專利名稱:改進(jìn)的融合產(chǎn)物的制作方法
由Kohler和Milstein在1975年所進(jìn)行的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與已被免疫的小鼠脾細(xì)胞的融合(Nature.256(1975)，495-497)，首次證實了連續(xù)獲得產(chǎn)生同型(所謂的“單克隆的”)細(xì)胞系的可能性以及由這些雜交瘤制造的抗體在各種科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)珍斷上的應(yīng)用。制備雜交瘤的方法一般包括下列步驟(a)用一種致免疫劑免疫小鼠或大鼠一類動物。所用的免疫方案應(yīng)該能夠產(chǎn)生有用量的適當(dāng)?shù)囊呀佑|抗原的脾細(xì)胞。
(b)從被免疫的動物體中取出脾臟，在一種合適的介質(zhì)中制成脾臟懸浮液。
(c)在一種合適的融合促進(jìn)劑存在的條件下，將該懸浮的脾細(xì)胞與從一合適的細(xì)胞系得來的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。融合促進(jìn)劑可以是仙臺病毒或是一化學(xué)融合劑，如平均分子量約1000至4000的聚乙二醇((PEG)(如商業(yè)上可得到的PEG1000等)。另一項有效的融合技術(shù)是根據(jù)已知方法的電-融合，如Zimmermann和Scheurich(Planta，151(1981)，26-32)、Vienken等(Planta，151(1983)，331)以及Jacob等(Sbud.Biophys，94(1983)，99)等所使用的方法。所用的骨髓瘤細(xì)胞系最好是所謂的“抗藥”型，以便使未融合的骨髓瘤細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上不能存活，而雜種則能存活，最普通的一類是8-氮鳥嘌呤抗性細(xì)胞系，由于它缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，從而不能夠在HAT(次黃嘌呤、氨基嘌呤和胸苷)培養(yǎng)基中存活。
(d)在各個容器中用選擇培養(yǎng)基稀釋并培養(yǎng)未融合的脾細(xì)胞，未融合的骨髓細(xì)胞和融合細(xì)胞的混合物，這種培養(yǎng)基將不能維持未融合的骨髓細(xì)胞以長時間而使未融合細(xì)胞死亡(約一周)。稀釋可以是一種有限型，其中稀釋劑的體積是通過統(tǒng)計學(xué)方法計算出來的，以便分離一定量的細(xì)胞數(shù)(如微量滴定板的每一孔)。在選擇性培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞死掉。由于未融合的脾細(xì)胞是非惡性的，它們僅有有限的代數(shù)，因此，經(jīng)過一段時間后(約一周)，這些未融合的脾細(xì)胞將不能繁殖。而另一方面，融合細(xì)胞由于具有骨髓瘤親本的惡性性質(zhì)以及脾細(xì)胞親本的在選擇培養(yǎng)基上的存活能力，所以能夠連續(xù)繁殖。
(e)鑒定在含有雜交瘤的每一容器(孔)中的上清液中抗體的存在，這種抗體是直接抗最初所使用的抗原的。
(f)篩選(如通過有限稀釋)和克隆產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤。
一旦所需的雜交瘤被篩選和克隆，則最終的抗體可以通過兩種方式之一產(chǎn)生。最純的單克隆抗體是在試管中在一種合適的培養(yǎng)基上對所需的雜交瘤進(jìn)行適當(dāng)時間的培養(yǎng)而產(chǎn)生的。然后由上清液中回收所需要的抗體。該適宜的培養(yǎng)基和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)周期為已知的或很易確定。這一試管技術(shù)生產(chǎn)的基本是單一的單克隆抗體，基本上無其它特定的抗人免疫球蛋白。既然培養(yǎng)基中含有異種血清(如牛胎兒血清)，所以該抗體中有少量的其它免疫球蛋白存在。但是，這一試管方法不能夠產(chǎn)生用于某些目的的大量抗體或抗體濃縮物，因為單克隆抗體的濃度僅約50微克/毫升。
為了產(chǎn)生在量的純度稍底的單克隆抗體濃縮物，可以將所需的雜交瘤注射進(jìn)小鼠中，最好是同源或半同源小鼠。適當(dāng)培養(yǎng)一段時間后，雜交瘤將引起產(chǎn)生抗體的腫瘤的形成，導(dǎo)致宿主小鼠的血流和腹膜浸出液(腹水)中所需抗體的濃度增高(約為5～20毫克/毫升)。
這一方法在文獻(xiàn)中已充分公開，它有特別的和嚴(yán)重的缺點。PEG作為融合劑已被越來越多的人所接受，因為其純品易于得到且在所需的分子量范圍內(nèi)，并且與仙臺病毒比較起來它較容易操縱。但是，PEG有效的整個濃度范圍非常窄。最佳濃度是50±5%(重量/體積)。在這一濃度下，它表現(xiàn)出對將被融合和已經(jīng)融合了的所有細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)。另一方面，當(dāng)使用亞最佳濃度的PEG時，僅現(xiàn)定到適度的細(xì)胞毒性，但是融合效率以及其后的雜交瘤形成都很低。與仙臺病毒相比，已知的化學(xué)融合劑如PEG和電-融合不影響被融合的細(xì)胞的凝集，因此，細(xì)胞膜在緊密貼近處對融合并非直接有效。
因此，本發(fā)明的目的之一就是提供能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的新型融合雜交細(xì)胞。本發(fā)明的目的之二是發(fā)展一種制備雜交細(xì)胞的方法，它是將能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的哺乳動物細(xì)胞或植物細(xì)胞(如胰島細(xì)胞)與能夠連續(xù)繁殖的合適的融合配偶體進(jìn)行融合。本發(fā)明的目的之三是要減少常規(guī)的化學(xué)融合劑的細(xì)胞毒作用，這些融合劑包括PEG、溶血卵磷脂、葡聚糖、DMSO(二甲基亞砜)、聚乙烯醇、聚-L-鳥氨酸以及已知有用的鹽如硝酸鈉或其組合物。在融合方法中，這將導(dǎo)致產(chǎn)生高產(chǎn)量的所需的雜環(huán)交細(xì)胞。本發(fā)明的目的之四是產(chǎn)生將被電-融合技術(shù)融合的凝聚細(xì)胞。
這些目的以及其它目的將在以下的敘述中清楚可見。從總體上講，本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的融合雜交細(xì)胞，它是將非抗體產(chǎn)生哺乳動物細(xì)胞與一種能夠連續(xù)繁殖的哺乳動物細(xì)胞融合而得到的，所說的融合通過首先一起凝聚然后影響凝聚細(xì)胞的融合而被簡化。從總體上講，本發(fā)明的另一個方面涉及植物細(xì)胞的凝聚和融合，以產(chǎn)生能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的雜交細(xì)胞。本發(fā)明涉及制備一個融合雜交細(xì)胞的方法，它是在選擇性條件下將能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的非抗體產(chǎn)生的哺乳動物細(xì)胞與能夠連續(xù)繁殖的哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行融合，它包括將被融合的細(xì)胞混合物與有效量的凝聚原接觸，然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合。在另一方面，本發(fā)明涉及植物細(xì)胞的凝聚和融合以產(chǎn)生能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的雜交細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備融合雜交細(xì)胞的方法，它包括將能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的植物細(xì)胞和能夠連續(xù)繁殖的植物細(xì)胞與有效量的凝聚原接觸，然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合。
本發(fā)明的另一方面是采用已知融合技術(shù)將能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的植物細(xì)胞的原生質(zhì)體與能夠連續(xù)繁殖的細(xì)胞(如根癌細(xì)胞)的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，它借助或未借助預(yù)先或伴隨的凝聚作用的幫助，這些雜交細(xì)胞具有產(chǎn)生所需的有用產(chǎn)物的能力。
“凝集原”是一個用于描述任何具有凝集被融合細(xì)胞的能力的試劑的術(shù)語。雖然它包括所有的凝集原，但典型的凝集原是植物凝集素(PHA)、伴刀豆球蛋白A和花生凝集素。本發(fā)明優(yōu)選的凝集原是PHA。凝集原的濃度應(yīng)進(jìn)行調(diào)整，使得觀察不到細(xì)胞毒性作用，而發(fā)生明顯程度的凝集作用。
凝集原PHA的適當(dāng)范圍是25～400微克/毫升。較好的PHA濃度為約150～200微克/毫升，最好是200微克/毫升。其它凝集原的合適濃度可以采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)很容易地被確定。凝集作用是在生理溫度(如37℃)下經(jīng)過足夠長時間(如5～15分鐘)的處理而進(jìn)行的。充分凝集后，就可進(jìn)行細(xì)胞的融合。在一實施方案中，首先加入常規(guī)的化學(xué)融合劑(最好是PEG)，然后在生理條件下培養(yǎng)混合物，實現(xiàn)凝集細(xì)胞的融合。當(dāng)使用PEG時，其濃度為約30～50%(重量/體積)。優(yōu)選的PEG的濃度約為40±5%(重量/體積)。最佳融合時間約為1分鐘。時間也可以更長，特別情況下達(dá)到2分鐘以上，但隨著時間的增加，存在著細(xì)胞毒性增加的危險。在另一實施方案中，凝集細(xì)胞的融合是通過電-融合實現(xiàn)的。
與以前技術(shù)所產(chǎn)生的結(jié)果相比，本發(fā)明的這一新型融合技術(shù)導(dǎo)致形成的能存活雜交細(xì)胞明顯增加。
術(shù)語“有用產(chǎn)物”包括被融合的哺乳動物細(xì)胞或植物細(xì)胞可以產(chǎn)生的所有產(chǎn)物。典型的例子有生物活性蛋白、糖蛋白、多肽、酶和非蛋白質(zhì)化合物，如生物堿、甾類、薯蕷皂苷配基、蒽醌、除蟲菊酯、芳香油、多糖、強心苷、香料和美發(fā)油成分。
能夠由被融合的細(xì)胞產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的典型例子如下面的表Ⅰ至Ⅴ所示。
表1生物堿 殺蟲劑變應(yīng)原 乳汁蒽醌 脂類抗白血病劑 萘醌抗腫瘤劑 核酸抗病毒劑 核苷酸香料 油苯醌 鴉片制劑碳水化合物(包括多糖) 有機酸強心苷 肽苯基苯乙烯酮 香水雙蒽 苯酚酶 色素酶抑制劑 植物生長調(diào)節(jié)素類黃酮、黃烷酮 蛋白質(zhì)食用香料(包括增香劑) 甾類及其衍生物螢香豆?jié)M酮 糖激素 鞣酸類物萜和類萜維生素表Ⅱ生物活性物質(zhì) 細(xì)胞來源 用途胰島素 胰島細(xì)胞 抗糖尿病胰高血糖素 胰島細(xì)胞 調(diào)節(jié)胰島素的產(chǎn)生生長激素抑制素 胰島細(xì)胞 調(diào)節(jié)胰島素的產(chǎn)生促腎上腺皮質(zhì)激素 垂體前葉細(xì)胞 消炎促黃體激素 垂體細(xì)胞 調(diào)節(jié)生殖促濾泡素 垂體細(xì)胞 調(diào)節(jié)生殖生長激素 垂體細(xì)胞 促進(jìn)生長促黃體激素 垂體細(xì)胞 調(diào)節(jié)生育力釋放激素促乳素 垂體細(xì)胞 刺激產(chǎn)乳促甲狀腺素(TSH) 垂體細(xì)胞 甲狀腺機能減退胸腺激素 胸腺細(xì)胞 免疫調(diào)諧劑紅血球生成素 腎臟 刺激紅細(xì)胞生成表皮生長因子 頜下腺 促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制胃酸分泌催產(chǎn)素 垂體后葉 控制子宮收縮和產(chǎn)乳后葉加壓素 垂體后葉 制尿激素腦啡吠 腎上腺嗜鉻細(xì)胞 止痛前房Naturietic 心臟細(xì)胞 舒張血管因子(ANF)
β-內(nèi)啡呔 腦，垂體 止痛抑制素 粒膜細(xì)胞(卵巢) 控制生育力降鈣素用狀腺細(xì)胞增加骨中Ca++的貯存甲狀旁腺激素 甲狀旁腺 引起骨的吸收(主細(xì)胞)白細(xì)胞介素-1 巨噬細(xì)胞 抗腫瘤白細(xì)胞介素-2 T輔助細(xì)胞 抗腫瘤白細(xì)胞介素-3 T輔助細(xì)胞 干細(xì)胞增殖α-干擾素 白細(xì)胞 抗病毒，抗腫瘤集落刺激因子-2 T細(xì)胞 MQ和粒細(xì)胞的增殖集落刺激因子-1 成纖維細(xì)胞 MQ的成長和活化B細(xì)胞生長因子 T輔助細(xì)胞 免疫缺陷腫瘤壞死因子 巨噬細(xì)胞 抗腫瘤γ-干擾素 巨噬細(xì)胞， 抗病毒和抗腫瘤T輔助細(xì)胞β-干擾素 成纖維細(xì)胞 抗病毒和抗腫瘤巨噬細(xì)胞激活 巨噬細(xì)胞 抗病毒和抗腫瘤因子血管原素 癌細(xì)胞 傷口愈合，血管形成甾類 腎上腺皮質(zhì)區(qū) 增殖神經(jīng)生長因子 唾腺細(xì)胞 神經(jīng)元再生血小板衍生 (Endothine 傷口愈合生長因子 血小板)黑素細(xì)胞刺激激 松果體細(xì)胞 著色控制素和褪黑激素表Ⅲ化合物群 類型及舉例藥劑 生物堿，甾類，蒽醌酶 蛋白酶(如木瓜蛋白酶)膠乳 類異戊二烯(如橡膠)蠟 蠟酯(如西蒙得木蠟)色素 著色劑和染料油 脂肪酸(如種子油)農(nóng)用化學(xué)品 殺蟲劑(如除蟲菊酯)美發(fā)油物質(zhì) 芳香油(如單萜)食品添加劑 香味化合物，非營養(yǎng)香料(如Thaumatin)樹膠 多糖(如阿拉伯樹膠)
表Ⅳ工業(yè) 植物產(chǎn)品 植物種 工業(yè)應(yīng)用藥劑 可待因(生物堿) 罌粟 止痛藥薯蕷皂苷配基(甾類) 三角葉薯蕷 抗生育力劑奎寧(生物堿) 金雞鈉樹 抗瘧藥地谷新(強心苷糖苷) 殺臘毛地黃 強心劑莨菪胺(生物堿) 曼陀羅 抗高血壓藥長青新堿(生物堿) 長春花 抗白血病藥農(nóng)業(yè)化學(xué)品 除蟲菊酯 除蟲菊 殺蟲劑食物及飲料 奎寧(生物堿) 金雞鈉樹 苦味劑Thaumat in(苯基 Thaumato- 非營養(yǎng)甜味劑苯己烯酮) coccusdanilli美容劑 茉莉 茉莉?qū)? 香水表Ⅴ藥用試劑 活性 植物來源來自薯蕷皂 抗生育力劑 三角葉薯蕷元的生物堿可待因 止痛藥 罌粟阿托品 抗膽堿能藥 顛茄利血平 抗高血壓藥 印度蘿芙木(蛇根木)莨菪堿 抗膽堿能藥 天仙子地高辛 強心劑 希蠟毛地黃東莨菪堿 抗膽減能藥 白花曼陀羅洋地黃毒甙 心血管藥 毛地黃匹魯卡品 膽堿能藥 毛果奎尼丁 抗瘧藥 金雞納樹來源于哺乳動物的非抗體產(chǎn)生細(xì)胞和植物細(xì)胞均可使用。植物細(xì)胞最好用原生質(zhì)體的形式。原生質(zhì)體的形成對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都是熟知的。
而且，產(chǎn)生除蛋白質(zhì)外的生物活性物質(zhì)(如甾類激素)的哺乳動物細(xì)胞也可被使用。對于植物細(xì)胞，產(chǎn)生生物堿(如奎寧，利血平，柯卡因，阿托品，莨菪胺，毛地黃，嗎啡類似物)的細(xì)胞均可被使用。
可被利用的細(xì)胞還包括那些產(chǎn)生芳香油和香水(麝香酮，靈貓酮，香葉醇以及其它在香水工業(yè)上有用的萜類似物質(zhì))的細(xì)胞。
用作融合配偶體的細(xì)胞及使哺乳動物細(xì)胞和植物細(xì)胞永生的連續(xù)繁殖(永久)細(xì)胞包括各種來源的骨髓瘤細(xì)胞，如來源于小屬、大鼠或人的細(xì)胞。典型的永久生長細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，如骨髓瘤細(xì)胞，從人瘤形成得到的細(xì)胞(包括HeLa細(xì)胞)，從咽癌細(xì)胞得到的HEP-2，從鼻咽癌細(xì)胞得到的KB，類淋巴母細(xì)胞，Eppstein-Barr病毒，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，高繁殖的胚胎細(xì)胞，肝癌細(xì)胞，腎癌細(xì)胞等。本發(fā)明中尤其重要的是抗藥性骨髓瘤細(xì)胞，包括鼠和人的骨髓癌細(xì)胞。雖然分泌型可被使用，但一般優(yōu)選所謂的“非分泌”型。
典型的連續(xù)生長植物細(xì)胞是根癌細(xì)胞，即被根癌土壤桿菌的有毒菌株轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞及其原生質(zhì)體。
與此相似，本發(fā)明也包括了雜交細(xì)胞的形成，這種細(xì)胞是通過將任何原核或真核型細(xì)胞(能夠產(chǎn)生有用物質(zhì))與任何合適的永生細(xì)胞融合而得到的，而不管這種永生細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞還是植物細(xì)胞。
融合細(xì)胞在含有常規(guī)的碳源、氮源以及微量鹽的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長和繁殖。繁殖基本上是在需氧條件下進(jìn)行的，即在95%的氧氣和5%的二氧化碳的混合物存在的條件下進(jìn)行。當(dāng)然，繁殖過后和所有以前步驟都是在無菌條件下進(jìn)行的。按照常規(guī)方法，可以在同源的或無胸腺的裸鼠中產(chǎn)生大量雜交細(xì)胞。這些細(xì)胞可以腹水或固體腫瘤的形式收集，且象常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)物一樣繁殖?？梢哉T導(dǎo)這些細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生大量的所需產(chǎn)物。一個典型的例子是從胰島細(xì)胞得到的雜交細(xì)胞的誘導(dǎo)，用葡萄糖誘導(dǎo)這些細(xì)胞，就可導(dǎo)致胰島素產(chǎn)量的增加。與此方式相類似，通過向產(chǎn)生尿激酶的雜交細(xì)胞中加入甘氨酸，就可刺激尿激酶的產(chǎn)生。
本發(fā)明的尤其重要的和新的特點在于，該方法促進(jìn)各種雜交細(xì)胞的產(chǎn)生，其中的每一種都能在同樣的培養(yǎng)基中產(chǎn)生它們自己特有的有用產(chǎn)物。例如(見例1)，從胰臟獲得的胰島細(xì)胞(所說的A、B、C、D型細(xì)胞的混合物，其中的某些將產(chǎn)生胰高血糖素，另一些將產(chǎn)生生長激素釋放抑制因子，還有一些將產(chǎn)生胰島素等。
由雜交細(xì)胞所產(chǎn)生的有用產(chǎn)物可用任何常規(guī)方法進(jìn)行分離，如從雜交細(xì)胞除去營養(yǎng)培養(yǎng)基，然后采用提取、逆流分配、親和層析、沉降、凝膠過濾、離子交換層析、HPLC(高壓液體色譜法)等方法。也可將這些方法結(jié)合使用。
其產(chǎn)物是熟知的，且進(jìn)行了鑒定，它們的用途也是熟知的。
下面的實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明。
實例1從剛出生的小鼠(一周齡)中取出胰腺組織，收集在盛有10毫升無菌Hank溶液的100毫米平皿中。該胰組織無結(jié)締組織和脂肪，且被絞碎成1×1毫米的小塊。在被膠原酶和胰蛋白酶分解前，用無菌鹽溶液將其沖洗兩次。然后將胰組織轉(zhuǎn)移到一錐瓶中(25毫升)，加入10毫升胰蛋白酶(用鹽水配成2.5%的濃度，Gibco)和2毫升的膠原酶(3毫克/毫升，Sigma)，通過溫和磁攪拌在37℃培養(yǎng)15分鐘，然后棄掉如此得到的上清液。重復(fù)胰蛋白酶-膠原酶處理三次，并且將每次得到的上清液在4℃保存。將通過離心(600g)得到的細(xì)胞沉淀懸浮在含有16.7mM葡萄糖的30毫升MEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基裝在10毫米的平皿中。在37℃培養(yǎng)22小時，同時通以95%的氧氣和5%的二氧化碳。收集未附著的漂浮胰島細(xì)胞，離心后用Hank溶液沖洗一次，在一無菌試管(15毫升Corning)中將如此得到的胰島細(xì)胞(6×107)與鼠骨髓瘤(Fox-NY)細(xì)胞(6×106)混合。通過離心用Hank溶液沖洗細(xì)胞混合物一次。輕輕懸浮得到的沉淀，加入0.2毫升的PHA(200微克/毫升)，在37℃將試管培養(yǎng)10分鐘。培養(yǎng)完畢后，向試管中加入0.8毫升50%(重量/體積)的PEG(平均分子量1000)溶液，以得到40%PEG的最終濃度。在37℃培養(yǎng)1分鐘后，試管中加入10毫升的MEM培養(yǎng)基，再在37℃培養(yǎng)1小時。細(xì)胞通過離心沖洗后懸浮于20毫升的HAT培養(yǎng)基中，再以0.2毫升/孔的量將其分散到96孔平板上(Corning)。在CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)平板。一周后更換培養(yǎng)基。并且在兩周后通過放射免疫測定(RIA)來檢測孔中胰島素的存在。傳代培養(yǎng)來維持陽性孔中的細(xì)胞。經(jīng)過48小時的培養(yǎng)后，這一方法獲得了24個產(chǎn)生80-200微量單位胰島素的陽性孔。
在這同一實驗中，也通過放射免疫測定(RIA)對這些孔中的生長激素抑制素胰高血糖素進(jìn)行了檢測。通過傳代培養(yǎng)和維持陽性孔中的細(xì)胞證實了在培養(yǎng)48小時后，有21個含有雜交細(xì)胞的孔中產(chǎn)生了300-400毫微微摩爾/毫升的胰高血糖素，有3個含有雜交細(xì)胞的孔中產(chǎn)生了約100-500摩爾/毫升的生長激素抑制素。
實例2按照實例1的方法，將從被小棒桿菌處理過的小鼠得到的活化腹膜巨噬細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。從得到的細(xì)胞中篩選白細(xì)胞介素-1，γ干擾素，腫瘤壞死因子和巨噬細(xì)胞活化因子。最后得到6個產(chǎn)生γ干擾素的孔。產(chǎn)生的γ干擾素約為100-300單位/毫升。
實例3通過混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)，活化從鼠脾臟得到的T-淋巴細(xì)胞，然后象實例1所述的那樣進(jìn)行融合。從得到的雜交細(xì)胞中篩選白細(xì)胞介素2，3和B細(xì)胞生長因子。
實例4按實例1融合垂體細(xì)胞，然后從得到的雜交細(xì)胞中篩選生長激素和促乳素利用激素。
實例5按實例1的方法，將由根癌(由煙草植物的根癌土壤桿菌有毒菌株誘導(dǎo))制備的原生質(zhì)體與從印度蘿芙木得到的原生質(zhì)體進(jìn)行融合。用已建立的方法提取迅速分裂的雜交細(xì)胞，以獲得利血平。
實例6按照實例1的方法，將從煙草植物的根瘤得到的原生質(zhì)體與從毛地黃得到的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，對這樣得到的雜交細(xì)胞進(jìn)行提取，以得到毛地黃糖苷。
實例7按照實例1的方法，將從煙草植物的根癌得到的原生質(zhì)體與從顛茄得到的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，對得到的雜交細(xì)胞進(jìn)行提取，以得到阿托品。
權(quán)利要求
1.一種能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的融合雜交細(xì)胞，它是通過非抗體產(chǎn)生哺乳動物細(xì)胞與能夠連續(xù)繁殖的哺乳動物細(xì)胞的融合而得到的，所說的融合是通過首先引起凝聚然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合而促進(jìn)的。
2.一種能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的融合雜交細(xì)胞，它是通過一種植物細(xì)胞與一種能夠連續(xù)繁殖的植物細(xì)胞的融合而得到的，所說的融合通過首先引入起凝聚，然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合而促進(jìn)的。
3.由權(quán)利要求
1或2的雜交細(xì)胞所產(chǎn)生的有用產(chǎn)物。
4.一種制備雜交細(xì)胞的方法，它是在融合并在選擇條件下將非抗體產(chǎn)生的哺乳動物細(xì)胞與能夠連續(xù)繁殖的哺乳動物細(xì)胞融合而得到的，這一方法包括將被融合的細(xì)胞混合物與有效量的凝聚原相接觸，然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合。
5.一種制備融合雜交細(xì)胞的方法，它包括將能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的植物細(xì)胞和能夠連續(xù)繁殖的植物細(xì)胞與有效的凝集原接觸，然后進(jìn)行凝集細(xì)胞的融合。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4或5所述的方法，其特征在于凝聚原是植物血球凝聚素。
7.根據(jù)權(quán)利要求
4或5所述的方法，其特征在于其融合為化學(xué)融合。
8.根據(jù)權(quán)利要求
4或5所述的方法，其特征在于其融合為電-融合。
9.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于其融合劑是平均分子量為1000至4000的PEG。
10.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其特征在于能夠連續(xù)繁殖的植物細(xì)胞是根癌細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中連續(xù)繁殖的細(xì)胞是骨髓瘤細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生胰島素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是胰島細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生胰高血糖素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是胰島細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生生長激素抑制素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是胰島細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生ACTH的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體前葉細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生促黃體生成激素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
17.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生促濾泡素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生生長激素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生LH-RH(黃體生成素釋放激素)的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
20.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生促乳素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
21.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生促甲狀腺素(TSH)的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
22.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生胸腺激素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是胸腺細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
23.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生紅血球生成素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是腎細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
24.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生表皮生長因子的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是頜下腺細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
25.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生催產(chǎn)素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體后葉細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
26.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生后葉加壓素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體后葉細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
27.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生腦啡肽的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是腎上腺嗜鉻細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
28.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生前房Naturietic因子(ANF)的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是心臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
29.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生內(nèi)啡肽的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是腦或垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
30.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生抑制素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是粒膜細(xì)胞(卵巢)與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
31.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生降鈣素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是甲狀腺細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
32.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生甲狀旁腺激素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是甲狀旁腺細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
33.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1的融合雜交細(xì)胞所說的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
34.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生白細(xì)胞介素-2的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是T輔助細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
35.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生白細(xì)胞介素-3融合雜細(xì)胞，所說的雜交細(xì)胞是T輔助細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
36.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生α-干擾素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是白細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
37.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生集落刺激因子-2的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是T細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
38.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生集落刺激因子-1融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
39.權(quán)利權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生β細(xì)胞生長因子的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是T輔助細(xì)胞與骨髓瘤的融合產(chǎn)物。
40.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生腫瘤壞死因子的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)物。
41.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生γ-干擾素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞或T輔助細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
42.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生β-干擾素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
43.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生巨噬細(xì)胞激活因子的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
44.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生血管原素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是癌細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
45.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生甾類的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
46.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生神經(jīng)生長因子的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是唾腺細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
47.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生得自血小板的生長因子(GF)的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是Endothine血小板與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
48.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能夠產(chǎn)生促黑素細(xì)胞激素和褪黑激素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是松果體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。
專利摘要
本發(fā)明介紹了新型的改進(jìn)融合產(chǎn)物。
文檔編號C07K7/16GK87104365SQ87104365
公開日1988年2月3日 申請日期1987年6月23日
發(fā)明者賽·P·三卡拉 申請人:默里爾多藥物公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan