專利名稱:4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶衍生物的制備方法
本發(fā)明涉及N-[4-(N-(2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并-[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸的衍生物(這些衍生物是抗腫瘤藥劑)及它們的制備和應(yīng)用，以及在這些衍生物的制備中有用的中間物。
葉酸抗代謝物氨基蝶呤和氨甲蝶呤(也稱為10-甲基氨基蝶呤)是抗腫瘤藥劑，這些化合物抑制包括葉酸的代謝衍生物的酶促轉(zhuǎn)化作用。例如氨甲蝶呤抑制二氫葉酸還原酶(它是一種由二氫葉酸鹽還原成四氫葉酸鹽所必需的酶)而二氫葉酸是在用胸苷酸合成酶使2-脫氧尿苷酸轉(zhuǎn)化為胸苷酸時形成的。
已經(jīng)合成了葉酸的及氨基蝶呤的其他衍生物并已作為抗代謝物進(jìn)行了試驗。在這些化合物中即在分子中通常為亞氨基或次氮基占據(jù)的位置上分別為亞甲基或次甲基所占據(jù)的化合物。這些化合物具有不同程度的代謝拮抗活性。10-脫氮雜氨基蝶呤具有高度的活性(Sirotak等人，癌癥治療報告書，1978，62，1047)而5-脫氮雜氨基蝶呤則具有與氨甲蝶呤相似的活性(Taylor等人，有機(jī)化學(xué)雜志，1983，48，4852)。據(jù)報告8，10-二脫氮雜氨基蝶呤具有活性(美國專利第4,460,591號)而5，8，10-三脫氮雜氨基蝶呤顯示抗小鼠L1210白血病的活性(Yan等人，雜環(huán)化學(xué)雜志，1979，16，541)。另一方面10-脫氮雜葉酸卻沒有顯示出顯著的活性(Struck等人，醫(yī)藥化學(xué)雜志，1971，14，693)而5-脫氮雜葉酸僅有微弱的細(xì)胞毒性。8，10-二脫氮雜葉酸作為二氫葉酸還原酶抑制劑僅有一定程度的效力(De Graw等人，“蝶啶的化學(xué)和生物學(xué)”，Elsevier，1979，229)而5，8，10-三脫氮雜葉酸也僅僅顯示出一定程度的抗小鼠L1210白血病的活性(Oatis等人，醫(yī)藥化學(xué)雜志，1977，20，1393)。在醫(yī)藥化學(xué)雜志，28∶7，914(1985)中Taylor等人發(fā)表了5，10-二脫氮雜氨基蝶呤和5，10-二脫氮雜-5，6，7，8-四氫氨基蝶呤以及相應(yīng)的5，10-二脫氮雜蝶呤衍生物。
本發(fā)明涉及(i)4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶類的化學(xué)式如下
式中R1是氫、甲基、乙基、或R5CO-在此基團(tuán)中R5是氫或具有1至6個碳原子的烷基；標(biāo)有*符號的碳原子的構(gòu)型是L型；(ii)此化學(xué)式的互變異構(gòu)體；(iii)它的可做藥用的鹽。
本發(fā)明也涉及這類化合物的制備方法和在這些制備中有用的中間物，并涉及在抗腫瘤中應(yīng)用這些化合物的組合物及方法。
本發(fā)明的化合物是5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶雜環(huán)的衍生物，此雜環(huán)上的原子其位次編號如下
化學(xué)式I的化合物與相應(yīng)的4-羥基化合物之間存在著互變異構(gòu)平衡
為了方便起見，上述用4(3H)-氧代的形式來描述而且本說明書中全部應(yīng)用相應(yīng)的命名原則，應(yīng)該理解在每一種情況下這一名詞包括互變異構(gòu)的3，4-脫氧-4-羥基式。
在谷氨酸鏈上，標(biāo)有*號的碳原子的絕對構(gòu)型是L型，與在丙氨酸上的相應(yīng)的α-碳原子的絕對構(gòu)型相同。在5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶環(huán)系統(tǒng)的6-位上的碳原子也是一個手性中心，導(dǎo)致產(chǎn)生d，L-和1，L-非對映異構(gòu)體，這兩種形式的異構(gòu)體(當(dāng)應(yīng)用色譜法時，可用機(jī)械方法將它們分離)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明包括可作醫(yī)藥用的鹽類，這些鹽類要未與酸形成(包括在8-位上的氮原子上形成的鹽)要未與堿形成(包括在谷氨酸殘基上的羧酸基團(tuán)上形成的鹽)。與堿形成的鹽類包括堿金屬、堿土金屬、無毒性金屬、銨、取代的銨等的鹽類，例如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋁、鋅、銨、三甲銨、三乙銨、三乙醇銨、吡啶鎓、取代的吡啶鎓等等。與酸形成的鹽類包括可作醫(yī)藥用的、無毒的酸加成鹽類，例如由(i)無機(jī)酸，例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等等所成的鹽，(ii)有機(jī)羧酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丁二酸、馬來酸、羥基馬來酸、甲基馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、4-苯氧基苯甲酸、2-乙酸氧基苯甲酸、4，4′-亞甲基雙(3-羥基-2-萘酸)、煙酸或異煙酸、和(iii)有機(jī)磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、乙基-1，2-二磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸或萘-2-磺酸。
本發(fā)明的化合物作為一種底物對應(yīng)用于葉酸特別是葉酸代謝衍生物的一種或幾種酶有作用。
本發(fā)明的化合物可由下式的2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶基-L-谷氨酸衍生物的第一步水解或氫解而制得
式中
R1的定義如前；R2和R3是相同或不相同的羧酸保護(hù)基團(tuán)；R4是一種氨基保護(hù)基團(tuán)；而標(biāo)有*號的碳原子構(gòu)型是L型。
保護(hù)基包括R2、R3和R4而對于除去它們的反應(yīng)，在文獻(xiàn)中已有敘述例如在以下文獻(xiàn)中“有機(jī)化學(xué)的保護(hù)基團(tuán)”Plenum出版，倫敦和紐約(1973)；Greene，“在有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)“Wiley，紐約(1981)；“肽”第1卷，Schroder和Lubke，Academic出版，倫敦和紐約(1965)；“有機(jī)化學(xué)方法”Houben-Weyl，第4版，15/I卷，Georg Thieme Verlag，Stuttgart(1974)。
羧酸保護(hù)基團(tuán)理論上可以是例如由具有1至6個碳原子的低級烷醇得到的酯，包括在1-位上有側(cè)鏈的和由一個或多個芳香基團(tuán)(如苯基)或由鹵素或烷氧基取代的酯，例如甲基、乙基、叔丁基、芐基、4-硝基芐基、二苯基甲基、甲氧基甲基取代的以及類似的酯類。也可以使用正硅烷酯類如三甲基硅烷酯。
氨基保護(hù)基包括脂?；?，特別是2至6個碳原子的烷?；?、烷氧羰基(它們可以被鹵素、烷氧基或苯基取代)；例如乙酰基、新戊酰基、2，2，2-三氯乙?；?、苯甲?；⑹宥⊙豸驶?、4-硝基芐氧基羰基等等。
水解作用是在正常的溫度下利用稀堿水溶液(例如0.1-0.3N堿金屬的氫氧化物水溶液)，任選地在一種與水混溶的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等等或一種酸例如三氟乙酸存在下進(jìn)行。如果有-N′-COR5基團(tuán)存在的話，應(yīng)用酸或強(qiáng)堿將導(dǎo)致水解作用發(fā)生?？梢杂^察到分子的谷氨酸部分的某些外消旋作用。
水解作用所形成的初步產(chǎn)物是雙陽離子谷氨酸鹽，而使用酸性如乙酸或0.5N鹽酸進(jìn)行酸化調(diào)節(jié)pH值，則此谷氨酸鹽很易變?yōu)橛坞x酸而測定出來。得到的產(chǎn)物通常是高熔點(diǎn)的結(jié)晶或微結(jié)晶固體。
另一方面，化學(xué)式I的化合物的制備，正如可由化學(xué)式II的谷氨酸中間物來制備那樣，可由化學(xué)式III的吡啶并[2，3-d]嘧啶化合物的氫化作用來制備
在式中R1的定義如前；R2′、R3′、各是氫或一種羧酸保護(hù)基，其定義與上述的R2和R3相同而R4是氫或一種氨基保護(hù)基團(tuán)，其定義與上述R4相同。
氫化作用是在一種酸性介質(zhì)中在一種貴金屬催化劑如鉑、釕或銠(包括它們的氧化物以及它們的截體)存在下進(jìn)行的。而以氧化鉑做催化劑較好。反應(yīng)時間、溫度、壓力的選擇是以能使吡啶環(huán)還原(不包括嘧啶環(huán))為準(zhǔn)。例如當(dāng)應(yīng)用氧化鉑為催化劑在室溫下在氫壓力為50至60磅/英寸2時約反應(yīng)15分鐘即可得到所需的產(chǎn)品。
當(dāng)R2′、R3′和R4′是氫時，其還原的產(chǎn)物是化學(xué)式I的化合物。如果R2′、R3′和R4′都不是氫則產(chǎn)物是化學(xué)式II的化合物。
化學(xué)式III的化合物是已知的或可用通常的方法制備。例如可以用適當(dāng)?shù)脑噭┨幚?-氨基-4(3H)-氧代-6-甲?；拎げ2，3-d]嘧啶以引入R保護(hù)基如乙酸酐，再使生成的化合物與一種被保護(hù)的N-(4-氨基苯甲酰基)-L-谷氨酸衍生物反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)式III的化合物，在此合物中R1＝H[見Taylor等人，有機(jī)化學(xué)雜志，48，4852(1983)]。應(yīng)用相應(yīng)的N-(4-甲基氨基苯甲?；?-L-谷氨酸或N-(4-乙基氨基苯甲酰基)-L-谷氨酸產(chǎn)生化學(xué)式III的相應(yīng)的化合物，其中的R1分別是甲基或乙基。
R1是H的化學(xué)式III的化合物經(jīng)乙?；饔镁涂傻玫絉1是R5CO-的化學(xué)式III的化合物。
當(dāng)R5是氫時，可應(yīng)用過量的甲酸[見Haynes等人，醫(yī)藥化學(xué)雜志20，588-591(1977)]或甲酸的活性乙?；苌锢缁旌系募姿狒?例如它可由甲酸與乙酸酐形成)進(jìn)行乙?；饔?。
當(dāng)R5是烷基時，則可應(yīng)用羧酸的活性衍生物例如象乙酰氯這樣的鹵化酸。
R1是R5CO-的化學(xué)式II和III的化合物是有價值的中間物，對于制備R1是氫的化學(xué)式I的最終化合物即N-[4-(N’-(2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸時尤其如此。這個化合物具有抗腫瘤活性并可通過化學(xué)式IV的化合物的直接氫化作用，任選的接著除去任何保護(hù)基團(tuán)R、R和R而制備成。但是在還原作用之前，引入N’-?；鶊F(tuán)如甲酰基、提供增加對易于氫解的氨基[由于苯甲基的胺(benzylic amine)的本性]的保護(hù)作用。因此首先要形成化學(xué)式III的N’-甲?；苌?，再氫解而產(chǎn)生化學(xué)式II的N’-甲?；?四氫中間物，然后使其水解，最好是酸水解與堿水解相繼進(jìn)行，而得到N-[4-(N’-(2-氨基-4(3H)-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸在最終產(chǎn)物的分子上存在著兩個手性中心在四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶環(huán)的-6-位上的碳原子和在谷氨酸基團(tuán)上的α-碳原子。至于該化合物在理論上的四種型式，在制備化學(xué)式III的化合物還原作用之前，引入N’-?；鶊F(tuán)如甲?；?、提供增加對易于氫解的氨基[由于苯甲基本的胺(benzylic amiuc)的本性]的保護(hù)作用。因此首先要形成化學(xué)式III的N’-甲酰基衍生物，再氫解而產(chǎn)生化學(xué)式II的N’-甲?；?四氫中間物，然后使其水解，最好是酸水解與堿水解相繼進(jìn)行，而得到N-[4-(N’-(2-氨基-4(3H)-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲酰基]-L-谷氨酸在最后產(chǎn)物的分子上存在著兩個手性中心在四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶環(huán)的6-位上的碳原子和在谷氨酸基團(tuán)上的α-碳原子。至于該化合物在理論上的四種型式，在制備化學(xué)式III的化合物時，對被保護(hù)的N-(4-氨基苯甲酰基)-L-谷氨酸試劑的應(yīng)用降低其可能性至兩個。然而，這兩者都是在相繼的氫化成化學(xué)式II的化合物時產(chǎn)生的，在除去了保護(hù)基團(tuán)之后，結(jié)果就生成了以(S，S)和(R，S)非對映異構(gòu)體混合物狀態(tài)存在的所需要的化合物。這兩個化合物(其中R2′、R3′和R4′都是氫)可表示如下
應(yīng)用色譜法可將這兩個非對映異構(gòu)體機(jī)械地分開，因此每一個化合物都大體上不混有另一個，即其旋光純度達(dá)到95％以上。另一方面，用一種合用的手性酸處理化學(xué)式I的非對映異構(gòu)體化合物可隨即形成一種鹽。然后通過一次或多次分部結(jié)晶法將所得到的非對映異構(gòu)體分離再通過用堿處理并除去保護(hù)基，至少一種分離出來的鹽的陽離子部分的游離堿被釋放出來。在除去保護(hù)基之前之后，或者在堿性條件下，當(dāng)這些基團(tuán)輕易地被除去時隨著除去這些基團(tuán)，可以用不連續(xù)的步驟進(jìn)行而釋放出鹽的陽離子，即進(jìn)行堿性水解。
適合的手性酸包括10-樟腦磺酸的個別對映體、樟腦酸、α-溴樟腦酸、薄菏氧乙酸、酒石酸、二乙酰酒石酸、蘋果酸、吡咯烷酮-5-羧酸等等。
可以單獨(dú)或混合的形式使用化學(xué)式I的化合物治療過去用氨甲蝶呤治療的腫瘤，包括絨毛膜癌、白血病、女性的乳腺癌、頭和頸的表皮癌、鱗狀的或小細(xì)胞肺癌，以及各種淋巴肉瘤。有代表性的化合物例如N-[4-(N′-(2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲酰基]-L-谷氨酸在72小時檢測抗CCRF-CEM細(xì)胞系(一種人類T-細(xì)胞衍生的白血病)中顯示出IC50為0.0052-0.0079微克/毫升(2.2×10-7摩爾)。而其非對映異構(gòu)體所顯示的IC50分別為0.0026和0.0027微克/毫升。N-[4-(N′-[2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-N’-甲酰氨基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸在同樣的測試中顯示的IC50為0.011。在另一方面，在這個測試中5-脫氮雜葉酸則相對地?zé)o活性，這些化合物也可以用來治療蕈樣真菌病和牛皮癬。
這些化合物可通過口服或較好是通過非腸道施用，可單獨(dú)或與其他的抗腫瘤劑，甾類化合物等結(jié)合施用于患腫瘤而需要治療的哺乳動物。非腸道施藥的途徑包括肌肉內(nèi)注射、鞘內(nèi)的注射、靜脈內(nèi)注射或動脈內(nèi)的施用。通常，施用這些化合物的方式與施用氨甲蝶呤的方式很相似，但是由于作用的方式不同，這些化合物的施用劑量較高于通常使用氨甲蝶呤的劑量不需要甲酰四氫葉酸解救。劑量的規(guī)定方案必須要滴注到特定的腫瘤處，按病人的條件和反應(yīng)而定，但通常的劑量是在5-10天內(nèi)每天約從10至100毫克或單次一日施用250-500毫克，周期性地重復(fù)使用如每14天一周期，口服劑量的形式包括每單位劑量含有1-10毫克藥物的片劑和膠囊。含有20-100毫克/毫升的等滲鹽水溶液可以用作腸道的施藥。
下面的實施例中將用作進(jìn)一步說明本發(fā)明實施例1N-[4-(N’-[2-乙酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲?；鵠谷氨酸二乙酯。
將800毫克2-乙酰氨基-6-甲酰基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶[Taylor等人，有機(jī)化學(xué)雜志48，4852(1983)]在55毫升冰醋酸中和1.2克對氨基苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯的混合物在室溫下靜置5小時。然后向此混合物中加入0.19毫升的氫化硼三乙胺復(fù)合物。在室溫下攪拌此混合物40分鐘然后在60℃加熱10分鐘。使此反應(yīng)混合物冷卻，并在真空中濃縮。將所得到的殘留物溶于90毫升甲醇中，將溶液過濾。用20毫升甲醇和360毫升乙醚洗滌從過濾收集到的固體。將濾液合并并蒸發(fā)至干。用硅膠快速色譜法[見still等人，有機(jī)化學(xué)雜志，43，2923(1978)](洗脫液為氯仿∶甲醇97∶3)分離提純殘余物，得到1.08克N-[4-(N’-(2-乙酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二乙酯。
實施例2N-[4-(N’-[2-乙酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯。
將含有340毫克N-[4-(N’-(2-乙酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二乙酯的80毫升甲醇與40毫升冰醋酸的混合物放置于氫化作用裝置(Adams)的容器內(nèi)。加入55毫克的氧化鉑催化劑并將該混合物在60磅/英寸2壓力及室溫下氫化15分鐘。過濾除去催化劑，并在真空中濃縮濾液。用硅膠快速色譜法，洗脫液成份為氯仿∶甲醇(97∶3至95.5∶5)分離殘余物，收集各液份各20毫升。液份62-73含有副產(chǎn)物2-乙酰氨基-6-甲基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶。液份74-88含有15.4毫克所需的產(chǎn)物N-[4-(N’-(2-乙酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯。
實施例3N-[4-(N’-[2-乙酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸將20毫克N-[4-(N’-(2-乙酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯溶于8毫升甲醇中并加入0.4毫升的1.0N的氫氧化鈉水溶液。將此混合物在室溫攪拌96小時然后加入0.1毫升冰醋酸。在真空中除去甲醇并將殘留物溶于5毫升水中。用0.16毫升冰醋酸將此混合物酸化，經(jīng)過濾收集所形成的溶液，得到6.0毫克產(chǎn)物N-[4-(N’-[2-乙酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲酰基]-L-谷氨酸。質(zhì)譜于444。
實施例4N-[4-(N’-[2-乙酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-N’-甲酰氨基苯甲?；鵠谷氨酸二乙酯。
將98％的甲酸(25毫升)和乙酸酐(4.9毫升，5.25克，51.5毫摩爾)的混合物在25℃攪拌2小時。向此溶液加入2.43克(4.5毫摩爾)的N-[4-(N’-[2-乙酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二乙酯[Taylor等人，有機(jī)化學(xué)雜志48，4852(1983)]。將此混合物在55℃攪拌15分鐘并在25℃攪拌1小時。在減壓下將溶劑除去并將殘留物在乙醚中研磨，濾出固體物質(zhì)，從2-丙醇中重結(jié)晶得到2.0克(78％)的N-[4-(N’-[2-乙酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-N’-甲酰氨基)苯甲?；鵠谷氨酸二乙酯熔點(diǎn)180-182℃1H NMR(Me2SO-d6)delta 1.05-1.23(m，6H)，1.95-2.10(m，2H)，2.16(s，3H)，2.49(t，1H，J＝7.36Hz)，3.97-4.10(m，4H)，4.36-4.39(m，1H)，5.24(m，2H)，7.51-7.54(m，2H，AA′BB′)，7.84-7.87(m，2H，AA′BB′)，8.21(m，1H)，8.69-8.75(m，2H)，8.82(s，1H).分析計算 C27H30N6O8 C，57.24；H，5.34；N，14.83.實測 C，56.94；H，5.11；N，14.57.
實施例5N-[4-(N’-[2-新戊?；被?4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-N’-甲酰氨基)苯甲?；鵠-谷氨酸二乙酯。
用相似于實施例4的方法利用N-[4-(N’-[2-新戊?；被?4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]氨基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二乙酯制備標(biāo)題化合物；1H NMR(Me2SO-d6)delta 1.09-1.16(m，6H)，1.21(s，9H)，1.90-2.10(m，2H)，2.39(t，2H，J＝7.37Hz)，3.96-4.09(m，4H)，4.31-4.43(m，1H)，5.22(s，2H)，7.50-7.53(AA′BB′，2H)，7.83-7.86(AA′BB′)，8.21(m，1H)，8.71(d，1H，J＝5.87Hz)，8.72(m，1H)，8.80(s，1H).
實施例6N-[4-(N’-[2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-N’-乙酰氨基)苯甲?；鵠-谷氨酸二乙酯。
將0.097克(1.2毫摩爾)的乙酰氯加到N-[4-(N’-[2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]-嘧啶-6-基甲基]-氨基)苯甲?；鵠谷氨酸二乙酯(1.1毫摩爾)與含有0.22克(2.2毫摩爾)的碳酸氫鉀冷卻至0-5℃的10毫升二氯甲烷的攪拌懸浮液中。將反應(yīng)混合物在0-5℃攪拌10分鐘，然后使其達(dá)到室溫。在室溫攪拌45分鐘之后，加入50毫升二氯甲烷。用25毫升水，25毫升碳酸氫鈉飽和溶液萃取該混合物，然后再用25毫升水萃取。合并水萃取液并再用50毫升二氯甲烷再萃取該水萃取液。用無水硫酸鎂干燥有機(jī)萃取液，過濾，在減壓下除去溶劑得到0.7克N-4-(N’-[2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]N’-乙酰氨基)苯甲?；鵠谷氨酸二乙酯，1H NMR(Me2SO-d6)delta 1.10-1.17(m，6H)，1.22(s，9H)，1.88(s，3H)，1.88-2.13(m，2H)，2.40(t，2H，J＝7.46Hz)，3.97-4.08(m，4H)，4.30-4.42(m，1H)，5.02(s，2H)，7.34-7.36(AA′BB′，2H)，7.83-7.86(AA′BB′，2H)，8.19(m，1H)，8.64(m，1H)，8.75(d，1H，J＝7.39Hz).
實施例7N’-〔4-(N-(2-乙酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基甲基〕N’-甲酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸二乙酯。
將0.743克(0.36毫摩爾的N-〔4-(N’-〔2-乙酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲酰基〕-L-谷氨酸二乙酯和含有230毫克氧化鉑的75毫升2∶1 乙醇∶乙酸溶液的混合物在氫氣氛下(40磅/英寸)振蕩1.5小時。將反應(yīng)混合物通過硅藻土過濾并蒸發(fā)濾液(先在吸氣真空下蒸發(fā)然后在高真空下蒸發(fā)并保持盡可能的低溫)。將殘留物溶于二氯甲烷中用色譜法(Chromatotron)分離提純用5％甲醇的二氯甲烷溶液洗脫，得到0.684克(93％)的N-〔4-(N’-(2-乙酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸二乙酯)熔點(diǎn)188°-190℃；1H NMR(Me2SO-d6)delta 1.12-1.19(M，6H，CH3的酯)，1.89-2.11(m，4H)，2.08(s，3H)，2.42(t，2H，J＝7.26Hz)，2.78-2.91(m，1H)，3.09-3.19(m，1H)，3.89(d，2H，J＝5.98Hz)，3.99-4.12(m，4H)，4.42(m，1H)，6.64(m，1H)，7.51-7.54(m，2H，AA′BB′)，7.91-7.94(m，2H，AA′BB′)，8.61(s，1H)，8.74(d，1H，J＝7.32Hz).
用色譜法處理一部分上述樣品取其中間的液份而制備出分析用的樣品。在除去溶劑以后在乙醚中研磨該樣品并收集固體。分析計算C27H34N6O8C，56.83；H，6.01；N，14.72實測C，56.60；H，5.90；N，14.43實施例8N-〔4-(N，-〔2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸二乙酯。
用相似的方法還原N-〔4-(N’-(2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基-N-甲酰氨基)苯甲?；彻劝彼岫阴サ玫絅-〔4-(N’-(2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲酰基〕-L-谷氨酸二乙酯；熔點(diǎn)152-153℃； IR(KBr)Vmax3369和3250-(NH)，1732，1637，和1605(C＝O)cm-1；1H NMR(Me2SO-d6)delta 1.12-1.2(m，6H)，1.17(s，9H)，1.90-2.18(m，4H)，2.43(t，2H，J＝7.4Hz)，2.80-2.94(m，1H)，3.12-3.20(m，1H)，3.89(d，2H，J＝5.59Hz)，4.00-4.11(m，4H)，3.90-4.47(m，1H)，6.40(m，1H)，7.52-7.55(AA′BB′，2H)，7.92-7.94(AA′BB′，2H)，8.62(s，1H)，8.75(d，1H，J＝7.33Hz).
分析計算C30H40N6O6C，58.81；H，6.58；N，13.72。
實測C，58.53；H，6.60；N，13.61實施例9N-〔4-(N’-(2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-乙酰氨基)苯甲酰基〕-L-谷氨酸二乙酯。
將96毫克氧化鉑加入含有0.64克(1.03毫摩爾)N-〔4-(N’-〔2-新戊酰基氨基-4(3H)-氧代吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-乙酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸二乙酯的40毫升冰醋酸溶液中。將此懸浮液在氫氣氛中(45磅/英寸2)振蕩2.5小時，用100毫升二氯甲烷稀釋混合物并通過硅藻土過濾以除去催化劑。將濾液在減壓下蒸發(fā)并將殘留物溶于100毫升二氯甲烷中，用飽和的碳酸氫鈉溶液萃取兩次每次用75毫升。再用75毫升二氯甲烷萃取水層，合并各有機(jī)層并用無水硫酸鎂干燥。過濾除去干燥劑之后，在減壓下除去濾液的溶劑，得到0.54克(84％產(chǎn)率)的N-〔4-(N’-〔2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-乙酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸二乙酯，此化合物可從乙酸乙酯中重結(jié)晶而進(jìn)一步純化；熔點(diǎn)120-123℃。1H-NMR-(Me2SO-d6)delta 1.06-1.19(m，6H)，1.16(s，9H)，1.82(s，3H)1.84-2.17(m，6H)，2.42(t，2H，J＝7.40Hz)，2.80-2.94(m，1H)，3.17-3.23(m，1H)，3.68(d，2H，J＝5.59Hz)，3.98-4.10(m，4H)，4.39-4.45(m，1H)，6.38(s，1H)，7.43-7.46(AA′BB′，2H)，7.90-7.93(AA′BB′，2H)，8.79(d，1H，J＝7.33Hz).
實施例10N-〔4-(N’-〔2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲酰基〕-L-谷氨酸。
將0.092克(0.16毫摩爾)的N-〔4-(N’-〔2-乙酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸與10毫升0.25N氫氧化鈉水溶液的混合物在25℃攪拌72小時，然后在減壓下蒸發(fā)水份。將殘留物溶于15毫升水中，使此溶液冷卻至0℃并用乙酸酸化。30分鐘后收集固體得到0.046克(60.5％)的N-〔4-(N’-〔2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕吡啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸。
1H NMR(Me2SO-d6)delta1.81-2.2(m，4H)，2.33(m，3H)，2.73(m，1H)3.1(m，1H)，3.85(m，2H)，4.39(m，1H)，6.2(m，1H)，7.49-7.51(m，2H，AA′BB′)，7.90-7.93(m，2H，AA′BB′)，8.59-8.62(m，2H)。
用類似的方法，將200毫克N’-〔4-(N’-〔2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-乙酰氨基)苯甲酰基〕-L-谷氨酸二乙酯與5毫升0.2N氫氧化鈉溶液攪拌72小時。用0.5N鹽酸中和該反應(yīng)混合物，冷卻至0℃并過濾收集所形成的固體，產(chǎn)生N-〔4-(N’-〔2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-乙酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸。
實施例11N-〔4-(N’-〔2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸。
將20毫克N-〔4-(N’-〔2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-氨基)苯甲?；?L-谷氨酸。在0.5毫升97％的甲酸中所成的溶液在90℃加熱1小時。在減壓下除去該溶劑并在乙醚中研磨殘留物。收集不溶的固體而得到17毫克的產(chǎn)物N-〔4-(N’-〔2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸，將該化合物溶于0.1N氫氧化鈉中并加入冰醋酸使之沉淀以進(jìn)一步純化。
實施例12N-〔4-(N’-〔2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-氨基)苯甲?；?L-谷氨酸。
將0.717克(1.3毫摩爾)的N-〔4-(N’-〔2-乙酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲酰基〕-L-谷氨酸二乙酯(制備如實施例2)加到32毫升5％鹽酸在甲醇中的溶液(由2毫升濃鹽酸用60毫升甲醇稀釋而制備成)中。在45℃攪拌該反應(yīng)混合物18小時。在使反應(yīng)混合物冷卻在25℃之后，加入4毫升氫氧化鈉(6N)，再將該混合物在25℃攪拌72小時。在減壓下濃縮此溶液。加入20毫升水并滴加冰醋酸使該混合物酸化。在0℃靜置2小時后收集固體物質(zhì)得到0.485克(產(chǎn)率88％)的N-〔4-(N’-〔2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕氨基)苯甲?；?L-谷氨酸；熔點(diǎn)198℃(開始分解)1H NMR(Me2SO-d6)delta 1.86-2.1(m，6H)，2.31(t，2H，J＝7.2)，2.8-2.86(m，1H)，3.24-3.28(m，2H)，4.2-4.4(m，1H)，5.94(s，2H)，6.29(s，1H)，6.34(t，1H，J＝5.24)，6.56-6.58(AA′BB′，2H)，7.62-7.65(AA′BB′，2H)，8.06(d，J＝5.15)，9.7(br，s，1H).
通過水解N-〔4-(N’-〔2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)苯甲?；?L-谷氨酸二乙酯可得到同樣的產(chǎn)物。
另一方面，將1.44克(2.4毫摩爾)的N’-〔4-(N-〔2-新戊酰氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕-N’-甲酰氨基)-苯甲酰基〕-L-谷氨酸二乙酯溶于1N氫氧化鈉中并將此溶液在25℃攪拌72小時。加入活性碳并攪拌此懸浮液然后過濾。用冰醋酸酸化濾液，在0℃冷凍30分鐘后收集白包固體物質(zhì)，得到0.87克(產(chǎn)率84％)相同的產(chǎn)物；熔點(diǎn)198℃以上緩慢地分解； IR(KBr)Vmax3460-2500(NH和COOH)，1695，1655，and 1600(C＝O)cm-1；1H NMR(Me2SO-d6)delta 1.85-2.02(m，6H)，2.3(t，2H，J＝7.4Hz)，2.81-2.88(m，1H)3.23-3.32(m，2H)4.2-4.4(m，1H)，5.92(s，2H)，6.34(t，1H，J＝5.28Hz)，6.55-6.57(m，2H AA′BB′)，7.61-7.64(AA′BB′，2H)，8.08(d，1H，J＝7.64Hz)，9.7(br，s，1H)。
實施例13制備每毫升含1毫克N-〔4-(N’-〔2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕氨基)苯甲?；?L-谷氨酸在含15％的乙腈和含85％的0.1％三乙胺-乙酸溶液(緩沖調(diào)節(jié)至pH7.0)中的溶液。將此溶液引入一支利用相同溶劑體系的10毫米×50厘米的Cyclobond I逆相高效液體色譜柱中，應(yīng)用的流速為1.10毫升/分鐘紫外光監(jiān)測在254毫微米。
得到基本上沒有其他化合物的第一種非對映異構(gòu)體持續(xù)時間為45.58分鐘，在此將其定名為異構(gòu)體“A”。得到基本上沒有第一種化合物的第二種非對映異構(gòu)體持續(xù)時間為48.32分鐘，在此定名為異構(gòu)體“B”。
實施例14用10只C3H雌鼠為一組，用C3H乳線癌細(xì)胞在其腋窩區(qū)進(jìn)行腹膜內(nèi)移植。然后施用在0.5毫升乳化劑IP(Emulphor IP)中的試驗化合物10天，對照組接受同樣的處理但沒有試驗化合物。
應(yīng)用N-〔4-(N’-〔2-氨基-4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3，-d〕嘧啶-6-基甲基〕氨基)苯甲?；?L-谷氨酸，劑量為6.25毫克/公斤在10只存活者中有7只得到90％的抑制作用。
用同樣的化合物治療6C3HED淋巴肉瘤，經(jīng)過8天的治療期可觀察到以下的結(jié)果。
劑量 抑制作用 存活者(毫克/公斤)6.0 77 10/1012.5 100 9/10
25.0 100 7/1050.0 100 4/10100.0 100 1/10
權(quán)利要求
1.制備下面化學(xué)式的化合物及其互變異構(gòu)體的方法
式中R1是氫或R5CO-R5是氫或具有1至6個碳原子的烷基，標(biāo)有*號的碳原子的構(gòu)型是L型。該方法包括水解下式的化合物
式中R1的定義如上，R2和R3是相同或不相同的羧酸保護(hù)基團(tuán)，R4是氨基保護(hù)基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中R1是氫，R2和R3分別是具有1至6個碳原子的烷基而R4是具有2至6個碳原子的烷?；?。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中R2和R3分別是乙基，而R4是乙酰基。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中R2和R3分別是乙基，而R4是新戊?；?br>5.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中R1是甲?；?，R2和R3分別是具有1至6碳原子的烷基而R4是具有2至6個碳原子的烷?；?。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中R2和R3分別是乙基，而R4是乙酰基。
7.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中R2和R3分別是乙基，而R4是新戊?；?。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中R1是乙?；?，R2和R3分別是具有1至6個碳原子的烷基而R4是具有2至6個碳原子的烷酰基。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中R2和R3分別是乙基，而R4是乙?；?。
10.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中R2和R3分別是乙基，而R4是新戊?；?。
11.制備由一組化合物中挑選出的化合物的方法，該組化合物包括(i)具有下面化學(xué)式的4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶類化合物
式中R1是R5CO-R2′和R3′是氫或者是相同或不相同的羧酸保護(hù)基團(tuán)，R4′是氫或一種氨基保護(hù)基團(tuán)，R5是氫或具有1至6個碳原子的烷基，而標(biāo)有*號的碳原子的構(gòu)型是L型，(ii)上述化合物的互變異構(gòu)體，該方法包括用化學(xué)式為R5COOH的酸(其中R5是氫或具有1至6個碳原子的烷基)或它的一種活性酰化衍生物處理下面化學(xué)式的化合物
式中R2′和R3′是氫或者是相同或不相同的羰基保護(hù)基團(tuán)，R4′是氫或一種氨基保護(hù)基團(tuán)，標(biāo)有*號的碳原子的構(gòu)型是L型。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11的方法，其中R2′，R3′，R4和R5分別是氫。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12的方法，其中R2′和R3′分別是具有1至6個碳原子的烷基，R4′是具有2至6個碳原子的烷酰基而R5是氫。
14.制備由一組化合物中挑選出的化合物的方法，該組化合物包括(i)具有下面化學(xué)式的4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶類化合物。
式中R1是氫、甲基、乙基或R5CO-，R2′和R3′是氫或者是相同或不相同的羧基保護(hù)基團(tuán)，R4′是氫或一種氨基保護(hù)基團(tuán)，R5是氫或具有1至6個碳原子的烷基，而標(biāo)有*號的碳原子的構(gòu)型是L型，(ii)上述化合物的互變異構(gòu)體，該方法包括催化氫化下面化學(xué)式的一種化合物
式中R1、R2′、R3′、R4′的定義如在此所給出的。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14的方法，其中R1是氫，R2′和R3′分別是具有1至6個碳原子的烷基而R4′是具有2至6個碳原子的烷酰基。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15的方法，其中R2′和R3′分別是乙基，而R4′是乙酰基。
17.根據(jù)權(quán)利要求
15的方法，其中R2′和R3′分別是乙基，而R4′是新戊?；?。
18.根據(jù)權(quán)利要求
14的方法，其中R2′，R3′和R4′分別是氫。
19.根據(jù)權(quán)利要求
14的方法，其中R1是甲?；琑2′和R3′分別是具有1至6個碳原子的烷基，而R4′是具有2至6個碳原子的烷?；?br>20.根據(jù)權(quán)利要求
19的方法，其中R2′和R3′分別是乙基而R4′是乙?；?。
21.根據(jù)權(quán)利要求
19的方法，其中R2′和R3′分別是乙基而R4′是新戊酰基。
22.根據(jù)權(quán)利要求
14的方法，其中R1是甲?；鳵2′，R3′和R4′分別是氫。
專利摘要
N-[-(N-[2-氨基-(4(3H)-氧代-5，6，7，8-四氫吡啶并-6-基甲基]-氨基)苯甲?；鵠-L谷氨酸的衍生物是抗仲瘤藥劑這類化合物可通過水解相應(yīng)的化合物(其中2-氨基和谷氨酸羧基是被保護(hù)著的)來制備。
文檔編號A61P35/00GK87104596SQ87104596
公開日1988年1月20日 申請日期1987年6月30日
發(fā)明者愛德華·C·泰勒, 喬治·彼得·比爾茲利, 石全, 詹姆斯·M·漢比 申請人:普林斯頓大學(xué)托管委員會導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan