專利名稱:氨基酸分離方法
本發(fā)明涉及從含至少兩種氨基酸的混合物中分離氨基酸的方法，特別是從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中分離氨基酸的方法。
已有多種制備氨基酸的方法，其中最常用的是化學(xué)或生物化學(xué)合成法。這些方法一般能得到以單一氨基酸溶液為主的制劑，單一氨基酸的提取及其純化通?？蛇_到可靠的工業(yè)生產(chǎn)水平。
但至今尚有某些氨基酸還難以在工業(yè)上以化學(xué)或發(fā)酵法制得。
氨基酸在蛋白質(zhì)內(nèi)部完全呈濃縮態(tài)，為所有動植物的組成部分;因此人們不斷尋求從蛋白質(zhì)水解物中提取氨基酸的途徑。在蛋白質(zhì)中，氨基酸為多達20種左右的混合物。
已嘗試過多種分離這些氨基酸的方法。事實上，值得注意的是所有氨基酸的物化性質(zhì)都甚為相似，均存在于生物體內(nèi)且常常沒有真正的主要組成部分，這就增加了其分離的困難程度。
文獻已報告的方法中，人們已嘗試過的有沉淀法，但此法分離效果不太好且必須回收沉淀試劑又使該方法復(fù)雜化;離子交換法，但此法因交換柱尺寸宏大且高度稀釋溶液及其連續(xù)作用方式而難實施。
從USP2，894，954中還可知用脂肪醇從氨基酸溶液中選擇性分離氨基酸的方法，但溶劑萃取能力一直很低，雖然這一缺點可通過添加己基胺來部分地加以克服，但即使在這后一種情況下，選擇性也非常差。
任何一種現(xiàn)有技術(shù)方法均不能以低于純粹化學(xué)或生物合成法成本的廉價從氨基酸混合物中分離出市場上需求的多種氨基酸如精氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸和組氨酸等。
本發(fā)明因此而提出了氨基酸分離方法，其特征是于至少一種醇，酮，醚和/或至少一種烴中用有機磷酸從汲盡胱氨酸后含至少兩種氨基酸的混合物中逆流選擇分離液態(tài)氨基酸。
本發(fā)明所用氨基酸混合物可來源于生化合成，化學(xué)后成，蛋白質(zhì)水解，生物轉(zhuǎn)化等的產(chǎn)物，而所用蛋白質(zhì)又可有角蛋白，農(nóng)產(chǎn)品，動物，血紅蛋白等各種來源。
本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物尤其是各種廢棄角蛋白如頭發(fā)，羊毛，羽毛，角，蹄等的水解產(chǎn)物。水解是用強無機酸如硫酸或鹽酸，強堿如鈉堿或鉀堿和酶在可變的時間尤其是在6-24小時內(nèi)于同樣是可變的溫度但優(yōu)選為約100℃下可靠地進行的，特別是進行化學(xué)水解。在汲盡胱氨酸特別是用鈉堿于高pH值下經(jīng)沉淀脫除胱氨酸之前或之后，必要時可將所得酸液濃縮。
含至少兩種氨基酸的混合物，優(yōu)選是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物混合物中的氨基酸濃度最低為100g/l，優(yōu)選是高于200g/l。
這種酸液再逆流與由有機磷酸，優(yōu)選為具有6-14，更優(yōu)選為具有8-10個碳原子的直鏈或支化脂肪醇和/或脂肪烴組成的有機萃取液接觸。
有機磷酸選自二烷基磷酸，二烷基膦酸，二烷基次膦酸，二芳基磷酸，二芳基膦酸，二芳基次膦酸等，而特別優(yōu)選的是2-二乙基己基磷酸。
二烷基或二芳基磷酸如下式(Ⅰ)
其中R1和R2為具有1-18個碳原子的芳基和/或脂肪基其中至少有一個具有4-15個碳原子。
二烷基或二芳基膦酸如下式(Ⅱ)
二烷基或二芳基次膦酸如下式(Ⅲ)
其中R1和R2同前述式(Ⅰ)定義。
可用的醇，酮和醚尤其選自具有至少5個碳原子的化合物。
優(yōu)選用具有8-10個碳原子的直鏈或支化醇，更優(yōu)選用2-乙基己醇。
可用的烴選自不溶于水的有機磷酸稀釋劑如具有至少5個碳原子的直鏈或支化脂肪烴，芳烴，囟代烴等，也可用其混合物，特別是石油餾分如煤油或SolvessoR。
優(yōu)選用煤油，更優(yōu)選用醇-煤油混合物。
本發(fā)明優(yōu)選萃取劑包括以下體積比的混合物-2-二乙基己基磷酸40-80%-2-乙基己醇5-20%-煤油55-0%市場上需求的主要氨基酸如纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，精氨酸和組氨酸可按下萃取工藝從汲盡胱氨酸的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物液中提取出來。
-苯丙氨酸可于介質(zhì)硫中于pH10用季銨鹽從氨基酸液中萃取出來;季銨鹽可選自氯化季銨鹽(R3N+CH3Cl-)或硫酸季銨鹽[(R3N+CH3)2SO4](R中有8-10個碳原子);這些產(chǎn)品的市售商名常為Adogen 464和Aliquat 336;尤其可用其3-20%(重量)的Solvesso
液。
-精氨酸可用預(yù)先調(diào)至pH2.7和7的萃取劑經(jīng)雙重萃取分離出來。
-亮氨酸可用pH3萃取劑萃取出來。
-異亮氨酸可用pH3采取劑從汲盡了苯丙氨酸的溶液中萃取出來。
本發(fā)明用下述實例進行詳細說明，這些實例不能理解為是對本發(fā)明的限制。
實例1從汲盡了胱氨酸的羽毛水解產(chǎn)物中分離氨基酸，pH2.7時水解產(chǎn)物組成如下-亮氨酸 21g/l-異亮氨酸 11.3g/l-苯丙氨酸 15g/l-精氨酸 24.5g/l-纈氨酸 17g/l-絲氨酸 39.5g/l-蘇氨酸 15g/l-脯氨酸 37.6g/l-丙氨酸 15g/l-谷氨酸 33.8g/l-天冬氨酸 24.5g/l-甘氨酸 26.3g/l-賴氨酸 5.6g/l
-蛋氨酸 1.9g/l-組氨酸 3.7g/l-NaCl 150g/l氨基酸總量為291.7g/l。將此溶液與如下組成的萃取液接觸2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%這一操作在圖1所示裝置中于逆流操作且理論上為9級的液-液萃取器1中進行。溶劑以100ml/h的流量從第1級，而氨基酸液于pH2.7以100ml/h的流量從第5級引入該萃取器。從第9級以40ml/h的流量引入10N鹽酸中含氯化鈉80g/l的溶液以進行選擇性洗滌。再以10ml/h的流量將10N鈉堿加入第2和5級的混合器中以在萃取時維持pH2.7。
從第1級出來的汲盡水相B中包含-精氨酸 17.5g/l-組氨酸 2.6g/l-賴氨酸 4g/l-谷氨酸 24.1g/l-甘氨酸 18.8g/l-天冬氨酸 17.5g/l-絲氨酸 28.2g/l-蘇氨酸 10.7g/l-丙氨酸 10.7g/l
-脯氨酸 26.8g/l-纈氨酸 ＜60ml/l-苯丙氨酸 ＜50ml/l-蛋氨酸 ＜6mg/l-亮氨酸 ＜15mg/l-異亮氨酸 ＜8mg/l-NaCl 100g/l這相當(dāng)于萃取率高于·99.5%(對于纈氨酸，蛋氨酸和苯丙氨酸)·99.9%(對于亮氨酸和異亮氨酸)從萃取器1排出的溶劑引入3級萃取器2，其中將該溶劑與流量為25ml/h的2N鹽酸溶液逆流接觸以從中回收萃取出的氨基酸水溶液。所得氨基酸水溶液A的組成如下-亮氨酸 84g/l-異亮氨酸 45.2g/l-苯丙氨酸 60l/l-纈氨酸 68l/l-蛋氨酸 7.6g/l-其它氨基酸 ＜2.4g/l氨基酸液B中繼續(xù)以10ml/h的流量添加10N鈉堿以將其調(diào)至pH7。所得溶液組成如下-精氨酸 16.3g/l
-組氨酸 2.5g/l-賴氨酸 3.7g/l-谷氨酸 22.4g/l-甘氨酸 17.5g/l-天冬氨酸 16.3g/l-絲氨酸 26.3g/l-蘇氨酸 10g/l-丙氨酸 10g/l-脯氨酸 25g/l-其它氨基酸 ＜0.2g/l-NaCl 92g/l再將此液與如下組成的萃取液接觸2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%這一操作在圖1所示裝置中于逆流操作且理論上為20級的液-液萃取器3中進行。溶劑以150ml/h的流量從第1級，而氨基酸液以150ml/h的流量從第7級引入該萃取器。選擇性洗滌用流量為80ml/h的含氯化鈉80g/l的溶液進行。再用以5ml/h的流量引入混合器3和7中的10N鈉堿將萃取時的pH維持在7。
從第1級出來的汲盡水相F中含99%以上的每一種氨基酸即賴氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，脯氨酸，丙氨酸，組氨酸和其它氨基酸以及少于150mg/l的精氨酸，這相當(dāng)于精氨酸萃取率高于99%。溶液F組成如下-賴氨酸 2.4g/l-谷氨酸 14.6g/l-甘氨酸 11.4g/l-天冬氨酸 10.6g/l-絲氨酸 17.1g/l-蘇氨酸 6.5g/l-丙氨酸 6.5g/l-脯氨酸 16.2g/l-組氨酸 1.6g/l-其它氨基酸 ≤0.12g/l-精氨酸 ≤0.15g/l-NaCl 80g/l從萃取器3中排出的含精氨酸的溶劑引入3級萃取器4，在其中將其與流量為25ml/h的2N鹽酸溶液逆流接觸以從中回收以水溶液萃取出的精氨酸。
所得水相為含97.8g/l的精氨酸和少于3g/l的其它氨基酸的水溶液。
汲盡水相F再與如下組成的有機相接觸2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%這一操作在圖1所示裝置中于逆流操作且理論上為19級的液-液萃取器12中進行。水溶液F以230ml/h的流量從第10級，而萃取劑以27ml/h的流量從第1級引入萃取器。選擇性洗滌是用以88.5ml/h的流量從第19級引入的0.15N鹽酸溶液進行的。10N鈉堿以15ml/h的流量從第1級引入。
在此條件下，從第1級出來的汲盡水相G中含少于25mg/l的組氨酸和高于99.9%的引入液F中的其它各種氨基酸。這相當(dāng)于組氨酸萃取率高于99.9%。將從第19級出來的含組氨酸的溶劑引入逆流操作且理論上為3級的液-液萃取器13，在其中將其與流量為10ml/h的2N鹽酸溶液接觸以從中回收以水相萃取出的組氨酸，可得到含37.5g/l的組氨酸和少于5mg/l的其它氨基酸的水相，即組氨酸純度至少為99.95%。
取第一次分離所得的再生提取物(記為A)并繼續(xù)以15ml/h的流量添加10N鈉堿而進行中和。
溶液A的組成如下-亮氨酸 52.5g/l-異亮氨酸 28.5g/l-苯丙氨酸 37.5g/l-纈氨酸 42.5g/l-蛋氨酸 4.8g/l-其它氨基酸 ≤1.5g/l-NaCl 80g/l再將其與如下組成的有機相接觸2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%這一操作在圖1所示的裝置中于逆流操作且理論上為24級的液-液萃取器5中進行。溶劑以170ml/h的流量從第1級，而氨基酸以40ml/h的流量從第12級引入該萃取器。選擇性洗滌是用以55ml/h的流量引入的1.25N鹽酸溶液進行的。10N鈉堿以10ml/h的流量從第1級引入。從第1級出來的汲盡水相C含高于99.8%的每一種氨基酸纈氨酸，蛋氨酸和其它氨基酸以及少于10mg/l的亮氨酸，異亮氨酸和苯丙氨酸，這相當(dāng)于這三種氨基酸的萃取率高于99.9%。
溶液C組成如下-纈氨酸 17.9g/l-蛋氨酸 2g/l-其它氨基酸 ≤0.6g/l-亮氨酸 ＜10ml/l-異亮氨酸 ＜10mg/l-苯丙氨酸 ＜10mg/l-NaCl 33g/l從萃取器5出來的溶劑引入3級萃取器6，在其中將其與以40ml/h引入的2N硫酸逆流接觸以從中回收以水相萃取出的氨基酸。所得水相D的組成如下-亮氨酸 52.5g/l-異亮氨酸 28.5g/l-苯丙氨酸 37.5g/l-其它氨基酸 ≤0.2g/l該溶液繼續(xù)用10N鈉堿以8ml/h的流量進行中和，這時溶液的組成如下-亮氨酸 42.7g/l-異亮氨酸 23.7g/l-苯丙氨酸 37.7g/l-其它氨基酸 ≤0.2g/l-Na2SO4142g/l繼續(xù)與如下組成的有機相逆流接觸而從中萃取出苯丙氨酸Aliquat
336 15%(以氯化物形式)Solvesso
150 85%這一接觸操作在圖1所示裝置中于理論上為16級的液-液萃取器7中進行。溶劑以140ml/h從第1級，而氨基酸液以48ml/h的流量從第8級引入該萃取器。選擇性洗滌用從第16級引入的流量為26ml/h的0.7N硫酸液進行。
以3ml/h從第1級引入10N鈉堿。在這種條件下，萃取出的苯丙氨酸在溶劑中的純度為99.9%，萃取率為99.7%。
從第1級出來的汲盡水相E的組成如下-亮氨酸 28.4g/l-異亮氨酸 15.4g/l-其它氨基酸 ≤0.1g/l-Na2SO492g/l從萃取器7出來的含苯丙氨酸的溶劑引入3級萃取器8，其中將其與以24ml/h的流量引入的2N硫酸溶液逆流接觸以從中回收以水相萃取出的苯丙氨酸，可得到含苯丙氨酸87.5g/l和其它氨基酸少于0.1%的水溶液。
將主要含亮氨酸和異亮氨酸的汲盡液E引入逆流操作且理論上為21級的液-液萃取器9中。
從第1級以90ml/h的流量向該萃取器中引入如下組成的溶劑2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%氨基酸液以74ml/h從第12級引入。選擇性洗滌用以130ml/h的流量從第21級引入的0.34N硫酸溶液進行。再以4ml/h的流量從第1級引入10N鈉堿。在這種條件下，汲盡水相為含純度高于98.8%的異亮氨酸5.6g/l的水溶液。
含亮氨酸的溶劑引入逆流操作且理論上為3級的液-液萃取器10中，其中萃取出的亮氨酸再與以20ml/h的流量引入的2N鹽酸溶液接觸而以水相得到回收，可得到含純度至少為99.8%的亮氨酸105g/l的水溶液。
實例2取實例1中第1次分離所得的再生提取物(記為A)并繼續(xù)以15ml/h的流量添加10N鈉堿而進行中和。
溶液組成如下-纈氨酸 42.50g/l-亮氨酸 52.50g/l-異亮氨酸 28.50g/l-苯丙氨酸 37.50g/l-蛋氨酸 4.15g/l
-酪氨酸 4.75g/l-其它氨基酸 ≤1.50g/l-Na2SO4142g/l再將其與氯化物形式的Aliquat
以15%(體積)溶入煤油中構(gòu)成的有機相接觸。
這一操作在圖2所示裝置中于逆流操作且理論上為16級的液-液萃取器5中進行。溶劑以117ml/h的流量從第1級，而氨基酸液以40ml/h的流量從第8級引入該萃取器。選擇性洗滌是用以22ml/h的流量從第16級引入的0.85N硫酸溶液進行的。從第1級以2.5ml/h的流量引入10N鈉堿。
在這種條件下，苯丙氨酸在溶劑中的純度為99.9%，其萃取率為99.7%。從該萃取器出來的含苯丙氨酸的溶劑引入3級萃取器6，其中將其與以20ml/h的流量引入的2N硫酸溶液逆流接觸以從中回收以水相萃取出的苯丙氨酸，可得到含苯丙氨酸75g/l和其它氨基酸少于0.1%的水溶液。
從第1級出來的汲盡液C的組成如下-亮氨酸 33.9g/l-異亮氨酸 18.4g/l-纈氨酸 27.4g/l-蛋氨酸 3.1g/l-酪氨酸 3.1g/l-Na2SO4142g/l-其它氨基酸 ≤1g/l再將其與如下組成的有機相接觸2-二乙基己基磷酸 75g/l2-乙基己醇 10g/l
煤油 15g/l這一操作在圖2所示裝置中于逆流操作且理論上為21級的液-液萃取器7中進行。溶劑以218ml/h的流量從第1級，氨基酸液以62ml/h的流量從第11級引入該萃取器。選擇性洗滌用流量為156ml/h的0.7N硫酸溶液進行。從第1級以13.5ml/h的流量引入10N鈉堿。
從第1級出來的汲盡水相D含高于99.8%的每一種氨基酸，即纈氨酸，蛋氨酸，酪氨酸和其它氨基酸以及少于10ml/h的亮氨酸和異亮氨酸，這相當(dāng)于這兩種氨基酸的萃取率為99.9%。溶液D的組成如下-亮氨酸 ≤10mg/l-異亮氨酸 ≤10mg/l-纈氨酸 7.8g/l-蛋氨酸 0.9g/l-酪氨酸 0.87g/l-其它氨基酸 ≤0.3g/l-Na2SO440g/l從萃取器7排出的溶劑引入3級萃取器8，其中將其與2N鹽酸液接觸以從中回收萃取出的氨基酸，主要為亮氨酸和異亮氨酸。用10N鈉堿中和之后，該溶液E的組成如下-亮氨酸 40g/l-異亮氨酸 28.50g/l-其它氨基酸 ≤0.1g/l
將其引入逆流操作且理論上為21級的萃取器9中。如下組成的溶劑2-二乙基己基磷酸 75%2-乙基己醇 10%煤油 15%以18ml/h的流量從第1級，而氨基酸液以40ml/h的流量從第12級引入該萃取器。選擇性洗滌是用流量為70ml/h的0.5N鹽酸進行的。從第1級以1.2ml/h的流量引入10N鈉堿。在這種條件下，汲盡水相為含純度高于98.8%的異亮氨酸10.4g/l的溶液。
排出的含亮氨酸的溶劑在理論上為3級的萃取器10中與以10ml/h的流量引入的2N鹽酸溶液逆流接觸，可得到含純度至少為99.8%的亮氨酸160g/l的水溶液。
實例3通過添加濃鹽酸將5ml于pH7.5下進行轉(zhuǎn)氨反應(yīng)反應(yīng)所得的含0.093摩爾L-苯丙氨酸和0.052摩爾天冬氨酸的溶液調(diào)至pH2.9。再向此溶液中添加5ml如下體積組成的混合物-雙(2-乙基己基)磷酸 75%-2-乙基己醇 10%-煤油 15%攪拌混合物后進行兩相分離并測定兩相的氨基酸含量。初始溶液中L-苯丙氨酸的94.2%轉(zhuǎn)移到了有機相而L-天冬氨酸的95%留在水相中。
實例4在調(diào)至pH2.9的450ml與實例1相同的溶液中加入如下體積組成的混合物450ml-雙(2-乙基己基)磷酸 50%-2-乙基己醇 6.7%-煤油 43.3%將此混合物攪拌，再進行潷析使之兩相分離。有機相用等體積的2N鹽酸逆流萃取。對第一級萃取后水相中的L-苯丙氨酸分析表明87%的L-苯丙氨酸已萃取出來了。
實例5通過添加濃鹽酸將5ml含0.05摩爾色氨酸，0.05摩爾L-絲氨酸和0.083摩爾甘氨酸的水溶液調(diào)至pH3。再向此溶液中添加5ml如下體積組成的混合物-雙(2-乙基己基)磷酸 75%-2-乙基己醇 10%-煤油 15%將此混合物攪拌，再進行潷析使之兩相分離。對水相的分析表明96%的L-色氨酸已在有機相中萃取出來，而L-絲氨酸和甘氨酸的95%以上仍保留在水相中。
實例6用濃鹽酸將5ml含0.05摩爾L-色氨酸，0.3摩爾L-絲氨酸和0.75摩爾甘氨酸的水溶液調(diào)至pH3。再向此溶液中添加5ml與實例5相同組成的萃取劑混合物。
攪拌和分析之后，對水相的分析表明97%的L-色氨酸已轉(zhuǎn)入有機相，而萃取出來的L-絲氨酸和甘氨酸少于5%。
權(quán)利要求
1.氨基酸分離方法，其特征是于至少一種醇，酮，醚和/或至少一種烴中用有機磷酸從汲盡胱氨酸后含至少兩種氨基酸的混合物中逆流選擇性分離氨基酸。
2.如權(quán)利要求
1的方法，其特征是所說氨基酸混合物為天然蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
3.如權(quán)利要求
1的方法，其特征是由蛋白質(zhì)水解而得的氨基酸混合物中含至少100g/l氨基酸。
4.如權(quán)利要求
3的方法，其特征是所說氨基酸混合物中含至少200g/l氨基酸。
5.如權(quán)利要求
1的方法，其特征是用以選擇性萃取氨基酸的是由有機磷酸，至少一種優(yōu)選為具有6-14個碳原子的直鏈或支化脂肪醇和/或至少一種脂肪烴組成的有機萃取液。
6.如權(quán)利要求
5的方法，其特征是有機磷酸選自二烷基磷酸，二烷基膦酸，二烷基次膦酸，二芳基磷酸，二芳基膦酸二芳基次膦酸。
7.如權(quán)利要求
6的方法，其特征是有機磷酸為2-二乙基己基磷酸。
8.如權(quán)利要求
5的方法，其特征是所述直鏈或支化脂肪醇具有8-10個碳原子。
9.如權(quán)利要求
8的方法，其特征是所述脂肪醇為2-乙基己醇。
10.如權(quán)利要求
1的方法，其特征是所述的脂肪烴選用煤油。
11.如權(quán)利要求
5的方法，其特征是有機萃取液的體積組成如下2-二乙基己基磷酸 40-80%2-乙基己醇 5-20%煤油 55-0%
專利摘要
本發(fā)明涉及氨其酸的分離方法，其中于至少一種醇，酮，醚和/或至少一種脂肪烴中用可能成液態(tài)的有機磷酸從汲盡胱氨酸后含至少兩種氨基酸的混合物中逆流選擇性萃取出氨基酸。
文檔編號C07B31/00GK87104295SQ87104295
公開日1988年3月2日 申請日期1987年6月19日
發(fā)明者瑪麗-克里斯蒂恩·比塔爾, 讓·路易斯·薩伯, 保爾·阿維隆·瓦爾勒 申請人:羅納·布朗克化學(xué)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan