專利名稱：松杉靈芝蛋白多糖及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白多糖及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及從松杉靈芝(Ganoderma tsugae Murrill.)中得到的一種蛋白多糖及其提取方法和該蛋白多糖作為藥物的活性成分的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前臨床上治療腫瘤疾病，主要采用三種方式手術(shù)、放療和化療，但放療、化療嚴(yán)重殺傷人體正常細(xì)胞和組織，使許多患者體質(zhì)迅速下降，甚至不能持續(xù)治療。長期以來，人們在不斷地尋找新的具有毒性小、抑瘤率高等特點(diǎn)地抗癌藥物。由于腫瘤的發(fā)生和擴(kuò)散與人體的免疫功能有密切關(guān)系，所以產(chǎn)生了腫瘤免疫治療法。二十世紀(jì)中后期，發(fā)現(xiàn)了一些來源于真菌類的多糖藥物，如云芝多糖、香菇多糖、裂褶菌多糖等，它們均具有提高機(jī)體免疫力抗腫瘤地作用。這些藥物地作用機(jī)制一方面是通過宿主中介，激活機(jī)體的各種免疫活性細(xì)胞，促進(jìn)各種淋巴因子的分泌，提高機(jī)體的抵抗力，達(dá)到吞噬和消除腫瘤細(xì)胞的作用，另一方面某些多糖，特別是蛋白-多糖對癌細(xì)胞有直接殺傷作用，抑瘤率很高，其特點(diǎn)是有效劑量小，抑瘤效果高，毒性很小，甚至無毒。與化療相比，沒有白血球降低，嘔吐，免疫力下降等毒副作用。該類天然藥物與化療藥物共同使用還可以降低化療藥物的毒副作用。蛋白-多糖抗腫瘤藥物是與化療藥物完全不同的一類新的抗癌藥物。
松杉靈芝(Gamoderma tsugae Murrill.)屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌科，靈芝屬的一種珍品，具有悠久的民間用藥歷史，藥理活性廣泛，且毒性極小。子實體為其地上部分，包括菌蓋和菌柄，一起入藥，松杉靈芝子實體的化學(xué)成分復(fù)雜，有三萜類，核苷類，生物堿類，呋喃類，氨基酸類及微量元素等等。水溶性成分主要有多糖類，糖-蛋白類，蛋白-多糖類等等。目前研究表明，多糖及糖-蛋白或蛋白-多糖類復(fù)合物具有提高機(jī)體免疫功能和抗癌作用。由于多糖的來源不同，分子量大小及空間三維螺旋結(jié)構(gòu)不同，特別是與蛋白質(zhì)結(jié)合方式不同，在藥理活性方面，表現(xiàn)出較大差異。MIZUNO等人從赤芝子實體中獲得分子量為100萬和45萬兩種水溶性多糖，經(jīng)小鼠腹腔注射給藥，以S180瘤株做實驗，具有顯著的抑瘤作用。李榮芷，何云慶等從赤芝中獲得分子量分別為16200，24500，35000，和40000四種多糖均能顯著增加正常小鼠脾細(xì)胞IL-2的產(chǎn)生。北京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院分離出的分子量為7100-9300的靈芝多糖能促進(jìn)TNFα、TNFγ mRNA的表達(dá)，增加TNFα、TNFγ mRNA的分泌等等。目前對赤芝(Ganoderma Lucidum)和紫芝(Ganoderma Sinersis)的研究比較多。對松杉靈芝(Ganoderma tsugae Murrill.)的研究卻罕見報道，其中僅有2003年臺灣國際揚(yáng)名大學(xué)在美國申報了名稱為《Polysaccharide-based extract from ganoderma，pharmaceutical use thereof，and process for preparing the same》的專利，公開了一種獲得松杉靈芝水溶性粗提物的工藝，但該工藝只是涉及到水提醇沉和脫蛋白等步驟，得到的產(chǎn)品是松杉靈芝的初級粗制品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種松杉靈芝蛋白多糖純品及其制備方法和以該松杉靈芝蛋白多糖為活性成分的抗腫瘤治療藥和抗腫瘤輔助治療藥。
一種松杉靈芝蛋白多糖，提取自松杉靈芝子實體，其平均分子量為0.5-1.6萬道爾頓。由蛋白與多糖組成，所述蛋白與多糖的重量比為蛋白∶多糖＝(15.5-19.5)∶(80-86)；所述多糖由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成，它們的重量比為半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖∶果糖＝(1.60-1.75)∶1.00∶(0.15-0.22)∶(0.10-0.20)，主鏈以β(1→3)連接。
制備松杉靈芝單一蛋白多糖的方法包括以下步驟1)松杉靈芝子實體粉碎物用醇脫脂，得到藥渣；2)藥渣用去離子水提取，收集提取液；3)將提取液用醇沉淀；4)沉淀物用水溶解后進(jìn)行微濾；5)濾液經(jīng)過80-100KD的超濾膜后所得濾液用3-5KD膜超濾，收集膜上的截留物；6)截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)層析柱，用去離子水洗脫，收集洗脫液，經(jīng)3-5KD膜，收集膜上的截留物；7)截留物上凝膠柱，收集洗脫液中第一流份；8)經(jīng)3-5KD膜超濾濃縮，冷凍干燥，得到產(chǎn)品。
在上述制備方法中，所述用于松杉靈芝子實體脫脂的醇為75-95％的乙醇或甲醇，乙醇或甲醇的重量為所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的6-12倍(8-10倍最好)，脫脂在75-80℃條件下進(jìn)行，回流提取2-3小時，重復(fù)3-6次；所述藥渣用去離子水提取，收集提取液中，去離子水的重量是所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的10-30倍(15-25倍最好)，于90-100℃(98-100℃最好)，間歇攪拌，提取2-3小時，重復(fù)3-7次，提取液濃縮至所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的7-12倍；所述將提取液用醇沉淀，是向提取液中加入乙醇或甲醇使其終濃度達(dá)到75-85％，邊加邊攪拌，在4-10℃條件下放置，離心(8000rpm，15min)得到沉淀；所述微濾進(jìn)行至少二次，濾膜的孔徑第一次為10μm，如果進(jìn)行二次，濾膜的孔徑分別是10μm、3μm為宜，如果進(jìn)行三次，濾膜的孔徑分別是10μm、5μm和1μm為宜；所述截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)層析柱中，如果采用DEAE-Sepharose(F.F.)層析柱進(jìn)行層析，一般選用3×80cm規(guī)格的層析柱，上樣速度應(yīng)為0.2-0.5ml/min，用去離子水洗脫的速度應(yīng)為2-4ml/min，如果采用SepharoseCL-6B層析柱進(jìn)行層析，一般選用3×70cm規(guī)格的層析柱，上樣速度應(yīng)為0.2-0.8ml/min，用去離子水洗脫的速度應(yīng)為1-2ml/min，如果采用DEAE-Cellulose(Cl-)層析柱進(jìn)行層析，一般選用3×75cm規(guī)格的層析柱，上樣速度應(yīng)為0.25ml/min，用去離子水作流動相洗脫柱子，的速度應(yīng)為4ml/min；所述凝膠柱可以選用現(xiàn)有的凝膠柱，例如Sephadex-G100凝膠柱(3×80cm)，用0.1～0.4mol/L NaOH洗脫，流速一般為1～5ml/min。
實驗證明，以本發(fā)明的方法制備的松杉靈芝蛋白多糖為活性成分的藥物具有明顯的抑制和治療腫瘤的作用，同時還可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物一般制成粉針劑，也可以制成注射液、片劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的用量一般為1-2mg松杉靈芝蛋白多糖/kg體重/天。
以本發(fā)明的方法制備的松杉靈芝蛋白多糖是一種奶白色或黃白色的片狀物，質(zhì)輕，易溶于水，純度高，粘度較小，易于選用各種劑型，給藥方便。
實驗表明，本發(fā)明的藥物抑瘤率高，毒性極小，經(jīng)動物整體實驗研究表明，急性毒理LD50未測出，測得最大(注射給藥)耐受量150mg/kg(小鼠)，基本無毒，具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
實施例1、制備松杉靈芝蛋白-多糖稱取松杉靈芝子實體粉100克，加85％乙醇1升，75℃加熱回流2小時，重復(fù)3次，過濾，向藥渣中加去離子水2升，加熱煮沸，間隔攪拌，每次提取3小時，重復(fù)5次，過濾，合并提取液，濃縮至體積為0.5-1升，冷至室溫，加無水乙醇2.5升，邊加邊攪拌，4℃放置澄清，離心(7000-8000rpm，15min)，取沉淀加水溶解后，10μm和1μm微濾，取濾液，然后超濾過80KD，取濾液，再用3KD膜進(jìn)行超濾，所得截留物溶于去離子水后，上已平衡好的DEAE-Cellulose(Cl-)柱(3×75cm)，上樣流速為0.25ml/min，然后用去離子水作流動相洗脫柱子，洗脫速度4ml/min，收集流出液，通過3KD膜，濃縮后冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白-多糖混合物，取該松杉靈芝蛋白-多糖混合物200mg溶于10ml蒸餾水中，上Sephadex-G100凝膠柱(3×80cm)，用0.2mol/L NaOH洗脫，流速1ml/min，以紫外檢測器檢測，記錄儀記錄流出曲線，收集第一組分流出液，經(jīng)過3KD超濾膜濃縮后，冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白-多糖。
實施例2、制備松杉靈芝蛋白-多糖稱取松杉靈芝子實體粉100克，加80％甲醇1.5升，80℃加熱回流3小時，重復(fù)5次，過濾，向藥渣中加去離子水4升，加熱煮沸，間隔攪拌，每次提取3小時，重復(fù)6次，過濾，合并濾液，濃縮至體積1升，冷卻，加無水甲醇4升，邊加邊攪拌，4℃放置澄清，離心(8000rpm，15min)，沉淀溶入水，經(jīng)10μm、5μm和1μm微濾，取濾液經(jīng)過超濾膜80KD，取濾液，再用3KD膜進(jìn)行超濾，所得截留物溶于去離子水后，上已平衡好的Sepharose-CL6B柱(3×70cm)，上樣流速為0.6ml/min，然后用去離子水作流動相洗脫柱子，洗脫速度1.5ml/min，收集流出液，通過3KD膜，濃縮后冷凍干燥，得松杉靈芝蛋白-多糖混合物，取該松杉靈芝蛋白-多糖混合物200mg溶于10ml蒸餾水中，上Sephadex-G100凝膠柱(3×80cm)，用0.4mol/L NaOH洗脫，流速5ml/min，以紫外檢測器檢測，記錄儀記錄流出曲線，收集第一組分流出液，經(jīng)過3KD超濾膜濃縮后，冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白-多糖。
實施例3、制備松杉靈芝蛋白-多糖稱取50kg松杉靈芝子實體碎粉于提取罐中，加入450升85％乙醇，攪拌下，于75-80℃回流提取，每次2小時，重復(fù)3次，回收乙醇，藥渣加水1000升，加熱至100℃，提取3小時，重復(fù)5次，過濾，濾液合并，濃縮至體積為250升，在攪拌下，加入5倍體積無水乙醇，置4℃低溫處，澄清，離心(8000rpm，15min)，沉淀用去離子水溶解，通過10μm微濾、1μm微濾，然后再經(jīng)過80KD超濾之后，用3KD膜濃縮，所得截留物溶于去離子水后，上已平衡好的DEAE-Sepharose(F.F.)柱(3×80cm)，上樣流速為0.4ml/min，然后用去離子水作流動相洗脫柱子，洗脫速度3ml/min，收集流出液，通過3KD膜，濃縮后冷凍干燥，得松杉靈芝蛋白-多糖混合物，取該松杉靈芝蛋白-多糖混合物200mg溶于10ml蒸餾水中，上Sephadex-G100凝膠柱(3×80cm)，用0.1mol/L NaOH洗脫，流速3ml/min，以紫外檢測器檢測，記錄儀記錄流出曲線，收集第一組分流出液，經(jīng)過3KD超濾膜濃縮后，冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白-多糖。
實施例4、松杉靈芝蛋白-多糖的檢測取實施例1得到的松杉靈芝蛋白-多糖對其進(jìn)行檢測一、純度測定采用凝膠柱Sephadex-G100柱(3×70cm)。取松杉靈芝蛋白-多糖適量，溶于水中，上柱后以0.2mol/L NaOH洗脫，流速0.2ml/min，以分步收集器收集流出液，每管接2ml，收集180管，以苯酚硫酸法進(jìn)行多糖含量測定，繪制吸光度值與管數(shù)之間的洗脫曲線。結(jié)果為單-的對稱峰，表明松杉靈芝蛋白-多糖的純度很高。
二、平均分子量的測定采用凝膠過濾法，用TOYOPERAL HW65F柱(3×32cm)，稱取松杉靈芝蛋白-多糖適量，溶于0.2mol/L的NaOH溶液中，同樣處理標(biāo)準(zhǔn)多糖T-10、T-40、T-70、T-110、T-150、T-200，以0.2mol/L NaOH洗脫，分別收集V0和Ve，繪制Ve/V0與各標(biāo)準(zhǔn)糖分子量對數(shù)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出松杉靈芝蛋白-多糖的平均分子量為1萬。
三、單糖組成分析稱取適量的松杉靈芝蛋白-多糖，用稀硫酸水解，水解后分別用紙層析和其衍生物-乙酰化物的氣相色譜分析，多次實驗結(jié)果均證明松杉靈芝蛋白-多糖由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成。以葡萄糖為100％，則比例為(1.60-1.75)∶1.00∶(0.15-0.22)∶(0.10-0.20)。
四、光譜分析1、紅外光譜分析取適量的松杉靈芝蛋白-多糖，溴化鉀壓片法，在2200～400cm-1范圍內(nèi)掃描，于890cm-1處有吸收峰，表明具有β-構(gòu)象。
2、紫外光譜分析取松杉靈芝蛋白-多糖適量，溶于水中，在200～400nm間掃描，在280nm處有吸收峰，表明蛋白存在。由于在分步收集器相同管數(shù)區(qū)間，有單一的蛋白吸收峰和多糖吸收曲線(苯酚-硫酸法)，判定該蛋白與多糖是分子內(nèi)結(jié)合。
3、1H和13C核磁共振取適量松杉靈芝蛋白-多糖，溶在D2O中，測1H和13C譜。以13C譜為主，在該譜上，具有化學(xué)位移100.7、78.5、76.1、73.7、72.4、71.5、71.1、69.4、63.9等核磁共振峰；以1H信息為參考，判定松杉靈芝蛋白-多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)為含有17％的蛋白的以半乳糖和葡萄糖為主體的蛋白多糖綴合物，其主鏈結(jié)構(gòu)為β(1→3)半乳糖。
實施例5、抑瘤作用實驗以不同的癌細(xì)胞為實驗對象，以環(huán)磷酰胺為陽性對照，以生理鹽水為陰性對照，研究本發(fā)明實施例1～5得到的松杉靈芝蛋白-多糖對癌細(xì)胞的抑制作用，其中抑瘤率的計算方法為 實驗結(jié)果如表1、表2所示，從實驗結(jié)果可以看出，本發(fā)明的松杉靈芝蛋白多糖對癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用。松杉靈芝蛋白-多糖對小鼠S180肉瘤、小鼠肝癌H22和小鼠Lewis肺癌的生長均有不同程度的抑制作用，對移植于裸鼠的人體腸癌LOV0、胃癌MKN45、肝癌QGY，均具有明顯的抗腫瘤作用，量效關(guān)系明顯。
表1、松杉靈芝蛋白-多糖對鼠的腫瘤生長的抑制作用 表2、松杉靈芝蛋白-多糖對移植于裸鼠的人體腫瘤生長的抑制作用 實施例7、松杉靈芝蛋白-多糖的增效作用以小鼠肝癌H22為實驗對象，研究松杉靈芝蛋白-多糖合并小劑量環(huán)磷酰胺、甲氨喋呤和絲裂霉素C的協(xié)同作用。
根據(jù)以下公式計算抑瘤率 合并用藥的效應(yīng)根據(jù)Webb氏分?jǐn)?shù)乘積法計算(fa)1，2＝1-[1-(fa)1][1-(fa)2](fa)1和(fa)2分別為兩藥的抑瘤率，(fa)1，2為計算的理論相加效應(yīng)。如果合并用藥的效應(yīng)大于理論相加效應(yīng)，則表示協(xié)同。
試驗結(jié)果如表3所示，從表中的數(shù)據(jù)可以看出，松杉靈芝蛋白-多糖合并小劑量環(huán)磷酰胺、甲氨喋呤和絲裂霉素C后，對小鼠肝癌H22的抑制作用明顯強(qiáng)于松杉靈芝蛋白-多糖或小劑量化療藥物單獨(dú)使用，可以得出小劑量松杉靈芝蛋白-多糖合并小劑量化療對小鼠肝癌H22有一定協(xié)同作用的結(jié)論。松杉靈芝蛋白-多糖與小劑量化療藥物環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和絲裂霉素合并應(yīng)用，經(jīng)Webb氏分?jǐn)?shù)乘積法計算，松杉靈芝蛋白-多糖與上述三種結(jié)構(gòu)迥異，藥理作用機(jī)制完全不同的化療藥物均具有協(xié)同作用，同時，與放療聯(lián)合應(yīng)用，抑瘤作用也明顯強(qiáng)于單獨(dú)放療。
表3 松杉靈芝蛋白-多糖合并CTX、MTX、MMC對小鼠肝癌H22的作用

與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
實施例8、松杉靈芝蛋白-多糖對免疫功能的增強(qiáng)作用1、松杉靈芝蛋白-多糖對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的增強(qiáng)作用以云芝糖肽為陽性對照，研究松杉靈芝蛋白-多糖對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的增強(qiáng)作用，結(jié)果如表4所示，表明松杉靈芝蛋白-多糖對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的增強(qiáng)作用。
表4.松杉靈芝蛋白-多糖對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

與荷瘤組比較**P＜0.01。
2、松杉靈芝蛋白-多糖對小鼠NK細(xì)胞活性的激活作用。
靶細(xì)胞的標(biāo)記取傳代后24小時生長良好的YAC-1細(xì)胞，按1×106個/ml細(xì)胞懸液加3H-TdR 10uci，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，每30分鐘振蕩一次，標(biāo)記后的細(xì)胞用培養(yǎng)液洗滌3次，重懸于培養(yǎng)液中，使細(xì)胞濃度為1×105/ml。
NK細(xì)胞活性測定C57BL/6小鼠36只，每鼠腋皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞，隨機(jī)分為6組，每組6只，即松杉靈芝蛋白-多糖2組，云芝糖肽膠囊，荷瘤對照組(生理鹽水對照組)2組，正常對照組。給藥結(jié)束后次日處死動物，無菌條件下取脾，制備脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml作效應(yīng)細(xì)胞，另取已培養(yǎng)24小時YAC-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/ml作為靶細(xì)胞，以靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞之比為1∶100的細(xì)胞加在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入3H-TdR 0.5uci/孔，每只動物設(shè)雙復(fù)孔，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24小時后，收集細(xì)胞，測CPM值，計算特異性抑制百分率(Pi)表示NK細(xì)胞活性，結(jié)果如表5所示，表明松杉靈芝蛋白-多糖能明顯激活小鼠NK細(xì)胞活性。

表5 松杉靈芝蛋白-多糖對荷瘤小鼠NK活性的影響

3、松杉靈芝蛋白-多糖對荷瘤小鼠IL-2產(chǎn)生的影響C57BL/6小鼠24只，每鼠腋皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，每組6只，即松杉靈芝蛋白-多糖，云芝糖肽膠囊，荷瘤對照組(生理鹽水對照組)，正常對照組。給藥結(jié)束后次日處死動物，測定IL-2的產(chǎn)生情況，結(jié)果如表6所示，表明松杉靈芝蛋白-多糖能夠促進(jìn)IL-2的產(chǎn)生，同時對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能也有明顯的促進(jìn)作用。
表6 松杉靈芝蛋白-多糖混合物對荷瘤小鼠產(chǎn)生IL-2的影響

權(quán)利要求
1.一種松杉靈芝蛋白多糖，提取自松杉靈芝子實體，其平均分子量在0.5-1.6萬道爾頓之間，由蛋白與多糖組成，所述蛋白與多糖的重量比為蛋白∶多糖＝(15.5-19.5)∶(80-86)；所述多糖由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成，它們的重量比為半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖∶果糖＝(1.60-1.75)∶1.00∶(0.15-0.22)∶(0.10-0.20)，主鏈以β(1→3)連接。
2.根據(jù)松杉靈芝蛋白多糖，其特征在于所述松杉靈芝蛋白多糖是用包括以下步驟的方法得到的1)松杉靈芝子實體粉碎物用醇脫脂，得到藥渣；2)藥渣用去離子水提取，收集提取液；3)將提取液用醇沉淀；4)沉淀物用水溶解后進(jìn)行微濾；5)濾液經(jīng)過50-80KD的超濾膜后所得濾液用3-5KD膜超濾，收集膜上的截留物；6)截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)層析柱，用去離子水洗脫，收集洗脫液，經(jīng)3-5KD膜，收集膜上的截留物；7)截留物上凝膠柱，收集洗脫液中第一流份；8)經(jīng)3-5KD膜超濾濃縮，冷凍干燥，得到產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的松杉靈芝蛋白多糖，其特征在于所述用于松杉靈芝子實體脫脂的醇為75-95％的乙醇或甲醇，乙醇或甲醇的重量為所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的6-12倍，脫脂在75-80℃條件下進(jìn)行，回流提取2-3小時，重復(fù)3-6次；所述藥渣用去離子水提取，收集提取液中，去離子水的重量是所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的10-30倍，于90-100℃，間歇攪拌，提取2-3小時，重復(fù)3-7次，提取液濃縮至所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的7-12倍；所述將提取液用醇沉淀，是向提取液中加入乙醇或甲醇，使其終濃度達(dá)到75-85％，邊加邊攪拌，在低溫下放置，離心得到沉淀；所述微濾進(jìn)行至少二次，濾膜的孔徑第一次為10μm；所述凝膠柱的洗脫液為0.1～0.4mol/L的NaOH。
4.一種制備松杉靈芝蛋白多糖的方法，包括以下步驟1)松杉靈芝子實體粉碎物用醇脫脂，得到藥渣；2)藥渣用去離子水提取，收集提取液；3)將提取液用醇沉淀；4)沉淀物用水溶解后進(jìn)行微濾；5)濾液經(jīng)過50-80KD的超濾膜后所得濾液用3-5KD膜超濾，收集膜上的截留物；6)截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)層析柱，用去離子水洗脫，收集洗脫液，經(jīng)3-5KD膜，收集膜上的截留物；7)截留物上凝膠柱，收集洗脫液中第一流份；8)經(jīng)3-5KD膜超濾濃縮，冷凍干燥，得到該發(fā)明物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述超濾后，截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)層析柱，用去離子水洗脫，收集洗脫液，經(jīng)3-5KD膜，濃縮冷凍干燥得到產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述用于松杉靈芝子實體脫脂的醇為75-95％的乙醇或甲醇，乙醇或甲醇的重量為所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的6-12倍，脫脂在75-80℃條件下進(jìn)行，回流提取2-3小時，重復(fù)3-6次。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述藥渣用去離子水提取，收集提取液中，去離子水的重量是所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的10-30倍，于90-100℃，間歇攪拌，提取2-3小時，重復(fù)3-7次，提取液濃縮至所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的7-12倍；所述將提取液用醇沉淀，是向提取液中加入乙醇或甲醇，使其終濃度達(dá)到75-85％，邊加邊攪拌，在低溫下放置，離心得到沉淀；所述微濾進(jìn)行至少二次，濾膜的孔徑第一次為10μm；所述凝膠柱的洗脫液為0.1～0.4mol/L的NaOH。
8.一種抗腫瘤及增強(qiáng)免疫力的藥物，它的活性成分是松杉靈芝蛋白多糖，該松杉靈芝蛋白多糖提取自松杉靈芝子實體，其平均分子量在0.5-1.6萬道爾頓之間，由蛋白與多糖組成，所述蛋白與多糖的重量比為蛋白∶多糖＝(15.5-19.5)∶(80-86)；所述多糖由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成，它們的重量比為半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖∶果糖＝(1.60-1.75)∶1.00∶(0.15-0.22)∶(0.10-0.20)，主鏈以β(1→3)連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物，其特征在于所述松杉靈芝蛋白多糖是包括以下步驟的方法得到的1)松杉靈芝子實體粉碎物用醇脫脂，得到藥渣；2)藥渣用去離子水提取，收集提取液；3)將提取液用醇沉淀；4)沉淀物用水溶解后進(jìn)行微濾；5)濾液經(jīng)過50-80KD的超濾膜后所得濾液用3-5KD膜超濾，收集膜上的截留物；6)截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)層析柱，用去離子水洗脫，收集洗脫液，經(jīng)3-5KD膜，收集膜上的截留物；7)截留物上凝膠柱，收集洗脫液中第一流份；8)經(jīng)3-5KD膜超濾濃縮，冷凍干燥，得到產(chǎn)品。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的藥物，其特征在于所述用于松杉靈芝子實體脫脂的醇為75-95％的乙醇或甲醇，乙醇或甲醇的重量為所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的6-12倍，脫脂在75-80℃條件下進(jìn)行，回流提取2-3小時，重復(fù)3-6次；所述藥渣用去離子水提取，收集提取液中，去離子水的重量是所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的10-30倍，于90-100℃，間歇攪拌，提取2-3小時，重復(fù)3-7次，提取液濃縮至所述松杉靈芝子實體粉碎物重量的7-12倍；所述將提取液用醇沉淀，是向提取液中加入乙醇或甲醇，使其終濃度達(dá)到75-85％，邊加邊攪拌，在低溫下放置，離心得到沉淀；所述微濾進(jìn)行至少二次，濾膜的孔徑第一次為10μm；所述凝膠柱的洗脫液為0.1～0.4mol/L的NaOH。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種松杉靈芝蛋白多糖及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明的松杉靈芝蛋白多糖，提取自松杉靈芝子實體，其平均分子量在0.5－1.6萬道爾頓之間，由蛋白與多糖組成，所述蛋白與多糖的重量比為蛋白∶多糖＝(15.5－19.5)∶(80－86)；所述多糖由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成，它們的重量比為半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖∶果糖＝(1.60－1.75)∶1.00∶(0.15－0.22)∶(0.10－0.20)，主鏈以β(1→3)連接。本發(fā)明的松杉靈芝蛋白多糖混合物具有顯著的抑制腫瘤的作用和提高免疫功能的作用，具有廣闊的藥用價值。
文檔編號C08B37/00GK1715297SQ20041005015
公開日2006年1月4日 申請日期2004年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月28日
發(fā)明者費(fèi)曉方 申請人:費(fèi)曉方