專利名稱:轉(zhuǎn)氨酶基因tyrB的克隆和應(yīng)用的制作方法
苯丙氨酸合成過程中的最后一步是利用轉(zhuǎn)氨酶對(duì)苯基丙酮酸進(jìn)行氨基化。雖然，有多種轉(zhuǎn)氨酶都能通過轉(zhuǎn)氨作用將苯基丙酮酸變?yōu)楸奖彼幔?xì)胞中完成這一功能的主要是稱為芳香轉(zhuǎn)氨酶的酶。在遺傳學(xué)中，大腸桿菌的芳香轉(zhuǎn)氨酶基因的縮寫是tyr B(Umbarger，Ann Rev.Biochemistry 47533-606，1978)。在大腸桿菌K12菌株中，已確切地知道了此基因在“細(xì)菌染色體”上的定位，這一基因的產(chǎn)物的酶分類編號(hào)被定為2.6.1.5(Bachmann et al.，Microbidogical Rev.441-56，1980)。
歐洲專利申請(qǐng)0，116，860號(hào)描述了從大腸桿菌K12中分離tyr B基因及將此氨基轉(zhuǎn)移酶基因克隆到多拷貝質(zhì)粒上的方法。將克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)回到最初分離此基因的菌株中，結(jié)果能使此菌株的L-苯丙氨酸產(chǎn)量提高大約11%。
現(xiàn)在，已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，從ATCC 11303大腸桿菌中分離tyr B基因，將其克隆到多拷貝質(zhì)粒上并用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化微生物后(尤其是轉(zhuǎn)化起始菌株)，能導(dǎo)致L-苯丙氨酸的產(chǎn)率提高10倍。
因此，本發(fā)明涉及1.從ATCC 11303大腸桿菌中分離的含有tyr B基因的一種染色體外復(fù)制組分。
2.利用1)中所述的染色體外組分合成芳香氨基轉(zhuǎn)移酶。
3.利用1)中所述的染色體外組分在微生物中大量生成L-苯丙氨酸，包括
a).將染色體外組分導(dǎo)入微生物中，b).使tyr B基因在此微生物中表達(dá)并合成活性芳香轉(zhuǎn)氨酶，以及c).由此轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行苯基丙酮酸的氨基化。
下面的描述和權(quán)利要求
書分別詳細(xì)說明和限定了本發(fā)明。
不僅能夠使用野生型大腸桿菌ATCC 11303，還可使用它的變種和突變株。例如，還能夠使用通過已知方法(E.Adelberget al.，Biochem.Biophys Res.Comm 18788，1965)已使之發(fā)生變異并通過L-苯丙氨酸的大量生成而選擇出來的菌株。大腸桿菌ATCC 11303的tyr B基因編碼的芳香氨基轉(zhuǎn)移酶，主要通過從谷氨酸轉(zhuǎn)移一個(gè)氨基而合成L-苯丙氨酸。除此以外，芳香轉(zhuǎn)氨酸還能合成酪氨酸、谷氨酸，天門冬氨酸和亮氨酸。異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸，苯丙氨酸和谷氨酸是利用ilv E基因編碼的轉(zhuǎn)氨酶形成的，而合成天門冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的轉(zhuǎn)氨酶是asp C基因負(fù)責(zé)表達(dá)的。但上述轉(zhuǎn)氨酸中的每一種，對(duì)主要應(yīng)當(dāng)由另兩種轉(zhuǎn)氨酶中的一種負(fù)責(zé)的氨基酸的合成也表現(xiàn)出較低的活性。
為了進(jìn)一步提高L-苯丙氨酸的合成，克隆編碼芳香氨基轉(zhuǎn)移酶的tyr B基因。這是通過從大腸桿菌ATCC 11303中分離DNA而完成的。對(duì)DNA進(jìn)行部分消化，然后使所得到的大小在20-30Kb范圍內(nèi)不等的片段連接到一柯斯質(zhì)粒中，它具有宿主復(fù)制子，然后包裝入λ噬菌體的頭部。最好是使用柯斯質(zhì)粒PIMS6026。柯斯質(zhì)粒PIMS 6026是從柯斯質(zhì)粒PLAFRI(ATCC37167)產(chǎn)生的，即將市售可得的ECORI片段(Pharmacia，Uppsala，Sweden)克隆到柯斯質(zhì)粒PLAFRI的單一Eco RI切割位點(diǎn)中，所述Eco RI片段中含有轉(zhuǎn)座子Tn 903的卡那霉素抗性基因。用Bam HI消化后再進(jìn)行連接，有可能去掉大部分Eco RI片段，從而使保留的小片段DNA插段中的Bam HI切割位點(diǎn)由兩個(gè)Eco RI切割位點(diǎn)鄰接。這一Bam HI切割位點(diǎn)(在柯斯質(zhì)粒PLAFRI中沒有)可用來進(jìn)行克隆。使包裝好的柯斯質(zhì)粒與通過合適方法制備的大腸桿菌DG 30懸浮液一起保溫，從而將柯斯質(zhì)粒導(dǎo)入微生物中。大腸桿菌DG 30缺失三種轉(zhuǎn)氨酶asp C、ilv E和tyr B。因此，雖然此菌株能在完全培養(yǎng)基中順利生長(zhǎng)，但它在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)必須從外部提供各種氨基酸，因?yàn)樗约翰荒芎铣蛇@些氨基酸。選擇合適的培養(yǎng)基則可能借助于此菌株檢測(cè)從外部吸收的DNA是否能夠補(bǔ)償某種特異轉(zhuǎn)氨酶的染色體缺失。通過在無酪氨酸的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌DG 30以檢測(cè)tyr B基因的導(dǎo)入。只有能夠補(bǔ)償酪氨酸合成的染色體缺失的克隆能夠在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，它們吸收了起源于大腸桿菌ATCC 11303菌株的含有asp C、tyr B或ilv E的DNA。雖然三種轉(zhuǎn)氨酶都能夠形成酪氨酸，但由asp C、tyr B和ilv E基因編碼的這三種酶的底物專一性不同。
例如，tyr B基因編碼的芳香轉(zhuǎn)氨酶不能從酮前體形成異亮氨酸，但能從相應(yīng)的酮前體高產(chǎn)率合成亮氨酸。asp C基因編碼的轉(zhuǎn)氨酶不能夠形成異亮氨酸，它的亮氨酸轉(zhuǎn)化效率也不高。
因此，通過在基本培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能夠分辨含有不同轉(zhuǎn)氨酶的克隆，此基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有代謝所需的基本氨基酸，但沒有特異于該特殊基因的那種氨基酸。通過這種方法，選擇出了含有tyr B基因的DG 30菌株的克隆。
現(xiàn)在有必要檢測(cè)此克隆是否真的具有tyr B基因。做到這一點(diǎn)必須從此克隆中分離出質(zhì)粒DNA。但是，要從DG 30菌株中進(jìn)行分離很為困難。雖然有可能得到質(zhì)粒DNA，但產(chǎn)率非常低。因此，在微量溶菌以后，用來自所述克隆的柯斯質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化一種大腸桿菌株，然后，有可能從中以高產(chǎn)率再分離出導(dǎo)入的DNA。大腸桿菌DHI(ATCC 33849)特別適合用于此目的。
下一步，使再分離的柯斯質(zhì)粒DNA與一種高拷貝數(shù)的載體連接。從大腸桿菌K12菌株的染色體基因圖譜已知，tyr B基因位于CLaI片段上。在大腸桿菌ATCC 11303中可能也是這樣。因此，優(yōu)先選用的載體應(yīng)當(dāng)是具有一個(gè)CLaI切割位點(diǎn)的多拷貝質(zhì)粒。序列已知的PAT 153是特別合適的載體(Winnacker，E.L.，《基因與克隆》，VCH-Verlagsgesellschaft，Weinheim)用限制性酶CLaI完全消化柯斯質(zhì)粒DNA和載體?；旌蟽煞NDNA并連接在一起，產(chǎn)物用來轉(zhuǎn)化意圖提高苯丙氨酸產(chǎn)量的宿主生物的感受態(tài)細(xì)胞。優(yōu)先使用腸道細(xì)菌，尤其是大腸桿菌，大腸桿菌ATCC 11303及其突變株和變種尤其適于此目的。用氨芐青霉素選擇抗性菌落，并通過在四環(huán)素平板上進(jìn)行復(fù)制平板培養(yǎng)而根據(jù)標(biāo)記抑制檢測(cè)插段。通過微量溶菌從合適的菌落分離質(zhì)粒DNA，用限制性酶CLaI進(jìn)行完全消化以檢測(cè)載體中是否含有CLaI片段。進(jìn)行限制性酶譜分析，以確保原初DNA片段中的所有CLaI片段都通過此方法亞克隆了。最后，使用天門冬氨酸-苯基丙酮酸、氨基轉(zhuǎn)移酶(APPAT)法，檢測(cè)含有所定義的這些CLaI片段之一的每一種克隆，檢測(cè)它們的芳香轉(zhuǎn)氨酸酶活性，也就是說檢測(cè)tyr B基因的產(chǎn)品。通過這種方法，有可能使tyr B的活性提高5至10倍。通過瓊脂糖凝膠電泳能夠表明，宿主菌株中的載體含有一個(gè)大小約為2.7MD的CLaI片段。
下述實(shí)例詳細(xì)描述了本發(fā)明。除非特別指出，百分?jǐn)?shù)都是指重量。
實(shí)例1 大腸桿菌中柯斯質(zhì)粒PIMS 6026的分離和消化從大腸桿菌分離柯斯質(zhì)粒PIMS6026所用方法根據(jù)Humphreys等人(BBA 383457-63，1975)，或者根據(jù)Birnboim和DoLy的方法(Nucleic Acids Res 7151)以大十倍的規(guī)模進(jìn)行堿性溶菌。在兩次方法中，質(zhì)粒DNA至少通過一次CsCl/EtBr密度梯度離心進(jìn)行純化。
根據(jù)生產(chǎn)廠家(New England Biolabs)的說明，用限制性酶BamHI完全消化柯斯質(zhì)粒PIMS6026。為了檢測(cè)消化的完全度，取一等分酶解混合物加到0.8%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色和用短波紫外光(254nm)照射后如果只出現(xiàn)一條帶則表明完全消化了。用苯酚處理從消化的柯斯質(zhì)粒DNA中去除限制性酶，用乙醇沉淀DNA，用70%的乙醇洗滌，真空干燥后加到適量的TE緩沖液中(10mM Tris 1mM EDTA，pH 8.0)。然后，根據(jù)生產(chǎn)廠家(Boehringer Mannheim)給出的方法，用堿性磷酸酯酶進(jìn)行任意處理。加入1μl堿性磷酸酯(CIP)，然后使反應(yīng)混合物在37℃下保溫30分鐘，并如上述通過苯酚處理除去酶和純化DNA。最后，使它再懸浮于TE緩沖液中。
實(shí)例2 大腸桿菌ATCC 11303 DNA的部分消化根據(jù)Marmur的方法(J.Mol.Biol.53155-162，1961)從大腸桿菌ATCC 11303中分離總DNA。用限制性酶Sau3A部分消化分離的總DNA，使得到的片段的大小主要在20-30kb范圍內(nèi)。先進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)，以確定達(dá)到這一目的所需的DNA和酶的最佳比例以及酶對(duì)DNA作用的最佳時(shí)間。合適的方法見于出版物《focus》中(第7卷第二冊(cè)第3頁(yè)，1985，BRL出版)。被選定為最佳的反應(yīng)時(shí)間過去后，在65℃下加熱10分鐘使酶分解，然后利用合適的DNA標(biāo)記物(例如用EcoRI消化的λ噬菌體DNA)，通過瓊脂糖凝膠電泳確定形成的DNA片段為所需的大小范圍。
實(shí)例3 限制性酶解混合物的連接用Sau3A部分消化的大腸桿菌ATCC 11303的總DNA，以大約1∶5的摩爾比例與柯斯質(zhì)粒PIMS 6026的DNA混合，該質(zhì)粒預(yù)先用BamHI完全切割并用堿性磷酸酯酶處理，使得到的混合物與濃縮好幾倍的緩沖液(如新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)公司所指出的那樣，使離子濃度對(duì)于T4DNA連接酶達(dá)到最佳化)混合，使混合物與1μl酶于16℃下至少保溫14小時(shí)。此混合物的總體積為50μl，總DNA濃度為20μg/ml。
實(shí)例4 λ噬菌體的包裝連接反應(yīng)完成后，將實(shí)例3所得的DNA離體包裝入λ噬菌體的頭部。達(dá)到此目的所必需的兩種不同的菌株提取物可由Hohn，B.的方法(參見吳瑞編輯的《重組DNA，酶學(xué)方法》第68卷第299-309頁(yè)，科學(xué)出版社，紐約，1979)得到，或可購(gòu)自Boehringer Mannheim或Amersham Buchler，Braunschweig。
使3μl實(shí)例3得到的混合物在冰浴中冷卻與使用前剛解凍的細(xì)菌提取物(Amersham公司提供)充分混合?；旌衔镉?0℃保溫30-60分鐘，然后加入200μl SM緩沖液(100mMNacl，10mM MgSO4，50mMTris-HclPH7.5，0.01%明膠)。此混合物或是直接用于轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，或是在加入10μl氯仿后保存在4℃下備用。
實(shí)例5 大腸桿菌DG30的轉(zhuǎn)導(dǎo)在5ml L肉湯中加入0.4%的麥芽糖，L肉湯的組成為1% Bacto胰蛋白胨，0.5%酵母提取物和0.5% Nacl，用50μl生長(zhǎng)靜止期的大腸桿菌DG30液體培養(yǎng)物接種混合物。于37℃下保溫12小時(shí)，直至達(dá)到早期止期。將細(xì)菌離心下來，小心地再懸浮于2.5ml含有10mM Mgcl2的水溶液中。10μl實(shí)例4的混合物與20μl濃縮的細(xì)菌懸浮液混合，混合物于室溫下保溫50分鐘。
然后加入200μlL肉湯，混合物于37℃下保溫1小時(shí)，伴以不時(shí)的搖動(dòng)。從混合物中取50μl的等分樣品涂在含有20μg/ml四環(huán)素的L肉湯瓊脂上。平板在37℃下至少保溫12小時(shí)。根據(jù)上述方法，每一批平均可能得到1000個(gè)菌落。
實(shí)例6 選擇帶有asp C或ilv E或tyr B基因的大腸桿菌DG30菌株將根據(jù)所述方法，在大腸桿菌DG30轉(zhuǎn)導(dǎo)后，在含有20μg/ml四環(huán)素的L肉湯瓊脂平板上得到的約800個(gè)菌落印在基本瓊脂上。基本瓊脂由M9培養(yǎng)基和葡萄糖組成(MiUer《分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1972)，其中補(bǔ)充有異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸，天門冬氨酸和苯丙氨酸。但DG30菌株同樣不能合成的酪氨酸沒有加入培養(yǎng)基中。800個(gè)印過來的菌落中，有7個(gè)能夠在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
為了分辨大腸桿菌DG30中三種可能的基因asp C、ilv E和tyr B，這7個(gè)菌落再印到上述基本培養(yǎng)基中，其中補(bǔ)充有上面列出的氨基酸，但每種情況中減去一個(gè)由某個(gè)基因編碼的某種轉(zhuǎn)氨酶對(duì)其具有底物專一性的氨基酸。下表列出結(jié)果克隆 補(bǔ)償?shù)幕九囵B(yǎng)基不含 假設(shè)的基因ASP Leu Ile Tyr1 + + - + tyr B2 + + - + tyr B3 - +- + +- ilv E4 - +- + +- ilv E5 + + - + tyr B6 + + - + tyr B7 - +- + +- ilv E+＝正常生長(zhǎng)+-＝不良生長(zhǎng)-＝?jīng)]有生長(zhǎng)實(shí)例7 tyr B基因的定位從實(shí)例6得到的克隆1至7中，根據(jù)Maniatis等人的方法(冷泉港實(shí)驗(yàn)室366-370頁(yè)，1982)通過微量溶菌得到柯斯質(zhì)粒DNA。此柯斯質(zhì)粒DNA然后導(dǎo)入大腸桿菌DHI中(ATCC 33849)，從中能夠以高產(chǎn)率再分離出導(dǎo)入的柯斯質(zhì)粒DNA。
最初從大腸桿菌DG30的克隆5(見實(shí)例6)中得到的質(zhì)粒DNA，從用此DNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DHI菌株中分離出來，并用限制性酶ClaI完全消化(根據(jù)生產(chǎn)廠家New England Biolabs公司的說明進(jìn)行)。同樣用ClaI完全消化載體PAT 153然后用堿性磷酯酶處理。根據(jù)實(shí)例4所述方法，混合兩種DNA并使之連接在一起，取1等分連接混合物(如10μl)轉(zhuǎn)化大腸桿菌ATCC 11303菌株的總感受態(tài)細(xì)胞。在含有50μg/ml氨芐青霉素的L肉湯平板上選擇抗性菌落，在含有20μg/ml四環(huán)素的L肉湯平板上進(jìn)行復(fù)制平板培養(yǎng)，以檢測(cè)標(biāo)記物純化及因此檢測(cè)插段。從表現(xiàn)出ArPTsc表型的菌落中，通過微量溶菌分離質(zhì)粒DNA，用限制性酶ClaI完全消化以確定載體PAT 153中ClaI片段的存在。
實(shí)例8 轉(zhuǎn)氨酶活性的檢測(cè)利用APPAT法(天門冬氨酸-苯基丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)法，Sigma藥盒GO390，其中的α-酮戊二酸由苯基丙酮酸代替)，測(cè)定實(shí)例7得到的克隆的芳香轉(zhuǎn)氨酶活性，即測(cè)定tyr B基因的產(chǎn)品。用未轉(zhuǎn)化的起始菌株大腸桿菌ATCC 11303作為比較。與起始菌株大腸桿菌ATCC 11303相比較，在測(cè)定的一例中tyr B活性表現(xiàn)出顯著上升，具體說上升5至10倍。
通過瓊脂糖凝膠電泳和合適的標(biāo)記物，有可能表明tyr B基因活性呈現(xiàn)上升的菌株含有PAT 153載體，它含有摻入其中的大小約為2.7MD的ClaI片段。如果再分離的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化不含質(zhì)粒的大腸桿菌ATCC 11303菌株，有可能在每一例中都觀察到tyr B基因的活性上升5-10倍。該相應(yīng)的質(zhì)粒被命名為PIMS 6056。
權(quán)利要求
1.一種制備含有tyr B基因的染色體外復(fù)制組為的方法，其中tyr B基因是從大腸桿菌ATCC11303中分離得到并克隆到一種質(zhì)粒中。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所用的質(zhì)粒是多拷貝質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中所用的質(zhì)粒是PAT153。
4.一種在微生物中大量生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，該方法包括a)將如權(quán)利要求
1中可得到的染色體外組分導(dǎo)入一種微生物中，b)在該微生物中表達(dá)tyr B基因并合成活性芳香轉(zhuǎn)氨酶，以及c)通過該轉(zhuǎn)氨酶對(duì)苯基丙酮酸進(jìn)行氨基化。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其中的微生物是腸道細(xì)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中的微生物是大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中的微生物是大腸桿菌ATCC 11303及其變種和突變株。
專利摘要
從大腸桿菌ATCC11303中分離tyrB基因，將它克隆到一種多拷貝質(zhì)粒中，用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化起始菌株后，可使L-苯丙氨酸的產(chǎn)率提高10倍。
文檔編號(hào)C12P13/22GK87106923SQ87106923
公開日1988年6月22日 申請(qǐng)日期1987年9月18日
發(fā)明者魯?shù)细瘛ゑR奎特, 約翰·森, 翰斯·馬斯亞斯·迪格, 格哈德·沃納, 馬蒂恩·羅賓森, 安德魯·多赫蒂 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan