專利名稱：極低分子量肝素的一種新用途的制作方法
背景技術(shù)：
所謂的普通肝素(UFH)平均分子量大約為12000-15000Da，并且具有初步抗凝血性。肝素治療表現(xiàn)出的一些副作用極大地限制了它的應用，其中最大的問題是引發(fā)出血和骨質(zhì)疏松癥狀。
特別是，普通肝素表現(xiàn)出的缺點是有三分之一接受治療超過三個月的病人骨骼密度無癥狀地減小而引發(fā)骨質(zhì)疏松，并且有2-3％的病人患骨折(Barbour LA et al.，Am.J.Obst.Gynecol.170，862，1994；Dahlman T.C.，AmJ.Obst.Gynec，168，1265，1993)。
近年的研究方向已經(jīng)指向開發(fā)更少副作用的低分子量肝素。
低分子量肝素(LMWH)是通過普通肝素分子的化學或酶解聚作用制備的，其分子量低于8000Da。因為使用多種碎裂和/或分餾工序，低分子量肝素由分子量、藥物代謝動力學和活性不同的異類化合物構(gòu)成。低分子量肝素廣泛用于所有病狀，特別是應用于預防和治療可通過利用抗凝血酶III(AT III)抑制凝血酶來調(diào)解的血栓栓塞病癥。
這些化合物主要具有抗血栓形成性，因此導致出血類副作用很少。
但是很多基于他們進入市場后的臨床試驗和回顧調(diào)查已經(jīng)指出即便低分子量肝素也可導致接受治療的病人高幾率患骨折，盡管沒有普通肝素那樣顯著(Monreal，M.et al，Thromb.Haemost，71，7，1994)。
基于上述現(xiàn)象的機理已證實為肝素本身(即使?jié)舛葹?μg/ml)能夠抑制造骨細胞的增殖培育和骨基質(zhì)的形成及其礦化。
動物實驗研究顯示，對于骨骼密度的影響取決于鏈的長度，因此也取決于分子量和肝素的硫酸鹽化程度，通過降低所使用的肝素片斷的分子量會減小影響(Hirsh J.，Circulation98，1575-1582，1998；Shaughnessy S.G.et al.，Blood86，(4)，1368-1373，1995)。
本發(fā)明人在美國專利US4,791,195、US4,933,326和歐洲專利EP0439555中已經(jīng)對通過肝素的過氧自由基解聚合作用獲得的特別的極低分子量肝素進行了描述，其具有抗血栓形成和/或抗動脈硬化的活性。這些平均分子量低于LMWH分子量的寡糖與傳統(tǒng)低分子量肝素相比具有不同的作用機理，表現(xiàn)出對抗凝血酶III有非常小的親合力和抗Xa因子活性≤80IU/mg。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有分子量≤5050Da和抗Xa因子活性≤80IU/mg的肝素片斷(其優(yōu)選包括本申請人在美國專利US4,791,195、US4,933,326和歐洲專利EP0439555中描述的極低分子量肝素)具有從其它抗Xa活性高于上述值的低分子量肝素無法觀測到的意想不到藥理學特征。
實際上，這些寡糖不但沒有從普通肝素或其他低分子量肝素觀測到的趨骨質(zhì)疏松(pro-osteoporotic)活性，而且難以置信地在對比中展現(xiàn)了作用于骨質(zhì)的相反活性。特別是這些肝素片斷能夠調(diào)整細胞內(nèi)和細胞外的鈣運動并可作為破骨細胞骨吸收的特別抑制劑。因此這些化合物展示了其對于骨質(zhì)疏松發(fā)作的抑制活性和通過其對于鈣鹽結(jié)晶的恰當抑制作用，同時扮演鈣沉積于組織和動脈、靜脈血管的抑制劑。
因此本發(fā)明涉及上述極低分子量肝素用于制備用于預防和治療骨質(zhì)疏松、動脈和靜脈血管鈣化和由鈣沉積于組織引起的病癥(例如尿石癥)的藥劑的用途。
另外，本發(fā)明人難以置信地發(fā)現(xiàn)上述寡糖對于降低由腦缺血引起的腦損害的能力也遠遠高于具有較高抗Xa因子活性的低分子量肝素(LMWH)。
因此本發(fā)明還涉及上述極低分子量肝素用于制備用于預防和治療腦缺血損害的藥劑的用途。


圖1.1顯示相對于大動脈重量，在正常鼠(NC)、或患有動脈硬化并使用安慰劑治療的鼠(PC)或口服15mg/kg得利高帕因(Deligoparin)鼠(Deligoparin)的大動脈組織上鈣沉積的百分比。
圖1.2顯示在正常鼠(NC)、或患有動脈硬化并使用安慰劑治療的鼠(PC)或口服15mg/kg Deligoparin鼠(Deligoparin)的心臟組織上鈣沉積的百分比。
圖2以百分比顯示在皮下(sc)注射2.5mg/kg依諾肝素(enoxaparin)組和皮下(sc)注射2.5mg/kg Deligoparin(Oligo H)組的年老鼠(作為控制)的炎癥效果(水腫-白色柱狀圖)和腦梗塞/缺血(TTC雙色-利用氯化三苯基四唑嗡(TTC)著色的免疫組織化學的百分比變化-黑色柱狀圖)的范圍。
具體實施例方式本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有分子量小于5050Da和抗Xa因子活性≤80IU/mg的肝素寡糖和其鈉鹽能夠抑制破骨細胞骨吸收，而且能控制鈣在細胞內(nèi)和細胞外的鈣傳輸。因此上述寡糖一方面可以抑制骨質(zhì)疏松的發(fā)作和加重，另一方面還能抑制組織及動脈和靜脈血管的礦化(鈣化)。
因此本發(fā)明的第一方面是上述寡糖用于制備預防和治療骨質(zhì)疏松的藥劑的用途。
本發(fā)明還涉及上述寡糖用于制備用于預防和治療動脈和靜脈血管鈣化和由鈣在組織中沉積而引起的病癥(優(yōu)選包括尿石癥)的用途。
本發(fā)明還已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)上述寡糖(在例子2中有描述)在抑制和降低腦缺血所帶來的損害上展現(xiàn)了其遠高于傳統(tǒng)低分子量肝素(LMW-H)的效力。
因此，本發(fā)明的另一方面為上述寡糖用于預防和治療由腦缺血引起的損害的用途。
本發(fā)明的寡糖是通過肝素的解聚合作用制備，優(yōu)選豬和牛作為來源。用于表征和分析肝素的片斷和碎片的方法被描述在歐洲藥典專論涉及低分子量肝素的部分。
特別是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選肝素寡糖是那些本申請人在美國專利US4,791,195、US4,933,326和歐洲專利EP0439555描述的，并且他們在此結(jié)合作為參考資料。
具體說，本發(fā)明使用的優(yōu)選寡糖選自的群組包括a)由包含平均13-17個糖單位(saccharide unit)和平均分子量介于3580-5050Da(優(yōu)選大約3580Da、4000Da、4570Da、4580Da和5050Da)的肝素寡糖組成的混合物；b)包含平均4-12個糖單位和平均分子量介于1000Da-3570Da(優(yōu)選1000Da、1700Da、2000Da、2100Da、2300Da、2880Da、3200Da、3500Da或3570Da)的肝素寡糖；上述寡糖包含由葡糖胺N，6-二硫酸鹽和艾杜糖醛酸2-硫酸鹽(iduronicacid 2-sulfate)組成的末端單糖，其異頭碳是還原性的。
按照藥典記載，所有上述平均分子量被認為具有取決于分子量測定方法限制的可信區(qū)間。
上述肝素寡糖(優(yōu)選為Deligoparin(INN))是通過豬肝素解聚合制備，并且平均分子量大約為3200Da。
例子1將會說明，Deligoparin能夠以同骨保護素(osteoprotegerin)相同的方式抑制動脈的鈣化(Price A.P.et al.Arterioscl.Thromb.Vase.Biol.211610-1616，2001)。
另外，例子2將會說明，本發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與正控制(positivecontrol)比較，Deligoparin能夠降低52％腦缺血導致的損害，而本身具有抗Xa因子活性約為110IU/mg的依諾肝素(雙倍于Deligoparin的活性)只能降低21％所述損害。
因此，本發(fā)明的另一方面為上述寡糖用于預防和治療腦缺血造成損害的用途。
本發(fā)明的寡糖不僅當注射給藥時有效，而且口服和支氣管內(nèi)吸入也有效。就人類而言，寡糖每日劑量為0.5-10mg/kg，這取決于采用哪種給藥方式。
本發(fā)明將通過下列例子更好地說明。
例子1通過Deligoparin抑制鈣在鼠的大動脈和心臟內(nèi)沉積以動脈硬化的鼠為模型(Villaverde模型，描述在Padró T.et.al.，Thromb.Res.49，519-530，1988；Villaverde C.A.，Drugs of Today 24(S1)，79，1988)研究平均分子量為3200Da和抗Xa因子活性約為57IU/mg的肝素寡糖Deligoparin(Oligo H)。
10只鼠通過連續(xù)喂食溶解于橄欖油中的維生素D2和膽固醇3天，接著用鼠糧、糖和蛋白質(zhì)再喂食18天，即患有動脈硬化。
第二組10只鼠不接受處理并且被用作控制組(正常鼠)。
其他每組也為10只鼠，第3天后接受口服或皮下給藥Deligoparin15mg/kg或口服17mg/kg，并連續(xù)18天，另外配以上述鼠糧。
患有動脈硬化的鼠的大動脈內(nèi)皮有非常明顯的鈣化，在動脈外部也清晰出現(xiàn)硬化和變形。大塊鈣化斑清晰地出現(xiàn)在動脈弓上，特別是大量出現(xiàn)在形成動脈弓本身的動脈上。部分胸部和腹部的動脈也顯示明顯的斑。動脈外膜上被覆有一層非常粘的白色脂肪，并且存在的營養(yǎng)血管也明顯多于控制組鼠的大動脈上的。心臟和腎被認為小于那些控制組，同時肝臟顏色非常黃有明顯的脂肪變性訊號。
接受Deligopari處理的鼠(特別是那些通過口服的鼠)顯示出大動脈更富有彈性且實際上未被鈣化，而且較少被脂肪和營養(yǎng)血管滲透。
三組鼠(正常、患動脈硬化和口服寡聚H組)大動脈的鈣含量(通過原子吸收分析)以柱狀圖顯示在圖1.1中。作為一個例子，圖1.2顯示口服17mg/kg寡聚H的鼠的心臟鈣含量。
例子2鼠的腦缺血引發(fā)損害的抑制使用多組體重300-500g年老雄性Wistar鼠，其中每組7-10只。
根據(jù)Derugin的方法(Olah L.，Wecker S.and Hoehn M.，Journal ofCerebral Blood Flow and Metabolism 20(10)，1474-82，2000；Derugin et al.Stroke 31(7)1752-1761，2000)，外科上局部缺血的產(chǎn)生是由中腦動脈局部梗塞引起的。
在趨血栓性梗塞后6小時，不同組鼠分別靜脈或皮下給藥劑量為2.5mg/kg的Oligo H(Deligoparin)或依諾肝素，每日兩次持續(xù)一周。
腦梗塞/缺血的損害由電腦分析四唑鹽著色的腦部斷層圖像來確定和評估。圖2顯示皮下給藥劑量2.5mg/kg的柱狀圖。
讓人吃驚的結(jié)果表現(xiàn)為，LMWH依諾肝素(INN)，以本質(zhì)活性表征，顯示了十分之一激活的抗因子(aXa)(以IU表示)(這是Deligoparin的一倍)，其結(jié)果只有(Deligoparin)的一半。當劑量為2.5mg/kg(140IUaXa/kg，每日兩次持續(xù)一周)時，分子量3200Da的肝素碎片能夠抑制52％的中風，而分子量大約4500Da的依諾肝素(劑量為270IU aXa/kg每日兩次持續(xù)一周)只能抑制21％的中風。
權(quán)利要求
1.一種分子量小于5050Da并且抗Xa因子活性≤80IU/mg的肝素寡糖或其鈉鹽用于制備用于預防和治療骨質(zhì)疏松、動脈和靜脈血管鈣化和由于鈣在組織上沉積引發(fā)的病癥的藥劑的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其中所述由于鈣在組織上沉積引發(fā)的病癥為尿石病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述用途，其中所述寡糖選自a)由包含平均13-17個糖單位和平均分子量介于3580-5050Da的肝素寡糖組成的混合物；和b)包含平均4-12個糖單位和平均分子量介于1000Da-3570Da的肝素寡糖；所述寡糖含有由葡糖胺N，6-二硫酸鹽和艾杜糖醛酸2-硫酸鹽組成的末端單糖，其異頭碳為還原性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其中所述寡糖a)由平均分子量為3580Da、4000Da、4570Da、4580Da和5050Da的寡糖混合物組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其中所述寡糖b)的平均分子量為1000Da、1700Da、2000Da、2100Da、2300Da、2880Da、3200Da、3500Da或3570Da。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述用途，其中所述寡糖的平均分子量為3200Da。
7.一種分子量小于5050Da并且抗Xa因子活性≤80IU/mg的肝素寡糖或其鈉鹽用于制備用于預防和治療腦缺血引發(fā)的損害的藥劑的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述用途，其中所述寡糖選自a)由包含平均13-17個糖單位和平均分子量介于3580-5050Da的肝素寡糖組成的混合物；和b)包含平均4-12個糖單位和平均分子量介于1000Da-3570Da的肝素寡糖；所述寡糖包含由葡糖胺N，6-二硫酸鹽和艾杜糖醛酸2-硫酸鹽組成的末端單糖，其異頭碳為還原性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述用途，其中所述寡糖a)由平均分子量為3580Da、4000Da、4570Da、4580Da和5050Da的寡糖混合物組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述用途，其中所述寡糖b)的平均分子量為1000Da、1700Da、2000Da、2100Da、2300Da、2880Da、3200Da、3500Da或3570Da。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述用途，其中所述寡糖的平均分子量為3200Da。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項所述用途，其中所述藥劑適于口服給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分子量小于5050Da并且抗Xa因子活性≤80IU/mg的肝素寡糖或其鈉鹽用于制備用于預防和治療骨質(zhì)疏松及其相關病癥的藥劑和用于有效預防和治療腦缺血和及其相關病癥的且能夠穿過血腦屏障的藥劑的用途。
文檔編號C08B37/00GK101052406SQ200580037531
公開日2007年10月10日 申請日期2005年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者皮特羅·比安奇尼, 基瑟普·馬斯塞拉尼, 布魯納·帕爾馬 申請人:歐普可因(共同)股份公司