專利名稱：聚乙二醇羧酸的制備方法和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域，涉及蛋白質(zhì)修飾劑的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
聚乙二醇(PEG)是一種合成高分子，為高度親水的聚醚，易溶于有機(jī)溶劑和水，具有很好的物理化學(xué)和生理性質(zhì)，并且無(wú)毒、無(wú)抗原和致免疫原性，已獲FDA批準(zhǔn)用于進(jìn)入人體的添加劑。PEG的生物相容性好，在體內(nèi)表現(xiàn)為低蛋白質(zhì)和低血小板吸附以及低細(xì)胞粘附性，這些特點(diǎn)使得它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。將聚乙二醇和蛋白質(zhì)、多肽類化合物、以及小分子相連，可以改變這些物質(zhì)在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、生理學(xué)的特性，從而把聚乙二醇的一些特性傳遞給蛋白質(zhì)、多肽類以及小分子化合物。例如，可以屏蔽多肽類的抗原性，降低它們?cè)隗w內(nèi)的清除率，減少免疫系統(tǒng)的識(shí)別和蛋白水解酶的水解，提高蛋白質(zhì)和多肽類化合物的水溶性，同時(shí)提高蛋白質(zhì)、多肽類以及小分子化合物的表現(xiàn)分子量，減少腎臟過(guò)濾和改變生物分配[1]。
聚乙二醇和蛋白質(zhì)及多肽類化合物連接的方法很多，白于蛋白質(zhì)和多肽類化合物存在氨基，一般常用的方法是在聚乙二醇分子中引入羰基，使其與蛋白質(zhì)或多肽類化合物形成仲氨或酰氨。目前應(yīng)用最普遍的是聚乙二醇羧酸。形成聚乙二醇羧酸的方法可分為兩大類第一類是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在聚乙二醇的羥基上引入一個(gè)羧基，第二類是將聚乙二醇的羥基轉(zhuǎn)化為羧基。在第一類方法普遍使用的是聚乙二醇丁二酸(SS-PEG)[z]，但是SS-PEG聚合物鏈中含有一個(gè)易水解的酯鍵，與蛋白質(zhì)或多肽類化合物連接后，該酯鍵在體內(nèi)易水解，使得保留在蛋白質(zhì)上的丁二酸充當(dāng)了半抗原，從而加劇了蛋白質(zhì)的免疫性。為了避免在聚乙二醇分子鏈中引入不穩(wěn)定的酯鍵，一般常采用第二類方法，即直接將聚乙二醇轉(zhuǎn)化為聚乙二醇羧酸。將醇轉(zhuǎn)化成羧酸的方法很多，最常用的有以下兒種(1)以硝酸氧化聚乙二醇可以得到羧酸，但是反應(yīng)過(guò)程中PEG的醚鍵易發(fā)生斷裂。因此，制得的PEG羧酸的分子量分布較寬，不利于制備均一的蛋白質(zhì)修飾劑，而且分子量小于400dalton的PEG具有毒性[1]。(2)用醇和苛性堿在貴金屬催化劑存在下液相脫氫制備羧酸鹽，此方法溫度高，易使醚鍵斷裂[4]。(3)在堿性條件下用高錳酸鉀氧化制備聚乙二醇羧酸[5]，但是這種方法同樣極易引起PEG醚鍵的斷裂。(4)使用溫和的氧化劑MnO2先將PEG氧化為PEG醛，然后在雙氧水的作用下將PEG醛氧化為PEG羧酸，這個(gè)方法雖然條件溫和，但收率低[6]。
近年來(lái)利用穩(wěn)定的氮氧自由基將醇氧化成相應(yīng)羧酸的研究逐步成熟[7，8]，F(xiàn)ried[9-1]等人用氮氧自由基合成烷氧基鏈烷酸，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)率高，但是該法使用了硝酸或者有機(jī)溶劑。在反應(yīng)過(guò)程中使用硝酸，往往會(huì)使PEG分子中的醚鍵斷裂，有大量的副產(chǎn)物生成，而且在產(chǎn)物中會(huì)殘留有少量的硝酸。使用有機(jī)溶劑，會(huì)造成環(huán)境污染，且不利于規(guī)模化生產(chǎn)。
本發(fā)明克服了上述方法的不足，以水作為溶劑，反應(yīng)在常溫常壓和堿性的條件下，聚乙二醇分子中的醚鍵不會(huì)發(fā)生斷裂，而且，采用一步氧化，即可將聚乙二醇按化學(xué)計(jì)量轉(zhuǎn)化為聚乙二醇羧酸。此外，本方法采用水作為溶劑，在實(shí)際生產(chǎn)中可減少環(huán)境污染，有利于環(huán)保和提高了生產(chǎn)上的安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種在水溶液中制備聚乙二醇羧酸的方法，所述方法如下常壓下，在水溶液中，在氮氧自由基和一定量的溴化物存在下，控制pH值為7-14，溫度保持在-5℃-50℃，以次鹵酸鹽氧化聚乙二醇為相應(yīng)的聚乙二醇羧酸。
目前，公認(rèn)的氧化機(jī)理為(1)(2)(3)(4)(5)具體實(shí)施方案，將聚乙二醇(PEG)、氮氧自由基(加入量為PEG中羥基的物質(zhì)的量的萬(wàn)分之一至百分之一)和溴化鉀(PEG中羥基的物質(zhì)的量的百分之五至百分之十五)溶于水中，冰水浴條件下磁力攪拌溶解。取一定量的次鹵酸鹽(PEG中羥基的物質(zhì)的量2.5-4倍)溶于水中，用4N的鹽酸調(diào)節(jié)其pH值至9-11后、置于冰水浴中冷卻，將冷卻的次鹵酸鹽水溶液倒入前述聚乙二醇的水溶液中。反應(yīng)體系用冰水浴冷卻，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)體系的pH值不斷下降，需用0.5N的氫氧化鈉水溶液控制反應(yīng)體系的pH值在9-11之間。當(dāng)體系的pH值穩(wěn)定不再降低時(shí)，在室溫下繼續(xù)攪拌6小時(shí)，然后加入一定量的乙醇湮滅反應(yīng)。以4N鹽酸調(diào)節(jié)上述水溶液的pH值為3后，用二氯甲烷或乙酸乙酯等有機(jī)容劑溶劑萃取三次，合并且濃縮萃取液。最后倒入冷的乙醚中，得到聚乙二醇羧酸。
上述方法將通過(guò)下面的實(shí)例進(jìn)一步描述，但是提供的實(shí)例不能作為對(duì)此方法的限制。


圖1實(shí)施例1制備的聚乙二醇羧酸的紅外光譜中a線為mPEG(750)的紅外光譜；b線為氧化后的mPEG(750)羧酸的紅外光譜圖。
從圖中可知，氧化后在1739cm-1處出現(xiàn)羰基峰。
圖2實(shí)施例1制備的聚乙二醇羧酸的質(zhì)譜中A圖為聚乙二醇，B圖為氧化后的聚乙二醇羧酸。
從圖譜中可以看出不存在未氧化的原料和斷鏈后的產(chǎn)物。
實(shí)施例1將7.5克單甲氧基聚乙二醇(mPEG，分子量為750)，0.0078克2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧基，0.2克溴化鉀倒入盛有50毫升水的燒杯中，磁力攪拌，冰水浴冷卻，向此燒杯中倒入40毫升8％的次氯酸鈉溶液(1℃，pH值為10)。冰水浴條件下，在反應(yīng)過(guò)程中，不斷用0.5N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值為10。大約2小時(shí)后pH值不再改變，穩(wěn)定在10左右。然后，室溫條件下，繼續(xù)攪拌6小時(shí)后，加入5毫升乙醇湮滅反應(yīng)。用4N鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)水溶液的pH值為3，用二氯甲烷萃取反應(yīng)液三次，合并萃取液并濃縮。將濃縮液倒入冷乙醚中，冷卻析出聚乙二醇羧酸，用冷乙醚淋洗產(chǎn)品。以標(biāo)定過(guò)的氫氧化鈉溶液滴定，轉(zhuǎn)化率為100％。通過(guò)紅外光譜表征，有羰基峰存在(圖1)。通過(guò)質(zhì)譜證明，沒(méi)有斷鏈產(chǎn)物和原料(圖2)。
實(shí)施例2將10克mPEG(分子量為2000)，0.0048克4-甲氧基-2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧基，0.11克溴化鉀倒入盛有70毫升水的燒杯中，磁力攪拌，冰水浴冷卻，向此燒杯中倒入24毫升8％的次氯酸鈉溶液(1℃，pH值為10)。冰水浴條件下，在反應(yīng)過(guò)程中，用0.5N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值為10。大約1.5小時(shí)后pH值不再改變，穩(wěn)定在10左右。然后，室溫條件下，繼續(xù)攪拌6小時(shí)后，加入3.5毫升乙醇湮滅反應(yīng)。用4N鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值為3，用二氯甲烷萃取反應(yīng)液三次，合并三次萃取液并濃縮。將濃縮液倒入冷乙醚中，冷卻析出，用冷乙醚淋洗，得到聚乙二醇羧酸，用標(biāo)定過(guò)的氫氧化鈉溶液滴定，轉(zhuǎn)化率100％。通過(guò)紅外光譜表征，有羰基峰存在。通過(guò)質(zhì)譜證明，沒(méi)有斷鏈產(chǎn)物和原料。
實(shí)施例3將20克mPEG(分子量為5000)，0.004克2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧基，0.08克溴化鈉倒入盛有120毫升水的燒杯中，磁力攪拌，冰水浴冷卻，向此燒杯中倒入13毫升8％的次氯酸鈉溶液(1℃，pH值為10)。冰水浴條件下，在反應(yīng)過(guò)程中，用0.5N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在10。大約2小時(shí)后pH值不再改變，穩(wěn)定在10左右。然后，室溫條件下，繼續(xù)攪拌6小時(shí)后，加入2毫升乙醇湮滅反應(yīng)。用4N鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值為3，用二氯甲烷萃取反應(yīng)液三次，合并三次萃取液并濃縮。將濃縮液倒入冷乙醚中，冷卻析出，用冷乙醚淋洗，得到聚乙二醇羧酸。用標(biāo)定過(guò)的氫氧化鈉溶液滴定，轉(zhuǎn)化率100％。通過(guò)紅外光譜表征，有羰基峰存在。通過(guò)質(zhì)譜證明，沒(méi)有斷鏈產(chǎn)物和原料。
實(shí)施例4將10克PEG(分子量為2000)，0.0075克2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧基，0.16克溴化鈉倒入盛有70毫升水的燒杯中，磁力攪拌，冰水浴冷卻，向此燒杯中倒入42毫升8％的次氯酸鈉溶液(1℃，pH值為10)。冰水浴條件下，在反應(yīng)過(guò)程中，用0.5N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在10。大約1小時(shí)后pH值不再改變，穩(wěn)定在10左右。然后，室溫條件下，繼續(xù)攪拌6小時(shí)后，加入3毫升乙醇湮滅反應(yīng)。用4N鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值為3，用二氯甲烷萃取反應(yīng)液三次，合并三次萃取液并濃縮。將濃縮液倒入冷乙醚中，冷卻析出，用冷乙醚淋洗，得到聚乙二醇羧酸。用標(biāo)定過(guò)的氫氧化鈉溶液滴定，轉(zhuǎn)化率為100％。通過(guò)紅外光譜表征，有羰基峰存在。通過(guò)質(zhì)譜證明，沒(méi)有斷鏈產(chǎn)物和原料實(shí)施例5將20克PEG(分子量為8000)，0.0036克2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧基，0.13克溴化鉀倒入盛有110毫升水的燒杯中，磁力攪拌，冰水浴冷卻，向此燒杯中倒入21毫升8％的次氯酸鈉溶液(1℃，pH值為10)。冰水浴條件下，在反應(yīng)過(guò)程中，用0.5N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在10。大約1小時(shí)后pH值不再改變，穩(wěn)定在10左右。然后，室溫條件下，繼續(xù)攪拌6小時(shí)后，加入4毫升乙醇湮滅反應(yīng)，用4N鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值為3，用二氯甲烷萃取反應(yīng)液三次，合并三次萃取液并濃縮。將濃縮液倒入冷乙醚中，冷卻析出，用冷乙醚淋洗，得到聚乙二醇羧酸。用標(biāo)定過(guò)的氫氧化鈉溶液滴定，轉(zhuǎn)化率為100％。通過(guò)紅外光譜表征，有羰基峰存在。通過(guò)質(zhì)譜證明，沒(méi)有斷鏈產(chǎn)物和原料實(shí)施例6將一定量由上述方法的制備的單烷氧基聚乙二醇羧酸(分子量為5000)溶于適量體積的二氯甲烷中，按照單烷氧基聚乙二醇羧基∶二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)∶N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為1∶2∶2的投料比(物質(zhì)的量比)，先加入DCC，攪拌反應(yīng)一小時(shí)后，加入NHS，然后室溫下密閉攪拌反應(yīng)24小時(shí)。停止反應(yīng)，過(guò)濾除去反應(yīng)生成的N、N′-二環(huán)己基脲，然后用7倍于反應(yīng)液體積的冷乙醚將活化后的N-羥基琥珀酰亞胺單烷氧基聚乙二醇羧酸酯沉淀析出，用冷乙醚淋洗，真空干燥備用。
取20毫升1.6毫克/毫升的重組人α-干擾素(分子量19kD)放入小燒杯中，調(diào)整pH值為10.4，將0.8克上述已活化后的N-羥基琥珀酰亞胺單烷氧基聚乙二醇羧酸酯加入到小燒杯中，反應(yīng)30min后，向燒杯中加入0.1N的甘氨酸(2ml)停止反應(yīng)。利用熒光胺法測(cè)定修飾度，修飾度為51％。表明本法明提供的聚乙二醇羧酸能簡(jiǎn)單地用于蛋白質(zhì)的修飾。
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權(quán)利要求
1.一種在水溶液中制備聚乙二醇羧酸的方法，其特征在于在催化劑量的氮氧自由基存在下，在水溶液中，以次鹵酸鹽為氧化劑，加入一定量的溴化物，反應(yīng)溫度控制在-5℃-50℃，pH值控制在7-14，氧化聚乙二醇為相應(yīng)的聚乙二醇羧酸，聚乙二醇羧酸的分子式RO(CH2CH2O)nCH2COOH，這里的R是-CH2COOH、-CH3、-C2H5、-C3H7等基團(tuán)，n是一個(gè)從5-1000的整數(shù)。
2.權(quán)利要求1中所述的溶液是以水做溶劑。
3.權(quán)利要求1中所述的氮氧自由基是2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧基、4-羥基-2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧基、4-氧代-2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧基、4-甲氧基-2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧基中的一種或它們的混合物，最好是2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧或4-甲氧基-2、2、6、6-四甲基-哌啶-1-氧基中的一種或它們的混合物。
4.權(quán)利要求3中所述的氮氧自由基的用量是聚乙二醇中羥基的物質(zhì)的量的萬(wàn)分之一到百分之一，最好是千分之二到千分之五。
5.權(quán)利要求1中所述的次鹵酸鹽是指次氯酸或次溴酸的鈉、鉀、鈣等堿金屬鹽或堿土金屬鹽。
6.權(quán)利要求5中所述的次氯酸鹽的用量是聚乙二醇中羥基的物質(zhì)的量的1.2-10倍，最好是聚乙二醇中羥基的物質(zhì)的量的2.5-4倍。
7.權(quán)利要求1中所述的溴化物是指溴化鈉、溴化鉀、溴化鈣等堿金屬鹽或堿土金屬鹽。
8.權(quán)利要求7中所述的溴化物的用量是聚乙二醇中羥基的物質(zhì)的量的百分之五至百分之三十。
9.權(quán)利要求1中所述溫度范圍是0℃-20℃，且在常壓條件下，pH值控制在9-11。
10.一種如權(quán)利要求1所述的方法制備的聚乙二醇羧酸的用途，其特征在于用于帶親核基團(tuán)的生物大分子和藥用小分子的修飾。
11.權(quán)利要求10所述的生物大分子為蛋白質(zhì)、多肽。
12.權(quán)利要求10所述的藥用小分子為帶氨基的抗癌藥、抗生素、消炎藥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)單、條件溫和、環(huán)境友好、轉(zhuǎn)化率高的將聚乙二醇轉(zhuǎn)化為聚乙二醇羧酸的新方法。該方法的特征在于以水作溶劑，在催化劑量的氮氧自由基和一定量的溴化物存在下，以次鹵酸鹽為氧化劑，在室溫常壓和堿性條件下，將聚乙二醇按化學(xué)計(jì)量轉(zhuǎn)化為聚乙二醇羧酸。本方法條件溫和，聚乙二醇醚鍵不斷裂，用于蛋白質(zhì)、多肽的修飾時(shí)，有利于得到均一穩(wěn)定的修飾產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C08G65/00GK1618837SQ20031011336
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月17日
發(fā)明者馬光輝, 蘇志國(guó), 李興奇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所