專利名稱：一種制備低分子量肝素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備低分子量肝素的方法，特別涉及一種利用肝素酶I融合蛋白MBP-HepA制備低分子量肝素的方法。
背景技術(shù)：
肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷鍵交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖重復(fù)單位的線形鏈狀結(jié)構(gòu)，其分子量在3000-37000之間，平均分子量為15000。自1916年首次發(fā)現(xiàn)肝素以來，其在醫(yī)藥方面作為抗凝試劑和抗栓試劑的應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。此外，肝素還具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調(diào)血脂等多種生物學(xué)功能。但是，由于肝素具有抗凝活性，所以大量使用肝素會引起出血和誘導(dǎo)血小板減少等副作用，從而大大限制了肝素在臨床上的應(yīng)用。
低分子量肝素(低分子量肝素寡糖)(簡稱LMWHs)(Robert J.Linhardt，PH.D.AndNur Sibel Guany，M.S，Seminar in Thrombosis and Hemostasis，1999，25(3)5-16)是在分離普通肝素時得到的一些低分子量組分，或肝素裂解后產(chǎn)生的小分子片段，長度約為普通肝素的1/3。LMWHs分子量在3000-8000Da之間，平均分子量為5000Da左右。與普通肝素相比，通過體內(nèi)、外實驗發(fā)現(xiàn)，在同等劑量下，LMWHs的抗凝作用小于肝素，但其體內(nèi)和體外抗血栓作用明顯強于肝素。此外，LMWHs還具有一些其它優(yōu)勢，如分子量小，生物利用度高，血漿半衰期長；不與肝素結(jié)合蛋白結(jié)合，因此有更穩(wěn)定的量效關(guān)系，按體重給藥，控制劑量，不需要進行實驗室監(jiān)測；較少與血小板結(jié)合，不易引起血小板減少。所以LMWHs既能有效防止血栓形成，又能減少出血等不良反應(yīng)，是一種安全有效的抗血栓藥物，可作為肝素的替代物。不同聚合度(dp)的肝素寡糖能和不同蛋白因子作用，從而呈現(xiàn)不同的生物學(xué)作用。分子量分布范圍窄，相對比較均一的LMWHs的藥效較好。在對LMWHs進行質(zhì)量控制方面，各生產(chǎn)單位均規(guī)定了其平均分子量及分子量分布范圍。所以，生產(chǎn)所需平均分子量的LMWHs及分子量分布范圍窄的肝素寡糖，具有重要的意義。
目前，LMWHs的制備方法(張萬忠，王云山，馬潤宇，蘇志國，國生化藥物雜志，2001，22(1)48-51)主要有化學(xué)裂解法和酶降解法?；瘜W(xué)降解法是工業(yè)上常采用的方法，主要有亞硝酸降解法、β-消去降解法、過氧化氫降解法、高碘酸、次氯酸、硫酸-氯磺酸和γ-照射法等。但是，化學(xué)裂解肝素反應(yīng)劇烈，使得肝素分子中的某些功能基團在反應(yīng)過程中或多或少地被破壞，因而，某些生物活性功能在不同程度被或多或少的破壞。而酶降解法由于反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高及對環(huán)境無毒性，成為許多糖生物學(xué)研究工作者的研究熱點。美國專利(Nielsen，US 5106734，1992)利用232nm處的吸光度值控制產(chǎn)品質(zhì)量，可制備出具有理想平均分子量的低分子肝素產(chǎn)品。于廣利等(于廣利，王群，管華詩，徐家敏，Robert J.Linhardt，青島海洋大學(xué)學(xué)報，2002，32(2)231-235)利用肝素酶對牛肺肝素進行控制酶解，得到了聚合度2～20的寡糖純品。高寧國等(高寧國，程秀蘭，楊敬，張樹政，微生物學(xué)報，1999，39(1)64-67)篩選出了一種能產(chǎn)肝素酶的鞘胺醇肝菌，并利用所產(chǎn)生的酶降解肝素，得到了一系列具有抗平滑肌增生活性而抗凝活很低的肝素寡糖。但是，這些方法中所用到的肝素酶需要經(jīng)過多步的純化步驟，收率較低，造成酶的成本非常昂貴(肝素黃肝菌產(chǎn)生的商品肝素酶的價格為40美元/U)，限制了酶法制備低分子肝素的發(fā)展。利用重組菌株生產(chǎn)肝素酶I是一條極有前景的途徑，但通常情況下重組肝素酶I極容易形成包涵體，需要復(fù)雜的復(fù)性過程才能形成活性蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備低分子量肝素的方法。
本發(fā)明所提供的制備低分子量肝素的方法，是以肝素為底物，用麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)降解肝素，得到低分子量肝素；所述麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)，是具有序列表中的SEQ ID N1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
序列表中的序列1由756個氨基酸殘基組成。
所述麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)可按照以下方法制備將pMal-hepA轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1，得到含有pMal-hepA的重組大腸桿菌TB1(pMal-hepA)，培養(yǎng)重組大腸桿菌TB1(pMal-hepA)，誘導(dǎo)表達，得到麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)；所述pMal-hepA是將具有序列表中SEQ ID№2的DNA序列的所述麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)編碼基因插入pMal-p2x或pMal-c2x載體的BamHI和PstI識別位點間得到的重組載體。
序列2中的DNA序列由2271個脫氧核苷酸組成，該基因的編碼序列為自5’端第1到第2271位脫氧核苷酸。
所述肝素可從商業(yè)途徑獲得，也可按照現(xiàn)有的方法合成。
所述肝素的初始濃度為1-100g/l，優(yōu)選為25g/l。
用于溶解所述肝素的溶劑可為含3.5mM Ca(CH3COO)2和0.05％NaN3的pH為6.5-8.0濃度為0.1M的NH4COOCH3緩沖液。
所述麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量為1.875-187.5IU/g底物，優(yōu)選為7.5IU/g底物。
所述方法中，反應(yīng)溫度可為10-45℃，優(yōu)選為15-20℃。
所述方法中，反應(yīng)時間為6-12小時。
反應(yīng)時間優(yōu)選為9-12小時；尤其優(yōu)選為9小時。
所述方法中，可按照以下方法純化低分子量肝素終止反應(yīng)后將混合物進行截留分子量為10000Da的超濾，將得到的濾液利用TSK-GEL G2000SW柱進行凝膠過濾層析，收集保留時間為18-20分鐘的洗脫峰，得到低分子量肝素；所述凝膠過濾層析中所用的緩沖液為含質(zhì)量百分含量為0.05％的NaN3，pH為7.0濃度為0.1M的NH4COOCH3緩沖液，所述緩沖液的流速為0.5ml/min。
本發(fā)明的方法采用具有較高酶活的麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白制備肝素，由于麥芽糖結(jié)合蛋白具有和麥芽糖親和吸附的能力，因此重組表達MBP-HepA有利于肝素酶的分離純化，一步純化就可以得到純度為95％左右的MBP-HepA，從而可以大大降低酶的分離純化成本；利用麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的親和吸附能力，可以很容易實現(xiàn)肝素酶I的定向固定化，使酶的反復(fù)使用成為可能，從而提高酶反應(yīng)效率，降低酶的使用成本；從而降低低分子量肝素的生產(chǎn)成本。本發(fā)明通過控制酶解反應(yīng)時間，得到了分子量分布范圍窄的低分子量肝素(平均分子量在5000-6000)。由于MBP-HepA的生產(chǎn)、分離純化和使用成本可以大幅度的降低，因此利用該融合蛋白生產(chǎn)具有理想平均分子量且分子量分布范圍窄的低分子量肝素的方法具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價值。


圖1為表達載體pMal-hepA的構(gòu)建過程示意2為從肝素黃桿菌中PCR擴增得到的肝素酶I基因電泳圖譜圖3為凝膠色譜中分子量與停留時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線4為MBP-HepA降解肝素6小時所得肝素寡糖的凝膠色譜5為MBP-HepA降解肝素9小時所得肝素寡糖的凝膠色譜6為MBP-HepA降解肝素0.5小時所得肝素寡糖的凝膠色譜圖具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-HepA)的獲得1、含有肝素酶I編碼基因的表達載體pMal-hepA的構(gòu)建表達載體pMal-hepA的構(gòu)建過程如圖1所示，具體過程如下從肝素黃桿菌Favabacterium heparinum(購買自IAM)的染色體組DNA中擴增肝素酶I基因，所用的上下游引物分別為5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3’(帶下劃線的堿基為BamHI的酶識別位點)，5’GCTTCTGCAGTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’(帶下劃線的堿基為PstI酶識別位點)，分別引入BamHI和PstI酶識別位點，50μL擴增反應(yīng)體系為50ng模板DNA，100pmol每種引物，1×擴增緩沖液(北京天為生物技術(shù)有限公司)，200μmol/L每種dNTP，1單位高保Pfu酶；擴增程序為95攝氏度變性5分鐘，50-60攝氏度引物退火45秒，72攝氏度引物延伸90秒，30個循環(huán)后，72攝氏度延伸5分鐘結(jié)束反應(yīng)。該PCR結(jié)果如圖2所示，表明擴增得到1.1kb的肝素酶I基因片段。圖2中，1-6分別為引物退火溫度為50、51、53、55、58或59℃擴增結(jié)果，7為分子量marker 15kb，箭頭所指處為1.1kb目標(biāo)片斷。
將pMal-p2x或pMal-c2x載體(購自NEB公司))和PCR產(chǎn)物分別用BamHI和PstI雙酶切，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化JM109，以5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC3’和5’GCTTCTGCAGTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’為引物，通過菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，提取可得到1.1kb PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒通過BamHI和PstI雙酶切驗證。將通過BamHI和PstI雙酶切得到1.1kb片段的質(zhì)粒進行測序，將含有具有序列表中序列2的核苷酸序列的肝素酶I融合蛋白編碼基因MBP-HepA的質(zhì)粒命名為pMal-hepA。
將pMal-hepA轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1，得到兩株含正確連接的重組質(zhì)粒載體菌株，其中一株命名為重組大腸桿菌TB1(pMal-hepA)。
2、肝素酶I融合蛋白MBP-HepA的表達將重組大腸桿菌TB1(pMal-hepA)在LB培養(yǎng)基(含100μg/ml Amp)37℃培養(yǎng)3小時，加入1mM IPTG，于15℃，200rpm進行誘導(dǎo)培養(yǎng)21小時，得到的培養(yǎng)液在4℃，10000rpm離心10min，收集菌體，用pH為7.0濃度為0.017M(0.017mol/L)含0.2M NaCl的Tris緩沖液洗滌菌體2次，按每2ml菌液離心得到的菌體加入1mlTris緩沖液的比例，將菌體懸浮在相同的緩沖液中，在冰浴中超聲破碎(輸出功率為300W，每次超聲3秒和間歇3秒的處理99次)。細胞破碎液在4℃，13000rpm離心30min，取上清液得無細胞粗提酶液。測定粗提酶液的酶活力，酶活的檢測采用232nm的光吸收法，1IU的酶活的定義為30℃每小時降解1mg底物肝素所需要的蛋白量。結(jié)果表明比活力為10.69IU/mg培養(yǎng)液。
3、肝素酶I融合蛋白MBP-HepA的一步純化用pH為7.0濃度為0.017M含0.2MNaCl的Tris緩沖液平衡2ml的直鏈淀粉(amylose)親和分離柱，上清液以0.5ml/min的速度通過親和柱，再用含10mM麥芽糖的10mM的Tris緩沖液洗脫，收集具有酶活性部分，得2ml酶液。
4、肝素酶I融合蛋白MBP-HepA活力的測量酶活的檢測采用232nm的光吸收法，1IU的酶活的定義為30℃每小時降解1mg底物肝素所需要的蛋白量。取肝素底物溶液0.5ml，加入步驟3中純化的酶液，其它體積以Tris緩沖液補充，最終的反應(yīng)液體積為1.5ml，測單位時間內(nèi)在232nm的吸光度變化ΔA232。消光系數(shù)ε＝3800M-1。測定結(jié)果表明純化得到的麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白比活力為15.57IU/mg培養(yǎng)液。經(jīng)過步驟3的一步純化得到純度為95％的MBP-HepA。
實施例2、低分子量肝素寡糖的制備1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作低分子量肝素寡糖平均分子量的測定方法如下以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(sigma)，通過凝膠過濾層析(TSK-GEL G2000SW，TOSOH公司，日本)，得到分子量與停留時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3，(標(biāo)準(zhǔn)品為葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，分子量分別為1000Da，5000Da，12000Da，25000Da)。其中，該凝膠過濾層析中所用的緩沖液為含質(zhì)量百分含量為0.05％的NaN3，pH為7.0濃度為0.1M的NH4COOCH3緩沖液；該緩沖液的流速為0.5ml/min。
平均分子量的計算公式為Mr=Σi(MwiAi)ΣiAi---(1)]]>其中，Mr為平均分子量，Mwi為各峰對應(yīng)物質(zhì)的分子量，Ai為各峰面積。
2、生產(chǎn)低分子量肝素以商品肝素(北京鼎國，效價150U/mg)為原料，所用的肝素溶液為將商品肝素加入到含3.5mM Ca(CH3COO)2，0.05％NaN3，pH7.0的濃度為0.1M的NH4COOCH3緩沖液中，使肝素的濃度為25g/l。取495μl肝素溶液，加入5μl一步純化的MBP-HepA酶液(18.6IU/ml)，反應(yīng)液于15℃搖床上分別反應(yīng)6小時和9小時后，此時吸光度值A(chǔ)232分別為0.638，和0.908，于100℃的金屬浴中3-5min終止酶反應(yīng)。反應(yīng)過程中每隔0.5h，取15μl反應(yīng)液，加入1485μl 30mM的HCl終止反應(yīng)，測定A232以監(jiān)測反應(yīng)過程。反應(yīng)液經(jīng)截留分子量為10000的超濾膜濾除去大分子肝素和酶蛋白后，利用凝膠過濾層析(TSK-GEL G2000SW，TOSOH公司，日本)分析其分子量分布。該凝膠過濾層析中所用的緩沖液為含質(zhì)量百分含量為0.05％的NaN3，pH為7.0濃度為0.1M的NH4COOCH3緩沖液，該緩沖液的流速為0.5ml/min。用紫外檢測器測定A232，分別得到了6h反應(yīng)液與9h反應(yīng)液的色譜圖，反應(yīng)6h得到的肝素寡糖混合物的色譜圖(圖4)中出現(xiàn)了三個主要峰，根據(jù)分子量與停留時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出各峰對應(yīng)的分子量(如表1)。從表1可以看出，在混合物中，分子量小于8000的峰主要有兩個，所占的峰面積百分比18.13％和31.15％，兩者總和占總峰面積的一半。根據(jù)公式(1)，得出反應(yīng)6h得到的肝素寡糖的平均分子量為6176.7。
表1反應(yīng)6h后的圖4的肝素寡糖色譜圖中各峰對應(yīng)的主要參數(shù)

反應(yīng)9h得到的肝素寡糖混合物的色譜圖(圖5)中出現(xiàn)了兩個主要峰，各峰對應(yīng)的分子量如表2所示。從表2可以看出，這兩個峰的分子量都小于8000，分別為7202.7、3933.5，所占的峰面積分別為37.51％和61.11％。根據(jù)公式(1)，得出反應(yīng)9h得到的肝素寡糖的平均分子量約為5176.8。
表2反應(yīng)9h后的圖5肝素寡糖色譜圖中各峰對應(yīng)的參數(shù)

而對于反應(yīng)0.5h得到的肝素寡糖混合物的色譜圖(圖6)，出現(xiàn)了四個主要峰，而且出峰時間比圖4、5都要早，表明降解反應(yīng)不充分，一些分子量較大的肝素寡糖未降解成分子量更低的肝素寡糖。所以控制酶反應(yīng)時間是得到理想平均分子量的肝素寡糖混合物的主要因素之一。
本實施例說明MBP-HepA能和商品肝素酶一樣有效的降解肝素，通過控制酶降解反應(yīng)時間，能夠得到具有理想平均分子量的低分子量肝素寡糖。
序列表<160>2<210>1<211>756<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys1 5 10 15Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr20 25 30Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe35 40 45Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala50 55 60His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile65 70 75 80Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp85 90 95Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys115 120 125Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly130 135 140Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro145 150 155 160Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys165 170 175Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly180 185 190Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp195 200 205Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala210 215 220Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys225 230 235 240Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser245 250 255Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro260 265 270Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp275 280 285Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala305 310 315 320Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln325 330 335Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala340 345 350Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn355 360 365Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile370 375 380Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Gly Ser Gln Gln Lys Lys Ser Gly Asn385 390 395 400lle Pro Tyr Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Lys Gln Lys Ala405 410 415Ile Ile Asp Asn Lys Trp Val Ala Val Gly Ile Asn Lys Pro Tyr Ala420 425 430Leu Gln Tyr Asp Asp Lys Leu Arg Phe Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg435 440 445Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser Leu Glu Gly Tyr Ala Ala Gly450 455 460Glu Thr Lys Gly Arg Thr Glu Leu Ser Tyr Ser Tyr Ala Thr Thr Asn465 470 475 480Asp Phe Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val Tyr Gln Asn Ala Gln Lys Leu485 490 495Lys Thr Val Tyr His Tyr Gly Lys Gly Ile Cys Glu Gln Gly Ser Ser
500 505 510Arg Ser Tyr Thr Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Phe Pro Asp Asn515 520 525Ala Thr Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Ala Pro Ser Arg Thr Leu530 535 540Val Ala Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys Thr Leu Ser Ile Glu Glu Phe545 550 555 560Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe Lys Lys Asn Ile Ala His Asp565 570 575Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Val Ala Gly580 585 590Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gln Gly Gly Tyr Pro Thr Leu Ala595 600 605Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Asp Arg610 615 620Gln Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn Pro Glu Asn625 630 635 640Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr Ser Thr Ile645 650 655Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gln Phe Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr660 665 670Phe Asp Val Ala Ile Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys Glu Ala Asn Thr675 680 685Ile Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr Tyr Thr Lys Asn690 695 700
Lys Lys Pro Gln Lys Ala His Ile Val Asn Gln Gln Glu Ile Leu Ile705 710 715 720Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg725 730 735Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Tyr Ser740 745 750Glu Thr Ala Arg755<210>2<211>2271<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat120ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt180atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc240accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac300aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa360gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg420
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1.一種制備低分子量肝素的方法，是以肝素為底物，用麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解肝素，得到低分子量肝素；所述麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白，是具有序列表中的SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白按照以下方法制備將質(zhì)粒pMal-hepA轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1，得到含有pMal-hepA的重組大腸桿菌TB1(pMal-hepA)，培養(yǎng)重組大腸桿菌TB1(pMal-hepA)，誘導(dǎo)表達，得到麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白；所述pMal-hepA是將具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列的所述麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白編碼基因插入pMal-p2x或pMal-c2x載體的BamHI和PstI識別位點間得到的重組載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述肝素的初始濃度為1-100g/l；優(yōu)選為25g/l。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述用于溶解肝素的溶劑為含3.5mMCa(CH3COO)2和0.05％ NaN3的pH為6.5-8.0濃度為0.1M的NH4COOCH3緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量為1.875-187.5IU/g底物；優(yōu)選為7.5IU/g底物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中，反應(yīng)溫度為10-45℃，優(yōu)選為15-20℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中，反應(yīng)時間為6-12小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)時間為9-12小時；優(yōu)選為9小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中，按照以下方法純化低分子量肝素終止反應(yīng)后將混合物進行截留分子量為10000Da的超濾，將得到的濾液利用TSK-GEL G2000SW柱進行凝膠過濾層析，收集保留時間為18-20分鐘的洗脫峰，得到低分子量肝素；所述凝膠過濾層析中所用的緩沖液為含質(zhì)量百分含量為0.05％的NaN3，pH為7.0濃度為0.1M的NH4COOCH3緩沖液，所述緩沖液的流速為0.5ml/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備低分子量肝素的方法。本發(fā)明的制備低分子量肝素的方法，是以肝素為底物，用麥芽糖結(jié)合蛋白－肝素酶I融合蛋白降解肝素，得到低分子量肝素；所述麥芽糖結(jié)合蛋白－肝素酶I融合蛋白，是具有序列表中的SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法采用具有較高酶活的麥芽糖結(jié)合蛋白－肝素酶I融合蛋白制備肝素，通過控制降解時間，得到具有理想平均分子量和分子量分布較窄的低分子量肝素寡糖。本發(fā)明為低分子量肝素的酶法工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的途徑。
文檔編號C08B37/00GK1712418SQ200510088970
公開日2005年12月28日 申請日期2005年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月4日
發(fā)明者邢新會, 況瑩, 陳銀, 羅明芳 申請人:清華大學(xué)