專利名稱：一種多糖及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多糖，具體地說是涉及一種海洋真菌炭團菌多糖YCP及它的制法和用途。
背景技術：
真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的、可以控制細胞分裂分化，調(diào)節(jié)細胞生長衰老的一類活性多糖。真菌多糖作為藥物研究始于50年代，在60年代以后成為免疫促進劑而引起人們的興趣。真菌多糖是目前公認的有較高效應的免疫增強劑，許多真菌多糖制劑已廣泛應用于臨床，在自身免疫性疾病、免疫功能低下癥以及腫瘤的治療等方面取得了令人鼓舞的臨床效果。但目前對陸生生物(動物、植物、微生物等)多糖的研究開始的較早，已從這些生物中分離純化得到了多種多糖，并對它們的結(jié)構與功能進行了比較廣泛的研究，例如目前已用于臨床的香菇多糖、茯苓多糖、云芝多糖以及裂褶菌多糖等真菌多糖均來源于陸生，而對海洋生物多糖的研究多局限于已能規(guī)模養(yǎng)殖或易于采集的海洋生物的多糖。另外，海洋天然產(chǎn)物的研究目前多見于結(jié)構類型各異的中小分子，對絕大多數(shù)海洋生物富含的多糖尚未給予足夠的重視，主要集中于甲殼素、藻類多糖等[參見Noda H，Amano H，Arashima K et al.Nippon Suisan Gakkaishi，1989，551265；Zhang EX，Yu LJ，XiaoX.Chinese J Mar Drugs，1994，131；Xue CH，Yu GL，Hirata T et al.Biosci Biotechnol Biochem，1998，62206；劉曉梅，張洪泉.螺旋藻多糖對荷瘤小鼠化療后造血細胞增殖、凋亡及Bcl-2表達的影響，藥學學報，2002，37616.]，而對海洋微生物產(chǎn)生的新活性多糖的研究報道極少。
多糖的結(jié)構可分為一級、二級、三級和四級結(jié)構。它的一級結(jié)構是指其單糖殘基的組成、排列序列和連接方式等；二級結(jié)構是指多糖骨架鏈間以氫鍵結(jié)合形成的各種聚合體，這只關系到其分子主鏈的構象，不涉及側(cè)鏈的空間排布；三級結(jié)構是指由多糖中糖殘基中的羥基、羧基、氨基及其它官能團間通過非共價作用而導致的有序、規(guī)則而粗大的空間構象；四級結(jié)構是指多糖多聚鏈間以非共價作用力而結(jié)合形成的聚集體。多糖的結(jié)構分析完整的多糖結(jié)構分析包括對多糖的一級結(jié)構和高級結(jié)構的分析。目前在多糖一級結(jié)構的分析中大多采用傳統(tǒng)的化學方法與物理方法相結(jié)合，可基本闡明某一多糖的一級結(jié)構的大致特征[參見StroopCJ，Xu Q，Retzlaff M et al.Carbohydrate research，2002，337335；Shashkov AS，Torgov VI，Nazarenko EL et al.Carbohydrate research，2002，3371119；KolenderAA，Matulewicz MC.Carbohydrate research，2002，33757.Yang BY，Ding Q，Montgomery R.Carbohydrate research，2002，337731]。
近年來我們從一株海洋真菌(Hypoxylon sp.)菌絲體中經(jīng)提取純化獲得了一種多糖(簡稱YCP)并對其理化性質(zhì)、化學結(jié)構、生物學活性進行了比較廣泛的深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種多糖，它的制法及在制備藥物中的用途。
本發(fā)明的具體的技術方案如下一種多糖，它由葡萄糖和糖醛酸構成，不含蛋白質(zhì)和核酸，分子量為1.6×106Da～2.6×106Da，端基碳為α-構型，旋光度[α]Dt＝+131.7°～+159.4°，多糖的基本骨架由1→4糖苷鍵連接的葡萄糖構成，每17個葡萄糖殘基有一個側(cè)鏈，側(cè)鏈為一個葡萄糖分子或一個糖醛酸分子，葡萄糖和糖醛酸的比例為2∶1，均通過1→6糖苷鍵與主鏈葡萄糖相連接，每摩爾多糖中葡萄糖與糖醛酸的物質(zhì)的量之比為53∶1，它有如下結(jié)構式 *側(cè)鏈上GlcpA∶Glc摩爾比為1∶2一種上述多糖的制法，它由下列步驟組成步驟1.稱取海洋真菌炭團菌濕菌體1000g，加水置組織搗碎器中搗碎，補足水至2000～4000mL，60～90℃水浴提取8～20小時，間歇攪拌，紗布濾去殘渣，2000～4000r.p.m.離心去沉淀，步驟2.將步驟1所得的提取液濃縮至500～2000mL，加入濃縮液1/4～1/7體積的氯仿及1/15～1/30體積的正丁醇，劇烈振蕩，靜置分層，除去下層有機溶劑層及中間層，保留水層，反復萃取2～5次，步驟3.將步驟2所得的水溶液對自來水透析24～48小時，透析液濃縮至500～2000mL，逐步加入1～4倍量乙醇，4℃放置2～10小時，離心，沉淀依次以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得多糖YCP粗品，步驟4.取多糖YCP粗品50mg，充分溶解，上已平衡好的離子交換柱(DEAE-32)，先以50～300mL蒸餾水洗滌，再以0～2mol/L NaCl溶液梯度洗脫，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測，合并相同組分。離子交換柱分離所得多糖組分上分子篩柱層析(Sephacryl S-400)，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測，合并相同組分，冷凍干燥，即得本發(fā)明的多糖YCP。
本發(fā)明的多糖YCP對小鼠移植瘤Heps和S180有明顯的抑制作用，因此本發(fā)明的多糖YCP可以應用于制備治療腫瘤的藥物。
四

圖1多糖YCP的高效液相色譜純度鑒定圖譜；圖2多糖YCP的單糖組分的薄層層析圖譜，其中1.混合糖 2.鼠李糖 3.甘露糖 4.葡萄糖 5.半乳糖 6.YCP 7.糖醛酸；圖3多糖YCP的甲基化分析步驟示意圖；圖4多糖YCP高碘酸消耗-時間曲線；圖5多糖YCP的紅外光譜分析圖譜；圖6多糖YCP的氫核磁共振光譜圖；圖7多糖YCP的碳核磁共振光譜圖；圖8多糖YCP與剛果紅絡合實驗最大吸收波長曲線。
五具體實施例方式
實施例1.多糖YCP的提取、分離純化、鑒定稱取濕菌體1000g，加水置組織搗碎器中搗碎，補足水至2000mL，60℃水浴提取20小時。間歇攪拌，紗布濾去殘渣，2000r.p.m.離心去沉淀。提取液濃縮至500mL，加入濃縮液1/4體積的氯仿及1/15體積的正丁醇，劇烈振蕩，靜置分層，除去下層有機溶劑層及中間層，保留水層。反復萃取2次。所得溶液對自來水透析24小時。透析液濃縮至500mL，逐步加入等體積的乙醇，4℃放置2小時。離心，沉淀依次以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得多糖YCP粗品。
取多糖YCP粗品50mg，充分溶解，上已平衡好的離子交換柱(DEAE-32)，先以50mL蒸餾水洗滌，再以0～2mol/L NaCl溶液梯度洗脫，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測，合并相同組分。離子交換柱分離所得多糖組分上分子篩柱(Sephacryl S-400)層析，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測，合并相同組分，冷凍干燥，即得本發(fā)明的多糖YCP。
HPLC純度鑒定采用Shodex SUGAR KS-805(8mmID×300mm)高效液相色譜柱和示差折光檢測器，流動相為H2O，YCF1mg/ml進樣20μl，流速1ml/min。
結(jié)果見圖1。HPLC純度鑒定結(jié)果為一個對稱峰，表明所得的多糖為單一組分。
實施例2.多糖YCP的提取、分離純化、鑒定稱取濕菌體1000g，加水置組織搗碎器中搗碎，補足水至3000mL，80℃水浴提取12小時。間歇攪拌，紗布濾去殘渣，3000r.p.m.離心去沉淀。提取液濃縮至1000mL，加入濃縮液1/5體積的氯仿及1/25體積的正丁醇，劇烈振蕩，靜置分層，除去下層有機溶劑層及中間層，保留水層。反復萃取4次。所得溶液對自來水透析36小時。透析液濃縮至1000mL，逐步加入3倍體積的乙醇，4℃放置6小時。離心，沉淀依次以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得多糖粗品。
取粗品50mg，充分溶解，上已平衡好的離子交換柱(DEAE-32)，先以200mL蒸餾水洗滌，再以0～2mol/L NaCl溶液梯度洗脫，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測，合并相同組分。離子交換柱分離所得多糖YCP組分上分子篩柱層析(Sephacryl S-400)，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測，合并相同組分，冷凍干燥，即得本發(fā)明的多糖YCP，純度與實施例1的相同。
實施例3.多糖YCP的提取、分離純化、鑒定稱取濕菌體1000g，加水置組織搗碎器中搗碎，補足水至4000mL，90℃水浴提取8小時。間歇攪拌，紗布濾去殘渣，4000r.p.m.離心去沉淀。提取液濃縮至2000mL，加入濃縮液1/7體積的氯仿及1/30體積的正丁醇，劇烈振蕩，靜置分層，除去下層有機溶劑層及中間層，保留水層。反復萃取5次。所得溶液對自來水透析48小時。透析液濃縮至2000mL，逐步加入4倍體積的乙醇，4℃放置10小時。離心，沉淀依次以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得多糖粗品。
取粗品50mg，充分溶解，上已平衡好的離子交換柱(DEAE-32)，先以300mL蒸餾水洗滌，再以0～2mol/L NaCl溶液梯度洗脫，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測，合并相同組分。離子交換柱分離所得多糖YCP組分上分子篩柱層析(Sephacryl S-400)，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測，合并相同組分，冷凍干燥，即得本發(fā)明的多糖YCP，純度與實施例1的相同。
實施例4.YCP重均分子量測定采用高效液相色譜儀，GPC專用軟件，色譜柱為測多糖的專用凝膠柱ShodexSUGAR KS-805(8mmID×300mm)，分離范圍上限為500×104道爾頓，檢測器為示差折光檢測器。流動相為水柱溫35℃流速1mL/min。取分子量不同的右旋糖酐分子量標準品適量，分別用流動相制成每mL中約含1mg的標準溶液，分別取上述標準溶液100μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由GPC專用軟件繪制標準曲線，得線性回歸方程lgMw＝8.948-0.4333tR(Mw為標樣的已知重均分子量；tR為標樣的保留時間)。取YCP多糖1mg，溶于1mL水，上樣100μL，記錄色譜圖。取3批樣品分別進行測定。
測定結(jié)果見表1。YCP多糖的重均分子量為1.6×106Da～2.6×106Da。
表1.YCP分子量測定批次1 2 3分子量(×106Da)1.6 1.92.6單糖組分分析實施例5.多糖YCP的薄層層析(TLC)稱取多糖樣品5mg，置于干凈的安瓿中，加入2mol/l三氟乙酸2mL，封管。100℃水解12小時后，將三氟乙酸蒸干，用甲醇洗4～5次后，用蒸餾水溶解，備用。精密稱取鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸各20mg，分別溶于1mL蒸餾水中，從中各吸取0.2mL溶液混合均勻作為混合糖。量取0.75％CMC-Na溶液16mL于研缽中，分次加入6g硅膠G以及終濃度為0.3mol/L的NaH2PO4，研磨均勻后均勻涂鋪在干凈的玻璃板上(10×20cm)。靜置晾干，使用前在105℃活化1小時。按正丁醇∶丙酮∶水＝4∶3∶1配成展開劑置于層析缸中，放入已活化好的板，飽和10分鐘后，上行展開。展開完畢后，取出，以苯胺-鄰苯二甲酸溶液為顯色劑顯色后，于110℃加熱10min。
結(jié)果見圖2。YCP完全酸水解后進行薄層層析，結(jié)果只顯示清晰的葡萄糖斑點。
實施例6.多糖YCP中糖醛酸和葡萄糖含量的測定糖醛酸含量的測定精密量取標準糖醛酸溶液(60μg/mL)0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于帶塞試管中，補足蒸餾水至0.5mL，在冰浴中預冷后逐滴加入1.5mL0.0125mol/L的四硼酸鈉-濃硫酸溶液。振搖混合，在沸騰水浴中煮沸5min。以冰浴冷卻至室溫，每管加入25μL0.15％的間羥聯(lián)苯-0.5％氫氧化鈉溶液。搖勻后在530nm處測定光吸收，以“0”管作空白對照，繪制標準曲線。為避免樣品中非己糖醛酸成份與四硼酸鈉硫酸溶液反應的干擾，可作一樣品對照，即以25μL0.5％氫氧化鈉代替間羥聯(lián)苯溶液，測得光吸收值從樣品吸收值中扣除。取YCP多糖配成1mg/mL的溶液，吸取0.1mL，補足蒸餾水至0.5mL，余操作同標準曲線的制備，再由回歸方程算出相應濃度。
葡萄糖含量的測定精確配置100μg/mL的標準糖醛酸溶液，分別吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL標準溶液置帶塞試管中，補足蒸餾水至1mL，加入2mg/mL蒽酮試劑4mL，混勻，沸水浴煮10min。冷卻后測定620nm處的吸光度。以“0”管作空白對照，以吸光度對葡萄糖濃度作圖得標準曲線。
精確配置100μg/mL的標準葡萄糖溶液，分別吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL標準溶液置帶塞試管中，補足蒸餾水至1mL，加入2mg/mL蒽酮試劑4mL，混勻，沸水浴煮10min。冷卻后測定620nm處的吸光度。以“0”管作空白對照，以吸光度對葡萄糖濃度作圖得標準曲線。
取YCP多糖配成1mg/mL的溶液，吸取0.1mL，補足蒸餾水至1mL，余操作同標準曲線的制備。
由于糖醛酸的存在對硫酸蒽酮法測定葡萄糖的含量存在一定的干擾，為此首先采用間羥聯(lián)苯法(y＝0.0064x-0.0006，γ＝0.9997)測定糖醛酸的含量，再根據(jù)糖醛酸-硫酸蒽酮標準曲線(y＝0.0013x-0.0003，γ＝0.9998)得到糖醛酸吸光度值的貢獻，總糖的吸光度與之的差值即為葡萄糖顯色所致，再根據(jù)葡萄糖-硫酸蒽酮標準曲線(y＝0.0069x-0.0028，γ＝0.9993)計算出總糖中葡萄糖的含量。由實驗可得總糖中葡萄糖為975μg/mgYCP，糖醛酸為12.7μg/mgYCP。
實施例7.多糖YCP的糖醇乙酰化衍生物的氣相分析稱取多糖10mg加2mol/L的三氟乙酸，于安瓿中封口，于100℃水解8h，水解產(chǎn)物于蒸發(fā)皿中蒸干后加入甲醇5～6次反復蒸干后溶于2mL水中，加入5mg硼氫化鈉還原，3mg內(nèi)標物肌醇，充分溶解后，65℃放置30min，水解液減壓蒸干。然后加少量強酸型離子交換樹脂732H+攪拌數(shù)分鐘后，檢查溶液呈酸性時過濾，樹脂用少量水反復洗3次，合并濾液在水浴上蒸干，所得殘余物加3mL甲醇溶解并蒸干，反復4次以上以除去硼化物，最后使還原產(chǎn)物于小安瓿管中徹底干燥。在上述還原產(chǎn)物中加入醋酐和無水吡啶各0.3mL，封口，于100℃水浴乙?；?0min，冷卻，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，加入0.5mL水，濃縮后反復加水2-3次直至蒸干，殘渣用1mL三氯甲烷提取，提取液用1mL水洗，三氯甲烷溶液減壓蒸干后，再用0.2mL三氯甲烷重溶。標準單糖(D-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖)按相同方法處理。
氣相條件為惠普6890氣相色譜儀，HP-55％苯甲基硅烷毛細管柱(30.0cm×0.25mm×0.25μm)。分流-不分流進樣口，進樣口溫度260℃。程序升溫110℃至190℃，3℃/min；190℃至206℃，2℃/min；206℃至280℃，20℃/min，保留2min。FID檢測器，載氣為N2，流速25.0mL/min，檢測器溫度300℃。
結(jié)果見表2。YCP酸水解產(chǎn)物的還原乙?；a(chǎn)物進行氣相色譜分析，YCP僅出現(xiàn)一個單峰，與標準單糖的保留時間對比，可認為YCP由葡萄糖組成。在氣相色譜中未檢出糖醛酸，這是因為糖醛酸含有羧基，在一般條件下不易被還原、乙?；?、氣化出峰。
表2.GYCP氣相色譜分析保留時間(min)23.981 24.35831.80732.12832.339D-鼠李糖 +D-阿拉伯糖 +D-甘露糖 +D-葡萄糖 +D-半乳糖 +YCP +相鄰單糖基連接方式分析實施例8.甲基化分析稱取20mg徹底干燥糖樣，溶于6mL無水二甲亞砜(DMSO)充氮氣封管，超聲波振蕩10分鐘，加入200mg精細研磨的NaOH，充氮氣密封，超聲波振蕩90min，放置90min，逐滴加入CH3I 2mL，超聲波振蕩30min，放置30min，減壓蒸餾除去剩余的CH3I。
后續(xù)步驟見圖3。
重復上述甲基化步驟一次，經(jīng)紅外光譜分析，在3500cm-1附近無吸收峰，表明多糖上的羥基已經(jīng)完全甲基化。
上述甲基化樣品中加入90％(V/V)甲酸3mL，封口，水解6h，減壓蒸發(fā)至干，加入2mol/L的三氟乙酸，封口，于100℃水解8h，乙?；?，進行氣相—質(zhì)譜聯(lián)用分析。
結(jié)果見表3。
表3.YCP甲基化反應氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)果甲基化糖 摩爾比 質(zhì)譜主要碎片(m/z) 連接方式2，3，4，6-Tetra-O-Me-Glc 0.66 43，45，71，87，101，117，129，145，161，205Glc-(1→2，3，6-Tri-O-Me-Glc 1643，45，99，101，113，117，233 →4)-Glc-(1→2，3-Di-O-Me-Glc 1 43，101，117，205 →4，6)-Glc-(1→
根據(jù)GC保留時間(tR)及MS主要碎片(m/z)，顯示反應產(chǎn)物中有1，5-二乙?；?2，3，4，6-四甲基葡萄糖、1，4，5-三乙酰基-2，3，6-三甲基葡萄糖以及1，4，5，6-四乙?；?2，3-二甲基葡萄糖，其摩爾比為0.66∶16∶1，表明1→4連接葡萄糖構成了多糖的基本骨架，每17個葡萄糖殘基有一個6-O位分支，根據(jù)此結(jié)果還可以推斷側(cè)鏈上還存在因不易被還原、乙?；鴼饣龇宓奶侨┧?，并且側(cè)鏈中的葡萄糖與糖醛酸的比例為2∶1，每摩爾多糖分子中葡萄糖與糖醛酸的摩爾比為53∶1，這與前述YCP多糖中葡萄糖與糖醛酸的比例相吻合。
實施例9過碘酸氧化與Smith降解將NaIO4配成15mmol/L溶液，稀釋250倍，再稀釋成10個不同濃度，于223nm處測吸收值，作標準曲線。
精確稱取多糖YCP10mg，加10mLNaIO4置4℃暗處，間或振搖，間隔時間取樣，稀釋250倍，在223nm處測吸收值，直至數(shù)值不再下降為止。由標準曲線查出NaIO4消耗量。
量取0.1mol/L的NaOH儲備液25ml加新煮沸過的冷蒸餾水定容至250ml。精密稱取三份干燥恒重的鄰苯二甲酸氫鉀，每份30mg，分別加20ml新煮沸過的冷蒸餾水溶解，冷卻后加酚酞指示液2滴，用NaOH標準溶液滴定至微紅色為終點。
高碘酸反應終止后，以溴甲酚紫作為指示劑，用上述標定過的0.006576mol/L的NaOH溶液測定甲酸釋放量。
YCP多糖經(jīng)15mM高碘酸完全氧化后，加入適量乙二醇攪拌30min以還原剩余的高碘酸。裝入透析袋，對流水透析48h，蒸餾水透析12h，于70-80℃減壓濃縮至最小體積，用NaBH4于室溫暗處還原12h，用0.1mol/L乙酸調(diào)節(jié)至pH5.5，以分解剩余的硼氫化物，對蒸餾水透析24h后冷凍干燥。將所得的多糖醇用2mol/L的三氟乙酸于100℃水解8h，水解液減壓蒸干，進行薄層層析。
結(jié)果見圖4。
YCP經(jīng)高碘酸氧化，144h可反應完全，高碘酸的消耗達到穩(wěn)定由NaIO4標準曲線(y＝0.0975x-0.0064，γ＝0.9997)測得每mol多糖消耗為1.03mol高碘酸量并有0.05mol甲酸生成，其結(jié)果與由甲基化結(jié)果計算的理論值1.06和0.06基本吻合，說明甲基化反應結(jié)果所得各殘基間的摩爾比正確。
Smith降解產(chǎn)物經(jīng)薄層層析主要產(chǎn)物為赤蘚醇并有少量甘油，說明YCP以1→4糖苷鍵為主要連接方式，并有少量1→6連接的葡萄糖側(cè)鏈，這也與甲基化和高碘酸反應結(jié)果相吻合。
端基碳構型分析實施例10.多糖YCP比旋測定將多糖YCP干燥失重后，精密稱取25mg，定容至25mL，用0.8μm的濾膜過濾，取續(xù)濾液依法測定旋光度，由公式[α]Dt＝α/lc計算比旋[α旋光度；L玻管長度(dm)；c溶液濃度(g/mL)]。取5批樣品分別進行測定。
測定結(jié)果見表4。多糖YCP具有較高的正性比旋(+131.7°～+159.4°)，表明YCP的端基碳為α-構型。
表4.YCP比旋測定批次 1 2 3 4 5比旋(°) +151.4+131.7+142.9+156.9+159.4實施例11紅外光譜分析多糖YCP經(jīng)干燥后稱取1mg，用溴化鉀壓片法在Nicolet-170X型紅外光譜儀上于4000～400cm區(qū)間掃描。
多糖YCP的紅外光譜圖如圖5所示。在3600～3200cm-1出現(xiàn)一種寬峰，是O-H的伸縮振動。在3000～2800cm-1的一組峰是糖類C-H伸縮振動，1400～1200cm-1的一些峰是C-H的變角振動。這兩組峰是糖類化合物的特征吸收。1000～1200cm-1間的吸收峰是由C-O的伸縮振動所引起。930cm-1的吸收是由D-葡萄吡喃環(huán)的非對稱環(huán)伸縮振動所引起。850cm-1的吸收是α-端基差向異構的的C-H變角振動的特征吸收，表明多糖YCP的端基碳為α-構型，這與比旋測定結(jié)果一致。761cm-1的吸收是由D-葡萄吡喃環(huán)的對稱環(huán)伸縮振動所引起。
實施例12核磁共振分析取純化的多糖YCP15mg，溶于氘代水(D2O)，60℃于Varian 500兆核磁共振儀上進行分析。
結(jié)果見圖6，圖7。多糖YCP所測得的核磁共振信號如下1H-NMRδ5.37brs，4.98brs 3.97m，3.87m，3.70m，3.66m，3.43t(J＝8.6Hz).13C-NMRδ185.8*(C)，100.1-100.3(CH)，77.9-78.2(CH)，75.3-75.5*(CH)，73.6-74.0(CH)，73.1-73.4*(CH)，71.8-72.1(CH)，70.2-70.5*(CH2)，70.0-70.2*(CH2)，61.4-61.8(CH2)。(*弱峰)。歸屬見表5。
表5.YCP的13C-NMR and1H-NMR信號歸屬化學位移(ppm)殘基C-1 C-2 C-3 C-4C-5 C-6H-1 H-2 H-3 H-4H-5 H-6Glc-(1→ 100.1-100.3 71.8-72.1 73.6-74.0 70.2-70.5 71.8-72.1 61.4-61.84.983.663.973.70 3.87 3.87→4)-Glc-(1→ 100.1-100.3 71.8-72.1 73.6-74.0 77.9-78.2 71.8-72.1 61.4-61.85.373.663.973.70 3.87 3.87→4，6)-Glc-(1→ 100.1-100.3 71.8-72.1 73.6-74.0 77.9-78.2 70.2-70.5 70.0-70.25.373.663.973.70 3.87 overlap100.1-100.3 71.8-72.1 73.6-74.0 70.2-70.5 73.1-73.4 185.8GlcA-(1→ 4.983.663.973.70 overlap -根據(jù)以上結(jié)果推斷多糖YCP的重復單元如下 *側(cè)鏈上GlcpA∶Glc摩爾比為1∶2構象分析實施例13KI-I2反應配制濃度為1mg/mL的多糖YCP溶液1mL，加入碘試劑(含0.02％I2的0.2％KI溶液)0.6mL，測定200～700nm的電子吸收光譜。
多糖YCP與碘試劑呈陰性反應，UV檢測于500nm以上無紫外吸收，說明該多糖不具有淀粉的α-螺旋結(jié)構，說明該多糖構象不同于直鏈淀粉。
實施例14剛果紅實驗將多糖溶液(濃度為2mg/mL)和剛果紅溶液(濃度為12.2μmol/L)等體積混合，靜置15min，依次測定混合液在0～0.4mol/L的NaOH溶液中最大吸收波長λmax的變化。以純剛果紅溶液為參比，手控波長掃描。
結(jié)果見圖9。多糖YCP在剛果紅實驗中，與剛果紅配合物的最大吸收波長沒有發(fā)生紅移，也未出現(xiàn)亞穩(wěn)區(qū)，表明多糖YCP分子并不存在多股螺旋構象，提示多糖YCP在水溶液中可能以無規(guī)線團構象存在。
實施例15.多糖YCPiv對小鼠移植瘤Heps的抑制作用取ICR小白鼠(18～22g，雌雄各半)60只，按移植性腫瘤研究法接種Heps實體型，接種后24小時稱鼠重，并隨機分為6組，空白對照組與天地欣(5mg/kg)組、環(huán)磷酰胺(20mg/kg)組分別為陰、陽性對照組，多糖YCP組設高、中、低三個劑量組(9，3，1mg/kg)。接種24小時后給藥，iv給藥，每2天一次，共給藥4次，于停藥后第2天處死荷瘤小鼠稱重，并分離瘤塊稱重，所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理(t檢驗)。
結(jié)果見表6。與生理鹽水對照組相比，多糖YCP(9，3mg/kg)組、天地欣組及Cy組皆有顯著抑制Heps的腫瘤生長作用，其中多糖YCP組與天地欣組對小鼠體重增長無明顯影響，而Cy組有顯著的抑制小鼠體重增長作用。實驗重復3次，結(jié)果相近。
表6 YCPiv對小鼠移植瘤Heps的抑制作用 (X±SD)(n＝10)劑量 小鼠體重(g)瘤重 抑瘤率批次 組別(mg/kg) 給藥前 給藥后 (g) (％)1空白對照 19.50±1.2827.9±2.47 1.92±0.29 0YCP1 19.40±1.0227.80±2.231.55±0.53 18.983 20.00±1.6127.90±2.701.29±0.44**32.599 19.20±1.1725.70±2.611.13±0.34**40.98天地欣 5 19.30±1.2726.40±2.241.22±0.44**36.65Cy 20 19.30±1.1023.00±1.34**0.62±0.19**67.942空白對照 19.30±1.1027.60±1.501.47±0.32 0YCP1 19.40±1.2027.70±1.491.21±0.47 17.593 19.20±1.6028.00±1.260.97±0.37**33.819 19.40±1.1127.70±1.100.83±0.35**43.29天地欣 5 19.50±1.0227.80±1.250.91±0.30**37.90Cy 20 19.30±1.1023.10±1.04**0.55±0.16**62.783空白對照 20.32±1.1227.70±2.101.78±0.27 0YCP1 19.78±1.0627.80±1.251.36±0.33**23.923 19.54±1.0427.30±1.101.10±0.24**38.079 19.75±1.0927.40±1.110.99±0.35**44.58天地欣 5 19.75±1.2127.00±1.001.08±0.46**39.53Cy 20 19.60±1.2023.30±1.42**0.59±0.17**67.15*P＜0.05，**P＜0.01與空白組比較實施例16多糖YCPiv對小鼠移植瘤S180的抑制作用取ICR小白鼠(18～22g，雌雄各半)60只，按移植性腫瘤研究法接種S180實體型，接種后24小時稱鼠重，并隨機分為6組，空白對照組與天地欣(5mg/kg)組、環(huán)磷酰胺(20mg/kg)組分別為陰、陽性對照組，YCP組設高、中、低三個劑量組(9，3，1mg/kg)。接種24小時后給藥，iv給藥，每2天一次，共給藥4次，于停藥后第2天處死荷瘤小鼠稱重，并分離瘤塊稱重，所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理(t檢驗)。
結(jié)果見表7。與生理鹽水對照組相比，多糖YCP(9，3mg/kg)組、天地欣組及Cy組皆有顯著抑制S180的腫瘤生長作用，其中多糖YCP組與天地欣組對小鼠體重增長無明顯影響，而Cy組有顯著的抑制小鼠體重增長作用。實驗重復3次，結(jié)果相近。
表7.YCPiv對小鼠移植瘤S180的抑制作用(X±SD)(n＝10)劑量 小鼠體重(g) 瘤重抑瘤率批次組別(mg/kg) 給藥前 給藥后 (g) (％)1 空白對照 19.40±0.9227.50±1.691.88±0.75 0YCP 119.70±1.4928.20±2.991.61±0.52 14.53319.90±1.3727.50±3.041.29±0.28*31.40919.60±1.5026.80±2.321.14±0.58*39.49天地欣519.70±1.4226.90±2.741.20±0.35*36.24Cy20 19.60±1.2023.60±1.20**0.62±0.14**67.272 空白對照 19.95±1.2725.40±2.841.11±0.30 0YCP 119.90±1.3026.50±2.050.98±0.28 12.08319.30±1.1926.70±1.270.75±0.14**32.10919.60±1.1127.20±0.870.63±0.30**43.10天地欣519.70±1.0027.10±1.450.70±0.23**37.33Cy20 19.70±1.4922.00±1.18**0.41±0.10**63.213 空白對照 20.00±1.2627.80±1.831.64±0.44 0YCP 120.20±1.4027.50±1.631.24±0.47 24.34320.30±1.2727.70±1.621.06±0.36**35.35920.10±1.4527.80±1.940.87±0.21**46.97天地欣520.00±1.4127.50±1.631.02±0.32**37.80Cy20 20.20±1.2522.80±1.33**0.51±0.17**68.68*P＜0.05，**P＜0.01與空白組比較
權利要求
1.一種多糖，其特征是它由葡萄糖和糖醛酸構成，不含蛋白質(zhì)和核酸，分子量為1.6×106Da～2.6×106Da，端基碳為α-構型，旋光度[α]Dt＝+131.7°～+159.4°，多糖的基本骨架由1→4糖苷鍵連接的葡萄糖構成，每17個葡萄糖殘基有一個側(cè)鏈，側(cè)鏈為一個葡萄糖分子或一個糖醛酸分子，葡萄糖和糖醛酸的比例為2∶1，均通過1→6糖苷鍵與主鏈葡萄糖相連接，每摩爾多糖中葡萄糖與糖醛酸的物質(zhì)的量之比為53∶1。
2.一種權利要求1所述的多糖的制法，其特征是它由下列步驟組成步驟1.稱取海洋真菌炭團菌濕菌體1000g，加水置組織搗碎器中搗碎，補足水至2000～4000mL，60～90℃水浴提取8～20小時，間歇攪拌，紗布濾去殘渣，2000～4000r.p.m.離心去沉淀，步驟2.將步驟1所得的提取液濃縮至500～2000mL，加入濃縮液1/4～1/7體積的氯仿及1/15～1/30體積的正丁醇，劇烈振蕩，靜置分層，除去下層有機溶劑層及中間層，保留水層，反復萃取2～5次，步驟3.將步驟2所得的水溶液對自來水透析24～48小時，透析液濃縮至500～2000mL，逐步加入1～4倍質(zhì)量的乙醇，4℃放置2～10小時，離心，沉淀依次以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得本發(fā)明的多糖粗品，步驟4.取本發(fā)明的多糖粗品50mg，充分溶解，上已平衡好的離子交換柱(DEAE-32)，先以50～300mL蒸餾水洗滌，再以0～2mol/L NaCl溶液梯度洗脫，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測，合并相同組分。離子交換柱分離所得多糖組分上分子篩柱層析(Sephacryl S-400)，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測，合并相同組分，冷凍干燥，即得本發(fā)明的多糖YCP。
3.根據(jù)權利要求所述的多糖在制備治療腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
一種多糖，它由葡萄糖和糖醛酸構成，不含蛋白質(zhì)和核酸，分子量為1.6×10
文檔編號C08B37/00GK1546531SQ200310106520
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月4日 優(yōu)先權日2003年12月4日
發(fā)明者高向東, 譚仁祥, 楊曉兵, 孫誠 申請人:中國藥科大學, 南京大學