專利名稱：一種聚合度為2～8的低聚木糖各組分的制備分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)中采用物理方法制備分離低聚木糖的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低聚木糖是指主要由2～8個木糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成的低聚糖。與其它功能性低聚糖相比，低聚木糖具有不被人和動物消化酶系統(tǒng)所分解、對腸道雙歧桿菌有高選擇性增殖效果、極高的酸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性、與食物或飼料的配伍性好等優(yōu)良特性。低聚木糖可作為促進(jìn)腸道雙歧桿菌增殖的因子，廣泛用作人體保健食品添加劑和動物飼料添加劑等。
將富含木聚糖的植物纖維原料(如玉米芯、甘蔗渣、樺木、楊木等)提取獲得木聚糖后，用生物或化學(xué)的方法進(jìn)行催化降解，可將木聚糖降解制得低聚木糖。CNZL 02112568.6《一種植物纖維原料酶降解制備低聚木糖的方法》提供了一種將木聚糖經(jīng)酶降解制備功能性食品添加劑低聚木糖的方法，其特征是以植物纖維原料提取的木聚糖為原料，以里氏木霉木聚糖酶進(jìn)行降解得到聚合度為2～5的低聚木糖產(chǎn)品；CN 200410065146.0《木聚糖高溫降解制備低聚木糖的方法》提供了一種用高溫降解工藝制備聚合度為2～10的低聚木糖的方法。也有選用其它細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母菌等制備木聚糖酶之后，將木聚糖經(jīng)酶降解制備低聚木糖的技術(shù)報(bào)道。
但是，迄今為止的技術(shù)報(bào)道，制備的都是低聚木糖各組分的混合物。美國某公司雖有木二糖產(chǎn)品出售，但價格昂貴，且制備、分離工藝并不對外公開。其他單組分低聚木糖目前尚無商品出售，也未見制備、分離低聚木糖各組分的系統(tǒng)技術(shù)報(bào)道。
低聚木糖各組分的制備是其生物活性研究的關(guān)鍵。低聚木糖的生物活性雖然已被證實(shí)，但對其各組分生物活性的研究在國內(nèi)外尚屬空白，這使得人們單純以低聚木糖總含量作為產(chǎn)品質(zhì)量的衡量指標(biāo)并不全面。因此，制備分離出低聚木糖的各組分，研究各組分增殖雙歧桿菌能力的相對大小，探討雙歧桿菌代謝低聚木糖各組分的規(guī)律和機(jī)理，對于高活性低聚木糖產(chǎn)品的研究與開發(fā)，制定適當(dāng)?shù)牡途勰咎钱a(chǎn)品衡量指標(biāo)，均具有重要的指導(dǎo)作用和科學(xué)意義。
低聚木糖各組分的制備也是低聚木糖產(chǎn)品檢測的需要。由于國內(nèi)外市場上沒有木二糖以外的標(biāo)準(zhǔn)品出售，無法對低聚木糖產(chǎn)品中的各組分進(jìn)行定性和定量檢測，使得低聚木糖的含量無法準(zhǔn)確計(jì)算，也無法科學(xué)制定該類產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是尋找一種低聚木糖各組分的高效制備分離方法，為低聚木糖的生物活性研究和產(chǎn)品質(zhì)量檢測提供單組分低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)樣品，即從聚合度為2～8的低聚木糖混合物中分別獲得木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖等。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案為采用超濾和多次凝膠層析法，將多組分低聚木糖混合物中的木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖分離，從而制得聚合度分別為2～8的低聚木糖單組分產(chǎn)品。其特征在于a.用截留分子量為5000的超濾膜，將低聚木糖和未降解的高聚物分離，獲得純度較高的聚合度為2～8的低聚木糖混合物；b.將超濾得到的聚合度為2～8的低聚木糖混合物，用聚丙烯酰胺凝膠為層析介質(zhì)在層析分離柱上進(jìn)行多次分離。
即可獲得木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖的低聚木糖單組分產(chǎn)品。
用聚丙烯酰胺凝膠在層析分離柱上進(jìn)行分離的次數(shù)，一般依產(chǎn)品的純凈度要求而定，當(dāng)產(chǎn)品的純凈度要求低于90％時，層析分離1～2次即可。
詳細(xì)制備分離過程、制備分離材料和制備分離參數(shù)，參見實(shí)施例。
四

圖1為低聚木糖層析洗脫圖譜。層析介質(zhì)為聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel P-4)，脫氣超純水洗脫，洗脫速度0.05ml/min，示差折光檢測器在線檢測。峰1是木糖(單糖)，峰2～8分別是聚合度為2～8的低聚木糖。
圖2為聚合度2～8的低聚木糖各組分分別進(jìn)行兩次制備分離后的洗脫圖譜。層析介質(zhì)為聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel P-2)。A～G分別為聚合度為2～8的低聚木糖各組分。
圖3為木六糖的高效液相色譜和電噴霧電離質(zhì)譜分析圖譜。其中，A是木六糖的層析兩次制備分離圖譜，B是木六糖的高效液相色譜分析圖譜，C是木六糖的電噴霧電離質(zhì)譜圖譜。
木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木七糖和木八糖的高效液相色譜和電噴霧電離質(zhì)譜分析圖譜與圖3類似，故未予羅列。
五具體實(shí)施例方式
多組分低聚木糖混合物的制取低聚木糖的制取方法可參見CNZL 02112568.6《一種植物纖維原料酶降解制備低聚木糖的方法》，采用該法獲得的多組分低聚木糖混合物中，主要成分為聚合度為2～5的低聚木糖，木六糖、木七糖和木八糖的成分較少。
當(dāng)采用CN 200410065146.0《木聚糖高溫降解制備低聚木糖的方法》時，可以獲得聚合度為2～10的多組分低聚木糖混合物。
還可以用其它細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母菌等制備木聚糖酶之后，將木聚糖經(jīng)酶降解制備獲得多組分低聚木糖混合物。
不論采用何種制取方法獲得的多組分低聚木糖混合物，均可使用以下典型實(shí)施例中的方法進(jìn)行制備分離。
實(shí)施例一制備分離工藝主要由超濾和凝膠層析兩個過程構(gòu)成a.超濾——多組分低聚木糖混合物中往往含有少量的高聚合度組分，因此必須將得到的低聚木糖溶液用超濾方法，將聚合度為8以下的低聚木糖與其他高聚合度組分分離。超濾設(shè)備用美國Millipore公司生產(chǎn)的Pellicon切向流超濾裝置，超濾膜的過濾面積為0.5m2，截留分子量為5000。超濾過程中，截留液返回到母液瓶中循環(huán)使用，透過液收集到容器中。間歇添加蒸餾水到母液瓶中，以保證超濾正常進(jìn)行。當(dāng)添加的蒸餾水體積為母液的4～5倍時，母液中90％以上的聚合度為8以下的低聚木糖被收集到透過液中。
b.凝膠層析——超濾得到的低聚木糖溶液經(jīng)濃縮后，采用快速液相層析系統(tǒng)(KTA FPLC系統(tǒng)，瑞典Pharmacia Biotech公司)分離。層析柱為XK 50/60(直徑50mm，長度60cm)，層析介質(zhì)為聚丙烯酰胺凝膠(美國Bio-Rad公司，Bio-Gel P-4)，柱溫48℃，脫氣超純水洗脫，洗脫速度0.05ml/min，進(jìn)樣量2.0ml，RID-10A型示差折光檢測器和280nm紫外線同時在線檢測。洗脫圖譜如附圖1所示。高效液相色譜分析表明，峰1是木糖(單糖)，峰2～8分別是聚合度為2～8的低聚木糖。
收集到的峰2到峰8各組分溶液，即為木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖的低聚木糖單組分溶液，但其純度較低(純度一般低于85％)。
實(shí)施例二制備分離工藝仍由超濾和凝膠層析兩個主要過程構(gòu)成，但為了提高成品的純度，可以進(jìn)行兩次凝膠層析a.超濾——同實(shí)施例1。
b.凝膠層析1——同實(shí)施例1。
c.凝膠層析2——將凝膠層析1中收集到的峰2到峰8各組分溶液，經(jīng)濃縮后分別進(jìn)行兩次凝膠層析，以得到純度更高的低聚木糖各組分。制備分離條件同凝膠層析1，但層析柱為XK16/100(直徑16mm，長度100cm)，層析介質(zhì)為Bio-Gel P-2。制備分離得到的各組分層析圖譜見附圖2。
將兩次凝膠層析制備分離得到的低聚木糖各組分作高效液相色譜(HPLC)分析，色譜儀的操作條件如下糖柱Bio-Rad Aminex HPX-42A(300×7.8mm)保護(hù)柱Micro-Guard Carbo-P和Micro-Guard Deashing Cartridges柱溫85℃流動相高純水，超聲波脫氣；流速0.6ml/min檢測器差示折光檢測器(RI)對兩次凝膠層析制備分離得到的低聚木糖各組分作電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析。操作條件如下
電噴霧電離質(zhì)譜儀美國Finnigan公司，LCQTM型電噴霧電壓4.55KV毛細(xì)管溫度200℃進(jìn)樣速度200μL/min流動相甲醇數(shù)據(jù)采集方式為Full Scan，m/z＝200～2000，正負(fù)離子同時收集。
高效液相色譜和電噴霧電離質(zhì)譜檢測結(jié)果表明，經(jīng)兩次凝膠層析得到的各組分分別為聚合度為2～8低聚木糖，即木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖，純度均為90％以上。附圖3給出了木六糖的檢測圖譜。其中，A是木六糖的兩次凝膠層析制備分離圖譜；B是木六糖的高效液相色譜分析圖譜，表明該組分純度高；C是木六糖的電噴霧電離質(zhì)譜圖譜，該組分主要有833、1238、1643三個峰，分別是[X6+Na]+離子、[3X6+2Na]2+離子和[2X6+Na]+離子(木六糖分子量為810，Na原子量為23)。
因此，采用本發(fā)明提供的方法，可以將低聚木糖各組分進(jìn)行有效的制備分離，可以為低聚木糖的生物活性研究和產(chǎn)品質(zhì)量檢測提供系列的單組分低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)樣品。
權(quán)利要求
1.一種將聚合度為2～8的低聚木糖混合物中的木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖制備分離的方法，其特征在于a.用截留分子量為5000的超濾膜，將低聚木糖和未降解的高聚物分離，獲得純度較高的聚合度為2～8的低聚木糖混合物；b.將超濾得到的聚合度為2～8的低聚木糖混合物，用聚丙烯酰胺凝膠為層析介質(zhì)在層析分離柱上進(jìn)行多次制備分離。
全文摘要
一種將聚合度為2～8的低聚木糖中的木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖制備分離的方法，其特征在于先用截留分子量為5000的超濾膜將低聚木糖和未降解的高聚物分離，再將超濾得到的低聚木糖混合物用聚丙烯酰胺凝膠為層析介質(zhì)在層析分離柱上進(jìn)行多次制備分離。采用本方法，可以將低聚木糖各組分進(jìn)行有效的制備分離，純度達(dá)到90％以上，可以為低聚木糖的生物活性研究和產(chǎn)品質(zhì)量檢測提供系列的單組分低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)樣品。
文檔編號C08B37/00GK1847254SQ200510094118
公開日2006年10月18日 申請日期2005年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者余世袁, 勇強(qiáng), 徐勇, 陳牧, 宋向陽 申請人:南京林業(yè)大學(xué)