專利名稱：一種用于降解纖維素的反膠束方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物能源技術(shù)開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化的領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種用于降解纖維素的反膠束方法。該方法將反膠束應(yīng)用于纖維素酶催化水解纖維素這一具有重要應(yīng)用前景的生物酶催化反應(yīng)，產(chǎn)品葡萄糖則進(jìn)一步加工為飼料、食糧、化學(xué)原料、微生物蛋白、氨基酸、抗生素等產(chǎn)品，從而開發(fā)出廢棄纖維素的生物降解無(wú)污染新工藝，實(shí)現(xiàn)纖維素類生物質(zhì)(如農(nóng)作物秸稈等)的綜合利用。該方法有效地克服傳統(tǒng)酶水解法的缺陷，使得纖維素降解效率極大提高。
背景技術(shù)：
反膠束是表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑為本體的溶液中的聚集體，具有極性的內(nèi)腔和非極性的外殼。反膠束的一個(gè)重要性質(zhì)是能增溶一定量的水分子(稱為核心水團(tuán)或“水池”)，水溶性的酶分子又可增溶在反膠束的“水池”中。由于反膠束中的“水池”為納米級(jí)空間，以此空間為反應(yīng)場(chǎng)可合成1～100nm的納米材料，因此又將其稱為納米反應(yīng)器。固定在反膠束中的酶學(xué)研究為介質(zhì)工程帶來(lái)了新的革命。利用反膠束包覆可使酶溶解在極性“水池”中，而一些水不溶性化合物，如膽固醇、生物堿、脂類等則溶解在非極性有機(jī)溶劑中，作為酶催化的底物進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。利用酶作用的專一性，還可能實(shí)現(xiàn)生物催化的手性合成。反膠束體系作為酶反應(yīng)介質(zhì)，具有組成靈活、熱力學(xué)穩(wěn)定、界面積大、可通過(guò)相調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物回收等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來(lái)受到人們的普遍關(guān)注。其中研究最多的是肽的合成和脂肪酶的催化反應(yīng)。如Xing等研究了AOT/正辛烷的反膠束體系中α2胰凝乳蛋白酶催化合成肽衍生物的反應(yīng)，得到56％～88％的產(chǎn)率；Tsai等研究了AOT/異辛烷/磷酸緩沖液中脂肪酶催化油脂水解反應(yīng)時(shí)表面活性劑濃度對(duì)CabdidaRngosa脂肪酶(CRL)水解活力的影響；Chen等在反膠束體系中用不同的蛋白酶合成了二肽。隨著研究的不斷深入，在反膠束體系中進(jìn)行酶的催化合成反應(yīng)不僅僅是在理論方面，而且在應(yīng)用開發(fā)上同樣具有廣闊的前景。
納米反應(yīng)器中的酶分子往往表現(xiàn)出超活性。從結(jié)構(gòu)上說(shuō)，反膠束十分類似于生物膜的脂雙層結(jié)構(gòu)，當(dāng)使用疏水性底物(如纖維素)時(shí)，人們能研究底物分子分配在納米反應(yīng)器和有機(jī)相中的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，同時(shí)由于反膠束的巨大比表面和它的極性內(nèi)腔與非極性外殼間的超短距離，且反膠束微粒間的碰撞頻率極高，其間的傳質(zhì)速率極快，為酶與底物的作用提供了最佳的微環(huán)境，因而可有效提高纖維素酶的催化效率和末端產(chǎn)物葡萄糖的收率。最近反膠束技術(shù)已被成功地應(yīng)用于研究二氫葉酸還原酶、鈣離子-ATP酶、β-乳酸酶和葡萄糖氧化酶等。
纖維素是地球上最豐富的可再生性自然資源，木質(zhì)纖維材料生物量的全利用無(wú)疑將是新的千年中對(duì)人類最為重要的生物技術(shù)之一。人類對(duì)纖維素的利用，迄今為止主要限于將木材直接作為建筑材料或加工成紙、纖維等，其廢棄物則作為堆肥或幾乎用焚燒處理。美國(guó)化學(xué)會(huì)認(rèn)為，將來(lái)能代替石油的唯一的化學(xué)原料就是每年超過(guò)2億噸的廢棄纖維素。同時(shí)由于我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)產(chǎn)廢棄纖維素(如稻草、麥稈等)的年產(chǎn)量非常巨大，因此積極開展纖維素生物降解的研究對(duì)緩解人類的糧食和能源危機(jī)、加速我國(guó)天然資源再生利用的發(fā)展具有重大意義，同時(shí)在環(huán)境污染的防治和良性生態(tài)系統(tǒng)的建立上也會(huì)發(fā)揮重要作用。
將纖維素分解為葡萄糖的手段有酸水解法和傳統(tǒng)酶水解法。酸水解法需高溫、高酸條件和耐酸耐壓容器，葡萄糖的收率雖可達(dá)50％，但嚴(yán)重污染環(huán)境，所以現(xiàn)在已被棄用。傳統(tǒng)酶水解法則克服了酸水解法的許多不足。天然纖維素在水溶液中由纖維素酶系(包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶)催化水解為葡萄糖的機(jī)理，目前尚不十分清楚，但一般認(rèn)為首先由前兩者將纖維素催化分解為纖維二糖等低聚糖，然后由β-葡萄糖苷酶將這些低聚糖水解為葡萄糖。雖然纖維素的酶水解法已進(jìn)行了不少頗有成效的研究，但將纖維素以工業(yè)規(guī)模轉(zhuǎn)換成葡萄糖的無(wú)污染新工藝尚末實(shí)現(xiàn)，這主要是由于天然纖維素為疏水性底物，在水溶液中的溶解度較差而造成傳統(tǒng)酶水解法中葡萄糖的收率尚不足50％。
在中國(guó)專利網(wǎng)中，涉及反膠束的專利較少，共有10項(xiàng)，其中有8項(xiàng)是以制備納米級(jí)化學(xué)物質(zhì)為內(nèi)容的。涉及纖維素生物降解的專利共47項(xiàng)，但這些專利無(wú)一涉及本項(xiàng)目——反膠束體系中纖維素高效降解的新方法。我國(guó)專利CN02289267“纖維素固相酶解——液體發(fā)酵耦合制備乙醇的裝置”，該裝置可降低酶解液中糖類對(duì)纖維素的抑制作用，從而有利于工業(yè)生產(chǎn)乙醇；我國(guó)專利CN97125800“從堿金屬的硅酸鹽制備納米二氧化硅顆粒的方法”，涉及到在反膠束中制備納米二氧化硅顆粒的新方法。國(guó)外涉及反膠束的專利有200多項(xiàng)，主要集中化學(xué)物質(zhì)的制備合成，生物分子的萃取分離，以及不同類型反膠束體系的制備，也有一些是對(duì)反膠束中化學(xué)反應(yīng)的方法研究。美國(guó)專利US 2004009117“Preparation of nanosizedcopper(I)compounds”，涉及反膠束中制備納米級(jí)銅化合物顆粒的新方法。美國(guó)專利03190471名稱是“Nanoparticle manganese zinc ferrites synthesized using reverse micelles”，報(bào)道了一種在反膠束中制備鐵酸鋅錳納米級(jí)顆粒的新方法。世界專利WO03051333名稱是“Reverse-micellar delivery system for controlledtransportation and enhanced absorption of agents”，該專利涉及利用反膠束體系作為一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，從而提高腸吸收功能。目前反膠束系統(tǒng)中大分子物質(zhì)的降解仍屬于空白領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種用于降解纖維素的反膠束方法，該方法簡(jiǎn)單易行且操作方便，酶需求量少、使用方便高效。有利于纖維素酶解的反膠束環(huán)境，提高了纖維素的降解效率和產(chǎn)品獲得率，且反應(yīng)效率高，生產(chǎn)過(guò)程安全、降解成本低廉。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明設(shè)計(jì)的反膠束系統(tǒng)能夠在包含的“水池”(即反膠束體系的核心水團(tuán)，為反膠束增溶的一定量水分子所形成)中加入纖維素酶(一種多組分的復(fù)合酶，主要有3種組分即內(nèi)切型β-葡聚糖酶，外切型β-葡聚糖纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶)，在體系中加入纖維素。纖維素酶在保持甚至增強(qiáng)活性的基礎(chǔ)上與纖維素結(jié)合并進(jìn)行降解，釋放產(chǎn)物葡萄糖。產(chǎn)物溶于“水池”中，可以通過(guò)萃取的方法從體系中得到分散液，而后從中分離得到。利用本發(fā)明提供反膠束體系來(lái)進(jìn)行纖維素的酶解，能在短時(shí)間(10分鐘～24小時(shí))內(nèi)大量降解纖維素并獲取產(chǎn)物葡萄糖，相對(duì)傳統(tǒng)的酸水解或水溶液體系中的酶解等模式更加方便、高效。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的反膠束體系是由表面活性劑(如Triton X-100、AOT等)溶解在有機(jī)溶劑(如二甲苯或正己醇或異辛烷等)中自發(fā)形成的、熱力學(xué)穩(wěn)定的、光學(xué)透明的球形聚集體(如圖1所示)。其特點(diǎn)在于反膠束有一個(gè)由表面活性劑分子(如Triton X-100、AOT等)的烴鏈組成的外殼，疏水尾指向有機(jī)溶劑(如二甲苯或正己醇或異辛烷等)，極性頭指向聚集體內(nèi)部形成極性腔。水分子在極性腔中形成納米尺寸的水池。
本發(fā)明設(shè)計(jì)中的磷酸緩沖液，為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液或磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液。
本發(fā)明提供了一種降解纖維素的反膠束方法，它含有下列步驟A、室溫下(20～25℃)，配置pH5.2～6.4的含有纖維素酶的緩沖溶液(A)，其中纖維素酶的濃度為30～900μM；B、配備含有表面活性劑的有機(jī)溶液(B)，其中表面活性劑的濃度為0.01～0.20M；表面活性劑為聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton X-100)或2-乙基己基琥珀酸鈉(AOT)；有機(jī)溶劑是二甲苯或正己醇或異辛烷；C、將適量溶液A和溶液B均勻混合，使得纖維素酶分子在混合液中的濃度為0.15～4.5μM，纖維素酶分子被包含于形成的反膠束體系的水池中，形成溶液C；D、靜置15～25秒，待溶液C形成均一穩(wěn)定的透明體系后，按0.9～10g/l的比例向其中加入微晶纖維素。所述微晶纖維素在30～60℃反應(yīng)10分鐘～24小時(shí)后被充分降解；E、加入10倍于溶液A體積的磷酸緩沖液及與溶液C等體積的萃取劑(氯仿)，劇烈振蕩后以3000～4000rpm的轉(zhuǎn)速高速離心5～10分鐘，使溶液分層。取出上層溶液，即為降解產(chǎn)物葡萄糖溶液。
從結(jié)構(gòu)上說(shuō)，反膠束十分類似于生物膜的脂雙層，同時(shí)由于反膠束的巨大比表面和它的極性內(nèi)腔與非極性外殼間的超短距離，而且反膠束微粒間的碰撞頻率極高，其間的傳質(zhì)速率極快，這為酶與底物的作用提供了最佳的微環(huán)境，因而可有效提高纖維素酶的催化效率和纖維素降解并能源化的效率。該方法將反膠束應(yīng)用于纖維素酶催化水解纖維素這一具有重要應(yīng)用前景的生物酶催化反應(yīng)，產(chǎn)品葡萄糖則進(jìn)一步加工為飼料、食糧、化學(xué)原料、微生物蛋白、氨基酸、抗生素等產(chǎn)品，從而開發(fā)出廢棄纖維素的生物降解無(wú)污染新工藝，實(shí)現(xiàn)纖維素類生物質(zhì)(如農(nóng)作物秸稈等)的綜合利用。該方法生產(chǎn)過(guò)程設(shè)備簡(jiǎn)單，具有良好的工業(yè)前景。圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，與在相同條件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纖維素酶解的結(jié)果相比，反膠束體系尤其是Triton X-100反膠束體系中進(jìn)行的纖維素酶解效率得到了顯著的提高，產(chǎn)物葡萄糖溶液的濃度提高了30多倍。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明可有效地克服傳統(tǒng)酶水解法的缺陷，使得纖維素降解效率極大提高。此外，該方法中使用的反膠束體系各有機(jī)組分可以通過(guò)精餾回收技術(shù)重復(fù)使用，從而減少環(huán)境污染，并進(jìn)一步降低了成本。


圖1為反膠束體系結(jié)構(gòu)示意圖。圖中A為水分子在反膠束極性內(nèi)腔中形成的納米尺寸的水池；B為有機(jī)相(如二甲苯或正己醇或異辛烷等)；C為單個(gè)表面活性劑分子(如Triton X-100、AOT等)；圖2為Triton X-100和AOT兩種反膠束體系以及水溶液中纖維素酶解后產(chǎn)物葡萄糖溶液的濃度比較，圖中“T”型標(biāo)識(shí)為誤差。由圖2可見，與在相同條件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纖維素酶解的結(jié)果相比，反膠束體系尤其是Triton X-100反膠束體系中進(jìn)行的纖維素酶解效率得到了顯著的提高。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如趙永芳主編，武漢大學(xué)出版社，2002，生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用(第三版)；周科衍、高占先主編，高等教育出版社，1997，有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)(第三版)；陳毓荃，科學(xué)出版社，2002，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)。
實(shí)施例1利用表面活性劑AOT形成的反膠束降解微晶纖維素的方法1.室溫下(25℃)，配制1ml pH6.0的纖維素酶緩沖溶液(緩沖液的配制方案參看生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用)，濃度為380μM，記為溶液A；2.取0.15mmol 2-乙基己基琥珀酸鈉(AOT)溶于3ml異辛烷，劇烈振蕩后靜置備用，記為溶液B；3.從溶液A中取14μl與溶液B混合，劇烈振蕩后靜置20秒，待其均一透明后，即為包含有纖維素酶分子的反膠束體系；4.將上述體系在50℃條件下保溫10分鐘后加入10mg微晶纖維素，在恒溫?fù)u床中充分反應(yīng)10分鐘(50℃，220rpm)；5.此后加入140μl磷酸緩沖液和3ml氯仿，劇烈振蕩后以3000rpm的轉(zhuǎn)速高速離心5分鐘，使溶液分層。上層無(wú)色透明，為產(chǎn)物葡萄糖溶液(本步為萃取操作，參看生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù))；6.用硫酸蒽酮法(參看生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù))測(cè)定產(chǎn)物葡萄糖的分解液，得到產(chǎn)物溶液中的葡萄糖含量，同時(shí)與相同條件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纖維素酶解的結(jié)果相比較，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在AOT反膠束體系中進(jìn)行的纖維素酶解效率要大大高于水溶液中進(jìn)行的酶解反應(yīng)效率。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下表所示(T＝50℃，pH＝6.0)

實(shí)施例2利用表面活性劑Triton X-100形成的反膠束降解微晶纖維素的方法1.室溫下(25℃)，配制1ml pH6.0的纖維素酶緩沖溶液(緩沖液的配制方案參看生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用)，濃度為400μM，記為溶液A；2.取0.15mmol聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton X-100)溶于1ml二甲苯中，再加入2ml正己醇，劇烈振蕩后靜置備用，記為溶液B；3.從溶液A中取18μl與溶液B混合，劇烈振蕩后靜置約15秒，待其均一透明后，即為包含有酶分子的反膠束體系；4.將體系在50℃條件下保溫10分鐘后加入10mg微晶纖維素，在恒溫?fù)u床中充分反應(yīng)10分鐘(50℃，220rpm)；5.此后加入180μl磷酸緩沖液和3ml氯仿，劇烈振蕩后以3500rpm的轉(zhuǎn)速高速離心8分鐘，使溶液分層。上層無(wú)色透明，為產(chǎn)物葡萄糖溶液(本步為萃取操作，參看生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù))；6.用硫酸蒽酮法(參看生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù))測(cè)定產(chǎn)物葡萄糖的分解液，得到分解液中的葡萄糖含量，同時(shí)與相同條件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纖維素酶解的結(jié)果相比較，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在反膠束體系尤其是Triton X-100反膠束體系中進(jìn)行的纖維素酶解效率要大大高于水溶液中進(jìn)行的酶解反應(yīng)效率。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下表所示(T＝50℃，pH＝6.0)

權(quán)利要求
1.一種用于降解纖維素的反膠束方法，其特征在于，它含有下列步驟A、室溫下，配制pH5.2～6.4含有纖維素酶的緩沖溶液(A)，其中纖維素酶的濃度為30～900μM；B、配備含有表面活性劑的有機(jī)溶液(B)，其中表面活性劑的濃度為0.01～0.20M；表面活性劑為聚氧乙烯烷基苯基醚或2-乙基己基琥珀酸鈉；有機(jī)溶劑是二甲苯或正己醇或異辛烷；C、將溶液A和溶液B均勻混合，使得纖維素酶分子在混合液中的濃度為0.15～4.5μM，纖維素酶分子被包含于形成的反膠束體系的水池中，形成溶液C；D、靜置15～25秒，待溶液C形成透明體系后，按0.9～10g/l的比例向其中加入微晶纖維素，所述微晶纖維素在30～60℃反應(yīng)1～24小時(shí)后被充分降解；E、加入10倍于溶液A體積的磷酸緩沖液及與溶液C等體積的氯仿，振蕩后以3000～4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5～10分鐘，使溶液分層，取出上層溶液，即為降解產(chǎn)物葡萄糖溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于降解纖維素的反膠束方法，首先將纖維素酶溶解于緩沖液得到緩沖液A；其次配備含有表面活性劑的有機(jī)溶液B；第三是將溶液A與溶液B均勻混合，形成溶液C；第四是待溶液C形成均一透明體系后，加入微晶纖維素；第五是加入10倍于溶液A體積的磷酸緩沖液和與溶液C等體積的萃取劑，劇烈震蕩后離心使溶液分層，取出上層溶液即為降解產(chǎn)物葡萄糖溶液。本方法具有反應(yīng)效率高，生產(chǎn)過(guò)程安全、降解成本低的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)生產(chǎn)過(guò)程設(shè)備簡(jiǎn)單，具有很好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。
文檔編號(hào)C08B15/00GK1696158SQ20051001894
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日
發(fā)明者梁毅, 陳楠, 范俊寶, 項(xiàng)瑾, 周拯, 陳杰 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)