專利名稱：低分子量的肝素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝素產(chǎn)品及其制備方法，尤其涉及一種低分子量的肝素及其制備方法。
背景技術(shù)：
血栓栓塞性疾病是當(dāng)前人類所面對(duì)的嚴(yán)重威脅之一，具有相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，如冠心病心肌梗塞、深靜脈血栓(DVT)形成、腦栓塞、肺栓塞(PE)等。此外，血栓形成是許多疾病發(fā)病機(jī)制中涉及的一種重要病理過程，如糖尿病小血管病變、腎小球腎炎、嚴(yán)重?zé)齻芯植坎∽兊膼夯⑷焉锔哐獕壕C合征、視網(wǎng)膜靜脈血栓形成、各種原因引起的彌漫性血管內(nèi)凝血等。因此，預(yù)防和治療血栓形成，對(duì)提高生存質(zhì)量，降低疾病發(fā)生率以及死亡率都具有十分重要的意義。
血栓栓塞性疾病的預(yù)防和治療中，肝素具有重要的臨床價(jià)值，作為傳統(tǒng)的抗凝抗血栓藥，已有60多年的應(yīng)用歷史，它療效顯著，很久以來，在臨床上具有不可替代的重要地位，但同時(shí)它也存在著副作用較大的不足，尤其是容易引起粘膜出血，有時(shí)甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重的顱內(nèi)出血，據(jù)統(tǒng)計(jì)出血發(fā)生率可高達(dá)35％，因此臨床應(yīng)用時(shí)要進(jìn)行嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控。另外，肝素皮下注射生物利用度低，長期使用還會(huì)造成血小板減少、脂質(zhì)代謝紊亂，從而限制了其藥效的發(fā)揮及臨床應(yīng)用。
八十年代中期，歐洲首先開發(fā)成功低分子肝素(LMWH)。低分子肝素是以普通肝素為原料，經(jīng)物理分離或化學(xué)降解而得，平均分子量一般在4000-6500之間。歐洲藥典(EP)規(guī)定至少有60％量的LMWH分子量應(yīng)小于8000，并規(guī)定其抗FXa活性不得低于70IU/mg，抗FXa/FIIa活性不得低于1.5。LMWH已上市的藥物有Enoxaparin，F(xiàn)raxiparin，Dalteparin等，適應(yīng)證包括血透時(shí)防止體外循環(huán)中發(fā)生凝血、深部靜脈血栓(DVT)的預(yù)防和治療以及不穩(wěn)定型心絞痛、無Q波心肌梗塞。另外，在腎臟疾病、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)以及動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、缺血性腦病、重癥肝炎、肺部疾病及其它血栓栓塞疾患等諸方面。
肝素類產(chǎn)品主要通過與血液中抗凝血酶III(ATIII)結(jié)合，促進(jìn)ATIII對(duì)凝血因子抑制來發(fā)揮抗凝、抗血栓作用。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)凝血因子Xa的抑制與抗栓作用相關(guān)，而滅活I(lǐng)Ia因子(凝血酶)則增加出血危險(xiǎn)性。肝素片段與ATIII結(jié)合需要一個(gè)特定的五糖序列，而抗IIa活性與肝素片段的長度有關(guān)，低于18糖的片段則沒有抑制IIa活性，而抗Xa活性則不受影響。普通肝素平均分子量為12000-15000，抗Xa活性與抗IIa活性相同，而LMWH平均分子量為4000-6500，抗Xa/抗IIa一般為1.5-4，與普通肝素相比，具有較選擇性的抗栓活性和低出血危險(xiǎn)性，但仍含有相當(dāng)比例的高分子量組分。
因此，本領(lǐng)域迫切需要平均分子量更低，質(zhì)量控制更嚴(yán)格，抗栓作用強(qiáng)、出血危險(xiǎn)性小、半衰期長的低分子肝素產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種亞硝酸裂解天然來源肝素得到的低分子量肝素及其藥用鹽。
本發(fā)明的另一目的是提供一種亞硝酸裂解天然來源肝素制備低分子量肝素的方法。
本發(fā)明的亞硝酸裂解天然來源肝素得到的低分子量肝素，具有如下特性平均分子量小于8000Da，其組分中重量小于8000Da的部分不小于60％，抗Xa因子效價(jià)不低于50％，抗Xa/抗IIa活性比不小于1.5。
在一個(gè)優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的低分子量肝素具有如下特性平均分子量在2100Da到2700Da之間；分子量分布組分總數(shù)的90％分子量在1500Da到5400Da之間；還原末端結(jié)構(gòu)為2，5-脫水-甘露糖；硫酸化率不低于1.8；抗Xa因子活性不低于50IU/mg；抗Xa因子/抗IIa因子活性比不低于10。
在進(jìn)一步優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的低分子量肝素具有如下特征平均分子量在2100Da到2700Da之間；分子量分布組分總數(shù)的90％分子量在1500Da到5400Da之間，組分總數(shù)的50％分子量在2000Da到4000Da之間；還原末端結(jié)構(gòu)為2，5-脫水-甘露糖；硫酸化率不低于1.8；抗Xa活性不低于60IU/mg；抗Xa因子/抗IIa因子活性比不低于20。
本發(fā)明的制備低分子量肝素的方法，包括以下步驟解聚反應(yīng)1-5％m/v的肝素溶液中，按每kg肝素加入40-70克亞硝酸鈉的比例，在pH值為3-4，室溫下處理2-4小時(shí)；還原反應(yīng)按每kg肝素加入15-25g硼氫化鈉的比例，在pH值為9～11，室溫下對(duì)肝素還原15-20小時(shí)，過量硼氫化鈉用鹽酸破壞；分級(jí)分離用35-55％v/v乙醇沉淀，，沉淀物按30％m/v的比例溶于蒸餾水中，加入1％(m/m)氯化鈉，加入5-12倍體積的乙醇，收集沉淀，冷凍干燥。
在一個(gè)優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的亞硝酸裂解天然來源肝素制備低分子量肝素的方法，包括以下步驟解聚反應(yīng)1-3％m/v的肝素溶液中，按每kg肝素加入50-60克亞硝酸鈉的比例，在pH值為3-4，室溫下處理2-4小時(shí)；還原反應(yīng)按每kg肝素加入15-25g硼氫化鈉的比例，在pH值為9～11，室溫下對(duì)肝素還原15-20小時(shí)，過量硼氫化鈉用鹽酸破壞；分級(jí)分離40％v/v乙醇沉淀，進(jìn)行沉淀，沉淀物按30％m/v的比例溶于蒸餾水中，加入1％(m/m)氯化鈉，加入8～15倍體積的乙醇，收集沉淀，冷凍干燥。
與現(xiàn)有的低分子量肝素相比，本發(fā)明的低分子量肝素具有如下優(yōu)點(diǎn)抗IIa因子活性很低，極大地減少了出血的可能性。肝素分子分子量低于1500Da將失去溶栓活性，高于5400Da將有出血的副作用。本發(fā)明的低分子量肝素組分總數(shù)的90％分子量在1500Da到5400Da之間，為選擇性溶栓的有效分子，因此溶血副作用極低。
治療指數(shù)提高。本發(fā)明的低分子量肝素在降低抗IIa因子活性的同時(shí)，基本保持了抗Xa因子活性?？筙a因子/抗IIa因子活性比遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過現(xiàn)有的低分子肝素的1.5，在一個(gè)優(yōu)選的方案中，抗Xa因子/抗IIa因子活性比超過20。
分子量分布更加集中。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，組分總數(shù)的90％分子量在1500Da到5400Da之間，組分總數(shù)的50％分子量在2000Da到4000Da之間，使得質(zhì)量控制嚴(yán)格，產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定。
本發(fā)明的方法有很高的收率。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，收率達(dá)到55％。


圖1為HPLC凝膠色譜圖譜。
圖2為抗Xa因子效價(jià)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3為抗Xa因子效價(jià)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
肝素的亞硝酸裂解在低pH值(2.5-4.0)的條件下，亞硝酸首先作用于肝素分子的N-硫酸葡糖胺單位，脫去HSO4-形成-NH2。-NH2與HNO2發(fā)生重氮化反應(yīng)，在放氮同時(shí)糖苷鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移，縮環(huán)生成2，5-脫氫甘露糖或脫氫甘露糖醇。
亞硝酸與N-硫酸葡萄糖胺反應(yīng)機(jī)理如下 亞硝酸控制解聚生產(chǎn)低分子肝素的過程受溫度、溶液pH值、亞硝酸的濃度及解聚時(shí)間的影響較大。一般來說，反應(yīng)溫度控制在-5℃-30℃，低于-5℃溶液就要凝固，高于30℃，LMWH可能被破壞。溶液pH值為1.5時(shí)，反應(yīng)需5-10min，而當(dāng)pH值為4時(shí)，反應(yīng)則長達(dá)10-18h，亞硝酸的具體用量要根據(jù)設(shè)計(jì)的分子量決定。低濃度的亞硝酸不能很好的解聚肝素，高濃度時(shí)又會(huì)導(dǎo)致肝素在不適宜的位置斷裂，使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。另外，通過控制亞硝酸和肝素的比例，可使反應(yīng)自我調(diào)節(jié)終止。
分子量測定及計(jì)算平均分子量按照高效液相色譜法測定(中國藥典 2000年版 二部附錄VD)。紫外檢測器和示差檢測器按順序串連使用，紫外檢測器的檢測波長為234nm，示差檢測器接紫外檢測器輸出端。
低分子肝素分子量標(biāo)準(zhǔn)品配制成每1ml含10mg的溶液，取20μl注入液相色譜儀，記錄示差和紫外圖譜，按下述方法計(jì)算分子量校正因子(f)在相關(guān)范圍內(nèi)(除去色譜峰末端的溶劑峰)計(jì)算UV234曲線下的總面積(∑UV234)和RI曲線下的總面積(∑RI)。按下式計(jì)算RI響應(yīng)和UV234響應(yīng)面積的比值rr＝∑RI/∑UV234因子ff＝Mna/r (Mna為標(biāo)準(zhǔn)品的已知數(shù)均分子量)。
UV234和RI響應(yīng)值相關(guān)聯(lián)時(shí)，按下式計(jì)算，得到任意點(diǎn)的分子量MiMi＝fRI/UV234樣品配制成每1毫升含10mg的溶液，取20μl注入液相色譜儀，記錄示差色譜圖，按下式計(jì)算重均分子量(Mw)Mw＝∑RIiMi/∑RIi其中RIi＝在第I部分中被洗脫物質(zhì)的量(重量)Mi＝第I部分中響應(yīng)的分子量樣品效價(jià)測定抗Xa因子效價(jià)和抗IIa因子效價(jià)測定原理為，ATIII為α2球蛋白，是調(diào)節(jié)體內(nèi)凝血機(jī)制的重要物質(zhì)，微肝素鈉能加速ATIII對(duì)多種凝血因子的中和反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)體系中加入過量的ATIII、Xa因子或IIa因子，被滅活的Xa因子或IIa因子的量與微肝素鈉的濃度成正比。未被滅活的Xa因子或IIa因子與具有特異性反應(yīng)的生色底物(CBS)發(fā)生反應(yīng)，使生色底物分解而顯色，在405nm波長處測定吸收度A，由此可計(jì)算出抗Xa因子或抗IIa因子活性。
紫外可見分光光度計(jì)選用尤尼柯(上海)儀器有限公司UV-2102型，色譜儀選用惠普1100高效液相色譜儀(DAD、RI檢測器)，色譜柱為TSK GEL G2000SWXL，7.8mmID*30cm，5μm。
IIa因子(PURIFIED THROMBIN，凝血酶)、抗凝血酶III(PURIFIED ATIII)、Xa因子(PURIFIED FACTOR Xa)購于DIAGNOSTICA STAGO公司，生色底物CBS31.39、生色底物CBS 34.47購于DIAGNOSTICA STAGO公司，低分子肝素效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品為歐洲藥典委員會(huì)監(jiān)制，(COUNCIL OF EUROPE EUROPEAN PHARMACOPOEIABP 907-F67029STRASBOURG CEDEX 1HEPARIN LOW-MOLECULAR-MASS FORASSAYBRP)Anti-IIaactivity44.2IU/ml，Anti-Xaactivity106.1IU/ml，Lotn°2d，其他試劑購于上?；瘜W(xué)試劑公司。
實(shí)施例1、低分子量肝素的制備在5000ml燒杯中加入肝素40g和蒸餾水2000ml，至肝素完全溶解；在25℃下，加入36％醋酸調(diào)pH值為3.20。一次加入0.7％亞硝酸鈉溶液320ml，于室溫下攪拌反應(yīng)3.0小時(shí)。
反應(yīng)結(jié)束時(shí)用4mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)(pH＞4.00)，繼續(xù)用4mol/L氫氧化鈉調(diào)pH＝10.0。
加入硼氫化鈉0.8克，于室溫下攪拌反應(yīng)18小時(shí)，進(jìn)行還原。用鹽酸調(diào)pH＝4.00，破壞過量的硼氫化鈉；再用4mol/L氫氧化鈉調(diào)pH＝7.00。小于10℃放置。在攪拌的條件下加入40％v/v的小于10℃95％乙醇，邊加邊攪拌，在小于10℃的條件下靜置24小時(shí)，沉淀出產(chǎn)物。
使沉淀物沉降，然后除去水-醇上層清液。將沉淀物溶于蒸餾水中(30％)。向沉淀產(chǎn)物溶液中加入氯化鈉1％(m/m)，然后將該溶液滴加至10倍溶液體積的95％乙醇中分離樣品，抽濾，收集沉淀，冷凍干燥。
制得微肝素鈉22g。收率55％。
實(shí)施例2、低分子肝素分子量分析色譜儀選用惠普1100高效液相色譜儀(DAD、RI檢測器)，色譜柱為TSK GELG2000SWXL，7.8mmID*30cm，5μm，檢測波長234nm，流動(dòng)相以2.84％(W/V)硫酸鈉溶液用1mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至5.0，柱壓35-40kg，流速0.5ml/min。
樣品、標(biāo)準(zhǔn)品及對(duì)照品均用流動(dòng)相配制成10mg/ml的溶液，進(jìn)樣分析。
(1)系統(tǒng)校正進(jìn)樣25μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，檢測使用與測定波長234nm的UV分光光度儀順序聯(lián)接的示差檢測器(RI)，并使UV聯(lián)接于色譜柱的輸出端，RI聯(lián)接于UV的輸出端。必須精確測定兩個(gè)檢測器間的時(shí)間差，以使由它們得到的色譜可正確關(guān)聯(lián)。校準(zhǔn)中使用的保留時(shí)間必須是從RI檢測器得到的數(shù)據(jù)。
(2)樣品分子量進(jìn)樣25μl樣品溶液，記錄色譜圖一段時(shí)間，以保證完全洗脫樣品和溶劑峰。按下式計(jì)算重均分子量(∑RIi Mi)/∑RIi[其中RIi＝在第i部分中被洗脫物質(zhì)的量(重量)；Mi＝第i部分中相應(yīng)的分子量。]測定HPLC凝膠色譜圖譜參見圖1。圖中，根據(jù)出峰時(shí)間先后依次為肝素鈉、低分子量肝素鈉、微肝素鈉，所說的微肝素鈉即為實(shí)施例1的產(chǎn)物。
可以看到本品由肝素裂解片段構(gòu)成，沒有其它多糖(如硫酸皮膚素)的雜峰，本品峰保留時(shí)間較肝素鈉及低分子量肝素鈉長，顯示分子量更小。峰形也較肝素鈉及低分子量肝素鈉窄瘦，顯示分子量分布更為集中。
通過計(jì)算，本品重均分子量為2400。其分子量小于8000的組分達(dá)到99％，分子量為1500-5400組分超過90％，分子量為2000-4000組分超過50％，可以看出本品基本是由5-18糖構(gòu)成的肝素裂解片段組成。
實(shí)施例3、抗Xa因子效價(jià)測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液以三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.4)稀釋，使成每1毫升中含0.02、0.05、0.1、0.15、0.2抗Xa因子國際單位的稀釋液。
樣品溶液的配制實(shí)施例1制備的低分子肝素，加生理鹽水溶解并稀釋至0.1mg/ml。以三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.4)稀釋60倍。(預(yù)估樣品的抗Xa因子效價(jià)為60IU/mg，配制成每1毫升中約含0.1抗Xa因子國際單位的樣品溶液。)取小試管，加入50μl PURIFIED ATIII溶液和50μl各個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻，37℃恒溫箱中保溫1分鐘，加入100μlXa因子溶液，混勻，37℃恒溫箱中保溫1分鐘，加入250μl生色底物溶液，混勻，37℃恒溫箱中保溫4分鐘，立即加入380μl冰醋酸，混勻。另取一管加入50μl PURIFIED ATIII溶液，50μl三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.4)，100μlXa因子溶液，250μl生色底物溶液及380μl冰醋酸，混勻做空白。按分光光度法(中國藥典2000年版附錄IVA)，在405nm波長處，分別測定吸收度(在測定開始和結(jié)束時(shí)測定空白值，兩次空白值不得有顯著差異)。對(duì)吸收度和相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，(見圖2)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線做線性回歸，其線性方程為A＝-0.29221gC+0.0092，相關(guān)系數(shù)r＝0.9973。
同樣方法測定樣品溶液的吸收度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其效價(jià)，樣品效價(jià)為抗Xa因子效價(jià)69.86IU/mg。
實(shí)施例4、抗IIa因子效價(jià)測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液以三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.4)稀釋，使成每1毫升中含0.02、0.03、0.04、0.06抗IIa因子國際單位的稀釋液。
樣品溶液的配制實(shí)施例1制備的低分子肝素，加生理鹽水溶解并稀釋至0.25mg/ml。以三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.4)稀釋25倍。(預(yù)估樣品的抗IIa因子效價(jià)為4IU/mg，配制成每1毫升中約含0.04抗Xa因子國際單位的樣品溶液。)取小試管，加入50μl PURIFIED ATIII溶液和50μl各個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻，37℃恒溫箱中保溫1分鐘，加入100μl凝血酶溶液，混勻，37℃恒溫箱中保溫1分鐘，加入250μl生色底物溶液，混勻，37℃恒溫箱中保溫4分鐘，立即加入380μl冰醋酸，混勻。另取一管加入50μl PURIFIED ATIII溶液，50μl三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.4)，加入100μl凝血酶溶液，250μl生色底物溶液及380μl冰醋酸，混勻做空白。按分光光度法(中國藥典2000年版附錄IVA)，在405nm波長處，分別測定吸收度(在測定開始和結(jié)束時(shí)測定空白值，兩次空白值不得有顯著差異)。對(duì)吸收度和相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線做線性回歸，其線性方程為A＝-0.88511gC-0.8943，相關(guān)系數(shù)r＝0.9949。
同樣方法測定樣品吸收度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其效價(jià)。樣品抗IIa因子效價(jià)為2.91IU/mg。
實(shí)施例3、4結(jié)果表明，本發(fā)明制備的低分子量肝素，抗Xa因子效價(jià)69.86IU/mg，抗IIa因子效價(jià)2.91IU/mg，抗Xa因子/抗IIa因子效價(jià)比值為24.0。
權(quán)利要求
1.一種亞硝酸裂解天然來源肝素得到的低分子量肝素，其特征在于，具有如下特性平均分子量小于8000Da，其組分中重量小于8000Da的部分不小于60％，抗Xa因子效價(jià)不低于50％，抗Xa/抗IIa活性比不小于1.5。
2.如權(quán)利要求1所述的低分子量肝素，其特征在于，具有如下特性平均分子量在2100Da到2700Da之間；分子量分布組分總數(shù)的90％分子量在1500Da到5400Da之間；還原末端結(jié)構(gòu)為2，5-脫水-甘露糖；硫酸化率不低于1.8；抗Xa因子活性不低于50IU/mg；抗Xa因子/抗IIa因子活性比不低于10。
3.如權(quán)利要求2所述的低分子量肝素，其特征在于，具有如下特性平均分子量在2100Da到2700Da之間；分子量分布組分總數(shù)的90％分子量在1500Da到5400Da之間，組分總數(shù)的50％分子量在2000Da到4000Da之間；還原末端結(jié)構(gòu)為2，5-脫水-甘露糖；硫酸化率不低于1.8；抗Xa活性不低于60IU/mg；抗Xa因子/抗IIa因子活性比不低于20。
4.一種亞硝酸裂解天然來源肝素制備低分子量肝素的方法，其特征在于，包括以下步驟解聚反應(yīng)1-5％m/v的肝素溶液中，按每kg肝素加入40-70克亞硝酸鈉的比例，在pH值為3-4，室溫下解聚2-4小時(shí)；還原反應(yīng)按每kg肝素加入15-25g硼氫化鈉的比例，在pH值為9～11，室溫下對(duì)肝素還原15-20小時(shí)；分級(jí)分離用35-55％v/v乙醇沉淀，，沉淀物按30％m/v的比例溶于蒸餾水中，加入1％(m/m)氯化鈉，加入乙醇，收集產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步驟解聚反應(yīng)1-3％m/v的肝素溶液中，按每kg肝素加入50-60克亞硝酸鈉的比例，在pH值為3-4，室溫下解聚2-4小時(shí)；還原反應(yīng)按每kg肝素加入15-25g硼氫化鈉的比例，在pH值9～11，室溫下對(duì)肝素還原15-20小時(shí)；分級(jí)分離40％v/v乙醇沉淀，進(jìn)行沉淀，沉淀物按30％m/v的比例溶于蒸餾水中，加入1％(m/m)氯化鈉，加入乙醇，收集產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種亞硝酸裂解天然來源肝素得到的低分子量肝素，平均分子量在2100 Da到2700 Da之間，組分總數(shù)的90％分子量在1500 Da到5400 Da之間。本發(fā)明的低分子量肝素抗IIa因子活性很低，抗Xa因子/抗IIa因子活性比超過20，極大地減少了出血的可能性。本發(fā)明還公開了制備該低分子量肝素的方法，包括亞硝酸裂解、硼氫化鈉還原、乙醇沉淀等步驟，具有很高的收率。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1880344SQ20051002677
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2005年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月15日
發(fā)明者王作鵬, 張立紅 申請(qǐng)人:上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司