EU/ml發(fā)熱物質(zhì)的水中使其密度變?yōu)?.5g/L，然后使用從Charles River Endosafe購得的LAL(鱟試劑，Limulus AmebocyteLysate)按照該產(chǎn)品所附手冊進行分析。分析值以每毫克透明質(zhì)酸中存在的內(nèi)毒素單位(EU)表示。
C.純度試驗通過咔唑法(Anal.Biochem.，4，330(1962))進行純度試驗。
D.蛋白質(zhì)含量通過勞拉法(Lowry method)測量蛋白質(zhì)的含量。
E.核酸含量將透明質(zhì)酸及其鹽溶于鹽水溶液中使其濃度為1％，然后在260nm測量其吸光度。
結(jié)果如下表1所示。
(表1)

從表1中可看出，由實施例1～7純化的透明質(zhì)酸及其鹽純度高達99％。而同時，由比較例純化的透明質(zhì)酸純度僅為95％。此外，實施例3～7的透明質(zhì)酸及其鹽中發(fā)熱物質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的含量比比較例低很多。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株鏈球菌KL0188(KCTC)，所述鏈球菌不表達透明質(zhì)酸酶并表現(xiàn)出非溶血性能。
2.一種純化透明質(zhì)酸的方法，該方法包括如下步驟用芳族吸附樹脂處理權(quán)利要求1的鏈球菌KL0188(KCTC 10248BP)的培養(yǎng)液，用活性炭處理上述培養(yǎng)液，并用有機溶劑使其沉淀以純化透明質(zhì)酸及其鹽。
3.權(quán)利要求2的純化透明質(zhì)酸的方法，其特征在于芳族吸附樹脂選自HP10、HP20、HP21、HP30、SP800、SP825、SP850、SP875、SP205、SP206和SP207。
4.權(quán)利要求2的純化透明質(zhì)酸的方法，其特征在于所述方法包括(a)由生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株的培養(yǎng)液制備培養(yǎng)濾液；(b)向培養(yǎng)濾液中加入芳族吸附樹脂，攪拌，并進行超濾以制備已除去發(fā)熱物質(zhì)的透明質(zhì)酸的水溶液；(c)向透明質(zhì)酸的水溶液中加入有機溶劑以沉淀透明質(zhì)酸及其鹽，并干燥沉淀，其中所述方法還包括在步驟(a)或(c)后向培養(yǎng)濾液中或透明質(zhì)酸的水溶液中加入活性炭以及除去活性炭。
5.一種由權(quán)利要求4的方法純化得到的透明質(zhì)酸及其鹽。
6.一種純化透明質(zhì)酸的方法，該方法包括如下步驟用芳族吸附樹脂處理生產(chǎn)透明質(zhì)酸的菌株的培養(yǎng)液，用活性炭處理上述培養(yǎng)液，并用有機溶劑使其沉淀以純化透明質(zhì)酸及其鹽。
7.權(quán)利要求6的純化透明質(zhì)酸及其鹽的方法，其特征在于芳族吸附樹脂是苯乙烯和二乙烯苯的共聚物或溴化聚苯乙烯。
8.權(quán)利要求6的純化透明質(zhì)酸及其鹽的方法，其特征在于芳族吸附樹脂選自HP10、HP20、HP21、HP30、SP800、SP850、SP875、SP205、SP206和SP207。
9.權(quán)利要求6的純化透明質(zhì)酸及其鹽的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(a)由生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株的培養(yǎng)液制備培養(yǎng)濾液；(b)向培養(yǎng)濾液中加入芳族吸附樹脂，攪拌，并進行超濾以制備已除去發(fā)熱物質(zhì)的透明質(zhì)酸的水溶液；(c)向透明質(zhì)酸的水溶液中加入有機溶劑以沉淀透明質(zhì)酸及其鹽，并干燥沉淀，其中所述方法還包括在步驟(a)或(c)后向培養(yǎng)濾液中或透明質(zhì)酸的水溶液中加入活性炭以及除去活性炭。
10.權(quán)利要求6的純化透明質(zhì)酸及其鹽的方法，其特征在于生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株是鏈球菌菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)透明質(zhì)酸的菌株鏈球菌KL0188和一種純化透明質(zhì)酸的方法，具體而言涉及不表達透明質(zhì)酸酶的非溶血性的鏈球菌KL0188以及一種使用芳族吸附樹脂和活性炭純化透明質(zhì)酸的方法。
文檔編號C08B37/08GK1675352SQ03819581
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月19日
發(fā)明者韓熙龍, 張圣弘, 金乙濟, 樸重慶, 韓永進, 李忠, 樸興順, 金潤哲, 樸鎬珍 申請人:可隆株式會社, 威科技術(shù)公司