專利名稱：一種活性小球藻多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種活性小球藻多糖的制備方法，屬于海洋生物技術(shù)，用于研制開發(fā)醫(yī)藥保健品和功能食品的基料。
背景技術(shù)：
海洋生物資源豐富、種類繁多、數(shù)量龐大，呈現(xiàn)原始性和多樣性特點(diǎn)。海洋生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特是新藥研究開發(fā)和現(xiàn)代醫(yī)藥保健品開發(fā)的當(dāng)今世界科學(xué)研究的活躍領(lǐng)域，美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所每年篩選3萬(wàn)個(gè)新的抗癌化合物，有5％來(lái)自海洋生物。迄今海洋生物中已發(fā)現(xiàn)3000余種新型活性物質(zhì)，其中包括生物堿類、萜類、大環(huán)聚酯類、肽類、聚醚類、及多糖類等化合物。美國(guó)、加拿大和日本均制定了開發(fā)利用海洋生物研究計(jì)劃，廣泛開展了對(duì)海洋生物活性物質(zhì)的篩選。近30年類，海洋天然產(chǎn)物化學(xué)的研究取得了令人注目的成果，從種類豐富的海洋生物中分離出許多結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特，具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤和抗突變、抗心血管病的生物活性物質(zhì)。
對(duì)海洋生物活性物質(zhì)的研究，已展現(xiàn)出誘人的前景，尤其在抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎，以及作用于神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等方面。當(dāng)前醫(yī)藥保健品發(fā)展趨勢(shì)，將由陸地轉(zhuǎn)向海洋，從海洋生物資源中開發(fā)研究醫(yī)藥保健品和功能食品潛力巨大。海洋生物抗腫瘤研究院(National Cancer Institute)從世界不同海域采集的各種海洋生物進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)海藻、苔蘚蟲、海兔、海綿、海鞘中某些活性成分可望研究成新穎的海洋藥物和海洋食品。但海洋生物中活性物質(zhì)一般都以微量形式存在，從而限制了其獲取和生產(chǎn)，因之其獲取和生產(chǎn)的可能性一直是未來(lái)實(shí)際應(yīng)用的難點(diǎn)。海洋生物資源具有廣闊的綜合利用前景，從海洋生物體內(nèi)獲取有功效的初生代謝產(chǎn)物與次生代謝產(chǎn)物，可發(fā)展海洋天然藥物，也可開發(fā)海洋生物保健品、海洋功能食品。利用海洋生物活性物質(zhì)新穎的結(jié)構(gòu)作為先導(dǎo)物，可設(shè)計(jì)合成治療疑難病的創(chuàng)新藥物。
海藻多糖是從海藻中提取的大分子糖類，目前研究最多的品種有褐藻膠、瓊膠、卡拉膠等，它們?cè)谑称贰⑨t(yī)藥、生物工程等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如用于固定化細(xì)胞及固定化酶載體的褐藻膠和瓊膠。已開發(fā)出動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的貼壁素、傷口粘合劑等產(chǎn)品。
海洋生物活性物質(zhì)研究過(guò)程中，分離提取是最關(guān)鍵的步驟之一。海洋生物種類繁多，但生物活性物質(zhì)含量低微，經(jīng)典的沉淀、結(jié)晶、吸附、萃取、離子交換技術(shù)等提取技術(shù)對(duì)于海洋活性物質(zhì)的提取和純化存在較大的困難和局限性。海洋生物活性物質(zhì)的提取大都采用有機(jī)溶劑萃取的方法，存在著溶劑回收困難，工序繁瑣，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)?，F(xiàn)代分離技術(shù)如膜分離技術(shù)、超臨界流體萃取技術(shù)在海洋活性物質(zhì)的提取、分離和純化中有重要的應(yīng)用前景。超臨界流體技術(shù)是利用超臨界流體在超過(guò)氣液共存狀態(tài)時(shí)的溫度、壓力時(shí)，來(lái)溶解某種固體、液體或它們中的某些組分，并且利用這種能力從原料中提取有用成分或脫除有害的成分，從而達(dá)到分離提純的目的。超臨界流體技術(shù)能夠從天然物質(zhì)中選擇性地提取、分離和純化所需組分，CO2不與生理活性物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，無(wú)毒，無(wú)污染，易于從產(chǎn)品中清除，并且可以循環(huán)使用。膜分離技術(shù)在分離過(guò)程中不涉及相變、無(wú)二次污染，又由于分離中具有生物膜濃縮富集的功能，同時(shí)它操作方便、結(jié)構(gòu)緊湊、維修費(fèi)用低，易于自動(dòng)化，因而它是現(xiàn)代分離技術(shù)中一種效率較高的分離手段，可以取代傳統(tǒng)的過(guò)濾、吸附、冷凝、重結(jié)晶、蒸餾和萃取的等分離技術(shù)，所以膜分離技術(shù)在分離過(guò)程中具有重要作用。海洋生物中存在大量具有獨(dú)特生理活性的天然產(chǎn)如藻膽蛋白、EPA和多糖等，亟待開發(fā)利用，超臨界CO2萃取技術(shù)及膜分離技術(shù)對(duì)于分離提純此類天然活性物質(zhì)又具有比傳統(tǒng)提取方法獨(dú)到的特點(diǎn)，避免海洋生物活性成分在整個(gè)提取過(guò)程中采用有毒的有機(jī)溶劑介入，從而保證其具有綠色產(chǎn)品的特色。該技術(shù)的運(yùn)用最大限度保留了產(chǎn)品的原型風(fēng)味、避免有效成份在提取過(guò)程中破壞或損失，能較大的保持產(chǎn)品的純天然性。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種提取高純度及高活性小球藻多糖的制備方法。該方法簡(jiǎn)便，成本低廉，易得，小球藻多糖無(wú)毒、安全和高活性。所提取的小球藻多糖得率、純度較高，具有較高的免疫調(diào)節(jié)作用的功能。
技術(shù)方案1、海藻多糖的制備方法，其特征在于(1)稱取100克脫脂后的蛋白核小球藻粉，加入2L純水混勻，用超聲波細(xì)胞破碎儀于1000W破碎800S，再于100℃的沸水中水浴4小時(shí)，離心沉淀，去除藻體，再加入三氯乙酸(TCA)至質(zhì)量比終濃度為3％以去除蛋白，離心沉淀后小球藻溶液用NaOH調(diào)PH至6.0-6.5；(2)小球藻溶液在進(jìn)口壓力0Psi，溫度40℃條件下用0.1μm的微濾膜過(guò)濾，去除濃縮液，將上清液再用3KD的超濾膜過(guò)濾，溫度25-40℃，進(jìn)口壓15Psi，回流壓11Psi，收集濃縮液。
(3)將濃縮液中加入乙醇溶液，至濃縮液與乙醇的體積比終濃度為1∶4進(jìn)行沉淀，將沉淀物用40℃純水溶解后冷凍干燥即獲得小球藻多糖。
有益效果本發(fā)明采用超聲波破壁、熱水浸提及膜分離技術(shù)相結(jié)合，提取的得率可達(dá)到4.76％以上，純度可達(dá)到60％以上。所提取的小球藻多糖經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，具有較高的免疫調(diào)節(jié)作用的功能。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，成本低廉，易得，小球藻多糖無(wú)毒、安全和高活性。所得小球藻多糖進(jìn)一步純化后可分為分子量差異較大的兩個(gè)組分，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)測(cè)得其分子量分別為81877Da和1749Da左右。對(duì)兩個(gè)組分進(jìn)行了簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)和組分鑒定，GC顯示組分1的主要單糖為甘露糖(relative mass 78.0％)和葡萄糖(13.2％)，組分2的主要單糖為甘露糖(76.5％)和葡萄糖(10.5％)以及一種不知名的單糖(8.4％)。
用所提取的粗多糖動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫功能評(píng)價(jià)，其中中、高劑量組在細(xì)胞免疫和體液免疫的試驗(yàn)中都表現(xiàn)出了顯著增高的結(jié)果，證實(shí)了小球藻多糖具有免疫調(diào)節(jié)功效。
四

圖1小球藻多糖對(duì)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響(耳腫脹法)五、發(fā)明的具體實(shí)施方式
實(shí)施例1(1)稱取100克脫脂后的蛋白核小球藻粉，加入2L純水混勻，用超聲波細(xì)胞破碎儀在1000W的功率下破碎800S。
(2)將破壁后的小球藻溶液在100℃的沸水中水浴4小時(shí)，以3000轉(zhuǎn)/min的速度離心10分鐘，去除沉淀；再加入三氯乙酸(TCA)至質(zhì)量比終濃度為3％，靜置片刻，以4000轉(zhuǎn)/min的速度離心10分鐘，去除沉淀；再用NaOH調(diào)PH至6.1。
(3)將提取液用0.1μm的微濾膜過(guò)濾(進(jìn)口壓0Psi，溫度40℃)，去除濃縮液。再將清液再用3KD的超濾膜過(guò)濾(溫度25℃，進(jìn)口壓15Psi，回流壓11Psi)，收集濃縮液。
(4)將濃縮液中加入乙醇溶液，至濃縮液與乙醇的體積比終濃度為1∶4進(jìn)行沉淀，將沉淀物用40℃純水溶解后冷凍干燥即獲得多糖含量為60.03％的小球藻多糖，得率4.76％。
實(shí)施例2(1)稱取100克脫脂后的蛋白核小球藻粉，加入2L純水混勻，用超聲波細(xì)胞破碎儀在1000W的功率下破碎800S。
(2)將破壁后的小球藻溶液在100℃的沸水中水浴4小時(shí)，以3000轉(zhuǎn)/min的速度離心10分鐘，去除沉淀；再加入三氯乙酸(TCA)至質(zhì)量比終濃度為3％，靜置片刻，以4000轉(zhuǎn)/min的速度離心10分鐘，去除沉淀；再用NaOH調(diào)PH至6.4。
(3)將提取液用0.1μm的微濾膜過(guò)濾(進(jìn)口壓力0Psi，溫度40℃)，去除濃縮液，再將清液再用30KD的超濾膜過(guò)濾(溫度35℃，進(jìn)口壓15Psi，回流壓11Psi)，收集濃縮液1；再將過(guò)30KD的超濾膜的清液用1KD的超濾膜過(guò)濾(溫度35℃，進(jìn)口壓15Psi，回流壓11Psi)，收集濃縮液2。
(4)將濃縮液1冷凍干燥得多糖組分1(得率5.74％，多糖含量為23.59％)；將濃縮液2冷凍干燥得多糖組分2(得率3.91％，多糖含量為5.63％)。
所得小球藻多糖進(jìn)一步純化后可分為分子量差異較大的兩個(gè)組分，經(jīng)高效液相色譜HPLC測(cè)得其分子量分別為81877Da和1749Da左右。對(duì)兩個(gè)組分進(jìn)行了簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)和組分鑒定，GC顯示組分1的主要單糖為甘露糖(relative mass 78.0％)和葡萄糖(13.2％)，組分2的主要單糖為甘露糖(76.5％)和葡萄糖(10.5％)以及一種不知名的單糖(8.4％)。用所提取的粗多糖做動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫功能評(píng)價(jià)，其中低劑量組的小球藻多糖在非特異性免疫和體液免疫的試驗(yàn)中都表現(xiàn)出了顯著增高的結(jié)果，而中、高劑量組在非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫的試驗(yàn)中均表現(xiàn)出了顯著增高的結(jié)果，充分地說(shuō)明了小球藻粗多糖具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功效。
小球藻多糖的非特異性免疫功能表1可見，正常對(duì)照組的小鼠在30天的生長(zhǎng)期中，體重均值由原來(lái)的19.64克顯著升高到了41.96克，低、中、高三個(gè)劑量的試驗(yàn)組中試驗(yàn)小鼠體重的增加趨勢(shì)都與陰性對(duì)照組沒有顯著差異。陰性對(duì)照組的小鼠的脾指數(shù)均值和胸腺指數(shù)均值分別為0.41mg/10g體重和0.16mg/10g體重，三個(gè)試驗(yàn)組無(wú)論脾指數(shù)均值還是胸腺指數(shù)均值都與正常對(duì)照組沒有顯著差異。小球藻多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響從表2的數(shù)據(jù)結(jié)果可以見到，陰性對(duì)照組的巨噬細(xì)胞的吞噬率均值為15.25％，低、中、高三個(gè)劑量組對(duì)應(yīng)的巨噬細(xì)胞吞噬率均值分別為16.95％、23.00％和26.25％，可見吞噬率隨著樣品劑量的增加呈現(xiàn)出了不斷升高的趨勢(shì)，且中、高劑量組的增強(qiáng)效果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異；陰性對(duì)照組的巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)均值為0.2035，三個(gè)劑量組對(duì)應(yīng)的巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)均值分別為0.2185、0.2970和0.3630，可見吞噬指數(shù)隨著樣品劑量的增加呈現(xiàn)出了不斷升高的趨勢(shì)，同樣的，其中、高劑量組的增強(qiáng)效果經(jīng)SAS統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異。
表1小球藻多糖對(duì)小鼠免疫臟器重量的影響

表2小球藻多糖的非特異性免疫效果(吞噬率和吞噬指數(shù))

小球藻多糖的細(xì)胞免疫功能圖1可知，隨著試驗(yàn)劑量的增加，低、中、高三個(gè)劑量組的小鼠耳腫脹率出現(xiàn)了不斷增加的趨勢(shì)，其中中、高劑量組的遲發(fā)性超敏反應(yīng)與陰性對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)。
小球藻多糖的體液免疫功能評(píng)價(jià)低、中、高三個(gè)劑量組的小球藻粗多糖對(duì)抗體積數(shù)的增加均有顯著地促進(jìn)作用(表3)，與陰性對(duì)照組10.3的抗體積數(shù)相均值比，對(duì)應(yīng)的抗體積數(shù)均值分別增加到了22.10、32.10和50.10。
表3小球藻多糖的對(duì)小鼠抗體數(shù)的影響

非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫是評(píng)價(jià)受試物免疫調(diào)節(jié)功能的三項(xiàng)主要指標(biāo)，其中如果有兩個(gè)以上(含兩個(gè))功能檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即可判定該受試物具有免疫調(diào)節(jié)效果。在本試驗(yàn)中，低劑量組的小球藻粗多糖只在非特異性免疫和體液免疫的試驗(yàn)中都表現(xiàn)出了顯著增高的結(jié)果，而中、高劑量組在非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫的試驗(yàn)中均表現(xiàn)出了顯著增高的結(jié)果，充分地說(shuō)明了小球藻粗多糖具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功效。
權(quán)利要求
1.一種活性小球藻多糖的制備方法，其特征在于(1)稱取100克脫脂后的蛋白核小球藻粉，加入2L純水混勻，用超聲波細(xì)胞破碎儀于1000W破碎800S，再于100℃的沸水中水浴4小時(shí)，離心沉淀，去除藻體，再加入三氯乙酸至質(zhì)量比終濃度為3％以去除蛋白，離心沉淀后小球藻溶液用NaOH調(diào)PH至6.0-6.5；(2)小球藻溶液在進(jìn)口壓力0Psi，溫度40℃條件下用0.1μm的微濾膜過(guò)濾，去除濃縮液，將上清液再用3KD的超濾膜過(guò)濾，溫度25-40℃，進(jìn)口壓15Psi，回流壓11Psi，收集濃縮液；(3)將濃縮液中加入乙醇溶液，至濃縮液與乙醇的體積比終濃度為1∶4進(jìn)行沉淀，將沉淀物用40℃純水溶解后冷凍干燥即獲得小球藻多糖。
全文摘要
本發(fā)明一種活性小球藻多糖的制備方法，屬于海洋生物技術(shù)。將脫脂后蛋白核小球藻粉用20倍的純水混勻，用超聲波細(xì)胞破碎儀于1000W破碎800S，再于100℃的沸水中水浴4小時(shí)，離心沉淀，去除藻體，再加入三氯乙酸(TCA)至終濃度3％以去除蛋白，離心沉淀后小球藻溶液用NaOH調(diào)pH至6.0－6.5；用0.1μm的微濾膜過(guò)濾，去除濃縮液，將清液再用3DK的超濾膜過(guò)濾，收集濃縮液，用80％的乙醇沉淀，將沉淀溶解后冷凍干燥得純度為60.03％的小球藻多糖，得率4.76％。獲得的提取物具有強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，可用于藥品和保健食品的基料，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病等功能。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1663966SQ20051003838
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2005年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月21日
發(fā)明者楊方美, 施瑛, 徐娟, 胡秋輝, 安辛欣 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)