專利名稱:肽的制造方法
本發(fā)明是關于制造一種含多肽物質的方法，特別是關于制造蛋白質的方法，以及用酶類蛋白質催化制備生物物質的方法。
在過去的十年里，復合DNA技術越來越多地用于制造工業(yè)上重要的生物物質。為此，對用多種醫(yī)學上重要的人體蛋白質編碼的DNA順序已進行了無性繁殖，它包括胰島素、血纖維蛋白溶酶原活化劑、α1-抗胰蛋白酶、以及凝固因子Ⅷ和Ⅸ。目前，雖然出現了復合DNA技術，然而這些蛋白質通常從血液和細胞組織中提純，該方法成本昂貴且費時，并且可能會引起傳染介質的傳播，這些傳染介質會引起艾滋病和肝炎。
盡管在細菌中表達DNA順序，對于產生所需的醫(yī)學上重要的蛋白質來說是一個吸引人的計劃，然而事實上細菌作為宿主通常是不能令人滿意的，因為在細菌細胞中，外來蛋白質不穩(wěn)定而且沒有合格處理過。
認識到這個問題，人們對在哺乳動物細胞組織培養(yǎng)物中的無性系基因的表達方式作了嘗試，而且在某種情況下已經證明這是一個可行的策略，然而動物細胞的間歇發(fā)酵是昂貴的、但卻是技術上需要的過程。
因此，需要一種產率高、成本低的制造生物物質，例如經恰當修飾的真核生物多肽的方法，這種方法的一個優(yōu)點是對人體沒有傳染介質。
根據本發(fā)明的第一方面，提供一種制造含多肽物質的方法，該方法包括通過在成年雌性哺乳動物乳腺中表達DNA順序，將用多肽編碼的DNA順序摻入到用乳劑乳清蛋白質編碼的哺乳動物基因中。該物質一般在轉譯后修飾之前或者最好是在之后從成年雌性哺乳動物的乳劑中回收。
在本說明書中使用的術語“多肽”是指包含氨基酸鏈的分子，無論鏈的長度對于劃為蛋白質是否合適，多肽最好具有足夠長的分子而成為蛋白質?！昂嚯奈镔|”可以是多肽本身，或者是改性的(例如糖基化的)多肽，或者此外也可以是在多肽經轉譯后修飾之后，交叉連接的物質。
本發(fā)明可用于生產肽激素、血液凝固因子(特別是因子Ⅷ和Ⅸ)或它們的亞基(特別是因子Ⅷ和Ⅸ)、血液蛋白質(例如β-珠蛋白)和血清蛋白(例如α1-抗胰蛋白酶)、糧食蛋白、包括天然或改進的宿主哺乳動物的乳蛋白、或酶。
本發(fā)明產生的酶能在原位作用于乳腺底物，因此，可以看出本發(fā)明包括一種生產酶反應產物的方法，該方法是通過在成年的雌性哺乳動物乳腺中表達DNA順序，將用酶編碼的DNA順序摻入用乳劑乳清蛋白編碼的哺乳動物基因中，然后由一種或多種酶作用物來催化制備反應產物，該反應產物一般從成年的雌性哺乳動物乳劑中回收。
最好在試管中，將用肽編碼的DNA順序(“所需的DNA順序”)摻入到乳劑乳清蛋白質基因中形成融合基因，這種蛋白基因可以在成年的雌性哺乳動物中表達。通過向已受精的哺乳動物卵注射融合基因，從而將融合基因插入種系中，此后，注射過的受精卵發(fā)育為成年的雌性哺乳動物。人們預計并非所有注射過的卵都能發(fā)育成所需的DNA順序表達的成年雌性哺乳動物。此外，將近一半的動物是雄性，在下一代生育雌性動物。
而關于外來DNA順序可以插入到哺乳動物種系中的有關技術已用于小鼠。目前，最有效的途徑需要將幾百個直鏈DNA分子直接顯微注射到受精卵細胞的原核中，這是本發(fā)明的優(yōu)選方法。顯微注射過的卵然后轉移到假孕養(yǎng)母的輸卵管中，進行培養(yǎng)。Brinster et al在Proc Natl Acad Sci 82(1985)4438-4442中報道培養(yǎng)的小鼠大約有25%繼承了一個或多個顯微注射的DNA拷貝。從商業(yè)觀點出發(fā)，顯然在本發(fā)明中，最好將具有高乳劑產率的哺乳動物作為宿主哺乳動物。因此，優(yōu)先選用家畜，例如綿羊、豬和羊，下面將進一步詳細討論。
研究大量家畜需要相當大的投資，尤其是在所需動物的數目及其成本方面。每個超數排卵的小鼠產生30個卵是正常的，而母羊排卵數只有3至5個。所遇到的另一個問題是農場動物的卵還不透明，這是由于它存在大量的囊，這就使得鑒別及向其原核進行成功注射更為困難。然而，向兔子、綿羊和豬的卵中注射DNA已由Hammer et al在Nature 315(1985)680-683中作了報道，他將金屬硫固生長激素融合基因注入這三種動物種系中。這2035個豬卵進行注射并轉移，有192只小豬出生，其中20只帶有融合基因。該結果對綿羊卻并不如此令人鼓舞，對1032個羊卵進行注射并轉移，但只有73只羊出生，其中只有一只羊含有外來DNA順序。
只要將外來DNA并入種系，外來DNA就可以在高選擇性的細胞組織內表達，生成一種功能蛋白質，這種蛋白質可以很容易地從動物中獲取。要進行這個過程，一般將用所需的肽編碼的DNA順序融合到DNA順序中，或介導在合適組織內表達的順序。盡管對小鼠進行的最初實驗表明加入DNA的細胞組織的專一表達是略有不同的(例如，Lacey et al，Cell 34(1983)343-356)，但是，現在一般的相符性是大多數轉染基因的標準細胞組織專一的表達可得到的。參閱Brinster et al Cell 27(1981)223-231;Swift et al Cell 38(1984)639-646;Shani Nature 314(1985)283-286;和Magram et al Nature 315(1985)338-340。關于標準的細胞組織特異性，它對于去除所有原核生物的載體順序顯然是重要的，在顯微注射前，它用于所需的DNA順序的無性繁殖方面(Krumlauf et al Mol.Cell Biol 5(1985)1639-1648)。
這些出版物指出的是將某些不同的細胞組織在基因轉移動物中當作目標，而沒有提出需要任何特殊的細胞組織來生產含多肽的物質，也沒有提出任何用給定的細胞組織表達的，并用來作為引入DNA表達的目標的特殊基因。
關于含肽物質和其直接表達的細胞組織，必須考慮到許多因子。為了顯示充分的生物活性，許多蛋白質需要廣泛的轉譯后修飾。例如因子Ⅸ需要將用于生物活性的谷氨酸殘余物的特定子集進行γ-羧化(De Seipio and Davie、Biochemistry 18 899-904(1979))。肝是天然合成因子Ⅸ的部位，它能熟練地進行這種修飾，盡管效率較低。成纖維細胞能夠進行因子Ⅸ的γ-羧化de la Salle et al Nature 316 268-270(1985)。然而，只有當在特異組織中合成時才可恰當修飾某種蛋白質，有時必須使表示的部位適合生產蛋白質的需要?？梢哉J為使用乳腺作為細胞組織來表達，不論滿意程度如何，這是一個潛在的困難因素。
與固體細胞組織相反，蛋白質需要從體液中獲得，因為該途徑一般說來是可以重復的，并且大部分生物醫(yī)學上重要的蛋白質本身是分泌到體液中的。從肝或β淋巴細胞分泌到血流中是一個可行的途徑，但是血液的凝固性質以及生物活性肽的抗原分子的存在是進行后續(xù)過程的障礙。
根據本發(fā)明，可以通過使用乳腺表達細胞組織來克服以上困難，乳劑很容易大量收集，并且有較好的生物化學特性，此外，主要的乳劑蛋白質以高濃度存在于乳劑中(大約1～15g/l)。
世界上許多國家的農場動物一般有四種豬、山羊、綿羊和牛，也就是說Suidae科、Capra屬、Ovis屬和Bos屬，家畜一般是Taurus種。
當本發(fā)明從廣義上不限制任何特殊哺乳動物種類時，豬、山羊、綿羊和牛優(yōu)先，在本發(fā)明的范圍內它們各有優(yōu)缺點。這些顧慮起源于實際情況，根據本發(fā)明的優(yōu)選方面，用多肽編碼的DNA順序于試管內摻入可用成年雌性哺乳動物乳腺表達的乳清蛋白基因中，形成融合基因，將這種基因注射到哺乳動物的受精卵中，從而使注射過的受精卵發(fā)育為成年雌性哺乳動物。
盡管從牛中獲得高乳劑產率是建議優(yōu)先選用牛的因素，但是，例如控制牛的胚胎比控制羊胚胎有更多的技術困難。然而包括牛在內的絕對實驗成本意味著其他三種優(yōu)選的家庭、農場動物是待選的。
下面表1給出了豬、羊和牛用于本發(fā)明的相互比較。
表1不同家畜進行胚胎控制和生成乳劑的比較豬 羊 ?？刂坡雅莩墒鞎r間的可能性 有 (有) (無)每個非超數排卵動物的卵母細胞數目; 10 1～3 1每個超數排卵動物的卵母細胞數目 15～20 4～10 大約6原核的可見性 (有) (有) (無)季節(jié)性繁殖 否 是 否每個胚胎轉移的相對成本 1.0 1.8 110包括動物的標定成本高峰時乳劑產率升/天 n.a. 1～3＊5～30＊＊取決于繁殖情況 n.a.＝得不到的數據原核可見性的意義在于它是本發(fā)明將含有用肽編碼的DNA順序的融合基因注射到受精卵的原核中的一個優(yōu)選特征。
豬的乳劑產率數據不易得到，但是羊的乳劑生產率為每天1～3升，這取決于繁殖情況。羊的擠奶專用設備可以從供應廠商處買到，該設備對牛也適用。因此羊成為選擇的動物，特別是諸如East Frieslands奶羊。由在黑羊內交叉合適的乳劑生產線產生的菌株被看作是可行的替換物。
分泌乳汁的乳腺是一個非常特殊的器官，它包括排出分泌細胞復合體小葉的廣泛輸管系統(tǒng)。乳腺細胞適合以多種方式高速分泌，例如，它們有特定的運輸機制確保有效地吸收血液中的前體，還具有一個廣泛的細胞內膜系統(tǒng)(粗面內質網、高爾基氏體等)，能高速進行合成蛋白質、轉譯后修飾和從細胞中輸出。
乳腺的生長和作用的各個方面取決于激素，關于乳腺的綜述包括Topper and Freeman，Physiol Rev 60 1049～1106(1980)和Forsyth in“The Biochemistry of Lactation”Mepham(Ed)，Elsevier(1982)309～349。影響乳腺的激素介導懷胎和喂奶期間發(fā)生的顯著變化。例如對于羊，這將導致細胞總數增加一倍，以及改變了各種細胞之間的比例和分泌細胞的最終差別。
乳腺將許多不同的蛋白質分泌到乳劑中，不同種乳劑組合物存在定性和定量差別，盡管在酪蛋白和可溶的(乳清)蛋白質之間可以找到一般的差別(參見Jenness in“Developments in Dairy chemistry，I”Fox(Ed)Elsevier(1982)87～109)。在乳腺中合成的反芻乳清蛋白質主要是α-乳清蛋白和β-乳球蛋白。
有三種主要的酪蛋白，它們是α-酪蛋白、β-酪蛋白和χ-酪蛋白，并以多種特征出現，在乳劑中將它們以微胞形式聚集來隔離鈣。反芻動物中主要的乳清蛋白質，β-乳球蛋白質的作用是未知的，盡管它似乎與κ-酪蛋白相互作用(Brunner.J.Dairy Sci.64 1038-1054(1981))。α-乳清蛋白在葡萄糖和半乳糖轉化為乳糖的過程中是一基本輔因子(Brew，Nature 223 671-672(1969))。表2列出了各種乳劑的蛋白質組合物。
表2各種乳劑的蛋白質組合物克/升 牛 羊 鼠 人酪蛋白 7αS110 12αS23.4 3.8 0.4β 10 10 3κ 3.9 3.9 1主要的乳清蛋白質α-乳清蛋白 1 0.8 痕量 1.6β-乳球蛋白 3 2.8 無 無乳清酸蛋白質 無 無 2 無其他乳清蛋白質血清清蛋白 0.4 . . 0.4溶菌酶 痕量 . . 0.4乳汁肝褐質(Lactoferrin) 0.1 . . 1.4免疫球蛋白 0.7 . . 1.4(以各種來源收集的數據)
通常人們認為單一復制基因可對不同的乳劑蛋白質進行編碼(Mercier and Gaye in“The Biochemistry of Lactation”、Mepham(Ed)Elsevier(1983)177-225)。酪蛋白在小鼠中似乎是雙連鎖基因(Rosen et al Biochem Soc Trans，9，112(1982))，在奶牛中也如此(Grossclaude Proc、16th Inti，Conf Animal Blood Groups、Biochem、Polymorphy，1 54-59(1979))。因為酪蛋白基因與乳清蛋白基因相比似乎表達水平更高，所以很自然地認為在摻入用于表達的外來DNA時應選擇酪蛋白基因。然而，出乎意料的是，本發(fā)明則規(guī)定了將用所需的肽編碼的DNA順序摻入用乳清蛋白質編碼的基因中。
大鼠的α-乳清蛋白基因包含四個外顯子，并且包含2.5kb染色體DNA(Qasba和Safaya Nature 311 377～380(1984))，牛的α-乳清蛋白基因似乎是類似的編碼?，F已發(fā)現羊的β-乳球蛋白最可能是單一復制基因，它在4.9kb的轉錄單位中包含7個外顯子，這種基因是本發(fā)明中使用的優(yōu)選基因。
已經確定在大鼠(Nakhasi和Qasba.J.Biol Chem 254 6016～6025(1979))、兔(Shuster et al Eur.J.Biochem.71 193～199(1976))和小鼠(Pauley et al Nature 275 455～457(1978))的乳房發(fā)育期間，在試管內利用轉譯和互補DNA雜化來改變乳劑蛋白信使RNA的含量，乳腺收集了80，000～100，000個由協(xié)調機制產生的乳劑蛋白質專一的信使RNA，這種協(xié)調機制包括高速合成乳劑蛋白質信使RNA和有效地穩(wěn)定這些分子(Mercier和Gaye，op.Cit、和Guyette et al Cell 17 1013-1073(1979))，然而也有例外。對于母羊，β-酪蛋白占蛋白質總數的45%，然而僅17%的互補DNA克隆，它從與相應這個基因的互補DNA庫分離出來(Mercier et al Biochimie 67 959-971(1985))。對于兔子，在微囊中隔離起來的α-乳清蛋白的量大大低于沒有微囊時根據蛋白質合成速率預計的數目，這樣就可以假定，單肽沒有最佳構型(Gaye et al Biochimie 64 173～184(1982))。許多乳劑蛋白質基因的最初轉譯產物有很大改變，例如α-乳清蛋白是N-糖基化的，κ-酪蛋白是O-糖基化的、以及α-和β-酪蛋白是O-糖基化的。除了它在轉譯后修飾中的作用之外，在冷凝和將酪蛋白包裹在微團的過程中還包括高爾基復合體，酪蛋白和乳清蛋白有可能通過不同的途徑從細胞中排出。關于這點，人們有趣地注意到，在中部和內部特異比較中，酪蛋白信號肽(與大量的其它分子比較)被很好地保存，預計它在新生的肽作為正確的分泌途徑目標時起作用(Mepham et al op Cit)。如上所述，乳劑蛋白質基因在分泌乳汁的乳腺中大量地表達，例如，對于母羊，在多聚腺核苷酸+RNA(Mercier et al((1985)op Cit)中，αS1-酪蛋白占30%左右，β-乳球蛋白占5%左右。給定這些來源于單一復制基因的轉錄本，于是，這些含量顯示了轉譯的高速率和有效的信使RNA穩(wěn)定作用(Teyssot和Houdebine.，Eur J.Biochem 110 263～272(1980))?？梢酝ㄟ^存在于成熟的信使RNA中的順序介導特異的信使RNA的穩(wěn)定作用，在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，對引入羊種系中的DNA順序可以進行類似程度的表達。將它連接到與乳劑乳清蛋白質基因有關的DNA順序中來完成該過程，從而維持高水平的組織專一表達及信使RNA穩(wěn)定作用β-乳球蛋白是優(yōu)選的基因。
將新基因轉入小鼠中是現在慣用的方法，在基因轉移的小鼠中顯示了對外來基因的高水平的組織專一表達，外來的DNA不僅包括結構基因，而且還包括5′和3′鄰接順序。盡管有大量的證據提出許多重要的調控元素位于信使RNA帽點的5′端(例如參見Mcknight和Kingsbury、Science 217 316～324(1982);Payvar et al Cell 35 381～392(1983);Renkawitz et al Cell 37 503～510(1984);Karin et al Nature 308 513～518(1984))，另外，很明顯，重要的調節(jié)順序，特別是介導組織專一表達的調節(jié)順序可以保留在結構基因中，乃至在結構基因的3′端(Charnay et al Cell 38 251-263(1984);Gillies et al Cell 33 717-728(1983))。然而外來順序(即存在于成熟的信使RNA順序中)可以含有維持信使RNA穩(wěn)定性的順序。表3詳細說明了小鼠中外來基因的組織專一表達。
鑒于以上理由，直接用于表達用所需的肽編碼的DNA順序的上述優(yōu)選融合基因包括一個或多個啟動子;轉錄初始位置;一個或多個(假定的)乳劑蛋白質基因的遠5′端調節(jié)順序;結構的乳劑蛋白質基因順序;鄰接乳劑蛋白質基因的3′順序。最優(yōu)的融合基因包括所有這三種類型的順序。
選擇的融合基因包括用插入乳清蛋白質基因的第一外顯子的所需的肽編碼的互補DNA順序，優(yōu)先的是將乳清蛋白質基因的5′端鄰接順序的數個kb包含在這樣一個融合基因中。在這些構成中，最好通過自身的信號肽介導所需肽的分泌，因而對所需的肽，融合基因最好含有一個信號肽。然而，組織專一的信號肽對于將新生的肽作為進入正確分泌路徑的目標是重要的(如上討論)。因此，特別優(yōu)先的是將用乳清蛋白質基因信號肽編碼的DNA順序準確地融合到用成熟蛋白質的N端氨基酸編碼的插入DNA順序。插入的3′端最好在其終止密碼子之后、但在信息切斷和聚腺苷位點之前終止。在插入點下流一般保留其余的結構基因，以及一些3′端鄰接順序。
在基因轉移的動物中，這種構成最有可能獲得提高水平的乳腺專一表達，最初的轉錄應進行適當的多腺苷酸化，并在保留乳清蛋白質基因處聯接。成熟的信使應含有用于有效穩(wěn)定信息RNA的順序，在構成中使用乳劑基因信號肽，轉譯成熟的信使RNA得到一個融合的前肽，其中從乳劑蛋白質基因中得到的信號肽有效地引導用插入的互補DNA編碼的成熟肽的分泌。
如上討論，羊的β-乳球蛋白是選擇的乳清蛋白質基因，它含有用所需的肽編碼的互補DNA。對于羊來說，β-乳球蛋白的經常表達為乳腺中的乳清蛋白，其信使RNA包括大約80%的總多聚腺核苷酸+RNA。因子Ⅸ和人體α1抗胰蛋白酶編碼的互補DNA順序的融合構成。
根據本發(fā)明的第二個方面，提供一種遺傳構成，它通過在成年雌性哺乳動物乳腺中表達DNA順序，將用肽編碼的順序摻入用乳劑乳清蛋白編碼的哺乳動物基因中。
根據本發(fā)明的第三個方面，提供一種如上所述的遺傳構成的動物細胞，該動物細胞可以是胚胎細胞。
根據本發(fā)明的第四個方面，提供一種包括如上所述的遺傳構成的質粒。
第二、三和四方面的優(yōu)選特征，如上文第一方面所述，mutatis mutandis。
為了更好地理解本發(fā)明，將給出一些實施例，在實施例中將對附圖作介紹，其中圖1～4指出了按照本發(fā)明的方法，加工β-乳球蛋白融合基因的基本步驟。
圖5表示羊的DNA Southern標記分析。
圖5a表示羊的DNA Southern標記分析以及通過實際生產遺傳β-乳球蛋白融合基因的說明。
圖6表示小白鼠和羊的乳清蛋白質的SDS-PAGE分析。
圖7表示羊和小鼠蛋白質的Western標記分析。
圖8表示從載有如上介紹的β-乳球蛋白融合基因的基因轉移母羊中得到的RIA乳劑。
實施例1A.復合DNA步驟復合DNA步驟是在Maniatis et al(“Molecular Cloning”Cold spring Harbor(1982))和“Methods in Enzymology”Vols 68，100和101(Wr.Grossman and Moldave，Eds)、Academic press之后出現的，在這里沒有詳細說明。除非特別提出，所有的化學品可從BDH Chemicals Ltd.Poole、Dorset、England或the Sigma Chemical Company、Poole、Dorset、England買到。羊的β-乳球蛋白融合基因的構成羊脾DNA的制備從剛屠宰的Black face/Suffolk羊中取出羊脾，基本上按照Rurch和Weintraub Cell 33 65(1983)介紹的方法隔離細胞核。將核溶解在0.3M NaCl、10mM Tris HCl、10mM EDTA、1% SDS pH7.4和400mcg/ml蛋白酶K(Sigma Co.Fancy Road，Poole，Dorset BH17 7NH)中，在37℃下保溫2小時。用苯酚/氯仿反復萃取，直到完全脫去蛋白質，用乙醇沉淀DNA，使用玻璃棒將其取出，用70%EtOH/30%TE(TE＝10mM Tris HCl、1mM EDTA，pH值為8.0)洗滌，在空氣中干燥，并重新懸浮在TE中，其濃度為1mg/ml。
羊脾DNA λ融合基因的構成用噬菌體EMBL 3(Frischauf et al J.Mol.Biol170 827(1983))構成基因庫，在生產廠家建議的條件下用過量5倍的限制性內切酶Eco RI和Bam HI(由Amersham Intgernational plc，Lincoln place，Green End.Ayles-bury、Bucking ham shire、England提供)消化30mcg的噬菌體DNA。消化后，加入氯化精胺鹽達到5mM，沉淀出λDNA，在冰上保溫1小時后，在臺式微型離心機中，在10000g作用下分離15分鐘，將DNA沉淀成片，在70%EtOH、300mM NaAc、100mM MgCl2中洗滌，反復壓成片，最后重新懸浮在1mg/ml濃度的TE中。
用限制性內切酶Sau 3A(Amersham)部分消化羊DNA，在37°下20分鐘內，用變量的Sau 3A〔從5～40單位〕消化羊DNA的100mcg整份。加入15mM EDTA終止該反應，消化程度通過在0.6%瓊脂糖酸上的電泳進行評價，將適當消化的樣品匯集起來，加到38.0ml10～40%的pH為8.0的1M NaCl、20mM Tris HCl、5mM的EDTA構成的蔗糖梯度中，這些梯度在Backmann SW28回旋器中以26，000rpm離心分離24小時，從頂部精餾出蔗糖梯度，收集1ml的餾分。每個餾分其DNA分子的粒徑分度由瓊脂糖酸電泳確定，依大小收集含有粒徑14～25kb的DNA分子的餾分。在TE溶液中稀釋2倍后，加入2體積的EtOH，在-20℃沉淀DNA一夜，然后DNA重新懸浮在TE中，濃度為300mcg/ml。
將7.5mcg由Bam HI/Eco RI切割的EMBL3和2.5mcg已用Sau 3A部分消化的羊脾DNA，在50mcl含有60mM Tris HCl、6mM MgCl2、10mM DTT、0.01%明膠、0.25mM rATP和25單位的T4DNA連接酶(Boehringer Company、Boehringer Mannheim House、Bell Lane、lewes、East Sussex)的溶液中混合，在14℃下保溫一夜。
連接后，使用從Amersham買到的用具根據生產廠商建議的步驟，在試管內將1mcg DNA包裹起來。包裹后的庫用E.coli菌株ED 8654測定滴度，預計該庫的大小為5.7×106的空斑形成單位(pfu′s)，測定滴度完成后立即將未放大庫的整份放在10×22cm2的Petri平皿上(大平板)，該過程在大約50，000pfu′s/板密度下使用E.coli菌株ED8654。屏蔽λ基因庫根據Benton和Davis(Science 196 180(1977))的方法，挑取大平板中的噬菌體放到20cm2的硝基纖維素膜上(Schieicher和Schull、Postfach 4，D-3354，West Germany)。通過Rigby et al(J.Mol.Biol.113，237(1977))介紹的方法，將β-乳球蛋白互補DNA克隆(p931-gift of J.C，Mercier，INRA，Jouey-en-Josas，Paris)通過32p dCTP制品轉譯為比活性＞108dpm/mcg，β-乳球蛋白互補DNA按照Mercier et al在Biochimie 67 959-971(1985)的描述進行無性繁殖，由Gaye et al在Biochimie 68，1097-1107(1986)給出p931無性系順序。
根據Maniatis et al在Cell 15 687(1978)的方法，將濾層預雜化、雜化和洗滌，最后的洗滌是在1×SET中于68℃下進行的(SET是pH為8.0的0.15M NaCl，2mM EDTA、0.03M Tris HCl)。對濾層吸濾干燥，在X-射線底片曝光之前點32p標記對它們定位。參考32p標記將含有陽性雜交空斑區(qū)域在大平板上定位，使用巴氏移管的無菌鈍園端將其取出。用E.coli ED8654對取出的最初空斑進行滴度測定，并放置到空斑密度將近500/板的15cm直徑的Petri平皿上，通過如2介紹的方法將這些板重新屏蔽起來，使用牙鑒將單個的陽性雜交空斑取出，加入1.0ml的噬菌體緩沖液中(噬菌體緩沖液是pH為7.4的10mM Tris HCl、10mM MgCl2、0.01%白明膠)。
無性繁殖的β-乳球蛋白DNA的制備將0.4ml再懸浮的噬菌體溶液加入到E.coli ED8654(Borg et al Mol.Gen.Genetics 146 199～207(1976))中，放到9cm直徑的Petri平皿上，得到細菌菌臺的匯合溶解，得到匯合板，將頂部平板瓊脂刮到10ml的噬菌體緩沖液中，并加入幾滴氯仿保溫一夜，在5000rpm下離心分離5分鐘，將細菌碎片沉淀成片，噬菌體原種在4℃下保存，用E.coli ED8654測定原種滴度，測出pfu/ml。
在37℃ 10ml的10mM MgSO4中將8×107pfu′s吸收到7×109E.Coli細胞上，15分鐘后，將2.5ml整份加入到1升蒸餾瓶內的100mlL Broth/10mM MgSO4中，使勁震動細菌懸浮液幾小時，每小時監(jiān)測OD540。由OD540降落測定，幾小時后產生溶菌，完成后，向每個100ml培養(yǎng)物中加入0.2ml氯仿，該培養(yǎng)物在4℃下放置一夜。
在10，000rpm下離心分離15分鐘除去細菌碎屑，將10mcg/ml RNA酶A和10mcg/ml RNA酶I加入到上清液中，然后在37℃保溫1小時。保溫后加入NaCl到40g/l，并加入聚乙二醇(PEG)至10%，將該制備物冷卻到4℃，放置至少2小時沉淀噬菌體。在10，000rpm下在15分鐘內將噬菌體沉淀成片，并重新懸浮在16.0ml的噬菌體緩沖劑中。在14.0ml的超離心分離管內，在含有1.5ml56%CsCl、1.5ml45%CsCl和2.5ml31%CsCl(溶于噬菌體緩沖液)的梯度中，將8.0ml的這種懸浮液分層。在20℃35，000rpm下，使振動回旋器中離心分離梯度1.5小時，使用一根針和注射器移去噬菌體層，提純噬菌體顆粒，進行第二梯度離心分離。
將提純的噬菌體顆粒分解到pH為8的0.1mM NaCl、10mM Tris HCl、1ml pH為8的EDTA中，然后使用苯酚和氯仿連續(xù)萃取脫去蛋白質，加入NaCl到最終濃度0.3M，然后，添加2體積的EtOH沉淀噬菌體DNA，在10，000rpm離心分離成20分鐘，將DNA沉淀成片，用70%EtOH、30%TE洗滌、干燥、然后重新懸浮在TE中，最終濃度200～400mcg/ml。
復合β-乳球蛋白克隆的說明用多種限制性內切酶限制如上描述的0.5mcg的DNA制備物，單消化產物和雙消化產物在0.6%和1%瓊脂糖膠上進行電泳分析，通過Southern(J.Mol.Biol.98 503(1975))的方法，將這些膠上的DNA轉移到Hybond膜(Amersham International、Little cha(font、Bucks)上的硝基纖維素濾層上，雜交到32p標記P931。使用的方法基本如上所述，雜交過的濾層通過放射自顯影術分析，用多種限制性內切酶P9315′端和3′端的特殊探查物，制成一個限制圖，從而測出β-乳球蛋白基因大小和方向(參見圖1)。
β-乳球蛋白克隆的同一性和基因5′端與3′端的準確位置直接通過DNA順序確認。使用合適的限制單位，碎片再次無性繁殖成質粒載體及M13載體，使用Sanger et al(PNAS 74 5463(1977))的二次脫氧方法進行順序化。
β-乳球蛋白融合基因的加工加工含有β-乳球蛋白以及在乳腺中表達所需基因的融合基因使用的加工方法在圖1-4中概括，該方法使用從λ克隆得到的順序，它的隔離和特征化如上所述。該方法包括將所需的DNA順序插入相應于5′端未轉譯的β-乳球蛋白信使RNA區(qū)域的DNA區(qū)域，根據這個基因的信使RNA轉錄酶轉譯的蛋白質將含有目標蛋白質的分泌肽。
按照圖1所示，將1.4kbλ噬菌體SS-1 sphI-Eco RI碎片連接到載體質粒pPoly上，構成亞基克隆pSS-1tgSE，其中載體質粒pPoly被SphI+Eco RI E，coli菌株DH′切割，后者按照Hanahan和Meselson的方法(Gene10 63(1980))進行適當的轉化。將抗克隆的氨芐青霉素隔離起來，用Birnboim和Doty的方法(Nuc.Acid Res.7 1513(1979))制備DNA。
在圖1中，頂端箭頭代表方向和存在于λSS1內的β-乳球蛋白轉錄單位的大小(大約4.9kb);比例始終相同。一般說來，在圖1至圖4中，應當注明只示出有關限制部位。大的開口方框代表λ EMBL2臂;窄的開口方框代表pPoly;窄的陰影方框代表將要表達的目標順序;線代表相應于β-乳球蛋白基因的無性繁殖的羊的順序以及它的鄰接順序。
通過用限制性核酸內切酶pvuⅡ(圖2)的消化作用對pSS-1tg SE線性化，限制性核酸內切酶pvuⅡ在相應于β-乳球蛋白5′端未轉譯的信使RNA順序的DNA范圍內的質粒中在單拷貝部位作切割，將5mcg完全消化后的質粒溶解在pH為9.0的0.5M Tris HCl、10mM MgCl2、1mM MnCl2、10mM精胺中，用0.01～0.04單位的牛腸磷酸酶(Boehringer)在56℃下處理30分鐘，牛腸磷酸酶在0.5%的SDS中失活，用苯酚/氯仿萃取和EtOH沉淀的方法回收DNA。
根據Dr.G.Brownlee Sir William Dunu School of Pathology、University of Oxford、Oxford的方法制造因子Ⅸ DNA克隆p5′G3′CVI，這個克隆在從PAT153中獲得的質粒中含有1579bp插入物(Twig et al Nature 283，216～218(1980))，它從離假定的信使RNA初始點-7的TagⅠ位作用到+1572位，并含有用人體因子Ⅸ完整編碼的順序(Arson et al Embo J.3，1053～1060(1984))。
將含因子Ⅸ順序的1553bp的NheⅠ-HindⅢ碎片切除，用如下描述的方法從載體中提純。根據Maniatis et al描述的技術(“Molecular Cloning”Cold Spring Harbor(1982))，使用Kle now多聚酶削弱它的HindⅢ端和NheⅠ端，碎片連接到PvuⅡ限制的、磷酸酶的pSS1tg SE(如上描述)，在將E.coli DH-1轉化為氨芐青霉素阻抗后形成pSS1 tg SE-因子Ⅸ。
收集受精卵方法類似于Gordon和Ruddle在“Methods in Enzymology”(1983)Vol 101(W.Grossman和Moldave，Eds)Academic Press pp 411至pp432中描述的用于小鼠的方法。
收集在發(fā)情期經誘導超數排卵的母羊胚胎，其中發(fā)情期靠孕激素類控制，已受精的成熟母羊用由60mg medrog proxy-esterone acetate浸潤的子鞘內海綿處理12～16天(Veromix，Upjohn Ltd.Crawley)。在孕激素類處理前28小時及在取出海綿時，肌肉注射2次馬的促卵泡激素〔3.5～4.3mg水溶液/羊〕，取出海綿后20～72小時，使發(fā)情期的羊進行多次交配，在每天8.00、12.00、16.00和20.00小時開始加熱觀察母羊，在發(fā)情期開始36～72小時后，由外科手術收集在1-4細胞發(fā)育階段的胚胎。
通過靜脈注射5-乙基-5-(1-甲基丁基)-2-巴比土酸鈉〔Intraval，May and Baker〕進行麻醉，保持在半封閉的循環(huán)系統(tǒng)中的氧和一氧化二氮混合物中，胚胎的收集依照Hunter et al(J.Agric.Sci.46 143～149(1955))的方法進行。將再生管通過中心斷口，以及插入到通過菌毛的輸卵管中的尼龍導管，介質通過鈍園的18號針引入子宮腔內，并強制通過子宮輸卵管接合處，通過輸卵管。在含有能源和蛋白質的磷酸鹽一緩沖劑鹽水中收集胚胎〔Ovum Culture Medium，Flow Labs，Irvine，Scotland〕。在卵的貯存和顯微注射期間，這種介質補充20%的胎牛血清。
注射DNA
因子Ⅸ互補DNA順序以下表示為TARG，見圖2。
按照如上所述制備質粒DNA，并通過用合適的限制性內切酶消化檢驗，用SphⅠ+Eco RⅠ消化質粒DNA，在含有0.5mcg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡(sigma)的1%蔗糖膠上電泳，用UV燈(Ultra-Violet Products、Inc，San Gabriel，California，USA)照射測出有關的SphⅠ-Eco RⅠ。在區(qū)域前部插入一塊滲析膜，DNA在膜上電泳，將DNA從滲析膜上洗滌出來，用“Elu-tip”〔Schleicher and Schll，Postfach 4，D-3354，Dassel，W.Germany〕，根據生產廠家建議的方法隔離DNA。
將λSS-1的XbaⅠ-SalⅠ碎片連接到pPoly消化的XbaⅠ-SalⅠ上構成質粒pSSⅠ tgХS(圖3)，隔離克隆，按前文所述制備質粒DNA，兩個DNA碎片分別與這個質?；蛴善浍@得的小亞克隆各自隔離10.5kb SphⅠ(部分)HindⅢ碎片和1.2kb Eco RⅠ-HindⅢ碎片(圖4)。通過如上所述的膠電泳方法隔離這些碎片。
Sph-Ⅰ-Eco RⅠ、SphⅠ-HindⅢ、和Eco RⅠ-HindⅢ碎片以大致相同的比例連接在一起，使用DNA形成DH-1，按照如上介紹的方法制備質粒DNA(pSSⅠ tg ХS-TARG)用XbaⅠ和SalⅠ消化，從載體中切去β-乳球蛋白基因。用膠電泳方法，然后用“Elu-tip”提純這種碎片，將用乙醇沉淀出的DNA成片，重新懸浮在TE中，進行苯酚/氯仿萃取、沉淀，DNA最終再懸浮于TE中，直接用于顯微注射。
B.基因轉移動物的構成將DNA(1-2mcg/ml)注射到單個卵細胞的原核中，或注射到2個和4個卵細胞的一個或多個核中。在充有卵培養(yǎng)介質的盒中操縱卵，該盒包括具有玻璃支架的硅化顯微鏡玻片(25mm×2mm×3mm)，它平行于長側的滑動邊，蓋玻片置于支架頂部，連接部分用硅化脂肪密封，盒的開端充滿Dow-Corning200流體(50cs)(BDH Chemicals)待注射的卵用吸管吸住，用Nikon Diaphet翻轉顯微鏡(Nikon(uk)Ltd.Haybrooke，Halesfield 9，Telford，Shropshire)可以看見原核或核，使用從在顯微電極拉出器(Campden Instruments，186 Campden Hill Road，London)上的毛細管(硼硅酸鹽玻璃-1mm外徑，帶有絲的薄壁-Clark Electromedical Instruments，POBOx 8，Pangbourne，Reading.RG8 7HU)中伸出的微量移管，將DNA注射到原核或核中，用顯微控制器(Leitz Mechanical Micro-manipulators.E.Leitz(Instruments)Ltd，48 Park Street，Luton，England)控制兩種顯微儀器的位置。含有待注射的DNA的微量移管通過空氣密封管連接到100ml玻璃注射器，由原核或核的可見膨脹顯示成功的注射，注射后的卵在室溫下保溫30分鐘以上，使損壞的卵進行可見的退變。
將判定為沒有注射過的胚胎轉移到未交配的受體母羊中，使用孕激素〔Veromix，Upjohn Ltd〕使其發(fā)情期周期與卵供體同步，使用細口移管將胚胎轉移到輸卵管中，向每只母羊轉移4個胚胎，這些胚胎分布在輸卵管之間。
母羊的身體是用可溶的肌原纖維細絲〔Descon，Davis andGreck〕和帶有Michel clips的皮膚包圍起來，每只羊在手術時注射抗菌素〔Duphapen L.A.，Duphar，Amersham〕，手術后10～20天除去Michel clips。
發(fā)育和成長母羊從麻醉中恢復過來后，返回小牧場，在那里它們度過整個懷孕時期。根據需要補充秣、蕪菁和濃縮食物，受孕第3個月期間，通過超聲波掃描測出胎的數目(White et al Vet.Rec.115，140～143(1986))。然后還要注意懷孕母羊中胎數目的變化，當接近預計的生產日期時，將羊圈起來以便監(jiān)督，以及在生產時給予協(xié)助。
基因轉移后的羊的分析生產小羊后至少2周，用皮下注射器通過靜脈穿刺移取10ml血樣，并收集在加了肝素的管中。從血樣中制備DNA如下向10ml血樣中加入30ml溶胞溶液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、1mM EDTA)，該混合物在冰上保溫15分鐘，在1500g作用下，在40℃分離10分鐘，分離出白血細胞，并重新懸浮在10mlSE(75mM NaCl、2mM EDTA)中，然后在SE中洗滌一次。加入蛋白酶κ達到100mcg/ml，再加入1ml20%SDS，該制備物保溫四小時，用苯酚/氯仿進行反復萃取，直到完全脫去蛋白質。將1/30th Vol的0.3M NaAc-1 Vol異丙醇加到水相中，沉淀DNA，將其取出，在70%EtOH中清洗，并重新懸浮在TE中。
10 mcg整份DNA制備物用合適的限制性內切酶(例如Eco RⅠ)消化，在0.8%的膠上電泳。通過Southern標記分析這些膠，基本上按照描述的方法進行雜交。
陽性雜交動物，即那些含有融合基因的動物(假定在染色體位置積分)長大成熟，雌性動物交配、一旦分泌乳汁，則分析乳汁的找出所需的物質(參見實施例7)。陽性雄性動物交配，用外源DNA順序屏蔽它們的女兒，隨后，分析其乳汁以找出所需的物質。
實施例2除了根據R.Cortese.EMBL.Meyerhofstrasse 1，D-6900 Heidelberg，West Germany獲得用所需多肽編碼的DNA順序(TARG順序)編碼α1-抗胰蛋白外，實施例2重復了實施例1的方法。切除含有1294 bp插入物(參見Ciliberto et al Cell 41 531～540(1985))的Tag 1-Bst NⅠ碎片，除去這個克隆并通過實施例1中描述的方法無性繁殖到pSS1 tg SE的PvuⅡ位點。
實施例3重復實施例1的方法，只是用質粒pUC18(Pharmacia Ltd，Pharmacia House，Midsummer Boulevard，Milton Keynes”，England)取代質粒pPoly。
實施例4重復實施例1的方法，只是用質粒pUC19(Pharmacia Ltd.Pharmacia House，Midsummer Boulevard，Milton Keynes”，England)取代質粒pPoly。
實施例5基因轉移的羊的傳代由質粒pSS1 tg XS-FIX(也稱為pSS1 tg XS-TARG，參見實施例1)切下的SalⅠ-XbaⅠ碎片，注射到羊卵中，每個受精卵注射將近200個拷貝，252個卵細胞中，有一個卵細胞被注射，并再移植到受體母羊中，52只小羊出發(fā)。分析由血樣制備的DNA，表明其中四個動物載有外源β-乳球蛋白因子Ⅸ順序(表4)。
表4基因轉移的羊的概況小羊編號 性別 構成物 拷貝數(大約)6LL225 M BLG-FIX 406LL231 F BLG-FIX 106LL239 M BLG-FIX 16LL240 F BLG-FIX 10所有的卵在原核階段注射，不進行離心分離，拷貝數通過定量掃描光密度分析法測定。
圖5是羊DNA的Southern標記，羊的DNA按照介紹制備，用指出的限制性內切酶消化，在0.8%的瓊脂膠上電泳，并轉移到Hybond膜上(Amersham International，Little Chalfont，Bucks，UK)。用32p示蹤質粒pSS1 tg XS-FIX(泳道1～7)，然后(脫去膜后)用質粒P931(泳道1′～7′)操測濾層，pSS1 tg XS-FIX復制對照包含在指示的膠上。泳道1，對照(非基因轉移的)羊DNA，泳道2和3對照DNA以及P5′G3′CVI1和5復制當量;泳道4～7，基因轉移的羊6LL225、6LL231、6LL239和6LL240中的DNA。每個基因轉移的羊產生因子Ⅸ，后者與pSS1 tg XS-FIX中獲得的因子大小一致，雜交范圍為5.95kb(EcoRⅠ)和6.05kb(BamHⅠ)，這表明基因轉移的5′端未觸動。觀察不到與羊的因子Ⅸ的明顯雜交，與P931雜交顯示了預測的4.4kb Eco RI和2.1kb Bam HI碎片。盡管內源的羊β-乳球蛋白基因促使在這個區(qū)域內雜交，但是增加在6LL225、6LL231和6LL240中的樣品密度表明這些區(qū)域主要來自注射了β-乳球蛋白因子Ⅸ融合基因，證實了構成的3′端是完整的。用HindⅢ切除的DNA泳道1，從pSS1 tg XS-FIX中切除的12.1kb提純的SalⅠ-XbaⅠ碎片;泳道2～5，來自6LL225、6LL231、6LL239和6LL240的DNA。探查物是P5′G3′CVI。雜交12.1kb HindⅢ碎片(6LL225、6LL231和6LL240)與注射的碎片大小一致，它顯示了從頭到尾的排列，同樣的羊15.6kb碎片顯示存在從頭到頭的重復。這些數據表明，在羊6LL225、6LL231和6LL240中，將從pSS1 tg XS-FIX(β-乳球蛋白因子Ⅸ融合基因)獲得的SalⅠ-XbaⅠ碎片整合，在一連串試樣中未探測出重復排列順序。對于羊6LL239，其數據與這個碎片的單個非重排復制的整合作用一致。
實施例6因子Ⅸ順序遺傳到F一代實施例5得到的雄性基因轉移后的羊6LL225(載有將近40個從pSS1 tg XS-FIX制備的SalⅠ-XbaⅠ碎片復制)與許多Finn-Dorset和Friesland母羊連續(xù)地交配。使用所述的人體因子Ⅸ質粒探查物P5′G3′CVI，根據由血樣制備的DNA和Southern標記分析其后代，對它的一些后代進行的分析列于圖5a中。標數泳道1、3、4、5、6、7、9、11、43、45、48和49，來自6LL225后代的DNA(稱為7R1、7R3等～7R49);泳道C211，來自對照(非基因轉移的)羊6LL211的DNA;泳道5～211及1～211，來自羊6LL211的DNA以及pSS1 tg XS-FIX的5和1復制當量。這些數據表明基因轉移的羊6LL225已將因子Ⅸ順序轉移到它的12個子孫中的6個中，從而這些順序插入到種系中。
實施例7羊的β-乳球蛋白編碼基因在基因轉移的小鼠中的表達基因轉移的小鼠一般是通過Gordon和Ruddle在Methods in Enzymology Vol 101(1983)，(Eds，Wu，Crossman和Moldave)、Academic Press pp411～432描述的技術方法形成，形成幾個載有克隆λSS-1的SalⅠ碎片的基因轉移的小鼠(圖3)，其中之一，B-Lac7多次交配，產生了許多遺傳了SS-1順序的后代。
生產一窩小鼠后8～12天，攝取小鼠的乳劑，該過程是這樣進行的，先內膜注射0.3IU催產素(Sigma)和7mcl/g動物的Hypnorm/Hypnovel(Fleckneil，Vet，Rec1983年12月10日，P574)，在每四個小時周期中，先移走動物幼子后，等待20分鐘，然后用手按摩各個乳腺，將乳劑收集到50ml的毛細管中。
將小鼠乳劑用蒸餾水以1∶5稀釋，在間歇式離心分離機中粗略分離進行脫脂，添加1NHCl使得pH值為4.6，以沉淀酪蛋白，離心分離后，移去乳清蛋白，用5%的三氯乙酸沉淀，根據Laemmli(Nature 277、680～684(1970)的方法進行聚丙稀酰胺膠電泳分析。(圖6表示鼠和羊的乳清蛋白質的SDS PAGE分析，泳道1，標示蛋白質;2，標準的小鼠乳清;3，羊的乳清;4，標準的小鼠乳清;5，B-Lac 7乳清;6，B-Lac 7乳清(2.5×5)，相應于標示蹤跡和羊乳清中的β-乳球蛋白的區(qū)域標有箭頭)。使用兔子中抗羊β-乳球蛋白的抗血清，通過用膠電泳分辨樣品上的Western標記(Burnett，Anal、Bioches，112，195～203(1981))探測羊的β-乳球蛋白。圖7表示Western標記分析。Western標記與兔的抗-β-乳球蛋白血清和抗兔Ig過氧化物酶血清反應。(泳道1，標記蛋白質;2，羊的乳清;3，B-Lac7乳清;4，標準的小鼠乳清;5，提純的β-乳清蛋白;6，Coomassie染色的羊的乳清(平行作用)。
分析表明，大量的乳球蛋白分泌到小鼠乳劑中，顯示出在B-Lac7中高水平地表達了SS-1。這個克隆可能含所有必要的順序，以確保在基因轉移的小鼠的乳腺中高水平地表達，從而預測，即使不是如此，在同源種類中，即在基因轉移的羊中也能有效地作用。因此，可以預計由這個克隆得到的融合基因也能在羊的乳腺中表達(有效)。
實施例8
人體因子Ⅸ在基因轉移后的母羊中的表達兩只雌性羊，6LL231和6LL240(各載有將近10個從pSS1 tg XS-FIX制備的SalⅠ-XbaⅠ碎片復制)與Fast Friesland公羊進行連續(xù)交配。分娩后，使小羊自然哺乳2周，以刺激分泌乳汁，用手將乳劑(每個動物約25ml)收集到無菌的塑料容器中，同樣收集對照(非基因轉移的)分泌乳汁羊的乳劑，在-20℃冷凍這些樣品，運送到位于愛丁堡皇家醫(yī)院的蘇格蘭國家輸血機構，在那里對人體因子Ⅸ進行放射免疫測定。
基因轉移的乳劑和對照乳劑在4℃蒸餾水滲析一夜，然后冷凍干燥。冷凍干燥后的樣品再懸浮于蒸餾水中，而后離心分離出乳劑，用RIA檢驗人體因子Ⅸ的存在，方法如下使用在RIA緩沖劑(50mM Tris/HCl，0.25%膠，1%Tween-20，10mM HCl，pH值7.2)中稀釋的標準人體血漿，稀釋度1/10-1/1280，建立標準曲線(參見圖8)。為了消除試樣中乳劑的任何干擾，將標準血漿同樣稀釋于對照乳劑中，作出標準曲線分析來自6LL231和6LL240冷凍干燥乳劑樣品的稀釋液，RIA中的每個試管包括50mcl RIA緩沖液，50mcl樣品稀釋液，在1/30000稀釋度，50mcl兔的聚無性繁殖的抗因子Ⅸ抗體(Dako-patts)，以及50mcl 1125示蹤Ⅸ。預備包含100mcl RIA緩沖液，50mcl抗體和50mcl 1125因子的用于最大結合的對照Ⅸ，還預備包含150mcl RIA緩沖液，50mcl 1125痕跡的非專一結合的對照。
保溫一夜后，50mcl瓊酯糖-S1000配以驢抗兔IgG在試管中混合、蔗糖分離回收小球、RIA試樣對0.125國際單位(iu)/dl敏感，含有該含量以上因子Ⅸ的樣品抑制在RIA中的最大結合。
對下列樣品將RIA中的結合百分數與因子的稀釋度例數作圖。
1.標準血漿。
2.標準血漿加乳劑。
3.來自6LL231(T1)的冷凍干燥的乳劑樣品。
4.來自6LL240(T2)的冷凍干燥的乳樣樣品。
這些結果示于圖8。
來自6LL231(T1)和6LL240(T2)的乳劑，分別在2.5iu/dl和8.0iu/dl時可探測出因子Ⅸ的含量。在試驗的靈敏度含量時，在對照乳劑亦未測出活性，這些數據表明載有β-乳球蛋白-因子Ⅸ融合基因(特別是從pSS1 tg XS-FIX(通常也稱為pSS1 tg XS-TARG)中得到的SalⅠ-XbaⅠ碎片)的基因轉移后的母羊表達這個基因，并將人體蛋白質分泌到乳劑中，這就為以這種方式生產人體蛋白質建立了基礎。
權利要求
1.一種制造含多肽物質的方法，其包括通過在成年的雌性哺乳動物乳腺中表達DNA順序，將用多肽編碼的DNA順序摻入用乳劑乳清蛋白質編碼的雌性哺乳動物基因中。
2.根據權利要求
1所述的方法，其中含多肽物質是從成年雌性哺乳動物的乳劑中回收。
3.根據權利要求
1或2所述的方法，其中含多肽物質是在轉錄后修飾的乳劑中回收。
4.根據權利要求
1、2或3所述的方法，其中含肽的物質是蛋白質。
5.根據權利要求
1至4之一所述的方法，其中含多肽的物質是人體血漿蛋白質。
6.根據權利要求
1、2或3所述的方法，其中含多肽的物質是肽激素。
7.根據權利要求
1、2或3所述的方法，其中含多肽物質是血液凝固因子或血液凝固因子的亞基。
8.按照權利要求
1至4之一所述的方法，其中含多肽的物質是酶。
9.一種制造酶反應產物物質的方法，其包括通過在成年的雌性哺乳動物乳腺中表達DNA順序，將用酶編碼的DNA順序摻入用乳劑乳清蛋白質編碼的哺乳動物基因中，從而由一種或多種酶的產物催化形成反應產物。
10.根據權利要求
9所述的方法，其中反應產物從成年雌性哺乳動物乳劑中回收。
11.根據權利要求
1至9之一所述的方法，其中用多肽編碼的DNA順序在試管內摻入可在成年雌性哺乳動物乳腺中表達的乳清蛋白質基因中，形成融合基因，通過將融合基因注射到受精卵或哺乳動物胚胎細胞中，將融合基因摻入種系中，然后使被注射的受精卵或胚胎發(fā)育為成年雌性哺乳動物。
12.根據權利要求
11所述的方法，其中向兩個細胞的胚胎核進行注射。
13.根據權利要求
11所述的方法，其中將直鏈DNA分子注射到卵的原核或核上。
14.根據權利要求
1至13之一所述的方法，其中哺乳動物是家畜哺乳動物。
15.根據權利要求
14所述的方法，其中哺乳動物選自Suidae科，Ovis屬，Capra屬，以及Bos屬。
16.根據權利要求
1至13之一所述的方法，其中哺乳動物是奶羊。
17.根據權利要求
1至16之一所述的方法，其中乳清蛋白質基因編碼β-乳球蛋白。
18.根據權利要求
11所述的方法，其中融合基因包括啟動子。
19.根據權利要求
11或18所述的方法，其中融合基因包含一個轉錄起始部位。
20.根據權利要求
11、18或19所述的方法，其中融合基因包括一個或多個乳劑蛋白質基因的遠5′調節(jié)順序。
21.根據權利要求
11、18、19或20所述的方法，其中融合基因包括結合乳劑蛋白質基因順序，該順序可任意地包含內部調節(jié)順序。
22.根據權利要求
11或18至21之一所述的方法，其中融合基因包括一個鄰接乳劑蛋白質基因的3′端順序。
23.根據權利要求
11或18至22之一所述的方法，其中融合基因包括用所需的肽編碼的互補DNA順序，該順序插入乳劑蛋白質編碼基因的第一個外顯子中。
24.根據權利要求
11或18至23之一所述的方法，其中融合基因包括乳劑蛋白質編碼基因的一些5′端鄰接順序。
25.根據權利要求
11或18至24之一所述的方法，其中融合基因含有用于所需肽的信號肽。
26.根據權利要求
1至25之一所述的方法，其中將用乳劑乳清蛋白質基因的信號肽編碼的順序準確地融合到物質生產過程中的用成熟多肽N-末端氨基酸編碼的DNA順序部分中。
27.根據權利要求
1至26之一所述的方法，其中DNA順序的3′端在終止密碼子之后，但是在它的多聚腺核苷酸添加位之前停止。
28.一種如說明書所述的生產含多肽物質的方法。
29.一種遺傳構成，通過在成年雌性哺乳動物乳腺中可表達的DNA順序，將用多肽的編碼DNA順序摻入用乳劑乳清蛋白質編碼的哺乳動物基因中。
30.如權利要求
29所述的一種含有遺傳構成的動物細胞。
31.如權利要求
30所述的動物細胞是胚胎細胞。
32.其遺傳物質包含如權利要求
29所述的遺傳構成的一種動物。
33.一種包括如權利要求
29所述的遺傳構成的質粒。
專利摘要
一種制造含多肽物質的方法，通過在成年雌性哺乳動物乳腺中表達DNA順序，將用肽編碼的DNA順序摻入用乳劑乳清蛋白質編碼的哺乳動物(例如羊)基因中，這種物質可以是(任意改性的)蛋白質，例如血凝固因子。最好將DNA順序插入用乳劑蛋白質，例如β-乳球蛋白，編碼的第一個基因外顯子中。一般從雌性哺乳動物乳劑中回收該物質，而且可以在原位使用(例如假若它是酶)。
文檔編號C12N5/06GK87105412SQ87105412
公開日1988年2月24日 申請日期1987年6月30日
發(fā)明者安東尼·約翰·克拉克, 理查德·萊恩 申請人:藥物用蛋白質有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan