專利名稱：基于包含兩親性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物藥物載體的生物活性劑傳遞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種傳遞系統(tǒng)和一種使用聚合物藥物載體細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及一種使用由如下(a)和(b)形成的聚合物藥物載體而細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的方法(a)包含親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的末端羥基基團(tuán)，以及(b)在聚合物末端具有至少一個(gè)末端羧基基團(tuán)的聚乳酸衍生物。
背景技術(shù)：
為了達(dá)到生物活性劑的希望的治療作用，應(yīng)使適量的被給予藥物進(jìn)入機(jī)體的靶細(xì)胞中。為了增加藥物的細(xì)胞內(nèi)在化，應(yīng)使藥物以合適濃度在靶組織中保持希望的時(shí)間；另外，應(yīng)使藥物進(jìn)入組織的靶細(xì)胞中。組織中的高藥物濃度可以通過呈現(xiàn)長血液循環(huán)時(shí)間的制劑而實(shí)現(xiàn)。因此，進(jìn)行了大量研究以開發(fā)利用具有長循環(huán)時(shí)間的納米顆粒藥物載體的藥物傳遞系統(tǒng)，包括脂質(zhì)體和聚合物膠束。
已經(jīng)提示有許多方法可增強(qiáng)生物活性劑的細(xì)胞內(nèi)攝取。也已經(jīng)描述了用于生物活性劑如寡核苷酸的細(xì)胞內(nèi)傳遞的傳遞載體如脂質(zhì)體(Felgner等的美國專利No.5,264,618(1993)；Eppstein等的美國專利No.4,897,355(1990)；及Wang等，Proc.Nat.Acad.Sci.847851-7855(1987)；美國專利No.5,759,519(1998))。然而，因?yàn)榇嬖诘桶饴省⑺幬锊环€(wěn)定性、快速藥物滲漏、及貯存穩(wěn)定性不佳等問題，脂質(zhì)體作為藥物載體的應(yīng)用受到限制。小的分子表面活性劑膠束(micelle)當(dāng)被給予機(jī)體內(nèi)后由體液稀釋時(shí)易于解離，因此難以使其發(fā)揮作為藥物載體的作用。
近年來，進(jìn)行了關(guān)于聚合物膠束的制備、鑒定和藥物應(yīng)用方面的研究。這些研究見V.Torchilin于Journal of Controlled Release 73(2001)pp.137-172中的綜述。聚合物膠束的特征是在水性介質(zhì)中的核心—?dú)そY(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是由具有疏水性(核心)和親水性(殼)鏈段的兩親性嵌段共聚物形成的。水溶性不佳的藥物被包封于該膠束的疏水性核心中。已經(jīng)有許多研究旨在開發(fā)具有親水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B、A-B-A或者B-A-B嵌段共聚物。對于用作藥物載體，優(yōu)選疏水性B嵌段(膠束內(nèi)部核心嵌段)包含可生物降解的聚合物如聚-DL-丙交酯、聚-ε-己內(nèi)酯或者聚(γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯(aspartate))，親水性A嵌段(膠束外部殼嵌段)是能與血漿蛋白和細(xì)胞膜相互作用的聚合物，如聚乙二醇(PEG)。
聚合物膠束之吸引人的特性是，其可以避免藥物在體內(nèi)被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)(RES)或者單核吞噬系統(tǒng)(MPS)攝取，并因此可以在血液中長時(shí)間循環(huán)。這個(gè)優(yōu)點(diǎn)來自膠束的結(jié)構(gòu)。兩親性嵌段共聚物的親水性部分形成外殼并暴露于體液，因此有效地保護(hù)膠束免于與細(xì)胞膜和血液中血漿蛋白相互作用[V.Torchilin等，Advanced DrugDelivery Reviews 16(1995)pp.141-155]。
R.Savic等示出了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，證明由聚(己內(nèi)酯)-b-聚(環(huán)氧乙烷)嵌段共聚物形成的膠束可以通過利用在聚合物PCL末端共價(jià)附著四甲基羅丹明-5-羰基疊氮(TMRCA)的膠束將生物活性劑傳遞至活細(xì)胞中[R.Savic等，Sceince 300(2003)pp.615-618]。然而，熒光膠束僅可以在胞質(zhì)中檢測到，而在細(xì)胞核區(qū)室中檢測不到，因此生物活性劑如DNA結(jié)合抗癌藥物不適合與膠束一起應(yīng)用。
綜上所述，需要開發(fā)可以將生物活性劑傳遞至靶細(xì)胞中的聚合物膠束或者納米顆粒。因此，本發(fā)明提供一種使用聚合物膠束或者納米顆粒藥物載體的靶向細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用由包含如下(a)和(b)的組合物形成的聚合物藥物載體來細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的方法(a)包含親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段的末端羥基基團(tuán)由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代，以及(b)在聚合物末端具有至少一個(gè)末端羧基基團(tuán)的聚乳酸衍生物。任選地，0.01-10當(dāng)量的二價(jià)或者三價(jià)金屬離子與1當(dāng)量的所述聚乳酸衍生物的羧基末端基團(tuán)結(jié)合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的傳遞系統(tǒng)，其包含在水溶液中的生物活性劑及所述生物活性劑包封于其中的聚合物藥物載體，其中所述聚合物藥物載體是由包含如下(a)和(b)的聚合物組合物制備的(a)包含親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的末端羥基基團(tuán)，(b)在聚合物末端具有至少一個(gè)羧基的聚乳酸衍生物；其中當(dāng)所述藥物載體與細(xì)胞接觸時(shí)，包封于該聚合物藥物載體中的所述生物活性劑可以大量傳遞至細(xì)胞中。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的組合物，其包含在水溶液中的生物活性劑和所述生物活性劑包封于其中的聚合物藥物載體，其中所述聚合物藥物載體是由包含如下(a)和(b)的聚合物組合物制備的(a)包含親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的末端羥基基團(tuán)，以及(b)在聚合物末端具有至少一個(gè)羧基基團(tuán)的聚乳酸衍生物；其中當(dāng)藥物載體與細(xì)胞接觸時(shí)，包封于該聚合物藥物載體中的所述生物活性劑可以大量傳遞至所述細(xì)胞中。
本發(fā)明涉及可以將生物活性劑傳遞至靶細(xì)胞中的聚合物藥物載體。


圖1是在給予本發(fā)明的組合物之后，生物活性劑自體液中的細(xì)胞內(nèi)在化示意圖。
圖2A示出在用藥物組合物處理多柔比星(doxorubicin)敏感細(xì)胞(MES-SA)之后，藥物在其中內(nèi)在化的細(xì)胞數(shù)。
圖2B示出在用藥物組合物處理多柔比星抗性細(xì)胞(MES-SA/Dx-5)之后，藥物在其中內(nèi)在化的細(xì)胞數(shù)。
圖3A示出在用藥物組合物處理多柔比星敏感細(xì)胞(MES-SA)之后，通過FACS檢測的熒光強(qiáng)度。
圖3B示出在用藥物組合物處理多柔比星抗性細(xì)胞(MES-SA/Dx-5)之后，通過FACS檢測的熒光強(qiáng)度。
圖4A示出在用含有多柔比星的組合物(組合物1，右側(cè))和常規(guī)溶液制劑(左側(cè))處理多柔比星敏感細(xì)胞(MES-SA)之后2小時(shí)獲得的共焦顯微鏡圖象。
圖4B示出在用含有多柔比星的組合物(組合物1)和常規(guī)溶液制劑處理多柔比星敏感細(xì)胞(MES-SA)之后8小時(shí)獲得的共焦顯微鏡圖象。
圖4C示出在用含有多柔比星的組合物(組合物1)和常規(guī)溶液制劑處理多柔比星抗性細(xì)胞(MES-SA/Dx-5)之后2小時(shí)獲得的共焦顯微鏡圖象。
圖4D示出在用含有多柔比星的組合物(組合物1)和常規(guī)溶液制劑處理多柔比星抗性細(xì)胞(MES-SA/Dx-5)之后8小時(shí)獲得的共焦顯微鏡圖象。
圖4E示出在用含有表柔比星(epirubicin)的組合物(組合物6)和常規(guī)溶液制劑處理表柔比星敏感細(xì)胞(MCF-7)之后2小時(shí)獲得的共焦顯微鏡圖象。
圖4F示出在用含有表柔比星的組合物(組合物6)和常規(guī)溶液制劑處理表柔比星敏感細(xì)胞(MCF-7)之后8小時(shí)獲得的共焦顯微鏡圖象。
圖4G示出在用含有表柔比星的組合物(組合物6)和常規(guī)溶液制劑處理表柔比星抗性細(xì)胞(MCF-7/ADR)之后2小時(shí)獲得的共焦顯微鏡圖象。
圖4H示出在用含有表柔比星的組合物(組合物6)和常規(guī)溶液制劑處理表柔比星抗性細(xì)胞(MCF-7/ADR)之后8小時(shí)獲得的共焦顯微鏡圖象。
圖5A示出在用藥物組合物(0.1μg/ml)處理多柔比星敏感細(xì)胞(MES-SA)之后細(xì)胞的生存力。
圖5B示出在用藥物組合物(1.0μg/ml)處理多柔比星抗性細(xì)胞(MES-SA/Dx-5)之后細(xì)胞的生存力。
圖6示出在大鼠中經(jīng)靜脈內(nèi)給予藥物組合物之后隨著時(shí)間的流逝血漿中的藥物濃度。
具體實(shí)施例方式
在揭示和描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文揭示的特定構(gòu)型、方法步驟和材料，這些構(gòu)型、方法步驟和材料可以變化。還應(yīng)理解本文應(yīng)用的術(shù)語只是用于描述特定的實(shí)施方案，無限制本發(fā)明范圍之意，本發(fā)明范圍僅受所附權(quán)利要求書及其等價(jià)物(equivalents)的限制。
必須注意在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式除非特別指出則也包括復(fù)數(shù)指示對象。因此，例如提及含有“末端基團(tuán)”的聚合物包括兩或多個(gè)這樣的基團(tuán)。
在對本發(fā)明進(jìn)行的描述和權(quán)利要求中，如下術(shù)語根據(jù)下述解釋應(yīng)用。
如本文所用，術(shù)語“生物活性劑”是指一種有機(jī)化合物或者藥物，其具有希望的生物學(xué)活性或功能，即在體內(nèi)的生物學(xué)作用或生理學(xué)作用。例如，由治療劑組成的生物活性劑可以改變細(xì)胞功能，如基因功能?；蛘?，由診斷劑如磁共振成像(“MRI”)或者計(jì)算機(jī)化斷層成像(“CT”)劑組成的生物活性劑具有增強(qiáng)組織和/或器官診斷圖象的生物學(xué)功能。
如本文所用，術(shù)語“可生物降解的”或者“生物降解”定義為通過增溶水解或者通過生物學(xué)形成的實(shí)體的作用，所述材料轉(zhuǎn)變?yōu)檩^不復(fù)雜的中間產(chǎn)物或者終產(chǎn)物。所述生物學(xué)形成的實(shí)體可以是酶或者其它生物體產(chǎn)物。
如本文所用，術(shù)語“生物相容的”是指對生物體不引起副作用的材料或所述材料通過增溶水解或者生物學(xué)形成的實(shí)體的作用形成中間產(chǎn)物或者終產(chǎn)物。所述生物學(xué)形成的實(shí)體可以是酶或者其它生物體產(chǎn)物。
“聚(丙交酯)”或者“PLA”是指衍生自乳酸縮合或者丙交酯的開環(huán)聚合的聚合物。術(shù)語“丙交酯”和“乳酸酯”可互換應(yīng)用。
現(xiàn)在參考示例性實(shí)施方案，并且本文使用特定的語言描述這些實(shí)施方案。應(yīng)理解這些解釋無任何限制本發(fā)明范圍之意。相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員對本文所述的本發(fā)明特征加以變化和進(jìn)一步修改，及本文所述的本發(fā)明的原理的其它應(yīng)用，均被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明提供一種使用聚合物藥物載體細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的方法，所述聚合物藥物載體是由如下聚合物組合物形成，所述聚合物組合物包含含有親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段共聚物及聚乳酸衍生物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的末端羥基基團(tuán)，而所述聚乳酸衍生物在該聚合物末端具有至少一個(gè)末端羧基基團(tuán)。
本發(fā)明還提供了一種使用藥物載體細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的方法，所述藥物載體是由如下聚合物組合物形成，所述聚合物組合物包含含有親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物及相對于1當(dāng)量的聚乳酸衍生物羧基末端基團(tuán)0.01-10當(dāng)量的二價(jià)或者三價(jià)金屬離子，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚琥珀酸或者膽固醇琥珀酸基團(tuán)取代的末端羥基基團(tuán)，所述聚乳酸衍生物在該聚合物末端具有至少一個(gè)末端羧基基團(tuán)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的傳遞系統(tǒng)，其包含在水溶液中的生物活性劑及所述生物活性劑包封于其中的聚合物藥物載體，其中所述聚合物藥物載體是由包含如下(a)和(b)的聚合物組合物制備的(a)包含親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的末端羥基基團(tuán)，以及(b)聚乳酸衍生物，在該聚合物末端具有至少一個(gè)羧基基團(tuán)；其中當(dāng)所述藥物載體與細(xì)胞接觸時(shí)，包封于該聚合物藥物載體中的所述生物活性劑可以大量傳遞至所述細(xì)胞中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑被大量、優(yōu)選以比沒有所述聚合物藥物載體的情況中更有效的方式傳遞至細(xì)胞中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供可將生物活性劑傳遞至靶細(xì)胞的聚合物藥物載體。
特別地，本發(fā)明提供一種細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的方法，其包括如下步驟a)選擇至少一種生物活性劑；b)制備包含含有親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物組合物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的末端羥基基團(tuán)，而所述聚乳酸衍生物在該聚合物末端具有至少一個(gè)羧基基團(tuán)；c)將所述聚合物組合物與所述生物活性劑在溶劑中混合及溶解，并蒸發(fā)所述溶劑；d)加入水溶液以在該溶液中形成所述生物活性劑包封于其中的聚合物藥物載體；和e)將所述藥物載體與細(xì)胞接觸以促進(jìn)所述生物活性劑傳遞至所述細(xì)胞中。
選擇至少一種生物活性劑本發(fā)明的生物活性劑可以是發(fā)揮希望的生物學(xué)活性的任何有機(jī)化合物或者任何藥物，其包括但不限于蛋白質(zhì)，激素如睪酮、雌二醇、雌激素、孕酮、醋酸去炎松、地塞米松等等，基因，多肽，寡核苷酸，核苷酸，抗體，藥物如抗癌劑、抗炎劑、抗真菌劑、抗生素、麻醉劑、抗高血壓劑、及治療糖尿病的劑、抗高脂血癥劑、抗病毒劑、Parkinson′s疾病治療劑、抗癡呆劑、止吐劑、免疫抑劑、抗?jié)儎?、輕瀉藥、抗瘧劑，及診斷顯影劑?？拱﹦├绨ㄗ仙即?、表柔比星、更生霉素、博來霉素、絲裂霉素、多西他賽、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、喜樹堿、依托泊苷、多柔比星、dausorubicin、伊達(dá)比星、ara-C、環(huán)孢霉素A等等，及其衍生物。
上述生物活性劑可以0.1～20∶80.0～99.9的重量比加入所述聚合物組合物中，以適當(dāng)?shù)匕庥谟蓛捎H性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物形成的膠束核心中。
制備聚合物組合物本發(fā)明的兩親性嵌段共聚物優(yōu)選是包含親水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B型雙嵌段共聚物或者B-A-B型三嵌段共聚物。所述兩親性嵌段共聚物當(dāng)被置于水相中時(shí)形成核心-殼型聚合物膠束，其中疏水性B嵌段形成核心，親水性A嵌段形成殼。優(yōu)選地，親水性A嵌段是選自如下組中的成員聚亞烷基二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺及其衍生物。更優(yōu)選地，親水性A嵌段是選自如下組中的成員單甲氧基聚乙二醇、單乙酰氧基聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯-共-丙烯二醇(polyethylene-co-propylene glycol)、及聚乙烯基吡咯烷酮。優(yōu)選地，親水性A嵌段的數(shù)均分子量為500-50,000道爾頓。更優(yōu)選地，親水性A嵌段的數(shù)均分子量為1,000-20,000道爾頓。
本發(fā)明的兩親性嵌段共聚物的疏水性B嵌段是選自以下組中的高度生物相容的和可生物降解的聚合物聚酯、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯和聚膦嗪。更優(yōu)選地，所述疏水性B嵌段是選自以下組中的一種或多種聚丙交酯、聚乙交酯、聚己內(nèi)酯、聚二氧六環(huán)-2-酮、聚乳酸-共-乙交酯、聚乳酸-共-二氧六環(huán)-2-酮、聚乳酸-共-己內(nèi)酯及聚乙醇酸-共-己內(nèi)酯。疏水性嵌段的末端基團(tuán)有羥基基團(tuán)，且疏水性B嵌段的羥基末端基團(tuán)由具有極佳疏水性的疏水性生育酚或膽固醇基團(tuán)取代，目的是增加疏水性B嵌段的疏水性同時(shí)保持其分子量。使用連接劑將生育酚或膽固醇基團(tuán)與疏水性B嵌段的末端羥基基團(tuán)化學(xué)結(jié)合，所述連接劑例如是二羧酸，如琥珀酸、丙二酸、戊二酸、己二酸。生育酚和膽固醇是具有環(huán)形結(jié)構(gòu)的生物相容的疏水性化合物，其可增加聚合物膠束的內(nèi)部疏水性，從而增強(qiáng)聚合物膠束的物理穩(wěn)定性。優(yōu)選地，兩親性嵌段共聚物的疏水性B嵌段的數(shù)均分子量為500-50,000道爾頓。更優(yōu)選地，兩親性嵌段共聚物的疏水性B嵌段的數(shù)均分子量為1,000-20,000道爾頓。
本發(fā)明的兩親性嵌段共聚物的親水性A嵌段與疏水性B嵌段的重量比優(yōu)選在3∶7至8∶2范圍內(nèi)，更優(yōu)選在4∶6至7∶3范圍內(nèi)。如果親水性A嵌段的含量太低，則聚合物在水溶液中不能形成聚合物膠束，如果其含量太高，則形成的聚合物膠束不穩(wěn)定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的兩親性嵌段共聚物可以由如下化學(xué)式表示R1’-O-[R3’]l’-[R4’]m’-[R5’]n’-C(＝O)-(CH2)x’-C(＝O)-O-R2’(I’)其中R1’是CH3-，H-[R5’]n’-[R4’]m’-，或者R2’-O-C(＝O)-(CH2)x’-C(＝O)-[R5’]n’-[R4’]m’-；R2’是生育酚或膽固醇；R3’是-CH2CH2-O-，-CH(OH)-CH2-，-CH(C(＝O)-NH2)-CH2-，或者 R4’是-C(＝O)-CHZ’-O-，其中Z’是氫原子或者甲基基團(tuán)；R5’是-C(＝O)-CHY”-O-，其中Y”是氫原子或者甲基基團(tuán)，-C(＝O)-CH2CH2CH2CH2CH2-O-，或者-C(＝O)-CH2OCH2CH2-O-；1’是4-1150的整數(shù)；m’是1-300的整數(shù)；n’是0-300的整數(shù)；X’是0-4的整數(shù)。
具有其羥基末端基團(tuán)由生育酚或膽固醇取代的疏水性嵌段的嵌段共聚物可以根據(jù)如下方法制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，將合適的連接劑例如二羧酸如琥珀酸、丙二酸、戊二酸或者己二酸引入生育酚或膽固醇的羥基基團(tuán)中，并使羧化的生育酚或膽固醇與疏水性B嵌段的羥基末端基團(tuán)化學(xué)結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)美國專利No.6,322,805所述方法，將包含單甲氧基聚乙二醇(mPEG；Mn＝2,000)和聚丙交酯(PLA；Mn＝1,750)的兩親性嵌段共聚物(mPEG-PLA)稱重，使用真空泵在120℃脫水，然后溶解于乙腈或者二氯甲烷中。向其中加入生育酚琥珀酸酯或者膽固醇琥珀酸酯，稱重二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)并分別作為引發(fā)劑和催化劑加入，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。由于在mPEG-PLA的末端-OH與疏水性化合物的-COOH之間形成二環(huán)己基脲(DCU)，反應(yīng)物變得不透明。24小時(shí)后，通過玻璃過濾器除去DCU，用鹽酸水溶液萃取并除去DMAP。向該純化產(chǎn)物溶液中加入MgSO4以除去任何殘余的水分，然后在己烷/二乙醚溶劑中形成沉淀以獲得結(jié)合了生育酚琥珀?；蛘吣懝檀肩牾；膬捎H性嵌段共聚物mPEG-PLA-生育酚或者mPEG-PLA-膽固醇(其中生育酚或膽固醇通過琥珀酸二酯與PLA結(jié)合)。過濾沉淀的聚合物，然后真空干燥獲得白色顆粒狀聚合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，不用任何催化劑而將羧化的疏水性化合物用草酰氯活化，并將其與mPEG-PLA的末端結(jié)合。即將生育酚(或者膽固醇)琥珀酸酯與草酰氯反應(yīng)，然后在室溫真空下除去過量的草酰氯。稱重mPEG-PLA并加入其中，反應(yīng)在100℃進(jìn)行12小時(shí)以獲得mPEG-PLA-生育酚(或者膽固醇)。將合成的聚合物溶解于乙腈或者二氯甲烷中，在己烷/二乙醚中沉淀，過濾。
在上述兩種制備方法中，可以使用生育酚(或膽固醇)丙二酸酯、生育酚(或膽固醇)戊二酸酯或者生育酚(或膽固醇)己二酸酯等代替生育酚(或膽固醇)琥珀酸酯。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用二氯化物作為連接劑將生育酚或膽固醇與mPEG-PLA末端結(jié)合。具體而言，稱重生育酚或膽固醇并使用真空泵在50℃脫水。向其中加入過量的連接劑，進(jìn)行反應(yīng)12小時(shí)。在反應(yīng)完成后，在100℃在真空下除去過量加入的連接劑。向其中加入稱重的mPEG-PLA，在100℃進(jìn)行反應(yīng)12小時(shí)。將合成的聚合物溶解于二氯甲烷中，在己烷/二乙醚中沉淀以獲得其中生育酚或膽固醇通過琥珀酸二酯與PLA結(jié)合的兩親性嵌段共聚物，即mPEG-PLA-生育酚或者mPEG-PLA-膽固醇。過濾沉淀的聚合物產(chǎn)物，在真空下干燥以獲得白色顆粒狀聚合物。該反應(yīng)中可以使用的連接劑可選自二氯化物如琥珀酰氯、草酰氯、丙二酰氯、戊二酰氯、己二酰氯。
本發(fā)明的聚乳酸衍生物的一或多個(gè)末端與至少一種羧酸或者羧酸鹽共價(jià)結(jié)合。本發(fā)明的聚乳酸衍生物的另一端可以與選自以下組中的官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合羥基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、癸酰氧基和棕櫚酰氧基。羧酸或者羧酸鹽在pH為4或更高的水溶液中作為親水性基團(tuán)，使得聚乳酸衍生物在其中形成聚合物膠束。當(dāng)本發(fā)明的聚乳酸衍生物溶解于水溶液中時(shí)，聚乳酸衍生物中存在的親水性和疏水性成分應(yīng)該是平衡的，以形成聚合物膠束。因此，本發(fā)明的聚乳酸衍生物的數(shù)均分子量優(yōu)選在500-2,500道爾頓范圍內(nèi)。聚乳酸衍生物的分子量可以通過在制備期間控制反應(yīng)溫度、時(shí)間等加以調(diào)節(jié)。
所述聚乳酸衍生物優(yōu)選由如下化學(xué)式表示RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM (I)其中A是-COO-CHZ-；B是-COO-CHY-、-COO-CH2CH2CH2CH2CH2-或者-COO-CH2CH2OCH2；R是氫原子、乙?；?、苯甲?；?、癸?；?、棕櫚?；?、甲基或者乙基基團(tuán)；Z和Y各自是氫原子、甲基或者苯基基團(tuán)；M是H、Na、K或者Li；n是1-30的整數(shù)，m是0-20的整數(shù)。
本發(fā)明的聚乳酸的一端與羧基基團(tuán)或者其堿金屬鹽共價(jià)結(jié)合，優(yōu)選與其堿金屬鹽結(jié)合。形成聚乳酸衍生物的堿金屬鹽中的金屬離子是一價(jià)離子，例如鈉、鉀或者鋰。金屬離子鹽形式的聚乳酸衍生物在室溫是固體，并且由于其相對中性的pH而非常穩(wěn)定。
更優(yōu)選地，所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY’]q-COO-CHZ-COOM (II)其中X是甲基基團(tuán)；Y’是氫原子或者苯基基團(tuán)；p是0-25的整數(shù)，q是0-25的整數(shù)，條件是p+q是5-25的整數(shù)；R、Z和M與化學(xué)式(I)中所定義的相同。
另外，以下化學(xué)式(III)、(IV)和(V)的聚乳酸衍生物也是合適的RO-PAD-COO-W-M’ (III)其中W-M’是 或者 PAD是選自如下組中的成員D，L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D，L-乳酸和乙醇酸的共聚物、D，L-乳酸與扁桃酸的共聚物、D，L-乳酸與己內(nèi)酯的共聚物、以及D，L-乳酸與1，4-二氧六環(huán)-2-酮的共聚物；R和M與化學(xué)式(I)中所定義的相同。
S-O-PAD-COO-Q (IV)其中S是 L是-NR1-或者-O-；R1是氫原子或者C1-10烷基；Q是CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH3或者CH2C6H5；a是0-4的整數(shù)；b是1-10的整數(shù)；R和M與化學(xué)式(I)中所定義的相同；PAD與化學(xué)式(III)中所定義的相同。
或 其中R’是-PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM，M與化學(xué)式(I)中所定義的相同；PAD與化學(xué)式(III)中所定義的相同；a是1-4的整數(shù)(當(dāng)a＝1時(shí)，其是3-arm PLA-COONa；如果a＝2，其是4-armPLA-COONa；當(dāng)a＝3時(shí)，其是5-arm PLA-COONa；如果a＝4，其是6-arm PLA-COONa)。
聚合物(化學(xué)式V)的合成引發(fā)劑包括甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇(threltol)、季戊四醇(pentaerytritol)、木糖醇、核糖醇、山梨醇和甘露醇。
基于兩親性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的總重量，本發(fā)明的聚合物組合物可以含有0.1-99.9重量％的兩親性嵌段共聚物和0.1-99.9重量％的聚乳酸衍生物。優(yōu)選地，本發(fā)明的聚合物組合物含有20-95重量％的兩親性嵌段共聚物和5-80重量％的聚乳酸衍生物。更優(yōu)選地，本發(fā)明的聚合物組合物含有50-90重量％的兩親性嵌段共聚物和10-50重量％的聚乳酸衍生物。
盡管本發(fā)明的聚乳酸衍生物單獨(dú)即可在pH為4或更高的水溶液中形成膠束，但是包含兩親性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物組合物可以在任何pH值的水溶液中形成膠束，且本發(fā)明的聚合物組合物可以在pH1-10的范圍內(nèi)使用，優(yōu)選在pH4-8的范圍內(nèi)使用。根據(jù)聚合物的分子量及聚乳酸衍生物與兩親性嵌段共聚物之比，由本發(fā)明的聚合物組合物制備的膠束或者納米顆粒的粒徑可以在1-400nm范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，優(yōu)選在5-200nm范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，聚乳酸衍生物的羧基末端基團(tuán)與二價(jià)或者三價(jià)金屬離子結(jié)合或固定。金屬離子固定的聚合物組合物可以通過向兩親性嵌段共聚物與聚乳酸衍生物的聚合物組合物中加入二價(jià)或三價(jià)金屬離子而制備。所述聚合物膠束或者納米顆?？梢酝ㄟ^改變加入的結(jié)合或者固定聚乳酸衍生物的羧基末端基團(tuán)的二價(jià)或者三價(jià)金屬離子的量而形成。
所述二價(jià)或者三價(jià)金屬離子優(yōu)選是選自如下組中的成員Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cr3+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+及Al3+。二價(jià)或者三價(jià)金屬離子可以硫酸鹽、氯化物、碳酸鹽、磷酸鹽或者羥基化物的形式，優(yōu)選CaCl2、MgCl2、ZnCl2、AlCl3、FeCl3、CaCO3、MgCO3、Ca3(PO4)2、Mg3(PO4)2、AlPO4、MgSO4、Ca(OH)2、Mg(OH)2、Al(OH)3、或者Zn(OH)2的形式加入兩親性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物組合物中。
聚合物膠束或納米顆粒可以通過改變加入的金屬離子的當(dāng)量數(shù)而制備。特別地，如果相對于羧基末端基團(tuán)加入0.5當(dāng)量或更少的二價(jià)金屬離子，則可以與聚乳酸衍生物的羧基末端基團(tuán)形成鍵合的金屬離子是不足夠的，因此形成聚合物膠束。如果加入0.5當(dāng)量或更多的二價(jià)金屬離子，則可以與聚乳酸衍生物的羧基末端基團(tuán)形成鍵合的金屬離子足以穩(wěn)固地固定膠束，因此形成納米顆粒。
另外，藥物從聚合物膠束或者納米顆粒中的釋放速度可以通過改變加入的金屬離子的當(dāng)量數(shù)而改變。如果金屬離子相對于聚乳酸衍生物的羧基基團(tuán)以1當(dāng)量或更低的量存在，則會降低可與聚乳酸衍生物羧基末端基團(tuán)結(jié)合的數(shù)目，由此而增加藥物釋放速度。如果金屬離子以1當(dāng)量或更高的量存在，則會增加可與聚乳酸衍生物羧基末端基團(tuán)結(jié)合的數(shù)目，由此降低藥物釋放速度。因此，為了增加藥物在血液中的釋放速度，應(yīng)使用小當(dāng)量的金屬離子，為了降低藥物釋放速度，則應(yīng)使用大當(dāng)量的金屬離子。
金屬離子固定的本發(fā)明的聚合物組合物可含有5-95重量％的兩親性嵌段共聚物，5-95重量％的聚乳酸衍生物及相對于聚乳酸衍生物的羧基末端基團(tuán)的當(dāng)量數(shù)0.01-10當(dāng)量的二價(jià)或者三價(jià)金屬離子。優(yōu)選地，其含有20-80重量％的兩親性嵌段共聚物，20-80重量％的聚乳酸衍生物及0.1-5當(dāng)量的二價(jià)或者三價(jià)金屬離子；更優(yōu)選地，其含有20-60重量％的兩親性嵌段共聚物，40-80重量％的聚乳酸衍生物及0.2-2當(dāng)量的二價(jià)或者三價(jià)金屬離子。
將所述聚合物組合物和生物活性劑在溶劑中混合及溶解并蒸發(fā)所述溶劑；配制生物活性劑包封于其中的藥物載體溶液本發(fā)明的藥物載體可以是由聚合物組合物形成的聚合物膠束或者納米顆粒，所述聚合物組合物包含含有親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段共聚物和在聚合物末端具有至少一個(gè)末端羧基基團(tuán)的聚乳酸衍生物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的末端羥基。
本發(fā)明的納米顆粒或者膠束可以由聚合物組合物形成，所述聚合物組合物包含含有親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的羥基末端基團(tuán)，所述聚乳酸衍生物在與二價(jià)或者三價(jià)金屬離子結(jié)合或固定的末端具有至少一個(gè)末端羧基基團(tuán)。
根據(jù)所述生物活性劑，所述生物活性劑可以包封于所述膠束或者納米顆粒中，或者其可以通過與可生物降解的聚乳酸衍生物的羧基基團(tuán)形成穩(wěn)定的離子復(fù)合物而摻入本發(fā)明的膠束或納米顆粒中。
可以將所述兩親性嵌段共聚物、聚乳酸衍生物及水溶性較差的藥物以一定比例溶解于一或多種混合的有機(jī)溶劑中，所述有機(jī)溶劑選自以下組中丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、氯仿、乙酸和二氧六環(huán)?？梢詮钠渲谐ニ鲇袡C(jī)溶劑以制備水溶性較差的藥物與聚合物的同質(zhì)混合物。本發(fā)明的水溶性較差的藥物與聚合物組合物的同質(zhì)混合物可以在0-80℃加入pH4-8的水溶液中，形成含有水溶性較差的藥物的混合的聚合物膠束水溶液。然后可以將上述含有藥物的聚合物膠束水溶液凍干，以制備固體形式的聚合物膠束組合物。
向含有水溶性較差的藥物的混合的聚合物膠束水溶液中加入含有0.001-2M二價(jià)或三價(jià)金屬離子的水溶液。將該混合物在室溫緩慢攪拌0.1-1小時(shí)，然后凍干以制備固體形式的金屬離子固定的聚合物膠束或者納米顆粒。
將藥物載體與細(xì)胞接觸為了口服或者非胃腸道給予生物活性劑，將所述生物活性劑包封于藥物載體中，并因此使其增溶。特別地，金屬離子固定的聚合物膠束或者納米顆粒在血流中長時(shí)間保留并在靶損害處積聚。在膠束降解時(shí)，所述生物活性劑從膠束的疏水性核心中釋放以發(fā)揮藥理學(xué)作用。
對于非胃腸道傳遞，所述聚合物組合物可以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)鼻、直腸內(nèi)、眼內(nèi)、或者肺內(nèi)給予。對于口服給予，將生物活性劑與本發(fā)明的藥物載體混合，然后以片劑、膠囊或者水溶液形式給予。本發(fā)明的聚合物組合物可以根據(jù)特定藥物需要而以不同劑量范圍給予。如醫(yī)藥領(lǐng)域所熟知，任一患者的給藥劑量依賴于許多因素，包括患者的體重、體表面積、年齡、給予的特定化合物、性別、給予時(shí)間和途徑、一般健康狀況、及同時(shí)給予的其它藥物。
生物活性劑的細(xì)胞內(nèi)在化生物活性劑的細(xì)胞內(nèi)在化可以使用含有藥物的組合物通過流式細(xì)胞儀和共焦顯微鏡進(jìn)行研究。作為本發(fā)明的實(shí)施例，將人子宮癌細(xì)胞系(MES-SA；MES-SA/Dx-5)和人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7；MCF-7/ADR)用本發(fā)明的藥物組合物處理。細(xì)胞系MES-SA和MCF-7均是多柔比星敏感的細(xì)胞系，細(xì)胞系MES-SA/Dx-5、MCF-7/ADR是多柔比星抗性細(xì)胞系。
如圖2A-3B和表2A和2B所示，與常規(guī)溶液制劑(游離-Dox)相比，藥物從本發(fā)明的藥物組合物(組合物1)中更有效地進(jìn)入細(xì)胞中。最顯著地，從本發(fā)明藥物組合物中吸收藥物的細(xì)胞數(shù)目比從常規(guī)溶液制劑中吸收藥物的細(xì)胞數(shù)目高5倍。特別地，在藥物抗性細(xì)胞系中明顯見到多柔比星被攝入細(xì)胞中。因此，本發(fā)明的藥物組合物可用于克服化療中的多重藥物抗性。
圖4A-4H中共焦圖象示出流式細(xì)胞儀結(jié)果當(dāng)用本發(fā)明的藥物組合物處理時(shí)，更多的藥物被細(xì)胞吸收。在圖4A-4H中，左側(cè)圖片是在用常規(guī)溶液制劑處理后的共焦圖象，右側(cè)圖片是在用本發(fā)明的組合物處理后的共焦圖象。如圖4B、4D、4F和4H所示，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)室中檢測到所述膠束或納米顆粒。
另外，圖5A-5B和表3示出的MTT分析結(jié)果支持了流式細(xì)胞儀和共焦顯微鏡研究的結(jié)果。對于MTT分析，測試了本發(fā)明的含有多柔比星的組合物(組合物1)和常規(guī)的多柔比星制劑(游離-Dox)對人子宮癌細(xì)胞系MES-SA(多柔比星敏感細(xì)胞系)和MES-SA/Dx-5(多柔比星抗性細(xì)胞系)的作用。如圖5A所示，這兩種組合物對于多柔比星敏感細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性相似，但是如圖5B所示，當(dāng)用這兩種組合物處理多柔比星抗性細(xì)胞時(shí)，與常規(guī)溶液制劑相比本發(fā)明的藥物組合物在處理3天后示出高6.7倍的活性。這種活性差異是由于藥物抗性細(xì)胞系的特點(diǎn)所致，其中P-糖蛋白(P-gp)是過表達(dá)的并且它們持續(xù)地將細(xì)胞毒性藥物從細(xì)胞中擠出。由于游離藥物不能在藥物抗性細(xì)胞中集中，該結(jié)果提示本發(fā)明的藥物載體與摻入該藥物載體中的藥物一起進(jìn)入細(xì)胞中。
從本發(fā)明的藥物載體的物理穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)在化研究結(jié)果中，可以斷定大多數(shù)本發(fā)明的含有生物活性劑的組合物以膠束或者納米顆粒形式通過胞吞而不是其結(jié)構(gòu)的毀壞而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。這種細(xì)胞內(nèi)在化過程示于圖1中1代表藥物，2代表膠束或者納米顆粒的內(nèi)部核心，3代表膠束或者納米顆粒的外殼，4代表胞外液體，5代表細(xì)胞膜，6代表細(xì)胞質(zhì)。
以Sprague-Dawley大鼠(200-250g)，使用含有多柔比星的本發(fā)明組合物(組合物1-5)及常規(guī)多柔比星制劑(游離-Dox)進(jìn)行藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)。如圖6和表4所示，與常規(guī)多柔比星制劑相比，本發(fā)明的組合物呈現(xiàn)在血液中循環(huán)時(shí)間延長。本發(fā)明的組合物1的由血液濃度-時(shí)間曲線下的面積(AUC)計(jì)算的生物利用度比常規(guī)多柔比星制劑高63倍。
本發(fā)明的藥物載體可以提供延長的體循環(huán)時(shí)間，因?yàn)槠涑叽巛^小(＜100nm)、其親水性殼使得被MPS的攝取降至最低、并且其高分子量防止了被腎臟排泄。本發(fā)明的藥物載體可用作水溶性藥物、肽和蛋白質(zhì)以及水溶性較差的藥物的載體。如細(xì)胞內(nèi)在化研究所證實(shí)，本發(fā)明的含有生物活性劑的組合物在水性介質(zhì)中形成如此穩(wěn)定的膠束或納米顆粒，以至于可以以膠束或者納米顆粒形式通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中而不會破壞其結(jié)構(gòu)。另外，通過本發(fā)明的組合物可以實(shí)現(xiàn)生物活性劑在腫瘤組織中更多地積聚。
最佳實(shí)施方式如下實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解怎樣實(shí)施本發(fā)明。應(yīng)理解盡管結(jié)合本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但如下實(shí)施例只是用于舉例說明本發(fā)明，而無任何限制本發(fā)明范圍之意。本發(fā)明的其它方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將顯而易見。
制備例1PEG和PLA的兩親性嵌段共聚物(mPEG-PLA)將20g單甲氧基聚乙二醇(分子量為2,000的mPEG)、20g從乙酸乙酯中重結(jié)晶的D，L-丙交酯及溶解于5ml甲苯中的0.2g辛酸亞錫的混合物加入配有機(jī)械攪拌器和蒸餾設(shè)施的反應(yīng)器中。在120℃蒸發(fā)殘余的甲苯。反應(yīng)在真空下(25mmHg)進(jìn)行。發(fā)生聚合6小時(shí)后，將所得聚合物溶解于二氯甲烷中并倒入冷卻的二乙醚中(4℃)以使聚合物沉淀。將沉淀的聚合物用二乙醚洗滌兩次并在真空下(0.1mmHg)干燥24小時(shí)。通過核磁共振(NMR)光譜分析確定的嵌段共聚物的分子量為2,000-1,800(對于PEG嵌段為2,000，對于PLA嵌段為1,800)。
制備例2PEG和PLGA的兩親性嵌段共聚物(mPEG-PLGA)
通過與制備例1中所述的相同程序，使用14g D，L-丙交酯和6g乙交酯代替20g D，L-丙交酯制備雙嵌段共聚物(mPEG-PLGA，LA∶GA＝70∶30重量比)。通過NMR確定的嵌段共聚物的分子量為2,000-1,750(對于PEG嵌段為2,000，對于PLGA嵌段為1,750)。
制備例3PEG和PCL的兩親性嵌段共聚物(mPEG-PCL)通過與制備例1中所述的相同程序，使用20gε-己內(nèi)酯代替D，L-丙交酯制備雙嵌段共聚物(mPEG-PCL)。通過NMR確定嵌段共聚物的分子量為2,000-1,800(對于PEG嵌段為2,000，對于PCL嵌段為1,800)。
制備例4PEO和PLA的兩親性嵌段共聚物(PLA-PEO-PLA)通過與制備例1中所述的相同程序，使用20g聚乙二醇(分子量為2,000的PEG)代替單甲氧基聚乙二醇(分子量為2,000的mPEG)制備三嵌段共聚物(PLA-PEO-PLA)。通過NMR確定嵌段共聚物的分子量為850-2,000-850(對于PEO嵌段為2,000，每個(gè)PLA嵌段均為900)。
制備例5生育酚琥珀酸酯將8.6g生育酚、2.4g琥珀酸酐和2.9g 4-(二甲胺)吡啶(DMAP)的混合物在配有機(jī)械攪拌器的反應(yīng)器中溶解于100ml的1，4-二氧六環(huán)中。反應(yīng)在室溫進(jìn)行。在攪拌24小時(shí)后，將反應(yīng)混合物引入HCl溶液中以沉淀生育酚琥珀酸酯(10.2g；產(chǎn)率＝96％)。
制備例6膽固醇琥珀酸酯通過與制備例5中所述的相同程序，使用7.7g膽固醇代替生育酚制備膽固醇琥珀酸酯(9.1g；產(chǎn)率＝94％)。
制備例7在疏水性嵌段末端具有生育酚基團(tuán)的兩親性嵌段共聚物(mPEG-PLA-Toco)將10.0g(2.6mmol)在制備例1中制備的mPEG-PLA與1.7g(3.2mmol)在制備例5中制備的生育酚琥珀酸酯的混合物在配有機(jī)械攪拌器的反應(yīng)器中溶解于50 ml乙腈中。0.78g(3.8mmol)的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和0.046g(0.38mmol)的4-(二甲胺)吡啶(DMAP)用作催化劑。在室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，使用玻璃過濾器過濾該混合物以除去二環(huán)己基脲(dicyclohexylcarbourea)。殘余的催化劑用HCl水溶液萃取，向聚合物溶液中加入硫酸鎂以除去水。使所得產(chǎn)物(mPEG-PLA-Toco)從n-己烷/二乙醚(6/4，v/v)共溶劑中重結(jié)晶。過濾重結(jié)晶的產(chǎn)物并在真空下干燥，獲得白色粉末狀產(chǎn)物(9.9g；產(chǎn)率＝87％)。
制備例8在疏水性嵌段末端具有生育酚基團(tuán)的兩親性嵌段共聚物(mPEG-PLGA-Toco)通過與制備例7中所述的相同程序，使用9.8g(2.6mmol)在制備例2中制備的mPEG-PLGA代替在制備例1中制備的mPEG-PLA制備兩親性嵌段共聚物(mPEG-PLGA-Toco)(9.5g；產(chǎn)率＝83％)。
制備例9在疏水性嵌段末端具有生育酚基團(tuán)的兩親性嵌段共聚物(mPEG-PCL-Toco)通過與制備例7中所述的相同程序，使用10.0g(2.6mmol)在制備例3中制備的mPEG-PCL代替在制備例1中制備的mPEG-PLA制備兩親性嵌段共聚物(mPEG-PCL-Toco)(10.1g；產(chǎn)率＝89％)。
制備例10在疏水性嵌段末端具有生育酚基團(tuán)的兩親性嵌段共聚物(Toco-PLA-PEO-PLA-Toco)通過與制備例7中所述的相同程序，使用9.6g(2.6mmol)在制備例4中制備的PLA-PEO-PLA代替在制備例1中制備的mPEG-PLA制備兩親性嵌段共聚物(Toco-PLA-PEO-PLA-Toco)(9.2g；產(chǎn)率＝84％)。
制備例11在疏水性嵌段末端具有膽固醇基團(tuán)的兩親性嵌段共聚物(mPEG-PLA-Chol)通過與制備例7中所述的相同程序，使用1.6g(3.2mmol)在制備例6中制備的膽固醇琥珀酸酯代替在制備例5中制備的生育酚琥珀酸酯制備兩親性嵌段共聚物(mPEG-PLA-Chol)(9.7g；產(chǎn)率＝86％)。
制備例12可生物降解的聚酯(PLMA-COONa)(1)PLMA-COOH的制備將7.5g D，L-乳酸(0.083mol)和2.5g D，L-扁桃酸(0.016mol)的混合物加入配有機(jī)械攪拌器和蒸餾設(shè)施的反應(yīng)器中。在80℃在減壓下(25mmHg)用吸氣器蒸發(fā)水分。反應(yīng)在真空下(10mmHg)在180℃高溫進(jìn)行5小時(shí)。將所得產(chǎn)物加入蒸餾水中，將沉淀的聚合物用蒸餾水進(jìn)一步洗滌。然后將聚合物產(chǎn)物加入0.1升蒸餾水中，通過向其中逐步加入碳酸氫鈉將該水溶液的pH調(diào)節(jié)為6-8以溶解該聚合物。通過離心或過濾分離和除去不可溶于水的聚合物。向其中滴加1N鹽酸溶液，將聚合物在該水溶液中沉淀。將沉淀的聚合物用蒸餾水洗滌兩次，分離并在減壓下干燥，獲得具有羧基末端基團(tuán)的聚合物(6.7gPLMA-COOH，產(chǎn)率＝67％)。通過NMR確定該聚合物的數(shù)量平均分子量為1,100。
(2)PLMA-COONa的制備將5g PLMA-COOH聚合物溶液在配有機(jī)械攪拌器和蒸餾設(shè)施的反應(yīng)器中溶解于丙酮中。將該溶液在室溫緩慢攪拌，向其中緩慢加入碳酸氫鈉溶液(1N)，以使pH達(dá)到7。向其中加入無水硫酸鎂以除去任何殘余的水分。過濾該混合物，將殘余的丙酮用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)，由此獲得白色固體產(chǎn)物。將該固體產(chǎn)物再溶解于無水丙酮中，過濾該溶液以除去不溶的顆粒，蒸發(fā)丙酮，獲得白色固體狀終產(chǎn)物PLMA-COONa(產(chǎn)率95％)。
制備例13可生物降解的聚酯(3arm-PLA-COOK)(1)3arm-PLA-OH的制備將1.0g(0.011mol)甘油加入配有機(jī)械攪拌器和蒸餾設(shè)施的反應(yīng)器中。在80℃使水分蒸發(fā)30分鐘。向其中加入于甲苯中的0.036g(0.089mmol)辛酸亞錫，將殘余的甲苯在120℃蒸發(fā)，將從乙酸乙酯中重結(jié)晶的36g(0.25mol)D，L-丙交酯引入反應(yīng)器中。在真空下(20mmHg)在130℃進(jìn)行反應(yīng)。聚合6小時(shí)后，將所得聚合物溶解于丙酮中，向其中滴加NaHCO3水溶液(0.2N)以使聚合物沉淀。將沉淀的聚合物用蒸餾水洗滌3次，在減壓下干燥，獲得白色粉末形式的聚合物(3arm-PLA-OH)。通過NMR光譜分析確定該聚合物分子量為3,050。
(2)3arm-PLA-COOH的制備將10g(3.28mmol)如上述制備的3arm-PLA-OH聚合物加入配有機(jī)械攪拌器和蒸餾設(shè)施的反應(yīng)器中。在120℃使水分蒸發(fā)1小時(shí)。向其中加入1.96g(19.6mmol)琥珀酸酐，在125℃實(shí)施反應(yīng)6小時(shí)。將所得聚合物溶解于丙酮中，向其中滴加蒸餾水以使聚合物沉淀。將沉淀的聚合物在60℃溶解于NaHCO3水溶液(0.2N)中，向其中滴加HCl水溶液(1N)以使聚合物沉淀。將沉淀的聚合物用蒸餾水洗滌3次，在真空下干燥，獲得白色粉末形式的聚合物(3arm-PLA-COOH)。通過NMR光譜分析確定該聚合物的分子量為3,200。
(3)3arm-PLA-COOK的制備最后，通過與制備例12中所述的相同程序，使用5g如上述制備的3arm-PLA-COOH聚合物和碳酸氫鉀溶液(1N)代替PLMA-COOH聚合物和碳酸氫鈉溶液(1N)制備可生物降解的聚酯(3arm-PLA-COOK)(產(chǎn)率＝90％)。
制備例14可生物降解的聚酯(4arm-PLA-COONa)(1)4arm-PLA-OH的制備通過與制備例13中所述的相同程序，使用1.5g(0.011mol)季戊四醇代替甘油制備4arm-PLA-OH聚合物。通過NMR光譜分析確定該聚合物(4arm-PLA-OH)的分子量為3,100。
(2)4arm-PLA-COOH的制備通過與制備例13中所述的相同程序，使用10g(3.23mmol)如上述制備的4arm-PLA-OH聚合物和2.58g(25.8mmol)琥珀酸酐代替10g(3.28mmol)3arm-PLA-OH聚合物和1.96g(19.6mmol)琥珀酸酐制備4arm-PLA-COOH聚合物。通過NMR光譜分析確定該聚合物(4arm-PLA-COOH)的分子量為3,300。
(3)4arm-PLA-COONa的制備最后，通過與制備例12中所述的相同程序，使用5g如上述制備的4arm-PLA-COOH聚合物代替PLMA-COOH聚合物制備可生物降解的聚酯(4arm-PLA-COONa)(產(chǎn)率＝92％)。
制備例15可生物降解的聚酯(PLA-COONa)(1)PLA-COOH的制備通過與制備例12中所述的相同程序，使用10g D，L-乳酸(0.11mmol)制備PLA-COOH(產(chǎn)率＝78％)。通過NMR確定該聚合物的數(shù)量平均分子量為1,100。
(2)PLA-COONa的制備通過與制備例12中所述的相同程序，使用5g如上述制備的PLA-COOH聚合物代替PLMA-COOH聚合物制備可生物降解的聚酯(PLA-COONa)(產(chǎn)率＝92％)。
實(shí)施例1含有藥物的組合物(組合物1多柔比星/mPEG-PLA-Toco/PLMA-COONa)將10mg鹽酸多柔比星在圓底燒瓶中溶解于5ml乙醇-水(9∶1v/v)中。向其中加入810mg在制備例7中制備的兩親性嵌段共聚物(mPEG-PLA-Toco)和180mg在制備例12中制備的可生物降解的聚酯(PLMA-COONa)，使其完全溶解形成清澈的溶液。將溶劑在升高的溫度(60℃)及真空下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)。加入3ml乳糖水溶液(20重量％)，并將該燒瓶用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60℃以100rpm轉(zhuǎn)動，以在水性介質(zhì)中形成膠束或者納米顆粒。使用0.22μm PVDF濾膜過濾該溶液。將過濾的溶液凍干并貯存在冰箱中直至使用。過濾的溶液中的膠束或者納米顆粒的粒徑通過動態(tài)光散射法(DLS，ZetaPlus，Brookhaven Instruments Ltd.)測定。通過使用道諾霉素作為內(nèi)標(biāo)以HPLC分析多柔比星含量而計(jì)算載藥率(相對于初始使用的藥物，摻入膠束或者納米顆粒中藥物的wt.％)。進(jìn)行HPLC分析的條件如下進(jìn)樣體積75μl
流速1.0ml/分鐘流動相在40分鐘將溶劑B從15％梯度增加至85％(溶劑A1％乙酸；溶劑B乙腈)溫度室溫柱C-18(Vydac，多環(huán)(multi-ring)，孔大小5μm)波長485nm根據(jù)動態(tài)光散射(DLS)方法測定粒徑。
結(jié)果示于表1。
實(shí)施例2含有藥物的組合物(組合物2多柔比星/mPEG-PLGA-Toco/PLMA-COONa)通過與實(shí)施例1中所述的相同程序，使用在制備例8中制備的mPEG-PLGA-Toco代替mPEG-PLA-Toco制備含有藥物的組合物(組合物2)。
結(jié)果示于表1。
實(shí)施例3含有藥物的組合物(組合物3多柔比星/mPEG-PCL-Toco3arm-PLA-COOK)通過與實(shí)施例1中所述的相同程序，使用在制備例9中制備的mPEG-PCL-Toco和在制備例13中制備的3arm-PLA-COOK代替mPEG-PLA-Toco和PLMA-COONa制備含有藥物的組合物(組合物3)。
結(jié)果示于表1。
實(shí)施例4含有藥物的組合物(組合物4多柔比星/Toco-PLA-PEO-PLA-Toco/4arm-PLA-COONa)通過與實(shí)施例1中所述的相同程序，使用在制備例10中制備的Toco-PLA-PEO-PLA-Toco和在制備例1 4中制備的4arm-PLA-COONa代替mPEG-PLA-Toco和PLMA-COONa制備含有藥物的組合物(組合物4)。
結(jié)果示于表1。
實(shí)施例5含有藥物的組合物(組合物5多柔比星/mPEG-PLA-Chol/PLMA-COONa)通過與實(shí)施例1中所述的相同程序，使用在制備例11中制備的mPEG-PLA-Chol代替mPEG-PLA-Toco制備含有藥物的組合物(組合物5)。
實(shí)施例6含有藥物的組合物(組合物6表柔比星/mPEG-PLA-Toco/PLMA-COONa)通過與實(shí)施例1中所述的相同程序，使用表柔比星代替多柔比星制備含有藥物的組合物(組合物6)。
結(jié)果示于表1。
實(shí)施例7含有藥物的組合物(組合物7Ca2+-固定的紫杉醇/mPEG-PLA-Toco/PLA-COONa)(1)含有紫杉醇的水溶液的制備將248.1mg在制備例15中制備的PLA-COONa、7.5mg紫杉醇和744.3mg在制備例7中制備的mPEG-PLA-Toco的混合物完全溶解于5ml乙醇中，獲得清澈的溶液。從中除去乙醇以制備含有紫杉醇的聚合物組合物。向其中加入蒸餾水(6.2ml)，將該混合物在60℃攪拌30分鐘，以制備含有紫杉醇的水溶液。
(2)用二價(jià)金屬離子固定將0.121ml(0.109mmol)的0.9M無水氯化鈣水溶液加入如上制備的含有紫杉醇的水溶液中，將混合物在室溫?cái)嚢?0分鐘。使用0.22μm PVDF濾膜過濾該混合物。將過濾的溶液凍干并貯存在冰箱中直至使用。
結(jié)果示于表1。
實(shí)施例8含有藥物的組合物(組合物8Mg2+-固定的紫杉醇/mPEG-PLGA-Toco/PLMA-COONa)通過與實(shí)施例7中所述的相同程序制備Mg2+-固定的含有紫杉醇的組合物，不同之處是使用248.1mg在制備例12中制備的PLMA-COONa(Mn1,096)、7.5mg紫杉醇、744.3mg在制備例8中制備的mPEG-PLGA-Toco及0.230ml(0.113mmol)的0.5M氯化鎂6水合物水溶液(Mw203.31)。
結(jié)果示于表1。
實(shí)施例9含有藥物的組合物(組合物9Ca2+-固定的紫杉醇/mPEG-PLA-Toco/PLMA-COONa)通過與實(shí)施例7中所述的相同程序制備Ca2+-固定的含有紫杉醇的組合物，不同之處是使用248.1mg在制備例12中制備的PLMA-COONa、7.5mg紫杉醇、744.4mg在制備例7中制備的mPEG-PLA-Toco及0.230ml(0.113mmol)的0.9M無水氯化鈣水溶液。
結(jié)果示于表1。
實(shí)施例10含有藥物的組合物(組合物10Ca2+固定的紫杉醇/mPEG-PLA-Chol/PLMA-COONa)通過與實(shí)施例7中所述的相同程序制備Ca2+固定的紫杉醇組合物，不同之處是使用248.1mg在制備例12中制備的PLMA-COONa、7.5mg的紫杉醇、744.4mg在制備例11中制備的mPEG-PLA-Chol及0.230ml(0.113mmol)的0.9M無水氯化鈣的水溶液。結(jié)果示于表1。
表1

實(shí)施例11藥物的細(xì)胞內(nèi)攝取的評價(jià)流式細(xì)胞儀為了評價(jià)生物活性劑的細(xì)胞內(nèi)攝取，測試了本發(fā)明的含有多柔比星的組合物(實(shí)施例1中組合物1)和常規(guī)的多柔比星制劑(鹽酸多柔比星的水溶液，游離-Dox)對人子宮癌細(xì)胞系MES-SA(多柔比星敏感細(xì)胞系)和MES-SA/Dx-5(多柔比星抗性細(xì)胞系)的作用。
根據(jù)Walker等(Experimental Cell Research 207142(1993))所述方法，使用FACStarPlus(Becton Dickinson)進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量研究。簡而言之，將細(xì)胞(1.0×106)在補(bǔ)加了10％胎牛血清和1％青霉素鏈霉素的McCoy′s 5A培養(yǎng)基(Invitrogen Corp.)中溫育。在溫育24小時(shí)之后，將細(xì)胞用1.0μg/ml劑量的所述藥物組合物處理。將于12×75 Falcon管中的細(xì)胞置于FACStarPlus上，在488nm(激發(fā))和519nm(發(fā)射)的波長下觀測熒光。數(shù)據(jù)通過CellQuest軟件分析，結(jié)果示于圖3A-4B及總結(jié)于表2A和2B。
表2A吸收藥物的細(xì)胞數(shù)目(％)

比值*＝組合物1/游離-Dox表2B熒光強(qiáng)度的改變(Δ)

比值*＝組合物1/游離-Dox如圖2A-3B及表2A和2B所示，與常規(guī)溶液制劑(游離-Dox)相比，藥物更有效地從本發(fā)明的藥物組合物(組合物1)中進(jìn)入細(xì)胞中。特別地，多柔比星在藥物抗性細(xì)胞系中顯著地被攝取。
實(shí)施例12A共焦顯微鏡檢MES-SA細(xì)胞中的含有多柔比星的組合物為了使生物活性劑的細(xì)胞內(nèi)攝取可視化，測試了本發(fā)明的含有多柔比星的組合物(實(shí)施例1中的組合物1)和常規(guī)的多柔比星制劑(鹽酸多柔比星的水溶液，游離-Dox)對人子宮癌細(xì)胞系MES-SA(多柔比星敏感細(xì)胞系)和MES-SA/Dx-5(多柔比星抗性細(xì)胞系)的作用。
在具有倒置熒光顯微鏡和圖像分析儀的Zeiss(Thornwood，NY)LSM510共焦成像系統(tǒng)上使細(xì)胞成像。簡而言之，將于補(bǔ)加了10％胎牛血清和1％青霉素鏈霉素的3ml McCoy′s 5A培養(yǎng)基(InvitrogenCorp.)中的細(xì)胞(3×105)在37℃在玻璃蓋玻片上溫育過夜。在溫育后，將細(xì)胞用1.0μg/ml劑量的藥物組合物處理，并將蓋玻片置于顯微鏡上。以給定的時(shí)間間隔在484nm激發(fā)波長下觀測熒光，結(jié)果示于圖4A-4D。
圖4A-4D中的共焦圖像示出流式細(xì)胞計(jì)量結(jié)果當(dāng)用本發(fā)明的含有多柔比星的組合物進(jìn)行處理時(shí)，細(xì)胞中吸收了更多的多柔比星。在圖4A-4D中，左側(cè)圖片是在用常規(guī)溶液制劑處理后的共焦圖像，右側(cè)的圖像是在用本發(fā)明的組合物處理后的圖像。如圖4B和4D所示，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)室中檢測到膠束或者納米顆粒。
實(shí)施例12B共焦顯微鏡檢MCF-7細(xì)胞中的含有表柔比星的組合物為了使藥物的細(xì)胞內(nèi)攝取可視化，測試了本發(fā)明的含有表柔比星的組合物(實(shí)施例6中的組合物6)和常規(guī)的表柔比星制劑(鹽酸表柔比星的水溶液)對人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(表柔比星敏感細(xì)胞系)和MCF-7/ADR(表柔比星抗性細(xì)胞系)的作用。
通過與實(shí)施例12A中所述的相同程序，使用RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen Corp.)代替McCoy′s 5A培養(yǎng)基獲得共焦圖像，結(jié)果示于圖4E-4H。
圖4E-4H的共焦圖像示出流式細(xì)胞計(jì)量結(jié)果當(dāng)用本發(fā)明的含有表柔比星的組合物進(jìn)行處理時(shí)，細(xì)胞中吸收了更多的表柔比星。在圖4E-4H中，左側(cè)圖片是在用常規(guī)溶液制劑處理后的共焦圖像，右側(cè)圖像是用本發(fā)明的組合物處理后的圖像。如圖4F和4H所示，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)室中檢測到所述膠束或者納米顆粒。
實(shí)施例13體外細(xì)胞毒性為了進(jìn)行本發(fā)明的組合物的體外細(xì)胞毒性測試，測試了本發(fā)明的含有多柔比星的組合物(實(shí)施例1中組合物1，Doxo-PNP)和常規(guī)多柔比星制劑(鹽酸多柔比星水溶液，游離-Dox)對于人子宮癌細(xì)胞系MES-SA(多柔比星敏感細(xì)胞系)和MES-SA/Dx-5(多柔比星抗性細(xì)胞系)的作用。MTT分析是一種經(jīng)充分確立的細(xì)胞毒性測試方法。當(dāng)將細(xì)胞用MTT(甲基噻唑四唑鎓)處理時(shí)，通過僅在活細(xì)胞中存在的酶的作用由MTT-四唑鎓還原產(chǎn)生MTT-甲(死亡的細(xì)胞不能將MTT-四唑鎓還原為MTT-甲)。MTT-甲的熒光通過熒光讀出器檢測，光密度與細(xì)胞的數(shù)目相關(guān)。該程序是自動化的，通過微平板讀出器中安裝的軟件計(jì)算細(xì)胞生存力和IC50值(50％細(xì)胞生長抑制濃度)。
每種組合物的細(xì)胞毒性活性以0.01至100μg/ml的5個(gè)10倍稀釋度在這兩種人腫瘤細(xì)胞系中評價(jià)。在持續(xù)暴露3天后，將細(xì)胞用MTT(甲基噻唑四唑鎓)處理。通過熒光讀出器檢測通過活細(xì)胞中存在的酶的作用而由MTT-四唑鎓還原產(chǎn)生的MTT-甲。光密度與細(xì)胞數(shù)目相關(guān)。兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均以各細(xì)胞系的IC50值(50％抑制濃度)表示。基本如Carmichael等(Cancer Research 47936(1987))所述的方法進(jìn)行MTT分析。簡而言之，從補(bǔ)加了10％胎牛血清和1％青霉素鏈霉素的McCoy′s 5A培養(yǎng)基(Invitrogen Corp.)中生長的指數(shù)生長期培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)并鋪板于96孔微滴定平板中(每個(gè)細(xì)胞系100個(gè)細(xì)胞懸浮液，5×104細(xì)胞/ml)。在恢復(fù)24小時(shí)后使細(xì)胞繼續(xù)指數(shù)生長，向孔中加入培養(yǎng)基(每個(gè)平板24個(gè)對照孔)或者含有藥物的培養(yǎng)基。各藥物濃度一式三份鋪板。在持續(xù)暴露于藥物3天后，將細(xì)胞用25μl于無菌水中的MTT溶液(2mg/ml)處理。使用自動微平板讀出器(SpectraMax 190，Molecular Devices)在549nm波長測定熒光，由光密度計(jì)算存活細(xì)胞數(shù)目。
細(xì)胞存活研究結(jié)果示于圖5A和5B，各細(xì)胞系的IC50值(50％抑制濃度)總結(jié)于表3。
表3MTT分析(IC50，μg/ml)

比值*＝游離-Dox/組合物1如圖5A所示，這兩種組合物對于多柔比星敏感細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性相似，但是當(dāng)處理多柔比星抗性細(xì)胞時(shí)，如圖5B所示，與常規(guī)溶液制劑相比本發(fā)明的藥物組合物在處理后3天時(shí)示出高6.7倍的活性。這種活性差異是由于藥物抗性細(xì)胞的特點(diǎn)所致，在藥物抗性細(xì)胞中P-糖蛋白(P-gp)是過表達(dá)的，并且其持續(xù)地將細(xì)胞毒性藥物擠出細(xì)胞外。由于游離藥物不能在藥物抗性細(xì)胞中積聚，該結(jié)果提示本發(fā)明的藥物載體與摻入該藥物載體中的藥物一起進(jìn)入細(xì)胞中。
實(shí)施例14在大鼠中的藥動學(xué)在7-8周齡的Sprague-Dawley大鼠(200～250g)中，在靜脈內(nèi)給予本發(fā)明的含有多柔比星的組合物(實(shí)施例1-5中的組合物1-5)和常規(guī)多柔比星制劑(鹽酸多柔比星水溶液，游離-Dox)之后測定血漿中藥物濃度。
向大鼠通過尾靜脈靜脈內(nèi)注射5mg/kg的劑量(每種制劑注射5只大鼠)。在注射藥物1分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘及1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和24小時(shí)后自尾靜脈收集血樣。將血樣立即離心，分離血漿。將血漿樣品貯存在-50℃直至進(jìn)行分析。通過如實(shí)施例1所述的HPLC分析方法分析多柔比星。
血液濃度—時(shí)間曲線(C-t曲線)示于圖6，使用線性梯形法則計(jì)算血液濃度-時(shí)間曲線下的面積(AUC)。結(jié)果示于表4。
表4在大鼠中的藥動學(xué)

應(yīng)理解上文參照的實(shí)施方案只是用于舉例說明本發(fā)明原理的應(yīng)用。在不偏離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)可以對本發(fā)明進(jìn)行多種修改和變化。盡管在附圖中對本發(fā)明進(jìn)行了圖示，并且結(jié)合本發(fā)明的目前被認(rèn)為是最為可行以及優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了具體和詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道在不偏離如本文所述的原理和觀念的條件下，可以對本發(fā)明進(jìn)行多種修改。
權(quán)利要求
1.一種用于細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的傳遞系統(tǒng)，其包含在水溶液中的生物活性劑及所述生物活性劑包封于其中的聚合物藥物載體，其中所述聚合物藥物載體是由包含如下(a)和(b)的聚合物組合物制備的(a)由親水性嵌段和疏水性嵌段組成的兩親性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的末端羥基基團(tuán)，和(b)在聚合物末端具有至少一個(gè)羧基基團(tuán)的聚乳酸衍生物；其中當(dāng)所述藥物載體與細(xì)胞接觸時(shí)，包封于該聚合物藥物載體中的所述生物活性劑可被大量傳遞至所述細(xì)胞中。
2.一種細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的方法，其包括如下步驟a)選擇至少一種生物活性劑；b)制備包含含有親水性嵌段和疏水性嵌段的兩親性嵌段和在聚合物末端具有至少一個(gè)羧基基團(tuán)的聚乳酸衍生物的聚合物組合物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的末端羥基基團(tuán)；c)將所述聚合物組合物和所述生物活性劑在溶劑中混合及溶解，并蒸發(fā)所述溶劑；d)加入水溶液以在該溶液中形成所述生物活性劑包封于其中的聚合物藥物載體；和e)將所述藥物載體與細(xì)胞接觸以使所述生物活性劑傳遞至所述細(xì)胞中。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM (I)其中A是-COO-CHZ-，B是-COO-CHY-、-COO-CH2CH2CH2CH2CH2-或者-COO-CH2CH2OCH2，R是氫原子、乙?；?、苯甲酰基、癸酰基、棕櫚?；?、甲基或者乙基基團(tuán)，Z和Y各自是氫原子、甲基或者苯基基團(tuán)，M是H、Na、K或者Li，n是1-30的整數(shù)，并且m是0-20的整數(shù)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY’]q-COO-CHZ-COOM(II)其中X是甲基基團(tuán)，Y’是氫原子或者苯基基團(tuán)，p是0-25的整數(shù)，q是0-25的整數(shù)，條件是p+q是5-25的整數(shù)，R是氫原子、乙?；⒈郊柞；⒐秕；⒆貦磅；?、甲基或者乙基基團(tuán)，Z是氫原子、甲基或者苯基基團(tuán)，并且M是H、Na、K或Li。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示RO-PAD-COO-W-M’ (III)其中W-M’是 或者 PAD是選自如下組中的成員D，L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D，L-乳酸與乙醇酸的共聚物、D，L-乳酸與扁桃酸的共聚物、D，L-乳酸與己內(nèi)酯的共聚物、D，L-乳酸與1，4-二氧六環(huán)-2-酮的共聚物，R是氫原子、乙?；⒈郊柞；⒐秕；⒆貦磅；⒓谆蛘咭一鶊F(tuán)，并且M是H、Na、K或Li。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示S-O-PAD-COO-Q (IV)其中S是 L是-NR1-或者-O-，R1是氫原子或者C1-10烷基，Q是CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH3或者CH2C6H5，a是0-4的整數(shù)，b是1-10的整數(shù)，R是氫原子、乙?；⒈郊柞；?、癸酰基、棕櫚酰基、甲基或者乙基基團(tuán)，M是H、Na、K或者Li，并且PAD是選自如下組中的成員D，L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D，L-乳酸與乙醇酸的共聚物、D，L-乳酸與扁桃酸的共聚物、D，L-乳酸與己內(nèi)酯的共聚物、以及D，L-乳酸與1，4-二氧六環(huán)-2-酮的共聚物。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示 或 其中R’是-PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM，而PAD是選自如下組中的成員D，L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D，L-乳酸和乙醇酸的共聚物、D，L-乳酸與扁桃酸的共聚物、D，L-乳酸與己內(nèi)酯的共聚物、以及D，L-乳酸與1，4-二氧六環(huán)-2-酮的共聚物，M與化學(xué)式(I)中所定義的相同，a是1-4的整數(shù)。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述親水性嵌段是選自以下組中之一聚亞烷基二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇和聚丙烯酰胺，而所述疏水性嵌段是選自如下組中之一聚丙交酯、聚乙交酯、聚二氧六環(huán)-2-酮、聚己內(nèi)酯、聚乳酸-共-乙交酯、聚乳酸-共-己內(nèi)酯、聚乳酸-共-二氧六環(huán)-2-酮、以及其衍生物，其中所述羧基末端基團(tuán)由生育酚琥珀酸或者膽固醇琥珀酸基團(tuán)取代。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述親水性和疏水性嵌段的數(shù)均分子量分別均在500-50,000道爾頓范圍內(nèi)。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所述兩親性嵌段共聚物中親水性嵌段與疏水性嵌段之比是3∶7至8∶2。
11.權(quán)利要求2的方法，其中所述聚乳酸衍生物的數(shù)均分子量為500-2,500道爾頓。
12.權(quán)利要求2的方法，其中所述聚乳酸衍生物是鈉鹽或者鉀鹽形式，其通過在沒有催化劑存在的條件下進(jìn)行縮合反應(yīng)并隨后用碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀或者碳酸鉀中和而獲得。
13.權(quán)利要求2的方法，其中基于所述兩親性嵌段共聚物與聚乳酸衍生物的總重量，所述聚合物組合物包含0.1-99.9重量％的兩親性嵌段共聚物及0.1-99.9重量％的聚乳酸衍生物。
14.權(quán)利要求2的方法，其中所述生物活性劑與聚合物組合物的重量比是0.1～20.0∶80.0～99.9。
15.權(quán)利要求2的方法，其中所述藥物載體的粒徑在1-400nm范圍內(nèi)。
16.權(quán)利要求2的方法，其中所述生物活性劑是選自以下組中之一蛋白質(zhì)和多肽藥物。
17.權(quán)利要求2的方法，其中所述生物活性劑是選自以下組中之一抗癌劑、抗炎劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、止吐劑和抗生素。
18.權(quán)利要求2的方法，其中所述生物活性劑是核酸。
19.權(quán)利要求2的方法，其中所述藥物載體是聚合物膠束。
20.一種細(xì)胞內(nèi)傳遞生物活性劑的方法，其包括如下步驟a)選擇至少一種生物活性劑；b)制備包含由親水性嵌段和其中羧基末端基團(tuán)由生育酚琥珀酸或者膽固醇琥珀酸基團(tuán)取代的疏水性嵌段組成的兩親性嵌段共聚物、在聚合物末端具有至少一個(gè)羧基基團(tuán)的聚乳酸衍生物、以及相對于1當(dāng)量的所述聚乳酸衍生物的羧基末端基團(tuán)0.01-10當(dāng)量的二價(jià)或者三價(jià)金屬離子的聚合物組合物；c)將所述聚合物組合物與所述生物活性劑在溶劑中混合及溶解，并蒸發(fā)所述溶劑；d)加入水溶液以在該溶液中形成所述生物活性劑包封于其中的聚合物藥物載體；和e)將所述藥物載體與細(xì)胞接觸以使所述生物活性劑傳遞至所述細(xì)胞中。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述二價(jià)或者三價(jià)金屬離子是選自以下組中之一Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cr3+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+和Al3+。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM (I)其中A是-COO-CHZ-，B是-COO-CHY-、-COO-CH2CH2CH2CH2CH2-或者-COO-CH2CH2OCH2，R是氫原子、乙?；⒈郊柞；⒐秕；⒆貦磅；?、甲基或者乙基基團(tuán)，Z和Y各自是氫原子、甲基或者苯基基團(tuán)，M是H、Na、K或者Li，n是1-30的整數(shù)，m是0-20的整數(shù)。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY’]q-COO-CHZ-COOM(II)其中X是甲基基團(tuán)，Y’是氫原子或者苯基基團(tuán)，p是0-25的整數(shù)，q是0-25的整數(shù)，條件是p+q是5-25的整數(shù)，R是氫原子、乙?；?、苯甲酰基、癸?；⒆貦磅；?、甲基或者乙基基團(tuán)，Z是氫原子、甲基或者苯基基團(tuán)，并且M是H、Na、K或者Li。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示RO-PAD-COO-W-M’ (III)其中W-M’是 或者 PAD是選自如下組中的成員D，L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D，L-乳酸和乙醇酸的共聚物、D，L-乳酸與扁桃酸的共聚物、D，L-乳酸與己內(nèi)酯的共聚物、D，L-乳酸與1，4-二氧六環(huán)-2-酮的共聚物，R是氫原子、乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕櫚酰基、甲基或者乙基基團(tuán)，并且M是H、Na、K或者Li。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示S-O-PAD-COO-Q (IV)其中S是 L是-NR1-或者-O-，R1是氫原子或者C1-10烷基，Q是CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH3或者CH2C6H5，a是0-4的整數(shù)，b是1-10的整數(shù)，R是氫原子、乙?；?、苯甲?；?、癸?；⒆貦磅；?、甲基或者乙基基團(tuán)，M是H、Na、K或者Li，以及PAD是選自如下組中的成員D，L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D，L-乳酸和乙醇酸的共聚物、D，L-乳酸與扁桃酸的共聚物、D，L-乳酸與己內(nèi)酯的共聚物、D，L-乳酸與1，4-二氧六環(huán)-2-酮的共聚物。
26.權(quán)利要求20的方法，其中所述聚乳酸衍生物由如下化學(xué)式表示 或 其中R’是-PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM，而PAD是選自如下組中的成員D，L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D，L-乳酸和乙醇酸的共聚物、D，L-乳酸與扁桃酸的共聚物、D，L-乳酸與己內(nèi)酯的共聚物、D，L-乳酸與1，4-二氧六環(huán)-2-酮的共聚物，M與化學(xué)式(I)中所定義的相同，a是1-4的整數(shù)。
27.權(quán)利要求20的方法，其中所述親水性嵌段是選自以下組中之一聚亞烷基二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇和聚丙烯酰胺，所述疏水性嵌段是選自以下組中之一聚丙交酯、聚乙交酯、聚二氧六環(huán)-2-酮、聚己內(nèi)酯、聚乳酸-共-乙交酯、聚乳酸-共-己內(nèi)酯、聚乳酸-共-二氧六環(huán)-2-酮、以及其衍生物，其中所述羧基末端基團(tuán)由生育酚琥珀酸或者膽固醇琥珀酸基團(tuán)取代。
28.權(quán)利要求20的方法，其中所述親水性和疏水性嵌段的數(shù)均分子量分別均在500-50,000道爾頓范圍內(nèi)。
29.權(quán)利要求20的方法，其中所述兩親性嵌段共聚物中親水性嵌段與疏水性嵌段之比是3∶7-8∶2。
30.權(quán)利要求20的方法，其中所述聚乳酸衍生物的數(shù)均分子量是500-2,500道爾頓。
31.權(quán)利要求20的方法，其中所述聚乳酸衍生物是鈉鹽或者鉀鹽形式，其通過在沒有催化劑存在的條件下進(jìn)行縮合反應(yīng)并隨后用碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀或者碳酸鉀中和而獲得。
32.權(quán)利要求20的方法，其中基于所述兩親性嵌段共聚物與聚乳酸衍生物的總重量，所述聚合物組合物包含0.1-99.9重量％的兩親性嵌段共聚物及0.1-99.9重量％的聚乳酸衍生物。
33.權(quán)利要求20的方法，其中所述生物活性劑與聚合物組合物的重量比為0.1～20.0∶80.0～99.9。
34.權(quán)利要求20的方法，其中所述藥物載體的粒徑在1-400nm范圍內(nèi)。
35.權(quán)利要求20的方法，其中所述生物活性劑是選自以下組中之一蛋白質(zhì)和多肽藥物。
36.權(quán)利要求20的方法，其中所述生物活性劑是選自以下組中之一抗癌劑、抗炎劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、止吐劑和抗生素。
37.權(quán)利要求20的方法，其中所述生物活性劑是核酸。
38.權(quán)利要求20的方法，其中所述藥物載體是聚合物膠束或納米顆粒。
全文摘要
本發(fā)明提供了生物活性劑的傳遞系統(tǒng)，其基于由如下組合物形成的聚合物藥物載體，所述組合物包含由親水性嵌段和疏水性嵌段組成的兩親性嵌段共聚物及聚乳酸衍生物，所述疏水性嵌段具有由生育酚或膽固醇基團(tuán)取代的末端羥基基團(tuán)，在所述聚合物衍生物中，所述聚乳酸的一個(gè)末端與至少一個(gè)羧基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。所述聚乳酸衍生物的羧基基團(tuán)可以用二價(jià)或者三價(jià)金屬離子固定，這可以通過向聚合物組合物中加入二價(jià)或者三價(jià)金屬離子而獲得。
文檔編號C08G63/91GK1964744SQ200580018124
公開日2007年5月16日 申請日期2005年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月6日
發(fā)明者李一雄, 李思元, 劉正一, 張東薰, 徐敏孝, 姜惠媛, 金在鴻 申請人:株式會社三養(yǎng)社