專利名稱：聚谷氨酸鹽-氨基酸軛合物及方法
本申請要求于2005年12月5日提交的題為“聚谷氨酸鹽-氨基酸及方法”的美國臨時申請第60/742,291號、于2006年1月10日提交的題為“聚谷氨酸鹽-天冬氨酸酯-紫杉烷類”的美國臨時申請第60/757,917號和于2006年4月10日提交的題為“聚谷氨酸鹽-天冬氨酸酯-MRI螯合物”的美國臨時申請第60/790,735號的優(yōu)先權(quán)，所有這些全部在此整體引入作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明一般地涉及具有側(cè)鏈官能團的生物相容性水溶性聚合物及其制備方法，并具體地涉及可用于藥物、生物分子和顯像劑輸送等各種應(yīng)用的聚谷氨酸鹽氨基酸軛合物。
相關(guān)領(lǐng)域描述 已經(jīng)使用多種體系來輸送藥物、生物分子和顯像劑。例如，這樣的體系包括膠囊、脂質(zhì)體、微粒、納米顆粒和聚合物。
已經(jīng)表征和研究了多種基于聚酯的生物可降解體系。聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)及其共聚物聚乳酸共羥基乙酸(PLGA)是用于藥物輸送應(yīng)用的設(shè)計和性能的一些最充分表征的生物材料。參見Uhrich，K.E.；Cannizzaro，S.M.；Langer，R.S.and Shakeshelf，K.M.“Polymeric Systems for Controlled Drug Release(用于藥物控釋的聚合物體系).”Chem.Rev.1999，99，3181-3198和Panyam J，Labhasetwar V.“Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells andtissue(向細胞和組織輸送藥物和基因的生物可降解納米顆粒).”AdvDrug Deliv Rev.2003，55，329-47。另外，已經(jīng)廣泛使用甲基丙烯酸2-羥丙酯(HPMA)生產(chǎn)應(yīng)用于藥物輸送的聚合物。也已經(jīng)研究了基于聚原酸酯的生物可降解體系。參見Heller，J.；Barr，J.；Ng，S.Y.；Abdellauoi，K.S.and Gurny，R.“Poly(ortho esters)synthesis，characterization，properties and uses(聚(原酸酯)合成、表征、性能及應(yīng)用).”Adv.DrugDel.Rev.2002，54，1015-1039。也已經(jīng)研究了聚酐體系。這樣的聚酐體系通常是生物相容的并且可以在體內(nèi)降解成相對無毒的化合物，該化合物作為代謝物從身體消除。參見Kumar，N.；Langer，R.S.and Domb，A.J.“Polyanhydridesan overview(聚酐綜述).”Adv.Drug Del.Rev.2002，54，889-91。
基于氨基酸的聚合物也已經(jīng)被視為新生物材料的潛在來源。已經(jīng)研究了具有良好生物相容性的聚氨基酸以輸送低分子量化合物。已經(jīng)確認了數(shù)量較少的聚谷氨酸和共聚物作為藥物輸送的候選物質(zhì)。參見Bourke，S.L.and Kohn，J.“Polymers derived from the amino acid L-tyrosinepolycarbonates，polyarylates and copolymers with poly(ethyleneglycol)(源自氨基酸L-酪氨酸的聚合物聚碳酸酯，多芳基化合物以及與聚(乙二醇)的共聚物).”Adv.Drug Del.Rev.，2003，55，447-466。
所給予的疏水性抗癌藥和治療蛋白及多肽的生物利用度通常很低。這樣的低生物利用度可能是由于疏水性藥物和水溶液的雙相溶液的不相容性和/或這些分子通過酶降解從血液循環(huán)的快速消除。增加所給予蛋白及其它小分子藥劑的效能的一項技術(shù)需要將所給予藥劑與諸如聚乙二醇(“PEG”)分子的聚合物軛合，這能夠在體內(nèi)提供防止酶降解的保護。這樣的“PEG化(PEGylation)”通常改善循環(huán)時間并因此改善所給予藥劑的生物利用度。
然而，PEG在某些方面有缺點。例如，因為PEG是線形聚合物，與支化聚合物相比，由PEG提供的空間保護有限。PEG的另一缺點是它通常容易在其兩端衍生化。這會限制能夠與PEG軛合的其它功能性分子(例如有助于向特定組織輸送蛋白或藥物的那些)的數(shù)目。
聚谷氨酸(PGA)是使疏水性抗癌藥增溶的聚合物的另一選擇。已經(jīng)報道了多種與PGA軛合的抗癌藥。參見Chun Li.“Poly(L-glutamicacid)-anticancer drug conjugates(聚(L-谷氨酸)-抗癌藥軛合物).”Adv.Drug Del.Rev.，2002，54，695-713。然而，目前FDA沒有批準任何一種。
從太平洋紫杉樹的樹皮中提取的紫杉醇(Paclitaxel)(Wani et al.“Plant antitumor agents.VI.The isolation and structure of taxol，a novelantileukemic and antitumor agent from taxus brevifolia(植物抗腫瘤劑.VI.來自紅豆杉的新抗白血病和抗腫瘤劑紫杉酚的分離和結(jié)構(gòu)).”JAm Chem Soc.1971，93，2325-7)，是FDA批準用于治療卵巢癌和乳腺癌的藥物。然而，與其它抗癌藥相似，由于其疏水性和在水溶液中的難溶性，紫杉醇的生物利用度也低。使紫杉醇增溶的一種方式是將它配制在Cremophor-EL和無水乙醇(1∶1，v/v)的混合物中(Sparreboom etal.“Cremophor EL-mediated Alteration of Paclitaxel Distribution inHuman BloodClinical Pharmacokinetic Implications(人類血液中Cremophor EL介導(dǎo)的紫杉醇分布的改變臨床藥物動力學(xué)推斷).”Cancer Research 1999，59，1454-1457)。這樣的藥劑目前可以以

商購(Bristol-Myers Squibb)。使紫杉醇增溶的另一方法是通過使用高速剪切均質(zhì)化進行乳化((Constantinides et al.“Formulation Developmentand Antitumor Activity of a Filter-Sterilizable Emulsion of Paclitaxel(紫杉醇的可通過濾器消毒的乳劑的配方開發(fā)和抗腫瘤活性).”Pharmaceutical Research 2000，17，175-182))。最近，已經(jīng)在一些臨床試驗中提出聚合物-紫杉醇軛合物(Ruth Duncan“The Dawning era ofpolymer therapeutics(聚合物療法的黎明時分).”Nature Reviews DrugDiscovery 2003，2，347-360)。更近地，已經(jīng)將紫杉醇與人白蛋白配制成納米顆粒并已在臨床研究中使用(Damascelli et al.“Intraarterialchemotherapy with polyoxyethylated castor oil free paclitaxel，incorporated in albumin nanoparticles(ABI-007)Phase II study ofpatients with squamous cell carcinoma of the head and neck and analcanalpreliminary evidence of clinical activity(用并入到白蛋白納米顆粒(ABI-007)中的不含聚氧乙烯化蓖麻油的紫杉醇進行的動脈內(nèi)化療頭頸和肛管鱗狀細胞癌患者的II期研究臨床活性的初步證據(jù)).”Cancer.2001，92，2592-602，和Ibrahim et al.“Phase I andpharmacokinetic study of ABI-007，a Cremophor-free，protein-stabilized，nanoparticle formulation of paclitaxel(不含Cremophor、蛋白穩(wěn)定的紫杉醇納米顆粒藥劑ABI-007的I期及藥物動力學(xué)研究).”Clin CancerRes.2002，8，1038-44)。這一藥劑目前可以以

商購(AmericanPharmaceutical Partners，Inc.)。
核磁共振成像(MRI)是疾病的診斷和進程確定中的重要工具，因為它是非侵入和非輻射的(參見Bulte et al.“Magnetic resonancemicroscopy and histology of the CNS(CNS的核磁共振顯微術(shù)和組織學(xué)).”Trends in Biotechnology 2002，20，S24-S28)。盡管能夠獲得組織的圖像，但是具有造影劑的MRI顯著改善其分辨率。然而，適用于MRI造影劑的順磁金屬離子通常有毒。降低毒性的方法之一是用諸如二亞乙基三胺五乙酸分子(DTPA)的多配位基分子與這些金屬離子螯合。FDA在1988年批準Gd-DTPA用于臨床用途，并且目前可以以

商購。FDA批準了其它的Gd螯合物并可以商購，而很多其它的在開發(fā)之中(參見Caravan et al.“Gadolinium(III)Chelates asMRI Contrast agentsStructure，Dynamics，and Applications(作為MRI造影劑的釓(III)螯合物結(jié)構(gòu)，動力學(xué)和應(yīng)用).”Chem.Rev.1999，99，2293-2352)。
然而，由于缺乏特異性，Gd-DTPA對于靶向腫瘤組織并不理想。在經(jīng)由IV注射給予Gd-DTPA時，其自發(fā)并且快速地擴散到組織的血管外空間。因此，通常需要大量的造影劑以產(chǎn)生合理的對比度圖像。此外，它經(jīng)由腎臟過濾很快消除。為了避免擴散和過濾，已經(jīng)開發(fā)出大分子MRI造影劑(參見Caravan et al.“Gadolinium(III)Chelates asMRI Contrast agentStructure，Dynamics，and Applications(作為MRI造影劑的釓(III)螯合物結(jié)構(gòu)，動力學(xué)和應(yīng)用).”Chem.Rev.1999，99，2293-2352)。這些大分子MRI造影劑包括蛋白MRI螯合物(參見Laufferet al.“Preparation and Water Relaxation Properties of Proteins Labeledwith Paramagnetic Metal Chelates(用順磁金屬螯合物標記的蛋白的制備和水馳豫性能).”Magn，Reson.Imaging 1985，3，11-16)、多糖MRI螯合物(參見Sirlin et al.“Gadolinium-DTPA-DextranA MacromolecularMR Blood Pool Contrast agent(釓-DTPA-右旋糖苷大分子MR血池造影劑).”Acad Radiol.2004，11，1361-1369)和聚合物-MRI螯合物(參見Lu et al.“Poly(L-glutamic acid)Gd(III)-DOTA conjugate with aDegradable Spacer for Magnetic Resonance Imaging(用于核磁共振成像的具有可降解間隔區(qū)的聚(L-谷氨酸)Gd(III)-DOTA軛合物).”Bioconjugate Chem.2003，14，715-719以及Wen et al.“Synthesis andCharacterization of Poly(L-glutamic acid)Gadolinium ChelateA NewBiodegradable MRI Contrast agent(聚(L-谷氨酸)釓螯合物的合成與表征新的生物可降解的MRI造影劑).”Bioconjugate Chem.2004，15，1408-1415)。
最近，已經(jīng)開發(fā)了組織特異性MRI造影劑(參見Weinmann et al.“Tissue-specific MR contrast agents(組織特異性MR造影劑).”Eur.J.Radiol.2003，46，33-44)。然而，尚未在臨床應(yīng)用中報道腫瘤特異性MRI造影劑。已經(jīng)報道納米尺寸的顆粒經(jīng)由增強的滲透和滯留(EPR)效應(yīng)而靶向腫瘤組織(參見Brannon-Peppas et al.“Nanoparticle and targetedsystems for cancer therapy(癌癥治療的納米顆粒和靶向體系).”ADDR2004，56，1649-1659)。
發(fā)明概述 相對疏水的顯像劑和藥物(如某些疏水性抗癌藥、治療蛋白和多肽)通常生物利用度低。據(jù)信該問題至少部分是由于這些顯像劑和藥物在水體系中的溶解度低。某些可以酶降解的藥物生物利用度也低，因為它們在循環(huán)系統(tǒng)中降解較快而導(dǎo)致從身體快速消除。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠與諸如顯像劑和/或藥物的多種藥劑軛合的一系列新穎的聚谷氨酸鹽-氨基酸。在某些實施方案中，聚合物和所得軛合物優(yōu)先在某些組織(如腫瘤組織)積聚，從而可用于向身體的特定部分(如腫瘤)輸送藥物(如抗癌藥)和/或顯像劑。在某些實施方案中，聚合物和所得聚合物軛合物形成納米顆粒，所述納米顆粒通過將顯像劑和/或藥物以分子水平分散而使其在水體系中有效增溶，從而增加功能性和/或生物利用度。
一實施方案提供包含如下所述的通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物軛合物，其中每一n獨立地是1或2；每一A1是氧或NR5；每一A2是氧；R1和R2各自獨立地選自C1-10烷基、C6-20芳基、銨、堿金屬、多配位基配體、具有受保護的氧原子的多配位基配體前體或包含藥劑的化合物；其中所述藥劑選自抗癌藥、靶向藥、光學(xué)顯像劑或磁共振顯像劑；其中R1和R2中的至少一個是包含藥劑的基團；R3和R4各自獨立地選自氫、銨或堿金屬；其中所述聚合物軛合物包含的藥劑量基于藥劑與聚合物軛合物的質(zhì)量比為1％至50％(重量/重量)；R5為氫或C1-4烷基；并且其中選擇藥劑的量、通式(I)重復(fù)單元的百分比和通式(II)重復(fù)單元的百分比以使聚合物軛合物的溶解度大于包含基本相同量藥劑的對照聚谷氨酸軛合物的溶解度，當在22℃下在0.9重量％的NaCl水溶液中包含至少5mg/mL聚合物軛合物的測試聚合物軛合物溶液在較寬的pH范圍內(nèi)具有大于對照測試聚谷氨酸軛合物溶液的光學(xué)透明度時，所述聚合軛合物溶解度更大。
另一實施方案提供上述聚合物軛合物的制備方法，包括將聚合反應(yīng)物溶解或部分溶解在溶劑中以形成溶解或部分溶解的聚合反應(yīng)物；以及使溶解或部分溶解的聚合反應(yīng)物與第二反應(yīng)物反應(yīng)，其中所述第二反應(yīng)物包含多配位基配體、具有受保護的氧原子的多配位基配體前體和包含藥劑的化合物中的至少一種。
另一實施方案提供藥物組合物，其包含本文所述的聚合物軛合物，并且還包含藥物可接受的賦形劑、載體和稀釋劑中的至少一種。
另一實施方案提供治療或改善疾病或疾病狀態(tài)的方法，包括向有需要的哺乳動物給予有效量的本文所述的聚合物軛合物。
另一實施方案提供診斷疾病或疾病狀態(tài)的方法，包括向哺乳動物給予有效量的本文所述的聚合物軛合物。
另一實施方案提供本文所述的聚合物軛合物在制備用于治療或改善疾病或疾病狀態(tài)的藥物中的用途。
另一實施方案提供本文所述的聚合物軛合物在制備用于診斷疾病或疾病狀態(tài)的藥物中的用途。
下文將更詳細地描述這些和其它的實施方案。
附圖簡述

圖1例示制備聚(γ-L-天冬氨酰谷氨酰胺)的反應(yīng)式。
圖2例示制備聚(γ-L-天冬氨酰谷氨酰胺)-聚L-谷氨酸的反應(yīng)式。
圖3例示制備聚(γ-L-天冬氨酰谷氨酰胺)的另一反應(yīng)式。
圖4例示制備聚(γ-L-谷氨?；劝滨０?的反應(yīng)式。
圖5例示制備聚(γ-L-谷氨?；劝滨０?-聚L-谷氨酸的反應(yīng)式。
圖6例示制備PGA-97-A-德克薩斯紅的反應(yīng)式。
圖7例示制備PGA-97-A-DTPA的反應(yīng)式。
圖8例示制備PGA-97-A-DTPA-Gd(III)的反應(yīng)式。
圖9例示制備PGA-A-PTX的一般反應(yīng)式。
圖10例示制備PGA-G-PTX的一般反應(yīng)式。
圖11例示C2’-紫杉醇-谷氨酸和C7-紫杉醇-谷氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其HPLC和LC-MS時間。
圖12例示制備PGA-97-G-27的反應(yīng)式。
圖13示出例示PGA-44-A-20、PGA-97-A-20和PGA(97k)-PTX-20(對照)在若干不同濃度下對B16F0黑素瘤細胞增殖的效果的圖。
圖14示出例示PGA-97-A-10、PGA(97k)-PTX-10、聚(γ-L-天冬氨酰谷氨酰胺)鈉鹽和紫杉酚在若干不同藥物濃度下對B16F0黑素瘤細胞增殖的效果的圖。
圖15示出例示在裸nu/nu小鼠中的B16F0黑素瘤腫瘤上PGA-44-A-19和紫杉酚的紫杉醇血漿濃度隨時間變化的圖。
圖16示出例示在裸nu/nu小鼠中的B16F0黑素瘤腫瘤上PGA-44-A-19和紫杉酚的紫杉醇腫瘤濃度隨時間變化的圖。
圖17示出例示在用PGA-21-G-20、PGA-32-G-20、Abraxane和生理鹽水在各自的最大耐受劑量下處理裸nu/nu小鼠時的體重改變(％)隨時間變化的圖。
圖18示出例示PGA-21-G-20、PGA-32-G-20、Abraxane和生理鹽水在其各自的最大耐受劑量下對裸nu/nu小鼠中的B16F0轉(zhuǎn)化的EGF黑素瘤腫瘤的抗腫瘤效果隨時間變化的圖。
圖19示出例示在用PGA-97-G-20、紫杉酚、Abraxane和生理鹽水在其各自的最大耐受劑量下處理裸nu/nu小鼠時的體重改變(％)隨時間變化的圖。
圖20示出例示PGA-97-G-20、紫杉酚、Abraxane和生理鹽水在其各自的最大耐受劑量下對裸nu/nu小鼠中的B16F0轉(zhuǎn)化的EGF黑素瘤腫瘤的抗腫瘤效果隨時間變化的圖。
圖21示出例示在用PGA-32-G-20、PGA(32k)-PTX-20和生理鹽水在其各自的最大耐受劑量下處理裸nu/nu小鼠時的體重改變(％)隨時間變化的圖。
圖22示出例示PGA-32-G-20、PGA(32k)-PTX-20和生理鹽水在其各自的最大耐受劑量下對裸nu/nu小鼠中的B16F0轉(zhuǎn)化的EGF黑素瘤腫瘤的抗腫瘤效果隨時間變化的圖。
圖23示出例示磷酸鹽緩沖液中在2mg/mL的聚合物-紫杉醇軛合物濃度下紫杉醇釋放隨時間變化的圖。
圖24示出例示血漿中PGA-21-G-19、PGA-32-G-19、PGA-97-G-24和紫杉酚的紫杉醇濃度隨時間變化的圖。
圖25示出例示腫瘤中PGA-21-G-19、PGA-32-G-19、PGA-97-G-24和紫杉酚的紫杉醇濃度隨時間變化的圖。
圖26示出例示PGA-97-A-DTPA-Gd(III)和OmniscanTM(釓雙胺)對裸nu/nu小鼠中B16F0黑素瘤腫瘤的腫瘤積聚效果隨時間變化的圖。
圖27例示PGA-44-A-20的冷凍斷裂電子顯微圖象的復(fù)制圖。
圖28示出例示靜態(tài)光散射(粒徑)與PGA-44-A-20和PGA-97-A-20的濃度的關(guān)系圖。
圖29示出例示靜態(tài)光散射(粒徑)與PGA-21-G-20和PGA-32-G-20的濃度的關(guān)系圖。
優(yōu)選實施方案詳述 術(shù)語“酯”在此以其通常的含義使用，并因此包括具有通式-(R)n-COOR’的化學(xué)部分，其中R和R’獨立地選自烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基(通過環(huán)碳連接)或雜脂環(huán)基(通過環(huán)碳連接)，并且其中n為0或1。
術(shù)語“酰胺”在此以其通常的含義使用，并因此包括具有通式-(R)n-C(O)NHR’或-(R)n-NHC(O)R’的化學(xué)部分，其中R和R’獨立地選自烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基(通過環(huán)碳連接)或雜脂環(huán)基(通過環(huán)碳連接)，并且其中n為0或1。酰胺可以被包括在連接于如本文所述的藥物分子的氨基酸或肽分子中，從而形成藥物前體。
在此公開的化合物上的任何胺、羥基或羧基側(cè)鏈都能夠酯化或酰胺化。用來實現(xiàn)這一目標的操作和具體基團是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且能夠輕易地在諸如Greene and Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis(有機合成中的保護基團)，3rd Ed.，John Wiley & Sons，NewYork，NY，1999的參考文獻來源中找到，在此將其整體引入作為參考。
本文所用的“烷基”是指包含完全飽和(無雙鍵或三鍵)的烴基團的直鏈或支鏈烴鏈。烷基可以含有1至20個碳原子(每當出現(xiàn)在本文中時，諸如“1至20”的數(shù)字范圍是指給定范圍內(nèi)的每一整數(shù)；例如，“1至20個碳原子”意為烷基可以由1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子等等直至并包括20個碳原子組成，盡管本定義也包括沒有指定數(shù)字范圍的術(shù)語“烷基”的情況)。烷基也可以是具有1至10個碳原子的中等大小的烷基。烷基也可以是具有1至5個碳原子的低級烷基。可以將化合物的烷基指定為“C1-C4烷基”或類似的指定。僅以實例的方式，“C1-C4烷基”表明在烷基鏈中有一至四個碳原子，即，烷基鏈選自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。典型的烷基包括但絕不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基等。
烷基可以被取代或不被取代。被取代時，取代基是一個或多個基團，其各自獨立地選自烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環(huán)基)烷基、羥基、受保護的羥基、烷氧基、芳氧基、酰基、酯、巰基、烷硫基、芳硫基、氰基、鹵素、羰基、硫代羰基、O-氨基甲?；?、N-氨基甲?；-硫代氨基甲?；-硫代氨基甲?；?、C-酰胺基、N-酰胺基、S-亞磺酰胺基、N-亞磺酰胺基、C-羧基、受保護的C-羧基、O-羧基、異氰酸基、硫氰酸基(thiocyanato)、異硫氰酸基(isothiocyanato)、硝基、甲硅烷基、亞氧硫基、亞硫?；?、磺?；?、鹵烷基、鹵烷氧基、三鹵代甲烷磺?；?、三鹵代甲烷亞磺酰胺基或包括單和雙取代氨基及其受保護的衍生物的氨基。每當取代基被描述為“被任選地取代”時，該取代基可以用上述取代基之一取代。
“順磁金屬螯合物”是其中配體與順磁金屬離子結(jié)合的絡(luò)合物。實例包括，但不限于，1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)-Gd(III)、DOTA-釔-88、DOTA-銦-111、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)-Gd(III)、DTPA-釔-88、DTPA-銦-111。
“多配位基配體”是本身能夠經(jīng)由兩個或多個連接點通過例如配位共價鍵與金屬離子結(jié)合的配體。多配位基配體的實例包括，但不限于二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、(1，2-亞乙基二氨基)四乙酸鹽(EDTA)、乙二胺、2，2’-二吡啶(bipy)、1，10-菲咯啉(phen)、1，2-雙(聯(lián)苯膦基)乙烷(DPPE)、2，4-戊烷二酮(acac)和草酸鹽(ox)。
“具有受保護的氧原子的多配位基配體前體”是用適當?shù)谋Ｗo基團保護的、包含氧原子的多配位基配體，所述氧原子如羧基的單鍵結(jié)合氧原子。適當?shù)谋Ｗo基包團括但不限于低級烷基、芐基和甲硅烷基。
一實施方案提供包含通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物軛合物
其中每一n獨立地是1或2，每一A1是氧或NR5，每一A2是氧，R1和R2各自獨立地選自任選取代的C1-10烷基、任選取代的C6-20芳基、銨、堿金屬、多配位基配體、具有受保護的氧原子的多配位基配體或包含藥劑的化合物。堿金屬的實例包括鋰(Li)、鈉(Na)、鉀(K)、銣(Rb)和銫(Cs)。在一實施方案中，堿金屬是鈉。
藥劑可以包含任意數(shù)目的活性化合物。例如，藥劑可以選自抗癌藥、靶向藥劑、光學(xué)顯像劑或磁共振顯像劑。R1和R2基團中的至少一個是包含所述藥劑的基團。通式(II)重復(fù)單元可以包含或不包含藥劑。在一實施方案中，R3和R4各自獨立地選自氫、銨或堿金屬。在另一實施方案中，R5是氫原子或C1-4烷基。
聚合物軛合物中存在的藥劑的量能夠在很寬的范圍內(nèi)變化。在一實施方案中，聚合物軛合物包含基于藥劑與聚合物軛合物質(zhì)量比約1％至約50％(重量/重量)的藥劑。在另一實施方案中，聚合物軛合物包含基于藥劑與聚合物軛合物質(zhì)量比約5％至約40％(重量/重量)的藥劑。在另一實施方案中，聚合物軛合物包含基于藥劑與聚合物軛合物質(zhì)量比約10％至約30％(重量/重量)的藥劑。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可以選擇藥劑的量以及通式(I)和通式(II)重復(fù)單元的百分數(shù)以有利地控制所得聚合物軛合物的溶解性。例如，在優(yōu)選的實施方案中，選擇藥劑的量以及通式(I)和通式(II)重復(fù)單元的百分數(shù)，使得聚合物軛合物在所關(guān)注的具體pH和/或pH范圍內(nèi)可溶(或難溶)。在某些實施方案中，也選擇聚合物的分子量以控制溶解度。下文提供的實施例例示了通過適當選擇藥劑量、通式(I)和通式(II)重復(fù)單元的百分數(shù)以及分子量來控制溶解度。得知本文提供的指導(dǎo)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用常規(guī)試驗確定導(dǎo)致具有期望溶解度特性的聚合物軛合物的適當?shù)乃巹┝亢屯ㄊ?I)和通式(II)重復(fù)單元百分數(shù)。取決于應(yīng)用，對溶解度進行這樣的控制可以是有利的。例如，本文提供的聚合物軛合物的實施方案可用于為用別的方式溶解度低的抗癌藥的提供改善的向選定組織的輸送，優(yōu)選減少不期望的副作用，和/或減少個體需要服用抗癌藥的頻率。
優(yōu)選對藥劑量和通式(I)和通式(II)重復(fù)單元百分數(shù)進行選擇以使聚合物軛合物的溶解度大于包含基本相同量的相同藥劑的對照聚谷氨酸軛合物的溶解度。在一實施方案中，聚合物軛合物的溶解度大于對照聚谷氨酸軛合物的溶解度。通過形成在約22℃的0.9重量％的NaCl水溶液中包含至少5mg/mL的聚合物軛合物的聚合物軛合物溶液，并測定光學(xué)透明度來測量溶解度。光學(xué)透明度可以用比濁法測定，例如通過肉眼觀察或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當?shù)膬x器方法。將所得溶解度與類似形成的聚谷氨酸軛合物溶液的溶解度進行比較顯示溶解度的改善，其證據(jù)是在較寬的pH值范圍內(nèi)更大的光學(xué)透明度。因此，當在約22℃的0.9重量％的NaCl水溶液中包含至少5mg/mL的聚合物軛合物的測試聚合物軛合物溶液在較寬的pH值范圍內(nèi)光學(xué)透明度大于對照測試聚谷氨酸軛合物溶液的光學(xué)透明度時，聚合物軛合物的溶解度大于包含基本相同量的藥劑的對照聚谷氨酸軛合物的溶解度。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，“對照”聚谷氨酸軛合物是這樣的對照物質(zhì)，其中軛合物的聚合部分的分子量同與其相比較的對象聚合物軛合物(包含通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元)大致相同。
聚合物軛合物能夠含有一個或多個手性碳原子。手性碳原子(可以用星號*標出)能夠具有右側(cè)(右手)或左側(cè)(左手)構(gòu)型，并且重復(fù)單元因此可以是外消旋的、對映異構(gòu)的或?qū)τ钞悩?gòu)富集的。除非另有說明，本文中其它位置所用的符號“n”和“*”(代表手性碳)與上述含義相同。
包含通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物是包含兩個或多個不同的通式(I)和通式(II)重復(fù)單元的共聚物。此外，包含通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物可以是包含非通式(I)和非通式(II)其它重復(fù)單元的共聚物。聚合物中通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的數(shù)目不受限制，但優(yōu)選為約50至約5,000，并優(yōu)選為約100至約2,000。
具有通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物軛合物中可包括多種其它重復(fù)單元。在一實施方案中，聚合物軛合物還包括通式(III)重復(fù)單元
其中R6基團是氫、銨或堿金屬。當R6基團是氫時，通式(III)重復(fù)單元是谷氨酸重復(fù)單元。
包含藥劑的化合物可以以多種不同方式與聚合物軛合。在一實施方案中，包含藥劑的化合物能夠直接連接于重復(fù)單元。在另一實施方案中，包含藥劑的化合物還包含連接基團，連接基團是將藥劑(或包含藥劑的化合物)連接于聚合物的基團。連接基團可以較小。例如，連接基團可以包含胺、酰胺、醚、酯、羥基、羰基或硫醇基?；蛘?，連接基團可以較大。例如，連接基團可以包含烷基、烷氧基、芳基、芳基(C1-6烷基)、雜芳基或雜芳基(C1-6烷基)。
藥劑可以包括任何類型的活性化合物。在一實施方案中，藥劑可以是光學(xué)顯像劑。在優(yōu)選實施方案中，光學(xué)顯像劑選自吖啶染料、香豆素染料、若丹明染料、呫噸染料、花青染料和芘染料的一個或多個。例如，具體的光學(xué)顯像劑可以包括可商購的或易于通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備的德克薩斯紅、Alexa

染料、

染料、熒光素、Oregon

染料和Rhodamine GreenTM染料。
在另一實施方案中，藥劑包含抗癌藥。在一實施方案中，抗癌藥可選自紫杉烷類、喜樹堿或阿霉素。當藥劑包含紫杉烷類時，優(yōu)選紫杉烷類是紫杉醇或多西紫杉醇。紫杉醇可以經(jīng)由紫杉醇的C2’碳在氧原子處與通式(I)重復(fù)單元或通式(II)重復(fù)單元軛合?；蛘呋虼送猓仙即伎梢越?jīng)由紫杉醇的C7碳在氧原子處與通式(I)重復(fù)單元或通式(II)重復(fù)單元軛合。
在另一實施方案中，藥劑包含磁共振顯像劑。在一實施方案中，磁共振顯像劑包含順磁金屬化合物。例如，磁共振顯像劑可以包含Gd(III)化合物。在這樣的例子中，Gd(III)化合物可以是
在另一實施方案中，藥劑包含多配位基配體。在一實施方案中，多配位基配體可以能夠與順磁金屬反應(yīng)形成磁共振顯像劑。例如，多配位基配體可以包含若干羧酸和/或羧酸鹽基團。在一實施方案中，多配位基配體包含如下結(jié)構(gòu)的化合物
其中每一R7獨立地選自氫、銨或堿金屬。
在另一實施方案中，藥劑包含多配位基配體前體。在這樣的實施方案中，多配位基配體的氧原子被適當?shù)谋Ｗo基團所保護。適當?shù)谋Ｗo基團包括但不限于低級烷基、芐基和甲硅烷基。具有保護基團的多配位基配體前體的實例提供如下
基于重復(fù)單元總數(shù)，聚合物軛合物中通式(I)重復(fù)單元的百分數(shù)可以在很寬的范圍內(nèi)變化。在一實施方案中，基于通式(I)和(II)重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，聚合物可以包含約1摩爾％至約99摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。在另一實施方案中，基于通式(I)和(II)重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，聚合物可以包含約1摩爾％至約50摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。在另一實施方案中，基于通式(I)和(II)重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，聚合物可以包含約1摩爾％至約30摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。在另一實施方案中，基于通式(I)和(II)重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，聚合物可以包含約1摩爾％至約20摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。在另一實施方案中，基于通式(I)和(II)重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，聚合物可以包含約1摩爾％至約10摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。
除了通式(I)和(II)重復(fù)單元，聚合物軛合物可以包含多種其它的重復(fù)單元。例如，在一實施方案中，聚合物軛合物包含通式(III)重復(fù)單元?；诎ㄊ?I)、(II)和(III)重復(fù)單元的聚合物軛合物中的重復(fù)單元總數(shù)，通式(I)重復(fù)單元的百分數(shù)可以在很寬的范圍內(nèi)變化。在一實施方案中，基于通式(I)、(II)和(III)重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，聚合物軛合物可以包含約1摩爾％至約99摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。在另一實施方案中，基于通式(I)、(II)和(III)重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，聚合物軛合物可以包含約1摩爾％至約50摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。在另一實施方案中，基于通式(I)、(II)和(III)重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，聚合物軛合物可以包含約1摩爾％至約30摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。在另一實施方案中，基于通式(I)、(II)和(III)重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，聚合物軛合物可以包含約1摩爾％至約20摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。在另一實施方案中，基于通式(I)、(II)和(III)重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，聚合物軛合物可以包含約1摩爾％至約10摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。
在一實施方案中，通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元中的至少一n為1。在另一實施方案中，通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元中的至少一n為2。
在一實施方案中，選擇聚合物軛合物中的藥劑量、通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的百分數(shù)，以使聚合物軛合物的溶解度大于包含基本相同量的藥劑的對照聚谷氨酸軛合物的溶解度。包含通式(I)和通式(II)重復(fù)單元的聚合物軛合物的溶解度大于對照聚谷氨酸軛合物的溶解度的pH值范圍可以窄或?qū)?。如上指出的那樣，通過形成在約22℃的0.9重量％的NaCl水溶液中包含至少5mg/mL的聚合物軛合物的聚合物軛合物溶液，并測定光學(xué)透明度來測量溶解度。在一實施方案中，聚合物軛合物在至少約三個pH單位的pH范圍內(nèi)可溶。在另一實施方案中，聚合物軛合物在至少約八個pH單位的pH范圍內(nèi)可溶。在另一實施方案中，聚合物軛合物在至少約九個pH單位的pH范圍內(nèi)可溶。在另一實施方案中，聚合物軛合物可溶的pH范圍包括約2至約5范圍內(nèi)的至少一pH值，例如pH＝2、pH＝3、pH＝4和/或pH＝5。優(yōu)選地，聚合物軛合物可溶的pH范圍比對照聚谷氨酸軛合物可溶的pH范圍寬。例如，在一實施方案中，聚合物軛合物可溶的pH范圍比對照聚谷氨酸軛合物可溶的pH范圍寬至少約一個pH單位，優(yōu)選寬至少約二個pH單位。
置于溶液中以測量溶解度的聚合物軛合物的量也能夠較大地變化。在一實施方案中，在測試聚合物軛合物溶液包含至少約5mg/mL聚合物軛合物時測定溶解度。在另一實施方案中，在測試聚合物軛合物溶液包含至少約10mg/mL聚合物軛合物時測定溶解度。在另一實施方案中，在測試聚合物軛合物溶液包含至少約25mg/mL聚合物軛合物時測定溶解度。在另一實施方案中，在測試聚合物軛合物溶液包含至少約100mg/mL聚合物軛合物時測定溶解度。在另一實施方案中，在測試聚合物軛合物溶液包含至少約150mg/mL聚合物軛合物時測定溶解度。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，對照聚谷氨酸軛合物是在與測試聚合物軛合物大約相同的濃度下測試的。
包含通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物可以以多種方式制備。在一實施方案中，將聚合反應(yīng)物溶解或部分溶解在溶液中以形成溶解或部分溶解的聚合反應(yīng)物。然后使溶解或部分溶解的聚合反應(yīng)物與第二反應(yīng)物反應(yīng)形成中間產(chǎn)物，或在某些實施方案中，形成包含通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物。
聚合反應(yīng)物可以包含任何能夠形成包含通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物的適當?shù)奈镔|(zhì)。在一實施方案中，聚合反應(yīng)物包含通式(IV)重復(fù)單元。

其中每一n獨立地是1或2，每一A3是氧，并且R7和R8各自獨立地選自氫、銨或堿金屬。
在一實施方案中，聚合反應(yīng)物可以包含通式(V)重復(fù)單元
其中R9是氫、銨或堿金屬。
第二反應(yīng)物可以是多種化合物。在一實施方案中，第二反應(yīng)物包含多配位基配體、具有受保護的氧原子的多配位基配體前體和包含藥劑的化合物中的至少一個。在一實施方案中，第二反應(yīng)物可包含取代基。取代基可選自羥基或胺基。
在一實施方案中，第二反應(yīng)物包含含有藥劑的化合物。藥劑可以是任何活性化合物。例如，包含藥劑的化合物可選自抗癌藥、靶向藥劑、光學(xué)顯像劑或磁共振顯像劑。在一實施方案中，光學(xué)顯像劑可以選自吖啶染料、香豆素染料、若丹明染料、呫噸染料、花青染料或芘染料。在另一實施方案中，抗癌藥能夠選自紫杉烷類、喜樹堿或阿霉素。在優(yōu)選實施方案中，抗癌藥可以包含紫杉烷類，并且紫杉烷類可選自紫杉醇或多西紫杉醇。
紫杉醇可以以多種方式與聚合物軛合。在一實施方案中，紫杉醇在連接于C2’上的氧原子處與通式(I)重復(fù)單元軛合。在另一實施方案中，紫杉醇在連接于C7上的氧原子處與通式(I)重復(fù)單元軛合。
在一實施方案中，包含藥劑的化合物包括磁共振顯像劑。在另一實施方案中，磁共振顯像劑包含順磁金屬化合物。優(yōu)選地，包含藥劑的化合物包括Gd(III)化合物。例如，包含藥劑的化合物可以包含如下結(jié)構(gòu)
在一實施方案中，多配位基配體可以與聚合物軛合?？梢允褂萌魏芜m當?shù)亩嗯湮换潴w。在一實施方案中，多配位基配體可以能夠與順磁金屬反應(yīng)形成磁共振顯像劑。例如，多配位基配體可以包含若干羧酸和/或羧酸鹽基團。例如，聚合物可以與如下結(jié)構(gòu)的多配位基配體軛合
其中每一R7獨立地是氫、銨或堿金屬。
在另一實施方案中，具有保護基團的多配位基配體前體可以與聚合物軛合。這樣的前體具有受適當?shù)谋Ｗo基團保護的氧原子。適當?shù)谋Ｗo基團包括但不限于低級烷基、芐基和甲硅烷基。具有保護基團的多配位基配體前體的一實例提供如下
在一實施方案中，聚合物軛合物的制備方法包括使溶解或部分溶解的聚合反應(yīng)物與第二反應(yīng)物在偶聯(lián)劑的存在下反應(yīng)?？梢允褂萌魏芜m當?shù)呐悸?lián)劑。在一實施方案中，偶聯(lián)劑選自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)、1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1，1’-羰基-二咪唑(CDI)、N，N’-琥珀酰亞氨基碳酸酯(DSC)、六氟磷酸N-[(二甲氨基)-1H-1，2，3-三唑并-[4，5-b]吡啶-1-基-亞甲基]-N-甲基甲銨鹽N-氧化物(HATU)、六氟磷酸2-[(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基銨鹽(HBTU)、六氟磷酸2-[(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基銨鹽(HCTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷基鏻鹽

六氟磷酸溴代-三吡咯烷基鏻鹽

四氟硼酸2-[(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基銨鹽(TBTU)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三(二甲氨基)鏻鹽(BOP)。
可以使用允許反應(yīng)發(fā)生的任何適當?shù)娜軇Ｔ谝粚嵤┓桨钢?，溶劑可以是極性非質(zhì)子溶劑。例如，溶劑可選自N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、N-甲基-2-吡啶酮(NMP)或N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)。
在另一實施方案中，反應(yīng)還可以包括在催化劑的存在下使溶解或部分溶解的聚合反應(yīng)物反應(yīng)?？梢允褂么龠M反應(yīng)的任何催化劑。在一實施方案中，催化劑可包含4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
在一實施方案中，包含通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物能夠由聚谷氨酸和諸如天冬氨酸和/或谷氨酸的氨基酸開始制備。或者，在另一實施方案中，聚合物可以通過首先將起始聚谷氨酸物質(zhì)轉(zhuǎn)化成其鹽形式來制備。聚谷氨酸的鹽形式能夠通過使聚谷氨酸與諸如碳酸氫鈉的適當?shù)膲A反應(yīng)來獲得。聚谷氨酸的側(cè)鏈羧酸基團能夠連接氨基酸部分。聚谷氨酸的重均分子量不受限制，但優(yōu)選為約10,000至約500,000道爾頓，且更優(yōu)選為約25,000至約300,000道爾頓。這樣的反應(yīng)可以用來制備聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)或聚(γ-L-谷氨酰基-谷氨酰胺)。
在一實施方案中，在連接到聚谷氨酸上之前，氨基酸受保護基保護。適于該反應(yīng)的受保護的氨基酸部分的一實例是如下所示的L-天冬氨酸二叔丁酯鹽酸鹽
L-天冬氨酸二叔丁酯鹽酸鹽 聚谷氨酸與氨基酸的反應(yīng)可以在任何適當?shù)娜軇┑拇嬖谙掳l(fā)生。在一實施方案中，溶劑可以是非質(zhì)子溶劑。在優(yōu)選實施方案中，溶劑是N，N’-二甲基甲酰胺。
在一實施方案中，能夠使用諸如EDC、DCC、CDI、DSC、HATU、HBTU、HCTU、

TBTU和BOP的偶聯(lián)劑。在其它實施方案中，能夠使用催化劑(例如，DMAP)使谷氨酸和氨基酸反應(yīng)。
反應(yīng)完成后，如果氨基酸的氧原子被保護，能夠使用已知方法如使用適當?shù)乃?例如三氟乙酸)除去保護基團。若需要，得自使聚谷氨酸與氨基酸反應(yīng)的聚合物的鹽形式能夠通過用諸如碳酸氫鈉溶液的適當?shù)膲A溶液處理聚合物的酸形式來形成。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法回收和/或純化聚合物。例如，可以通過諸如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的適當?shù)姆椒ǔト軇４送?，可以將反?yīng)混合物過濾入酸性水溶液中以誘導(dǎo)沉淀。然后能夠?qū)⑺贸恋磉^濾并用水洗滌。
在一實施方案中，包含通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物還能夠包括如上所述的通式(III)重復(fù)單元。形成包含通式(I)、(II)和(III)重復(fù)單元的聚合物的方法之一是通過由聚谷氨酸開始并使之與諸如天冬氨酸和/或谷氨酸的氨基酸反應(yīng)，其量為基于聚谷氨酸小于1.0當量的氨基酸。例如，在一實施方案中，能夠用聚谷氨酸與0.7當量的基于聚谷氨酸的氨基酸反應(yīng)，使得所得聚合物中約70％的重復(fù)單元包含氨基酸。如上文所討論的，能夠用適當?shù)谋Ｗo基團保護氨基酸的氧原子。在一實施方案中，氨基酸可以是L-天冬氨酸或L-谷氨酸。在另一實施方案中，能夠用叔丁基保護氨基酸的氧原子。若氨基酸的氧原子被保護，則能夠用已知方法如適當?shù)乃?例如三氟乙酸)除去保護基團。
包含藥劑、多配位基配體和/或具有受保護的氧原子的多配位基配體前體的基團與聚合物酸或其鹽形式的軛合可以以多種方式進行，例如，通過將包含藥劑、多配位基配體和/或具有受保護的氧原子的多配位基配體前體的基團共價結(jié)合到各種聚合物上。前述基團與得自聚谷氨酸和/或鹽的聚合物軛合的方法之一是使用加熱(例如通過使用微波方法加熱)?；蛘?，軛合可以在室溫下進行?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知和/或本文所述的適當?shù)娜軇⑴悸?lián)劑、催化劑和/或緩沖液以形成聚合物軛合物。對于聚谷氨酸，得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物的鹽或酸形式均能用作形成聚合物軛合物的起始原料。
能夠與得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物軛合的適當?shù)乃巹┌ǖ幌抻诠鈱W(xué)藥劑、抗癌藥、靶向藥劑、磁共振顯像劑(如順磁金屬化合物)、多配位基配體和具有受保護的氧原子的多配位基配體前體。
在一實施方案中，得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物能夠與光學(xué)藥劑軛合。在一實施方案中，光學(xué)藥劑能夠是德克薩斯紅-NH2。

德克薩斯紅-NH2 在一具體實施方案中，包含至少一個通式(I)重復(fù)單元和至少一個通式(II)重復(fù)單元的聚合物可以與DCC、德克薩斯紅-NH2染料、吡啶和4-二甲氨基吡啶反應(yīng)。使用微波方法加熱混合物。在一實施方案中，將反應(yīng)加熱到約100℃至150℃的溫度。在另一實施方案中，物質(zhì)的加熱時間為5分鐘至40分鐘。若需要，能夠?qū)⒎磻?yīng)冷卻至室溫。能夠使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當方法分離和/或純化聚合物軛合物。例如，能夠?qū)⒎磻?yīng)混合物過濾入酸性水溶液中。然后將形成的任何沉淀過濾并用水洗滌。任選地，能夠用任何適當方法純化沉淀。例如，能夠?qū)⒊恋磙D(zhuǎn)移至丙酮中溶解，并將所得溶液再次過濾入碳酸氫鈉溶液中。若需要，能夠?qū)⑺梅磻?yīng)溶液在水中用纖維素膜透析并能夠?qū)⒕酆衔飪龈刹⒎蛛x。
如下文的實施例所例示的，可以使用包含德克薩斯紅染料的軛合物向選定組織輸送顯像劑。例如可以如下文所例示的，使上述聚合物在水溶液中形成納米顆粒。
在一實施方案中，能夠使得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物與抗癌藥軛合。在一實施方案中，抗癌藥能夠是紫杉烷類、喜樹堿和/或阿霉素。在優(yōu)選實施方案中，抗癌藥是諸如紫杉醇或多西紫杉醇的紫杉烷類。
在一實施方案中，與聚合物軛合的抗腫瘤藥物是紫杉醇。在一實施方案中，紫杉醇可以在C2’氧原子處與聚合物連接。在另一實施方案中，紫杉醇可以在C7氧原子處與聚合物連接。在另一實施方案中，聚合物鏈包含僅通過C2’氧原子與聚合物連接的紫杉醇。在另一實施方案中，聚合物鏈包含僅通過C7氧原子與聚合物連接的紫杉醇。在另一實施方案中，聚合物包含C2’軛合的紫杉醇基團和C7軛合的紫杉醇基團。
能夠使用上述關(guān)于德克薩斯紅的方法將抗癌藥與得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物軛合。
在一實施方案中，優(yōu)選在偶聯(lián)劑(例如，EDC和/或DCC)和催化劑(例如DMAP)的存在下，能夠使紫杉醇與得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物在溶劑(例如非質(zhì)子溶劑，如DMF)中反應(yīng)?？墒褂闷渌巹┤邕拎せ蛄u基苯并三唑。在一實施方案中，反應(yīng)可以在0.5至2天的時間段內(nèi)進行。能夠使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當方法分離和/或純化聚合物軛合物。例如，能夠?qū)⒎磻?yīng)混合物傾入酸性溶液以形成沉淀。然后將形成的任何沉淀過濾并用水洗滌。任選地，能夠用任何適當?shù)姆椒兓恋?。例如，能夠?qū)⒊恋磙D(zhuǎn)移至丙酮中溶解，并將所得溶液再次過濾入碳酸氫鈉溶液中。若需要，能夠?qū)⑺梅磻?yīng)溶液在水中用纖維素膜透析并能夠?qū)⒕酆衔飪龈刹⒎蛛x。所得聚合物中紫杉醇的含量可通過UV光譜法測定。
或者，能夠使包含藥劑的化合物與諸如谷氨酸和/或天冬氨酸的氨基酸反應(yīng)，其中使包含藥劑的化合物與氨基酸偶聯(lián)(如共價結(jié)合)。然后能夠使氨基酸-藥劑化合物與聚谷氨酸或其鹽反應(yīng)以形成聚合物軛合物。在一實施方案中，使紫杉醇與谷氨酸反應(yīng)形成化合物，其中紫杉醇與谷氨酸的側(cè)鏈羧酸基團共價結(jié)合。然后能夠使谷氨酸-紫杉醇化合物與聚谷氨酸或其鹽反應(yīng)形成聚合物軛合物。在一實施方案中，使紫杉醇與天冬氨酸反應(yīng)形成化合物，其中紫杉醇與天冬氨酸的側(cè)鏈羧酸基團共價結(jié)合。然后能夠使天冬氨酸-紫杉醇化合物與聚谷氨酸或其鹽反應(yīng)形成聚合物軛合物。若需要，能夠用已知的分離方法(如HPLC)將通過C2’氧連接到氨基酸上的紫杉醇與通過C7氧連接到氨基酸上的紫杉醇分離。
形成聚合物軛合物之后，還可以測量沒有與聚合物共價結(jié)合的任何游離量的藥劑。例如，可以用薄層色譜(TLC)證實基本不存在保留在與紫杉醇軛合的聚合物的組合物中的游離紫杉醇。
在一實施方案中，能夠使得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物與多配位基配體軛合。適當?shù)亩嗯湮换潴w包括但不限于二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、(1，2-亞乙基二氨基)四乙酸酯(EDTA)、乙二胺、2，2’-二吡啶(bipy)、1，10-菲咯啉(phen)、1，2-雙(聯(lián)苯膦基)乙烷(DPPE)、2，4-戊烷二酮(acac)和草酸鹽(ox)。能夠使用如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的和/或本文所述的適當溶劑、偶聯(lián)劑、催化劑和/或緩沖液以形成聚合物軛合物。在另一實施方案中，能夠使得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物與具有受保護的氧原子的多配位基配體前體軛合。對于聚谷氨酸，得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物的鹽或酸形式均能用作形成聚合物軛合物的起始原料。
在一實施方案中，多配位基配體包含DTPA。在一實施方案中，優(yōu)選在偶聯(lián)劑(如DCC)和催化劑(如DMAP)的存在下，能夠使諸如DTPA的多配位基配體(含或不含受保護的氧原子)與得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物在溶劑(例如非質(zhì)子溶劑如DMF)中反應(yīng)。若存在保護基團，能夠使用適當?shù)姆椒ǔ?。例如，能夠使用諸如三氟乙酸的酸處理聚合物軛合物，所述聚合物軛合物包含具有受保護的氧原子的多配位基配體前體，如具有受叔丁基保護的氧原子的DTPA。除去保護基團之后，能夠通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去酸。在一實施方案中，能夠用適當?shù)膲A處理DTPA以除去羧酸-OH基團上的氫原子。在某些實施方案中，堿是碳酸氫鈉。
在一實施方案中，能夠使得自聚谷氨酸和/或鹽和氨基酸的聚合物與磁共振顯像劑軛合。在一實施方案中，磁共振顯像劑包含Gd(III)化合物。形成磁共振顯像劑的方法之一是通過使順磁金屬與包含多配位基配體的聚合物軛合物反應(yīng)。適當?shù)捻槾沤饘侔ǖ幌抻贕d(III)、銦-111和釔-88。例如，能夠在緩沖溶液中用Gd(III)處理包含DTPA的聚合物軛合物數(shù)小時的時間。能夠使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當?shù)姆椒ǚ蛛x和/或純化聚合物軛合物。例如，能夠?qū)⑺梅磻?yīng)溶液在水中用纖維素膜透析并能夠?qū)⒕酆衔飪龈刹⒎蛛x。順磁金屬的量可以通過電感耦合等離子體-光發(fā)射光譜(ICP-OES)測量來定量。
例如在下文的實施例中所例示的，聚合物軛合物可用于向選定組織輸送顯像劑和/或藥物。例如下文所例示的，可以使上述聚合物在水溶液中形成納米顆粒?？梢允拱酆衔锖退幬锏能椇衔镆灶愃品绞叫纬杉{米顆粒。這樣的納米顆?？捎糜谙蜻x定組織優(yōu)先輸送藥物。
藥物組合物 在某些實施方案中，提供了本文公開的化合物(例如，聚合物軛合物和/或其包含的藥劑)的前藥、代謝物、立體異構(gòu)體、水合物、溶劑化物、多晶形物和藥物可接受的鹽。
“前藥”是指在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成母體藥物的藥劑。前藥通常是有用的，因為在某些情形下它們比母體藥物更容易給藥。例如，它們可以通過口服給藥獲得生物利用而母體藥物不可以。前藥還可以具有與母體藥物相比改善的溶解度。非限制性的前藥實例可以是這樣的化合物，其作為酯(“前藥”)給藥以有助于轉(zhuǎn)運通過細胞膜，因為在所述細胞膜處水溶性對活動性是不利的；但是所述酯一旦進入細胞內(nèi)就代謝水解為活性體羧酸，因為在細胞內(nèi)水溶性是有利的。前藥的另一實例可以是與酸基團結(jié)合的短肽(聚氨基酸)，肽被代謝后暴露活性部分。在例如Design of Prodrugs(前藥設(shè)計)，(ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985)中描述了選擇和制備適當?shù)那八幯苌锏某Ｒ?guī)方法，在此將其整體引入作為參考。
術(shù)語“前藥酯”是指通過加入若干種在生理條件下水解的酯形成基團中的任一種而形成的本文公開的化合物的衍生物。前藥酯基團的實例包括特戊酰氧基甲基、乙酰氧基甲基、2-苯并[c]呋喃酮基、2，3-二氫化茚基和甲氧基甲基，以及本領(lǐng)域已知的其它這樣的基團，包括(5-R-2-氧代-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基。在例如T.Higuchi and V.Stella，in“Pro-drugs as Novel Delivery Systems(作為新釋藥系統(tǒng)的前藥)”，Vol.14，A.C.S.Symposium Series，American Chemical Society(1975)和“Bioreversible Carriers in Drug DesignTheory and Application(藥物設(shè)計中的生物可逆載體理論和應(yīng)用)”，edited by E.B.Roche，Pergamon PressNew York，14-21(1987)(提供可用作含羧基化合物的前藥的酯的實例)中能夠找到前藥酯基團的其它實例。每一上述參考文獻均以參考的方式整體并入本文。
術(shù)語“藥物可接受的鹽”是指對其所給予的有機體不引起顯著刺激性并且不使化合物失去生物活性和性質(zhì)的化合物的鹽。在某些實施方案中，鹽是化合物的酸加合鹽。藥物鹽能夠通過使化合物與諸如氫鹵酸(如鹽酸或氫溴酸)、硫酸、硝酸、磷酸等的無機酸反應(yīng)而獲得。藥物鹽也能夠通過使化合物與諸如脂肪族或芳香族羧酸或磺酸的有機酸反應(yīng)而獲得，所述有機酸例如乙酸、琥珀酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、煙酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸或萘磺酸。藥物鹽也能夠通過使化合物與堿反應(yīng)形成鹽來獲得，所述鹽如銨鹽；諸如鈉鹽或鉀鹽的堿金屬鹽；諸如鈣或鎂鹽的堿土金屬鹽；諸如二環(huán)己胺、N-甲基-D-葡糖胺、三(羥甲基)甲胺、C1-C7烷基胺、環(huán)己胺、三乙醇胺、乙二胺的有機堿的鹽；以及與諸如精氨酸、賴氨酸等氨基酸的鹽。
若藥物制劑的生產(chǎn)涉及親密混合藥物賦形劑和鹽形式的活性成分，則可以期望使用非堿性的藥物賦形劑即酸性或中性賦形劑。
在各種實施方案中，本文公開的化合物(例如聚合物軛合物和/或其包含的藥劑)能夠單獨使用、與本文公開的其它化合物組合使用或與在本文公開的治療領(lǐng)域中有活性的一種或多種其它藥劑組合使用。
另一方面，本公開內(nèi)容涉及藥物組合物，其包括一種或多種生理可接受的表面活性劑、載體、稀釋劑、賦形劑、流平劑、助懸劑、成膜物質(zhì)和包被助劑，或其組合；和本文公開的化合物(例如聚合物軛合物和/或其包含的藥劑)。用于治療的可接受的載體或稀釋劑在制藥領(lǐng)域是公知的，并描述在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明頓制藥學(xué))，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)中，將其以參考的方式整體并入本文。在藥物組合物中可以提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料、甜味劑、香料、矯味劑等。例如，苯甲酸鈉、抗壞血酸和對羥基苯甲酸酯可作為防腐劑加入。此外，可以使用抗氧化劑和助懸劑。在各種實施方案中，醇、酯、硫酸處理的脂肪醇等可用作表面活性劑；蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、結(jié)晶纖維素、甘露醇、輕無水硅酸鹽、鋁酸鎂、鋁酸甲基硅酸鎂、合成硅酸鋁、碳酸鈣、碳酸氫鈉、磷酸氫鈣、羧甲基纖維素鈣等可用作賦形劑；硬脂酸鎂、滑石、硬化油等可用作流平劑；椰子油、橄欖油、芝麻油、花生油、大豆油可用作助懸劑或潤滑劑；作為諸如纖維素或糖的碳水化合物的衍生物的鄰苯二甲酸醋酸纖維素或作為聚乙烯衍生物的甲基乙酸酯-甲基丙烯酸酯共聚物可用作助懸劑；以及諸如鄰苯二甲酸酯等的增塑劑可用作助懸劑。
術(shù)語“藥物組合物”是指本文公開的化合物(如聚合物軛合物和/或其包含的藥劑)與諸如稀釋劑或載體的其它化學(xué)組分的混合物。藥物組合物有助于向有機體的給予化合物。該領(lǐng)域中有多種給予化合物的技術(shù)，包括但不限于口服、注射、氣霧劑、腸道外和局部給藥。藥物組合物也能夠通過使化合物與無機或有機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對苯甲磺酸、水楊酸等反應(yīng)而獲得。
術(shù)語“載體”是指有助于化合物進入細胞或組織的化學(xué)物質(zhì)。例如二甲亞砜(DMSO)是常用載體，因為它有助于許多有機化合物吸收進入有機體的細胞或組織。
術(shù)語“稀釋劑”是指會溶解所關(guān)注的化合物(如聚合物軛合物和/或其包含的藥劑)并且使所述化合物的生物活性形式穩(wěn)定的稀釋在水中的化合物。本領(lǐng)域中使用溶解在緩沖液中的鹽作為稀釋劑。一常用的緩沖液是磷酸鹽緩沖的生理鹽水，因為它模仿人類血液的鹽條件。由于緩沖鹽能夠在低濃度下控制溶液的pH，被緩沖的稀釋劑很少改變化合物的生物活性。術(shù)語“生理可接受”是指不使化合物失去生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。
能夠?qū)⒈疚乃龅乃幬锝M合物本身給予人類患者，或者在組合治療中將它們以與其它活性成分混合的藥物組合物給予人類患者，或者將它們以與適當?shù)妮d體或賦形劑混合的藥物組合物給予人類患者。本申請的化合物的配制和給藥技術(shù)可以在Remington’s PharmaceuticalSciences(雷明頓制藥學(xué))，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)中找到。
適當?shù)慕o藥途徑可以包括例如口服、直腸、透粘膜、局部、或腸內(nèi)給藥；腸道外釋放，包括肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、脊髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射?；衔?如聚合物軛合物和/或其包含的藥劑)也能夠以緩釋或控釋劑型給藥，包括積存注射、滲透泵、丸劑、透皮(包括電遷移)貼劑等用于以預(yù)定速率延時和/或定時、脈沖給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可以以其已知的方式生產(chǎn)，例如，通過常規(guī)的混合、溶解、造粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包囊、包埋或壓片方法。
因此用于本發(fā)明用途的藥物組合物可以以常規(guī)方式使用包含賦形劑和助劑的一種或多種生理可接受的載體配制，所述賦形劑助劑有助于處理活性化合物使之進入能夠藥用的制劑中。適當?shù)呐浞揭蕾囉谒x的給藥途徑?？梢允褂萌魏芜m當?shù)牟⑶覟楸绢I(lǐng)域諸如以上的Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明頓制藥學(xué))中所理解的公知技術(shù)、載體和賦形劑。
能夠?qū)⒖勺⑸渌幬镏苽涑沙Ｒ?guī)形式，可作為液體溶液或混懸液、適用于注射前的溶液或液體中混懸液的固體形式、或乳液。適當?shù)馁x形劑例如是水、生理鹽水、右旋糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸等。此外，若需要，可注射的藥物組合物可以含有少量無毒的輔助物質(zhì)，如潤濕劑、pH緩沖劑等。生理相容的緩沖液包括但不限于Hanks溶液、Ringer溶液或生理鹽水緩沖液。若需要，可使用吸收促進制劑(例如脂質(zhì)體)。
對于透粘膜給藥，可以在制劑中使用對待滲透的屏障合適的滲透劑。
用于通過諸如團注或連續(xù)輸注進行腸胃外給藥的藥物制劑包括可水溶形式的活性化合物的水溶液。此外，可以將活性化合物的混懸液制備成適當?shù)挠托宰⑸浠鞈乙骸＿m當?shù)挠H脂性溶劑或介質(zhì)包括脂肪油如芝麻油；或其它有機油如大豆油、柚子油或杏仁油；或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、或甘油三酯；或脂質(zhì)體。水性注射混懸液可以含有增加混懸液粘性的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或右旋糖酐。任選地，混懸液還可以含有適當?shù)姆€(wěn)定劑或增加化合物溶解度以允許制備高度濃縮溶液的藥劑。注射用制劑可以是單位劑型，例如在安瓿中或與加入的防腐劑在多劑量容器中。組合物可以在油性或水性介質(zhì)中采取諸如混懸液、溶液或乳液的形式，并可含有諸如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑的配方(formulatory)劑。或者，活性成分可以是粉末形式用于在使用前與諸如無菌無熱原水的適當介質(zhì)組合。
對于口服給藥，能夠很容易通過將活性化合物與本領(lǐng)域公知的藥物可接受載體組合而配制化合物。這樣的載體使本發(fā)明的化合物能夠被配制成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體劑、凝膠、糖漿、懸浮液等用于待治療患者口服攝取。能夠通過將活性化合物與固體賦形劑組合、任選地研磨所得混合物并在加入適當?shù)闹鷦?若需要)之后處理顆粒混合物以獲得片劑或糖衣丸核來獲得用于口服使用的藥物制劑。特別地，適當?shù)馁x形劑是填充劑如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、白明膠、樹脂黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。若需要，可加入崩解劑如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽如海藻酸鈉。提供具有適當?shù)陌碌奶且峦韬?。為此，可使用濃縮的糖溶液，其可任選地含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝膠、聚乙二醇，和/或二氧化肽、漆溶液，以及適當?shù)挠袡C溶劑或溶劑混合物。可以向片劑或糖衣丸包衣中加入染料或顏料以識別或表征活性化合物劑量的不同組合。為此，可使用濃縮的糖溶液，其可任選地含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝膠、聚乙二醇，和/或二氧化肽、漆溶液，以及適當?shù)挠袡C溶劑或溶劑混合物?？梢韵蚱瑒┗蛱且峦璋轮屑尤肴玖匣蝾伭弦宰R別或表征活性化合物劑量的不同組合。
能夠口服使用的藥用制劑包括由白明膠制成的推入配合膠囊，以及由白明膠和諸如甘油和山梨醇的增塑劑制成的柔軟密封膠囊。推入配合膠囊能夠含有與諸如乳糖的填充劑、諸如淀粉的粘合劑和/或諸如滑石或硬脂酸鎂的潤滑劑以及任選的穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，可將活性化合物溶解或混懸在諸如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇的適當液體中。此外，可以加入穩(wěn)定劑。所有口服給藥制劑的劑量應(yīng)當適于這樣的給藥方式。
對于口腔給藥，組合物可以采取以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。
對于吸入給藥，使用適當?shù)耐七M劑將用于本發(fā)明用途的化合物以來自加壓包或噴霧器的氣溶膠噴霧表現(xiàn)的形式方便地輸送，所述適當?shù)耐七M劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適當?shù)臍怏w。在加壓氣溶膠的情況下，可以通過提供定量輸送閥門來確定劑量單元。在吸入器或吹藥器中使用的例如白明膠的膠囊或筒可以配制成含有化合物和諸如乳糖或淀粉的適當粉末基質(zhì)(base)的粉末混合物。
本文還公開了制藥領(lǐng)域公知的用于包括眼內(nèi)、鼻內(nèi)和耳內(nèi)輸送的各種藥物組合物。這些用途的適當滲透劑是本領(lǐng)域公知的。眼內(nèi)輸送的藥物組合物包括活性化合物的水性滴眼液，其為可水溶形式如滴眼液、或結(jié)冷膠形式(Shedden et al.，Clin.Ther.，23(3)440-50(2001))或水凝膠形式(Mayer et al.，Ophthalmologica，210(2)101-3(1996))；眼用軟膏；眼用混懸液如微粒、懸浮于液體載體介質(zhì)中的含藥小聚合顆粒(Joshi，A.，J Ocul.Pharmacol，10(1)29-45(1994))、脂溶制劑(Aim et al.，Prog.Clin.Biol.Res.，312447-58(1989))和微球(Mordenti，Toxicol.Sci，52(1)101-6(1999))；以及眼用膜劑。所有上述參考文獻在此都整體引入作為參考。最通常并優(yōu)選將這樣適當?shù)乃幬镏苿┡渲瞥蔁o菌、等滲和緩沖使之穩(wěn)定舒適。鼻內(nèi)輸送的藥物組合物還可以包括滴劑和噴霧劑，其通常制備為在許多方面模仿鼻分泌物以確保正常纖毛作用的維持。如在整體引入作為參考的Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明頓制藥學(xué))，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)中公開的以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，適當?shù)呐浞阶钔ǔ２?yōu)選等滲、稍微緩沖以維持5.5至6.5的pH，并且最通常并優(yōu)選包括抗微生物防腐劑和適當?shù)乃幬锓€(wěn)定劑。耳內(nèi)輸送的藥物制劑包括在耳中局部應(yīng)用的混懸液和軟膏。這樣的耳制劑的常用溶劑包括甘油和水。
也可以將化合物配制在諸如栓劑或保留灌腸劑的直腸組合物中，例如含有諸如可可油或其它甘油酯的常規(guī)栓劑基質(zhì)。
除前述制劑外，也可以將化合物配制成積存制劑。這樣的長效制劑可以通過植入(如皮下或肌肉內(nèi))或肌肉內(nèi)注射給藥。因此，例如，化合物可以與適當?shù)木酆匣蚴杷镔|(zhì)配制(例如作為可接受的油中的乳劑)或與離子交換樹脂配制，或配制為難溶衍生物，如難溶鹽。
對于疏水化合物，適當?shù)乃幬镙d體可以是助溶劑體系，其包含芐醇、非極性表面活性劑、可與水混溶的聚合物和水相。所用的常見助溶劑體系是VPD助溶劑系統(tǒng)，其為3％w/v芐醇、8％w/v非極性表面活性劑Polysorbate 80TM和65％w/v聚乙二醇300的溶液，用純乙醇補足體積。自然，可以大幅度改變助溶劑體系的比例而不破壞其溶解性和毒性特征。此外，可以改變助溶劑成分本身例如，可以用其它的低毒非極性表面活性劑代替POLYSORBATE 80TM；可以改變聚乙二醇的片段大?。黄渌锵嗳莸木酆衔锟梢匀〈垡叶?，如聚乙稀吡咯烷酮；并且其它糖或多糖可以取代右旋糖。
或者，可以使用疏水藥物化合物的其它輸送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是疏水藥物輸送介質(zhì)或載體眾所周知的實例。可以使用某些有機溶劑如二甲亞砜，盡管通常要以毒性較大為代價?；蛘?，可以用緩釋系統(tǒng)如含有治療劑的固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)輸送化合物。各種緩釋材料已經(jīng)建立并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，緩釋膠囊可以釋放藥物數(shù)小時或數(shù)周，高至超過100天。根據(jù)治療劑的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定性，可以使用其它策略穩(wěn)定蛋白。
打算細胞內(nèi)給藥的藥劑可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)給藥。例如，可以將這樣的藥劑封入脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體形成時存在于水溶液中的所有分子并入水性內(nèi)部。脂質(zhì)體內(nèi)容物都被保護不受外部微環(huán)境的影響，而且因為脂質(zhì)體與細胞膜融合而被有效地輸送入細胞的細胞質(zhì)內(nèi)?？梢杂媒M織特異性抗體包被脂質(zhì)體。期望的器官會靶向并選擇性吸收脂質(zhì)體?；蛘撸〉氖杷袡C分子可以直接細胞內(nèi)給藥。
可以將其它治療劑或診斷劑并入藥物組合物?；蛘呋虼送?，可以將藥物組合物與含有其它治療劑或診斷劑的其它組合物組合。
給藥方法 可以通過任何適當方法將化合物或藥物組合物給予患者。給藥方法的非限制性實例包括(a)通過口服途徑給藥，包括以膠囊、片劑、顆粒、噴霧劑、糖漿或其它這樣的形式給藥；(b)通過如直腸、陰道、尿道內(nèi)、眼內(nèi)、鼻內(nèi)或耳內(nèi)的非口服途徑給藥，包括作為水混懸液或油藥劑等或作為滴劑、噴霧劑、栓劑、軟膏、油膏等給藥；(c)通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、眶內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)等注射，包括輸液泵輸送；(d)局部給藥如通過在腎臟或心臟區(qū)域直接注射，如通過積存植入；以及(e)局部給藥；本領(lǐng)域技術(shù)人員認為適當?shù)氖够钚曰衔锱c活組織接觸的方法。
適于給藥的藥物組合物包括含有有效量的活性成分以實現(xiàn)其預(yù)期目的的組合物。作為劑量而要求的本文公開的化合物的治療有效量會取決于給藥途徑、所治療的包括人在內(nèi)的動物類型和所考慮的具體動物的身體特征。能夠調(diào)整劑量以實現(xiàn)期望效果，但是會取決于諸如體重、飲食、同時使用的藥物的因素，以及醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)人員會認可的其它因素。更具體地，治療有效量是指有效地預(yù)防、緩解或改善疾病癥狀或延長所治療對象存活時間的化合物的量。治療有效量的測量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，尤其是根據(jù)本文提供的詳細公開內(nèi)容。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，待給予的體內(nèi)有用劑量和具體給藥模式會根據(jù)年齡、體重和所治療的哺乳動物種類、使用的具體化合物以及使用這些化合物的具體用途而變化。有效劑量水平即實現(xiàn)期望結(jié)果必需的劑量水平的測定能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)藥理學(xué)方法完成。通常，產(chǎn)物的人體臨床應(yīng)用開始于較低的劑量水平，增加劑量水平直至達到期望效果?；蛘?，能夠用可接受的體外研究使用確立的藥理學(xué)方法來確定通過本發(fā)明的方法鑒定的組合物的有用劑量和給藥途徑。
在非人類的動物研究中，潛在產(chǎn)物的應(yīng)用開始與較高的劑量水平，降低劑量水平直至不再達到期望效果或不良副作用消失。根據(jù)期望效果和治療表現(xiàn)，劑量可以大幅度變化。通常，劑量可以為約10μg/kg至100mg/kg體重，優(yōu)選為約100μg/kg至10mg/kg體重。或者可以如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的那樣，根據(jù)患者的表面積計算。
本發(fā)明的藥物組合物的準確制劑、給藥途徑和劑量能夠由個體醫(yī)師根據(jù)患者情況進行選擇。(參見例如，F(xiàn)ingl et al.1975，“ThePharmacological Basis of Therapeutics(治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ))”中，其整體在此引入作為參考，具體參考Ch.1，p.1)。通常，向患者給予的劑量范圍能夠是約0.5至1000mg/kg患者體重。根據(jù)患者的需要，劑量可以是單獨的一個或在一日或多日過程中所給予的兩個或多個的系列。當對于至少某種條件已確立了化合物的人體劑量的情況下，本發(fā)明會使用那些相同的劑量，或確立的人體劑量的約0.1％至500％、優(yōu)選約25％至250％的劑量。沒有確立人體劑量時，如對于新發(fā)現(xiàn)的藥物組合物的情形，適當?shù)娜梭w劑量能夠從ED50或ID50值或從來自體外或體內(nèi)研究的其它適當值推斷，如通過動物中的毒性研究和有效性研究所定性的那些值。
應(yīng)當指出，主治醫(yī)師會知道如何以及何時由于毒性或器官功能失常而停止、中斷或調(diào)整給藥。相反，主治醫(yī)師也會知道如果臨床響應(yīng)不夠則將治療調(diào)整至較高水平(排除毒性)。在所關(guān)注的疾病的治療中給藥劑量的大小會隨著待治療疾病的嚴重程度和給藥途徑而變化。疾病的嚴重程度可以通過例如標準預(yù)后評價方法部分地評價。此外，劑量和可能的劑量頻率也會根據(jù)個體患者的年齡、體重和響應(yīng)而變化。與如上討論相當?shù)某绦蚩梢杂糜讷F醫(yī)學(xué)。
雖然準確的劑量會根據(jù)不同的藥物來確定，但是在多數(shù)情況下，能夠?qū)┝孔龀瞿承w納。成人患者的日劑量可以是，例如，每一活性成分0.1mg至2000mg的口服劑量，優(yōu)選1mg至500mg，例如5至200mg。在其它實施方案中，使用的每一活性成分的靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)劑量為0.01mg至100mg，優(yōu)選0.1mg至60mg，例如1mg至40mg。在給予藥物可接受鹽的情況下，劑量可以游離堿來計算。在某些實施方案中，組合物每日給藥1至4次?；蛘弑景l(fā)明的組合物可以通過連續(xù)靜脈輸注給藥，優(yōu)選每一活性成分的劑量高至每天1000mg。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，在某些情形下，為了有效和侵略性地治療特別嚴重的疾病或感染，可能必須以超過或甚至遠超過上述優(yōu)選劑量范圍的量給予本文公開的化合物。在某些實施方案中，在持續(xù)治療期內(nèi)給予化合物，例如一周或更長，或數(shù)月或數(shù)年。
可以獨立地調(diào)整劑量和間隔以提供足以維持調(diào)節(jié)效果或最低有效濃度(MEC)的活性部分的血漿水平。MEC會隨每一化合物而變化但是能夠從體外數(shù)據(jù)估算。達到MEC必需的劑量取決于個體特征和給藥途徑。然而，HPLC測定和生物測定能夠用來測定血漿濃度。
劑量間隔也能夠用MEC值確定。應(yīng)當使用維持血漿水平在10％至90％的時間內(nèi)、優(yōu)選在30％至90％的時間內(nèi)、并且最優(yōu)選在50％至90％的時間內(nèi)高于MEC的方案給予組合物。
在局部給藥或選擇性吸收的情況下，藥物的有效局部濃度可以與血漿濃度無關(guān)。
所給予的組合物的量可以依賴于待治療的個體，依賴于個體的體重、疾病的嚴重程度、給藥方式和處方醫(yī)師的判斷。
能夠使用已知方法評價本文公開的化合物(如聚合物軛合物和/或其包含的藥劑)的效能和毒性。例如，具體化合物或具有某些相同化學(xué)部分的化合物子集的毒理學(xué)可以通過測定對細胞系如哺乳動物優(yōu)選人細胞系的體外毒性來建立。這種研究的結(jié)果通常預(yù)示在動物如哺乳動物，或更具體地，人中的毒性?；蛘?，可以用已知方法測定具體化合物在動物模型如小鼠、大鼠、兔或猴中的毒性。具體化合物的效能可以用若干公認方法確定，如體外方法、動物模型或人體臨床試驗。幾乎每一類疾病狀態(tài)都存在公認的體外模型，所述疾病狀態(tài)包括但不限于癌、心血管疾病和各種免疫功能失常。類似地，可以用可接受的動物模型來確立治療這樣的疾病狀態(tài)的化學(xué)物質(zhì)的效能。當選擇測定效能的模型時，現(xiàn)有技術(shù)能夠引導(dǎo)技術(shù)人員選擇適當?shù)哪Ｐ?、劑量、給藥途徑和方案。當然，也能夠使用人體臨床試驗來測定化合物在人體中的效能。
若需要，可將組合物裝在可以含有一個或多個含有活性成分的單位劑量形式的包或分配裝置中。包可以包含例如金屬或塑料薄片，如水泡眼包裝。包或分散裝置可以伴有給藥說明書。塊或分散裝置還可以伴有與容器有關(guān)的告示，其形式由管理藥物的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定，所述告示反映出該機構(gòu)批準該藥物形式用于人體或獸醫(yī)給藥。這樣的告示可以是例如美國食品藥品管理局批準用于處方藥的標簽，或批準的產(chǎn)品插頁。也可以制備包含配制在相容的藥物載體中的本發(fā)明化合物的組合物，將其置于適當?shù)娜萜髦胁耸居糜谥委熕镜募膊顟B(tài)。
實施例 提供以下實施例的目的是進一步描述本文所述的實施方案，而不是限制本發(fā)明的范圍。
材料 具有不同分子量的聚L-谷氨酸鈉(基于多角度光散射(MALS)的平均分子量為41,400(PGA(97k))、17,600(PGA(44k))、16,000(PGA(32k))和10,900(PGA(21k))道爾頓)、1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、羥基苯并三唑(HOBt)、吡啶、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)、醋酸釓、氯仿和碳酸氫鈉購自Sigma-Aldrich化學(xué)公司。用2N鹽酸溶液將聚L-谷氨酸鹽轉(zhuǎn)化成聚L-谷氨酸。三氟乙酸(TFA)購自Bioscience。OmniscanTM(釓雙胺)購自GE healthcare。
L-天冬氨酸β-叔丁酯α-叔丁酯鹽酸鹽(H-Asp(OtBu)-OtBu·HCl)、L-谷氨酸二叔丁酯鹽酸鹽(H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl)、N-α-CBZ-L-谷氨酸α-芐基酯(Z-Glu-OBzl)購自Novabiochem(La Jolla，CA)。紫杉醇購自PolyMed(Houston，Texas)。3H-紫杉醇購自Moravek Biochemicals，Inc.。用于細胞毒性MTT測試(細胞生存能力)的磺酰羅丹明B染料購自Molecular Imaging Products Company(Michigan)?；瘜W(xué)制品p-NH2-Bn-DPTA-五(叔丁酯)購自Macrocyclics(Dallas，Texas)。Texas

尸胺(德克薩斯紅-NH2染料)購自Molecular Probe。牛血清購自Sigma。將其在10,000rpm下離心以除去任何顆粒物質(zhì)。
1H NMR得自Joel(400MHz)，粒徑通過ZetalPals(BrookhavenInstruments Corporation)測定。微波化學(xué)在Biotage中進行。聚合物的分子量通過與多角度光散射(MALS)(Wyatt Corporation)檢測器組合的體積排除色譜(SEC)測定 SEC-MALS分析條件 ■HPLC系統(tǒng) Agilent 1200 ■柱Shodex SB 806M HQ (普魯蘭多糖的排除限制是20,000,000，粒徑 13微米，尺寸(mm)ID×長度為8.0×300) ■流動相1×DPBS或1％LiBr的DPBS溶液(pH 7.0) ■流速 1ml/min ■MALS檢測器來自Wyatt的DAWN HELEOS ■DRI檢測器 來自Wyatt的Optilab rEX ■在線粘度計來自Wyatt的ViscoStar ■軟件來自Wyatt的ASTRA 5.1.9 ■樣品濃度1mg/ml至2mg/ml ■進樣體積100μl 測量中使用的聚合物dn/dc值為0.185。
BSA用作允許實際樣品前的對照。
使用上述系統(tǒng)和條件(下文中稱為具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng))，試驗發(fā)現(xiàn)起始聚合物(Sigma-Aldrich用其具有MALS的系統(tǒng)報道的41,400、17,600、16,000和10,900道爾頓平均分子量的聚L-谷氨酸鈉鹽)的平均分子量分別為49,000、19,800、19,450和9,400道爾頓。
用紫外/可見分光光度計(Lambda Bio 40，PerkinElmer)基于用甲醇中已知濃度的紫杉醇產(chǎn)生的標準曲線(λ＝228nm)估算聚合物-紫杉醇軛合物中紫杉醇的含量。
根據(jù)以前的報道進行聚L-谷氨酸鹽-紫杉醇軛合物(PGA-PTX)的合成。參見See Li et al.“Complete Regression of Well-established tumorsusing a novel water-soluble poly(L-glutamic acid)-paclitaxel conjugate(用新型水溶性聚(L-谷氨酸)-紫杉醇軛合物使充分確立的腫瘤完全衰退).”Cancer Research 1998，55，2404-2409，其內(nèi)容整體在此引入作為參考。由平均分子量分別為49,000和19,450道爾頓的聚谷氨酸制備的PGA(97k)-PTX-20和PGA(32k)-PTX-20中紫杉醇的量通過紫外分光光度計在λ＝229nm下定量為20％重量比。通過降低紫杉醇的量，對于由平均分子量為49,000道爾頓的聚谷氨酸得到的PGA(97k)-PTX-10獲得基于總重的10％重量比。
實施例1 根據(jù)圖1例示的一般反應(yīng)式如下制備聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺) 將基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為49,000道爾頓的聚谷氨酸(0.75g)部分地加入100mL二氯甲烷(DCM)中。加入DCC(8.7mL，1M的DCM溶液)并攪拌20分鐘。然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去DCM，并用DMF(80mL)溶解殘余物。加入H-asp(OtBu)-(OtBu)(2.44g)、吡啶(4mL)和DMAP(0.1g)并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物15至24小時。將反應(yīng)混合物過濾入酸性水溶液中(500mL，基于pH試紙的pH小于2)。形成白色沉淀，過濾并用水洗滌。然后將白色沉淀溶解在丙酮(100mL)中。將溶液通過0.2μm過濾器過濾，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮。通過1H-NMR由1.4ppm處O-tBu峰的存在證實了中間體聚合物的結(jié)構(gòu)。
在DCM中用95％的三氟乙酸(TFA)處理中間體聚合物5至8小時。然后加入DCM直到沉淀形成。除去溶劑，殘余物用更多的DCM洗滌。將殘余物置于真空中以除去DCM。將殘余物重新溶解在甲醇和水中然后用半透膜纖維素(分子量截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析過夜(換水4次)。聚-(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)透析后在水中pH為7時基本上光學(xué)透明。冷凍干燥后獲得聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)(1.2g)白色粉末。通過1H-NMR由1.4ppm處O-tBu峰的消失證實了聚合物。
實施例2 根據(jù)圖2例示的一般反應(yīng)式如下制備聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)-聚L-谷氨酸 將基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為49,000道爾頓的聚谷氨酸(0.075g)部分地溶解于DMF(3mL)中。然后加入DCC(130mg)、H-asp(OtBu)-(OtBu)(0.11g)、吡啶(200μL)和DMAP(0.010g)。在120℃下用微波方法使反應(yīng)進行30分鐘。然后將反應(yīng)冷卻至室溫。在通過用薄層柱(TLC，乙酸乙酯中的Rf＝0.4)監(jiān)測到H-asp(OtBu)-(OtBu)完全消失后，反應(yīng)完成。完成后，將反應(yīng)混合物過濾入酸性水溶液中(500mL，基于pH試紙的pH小于2)。形成白色沉淀，過濾并用水洗滌。然后將白色沉淀溶解在丙酮(50mL)中。將溶液過濾入碳酸氫鈉溶液(0.5M)中然后用半透膜纖維素(分子量截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析過夜(換水4次)。冷凍干燥后獲得白色中間體聚合物。通過1H-NMR由1.4ppm處O-tBu峰的存在證實了中間體聚合物的結(jié)構(gòu)。
然后在DCM中用95％的三氟乙酸(TFA)處理中間體聚合物5小時。加入DCM直到沉淀形成。然后除去溶劑，殘余物用另外的DCM洗滌。將殘余物置于真空中以除去DCM。將殘余物重新溶解在甲醇和水中并用半透膜纖維素(分子量截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析過夜(換水4次)。冷凍干燥后獲得聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)-聚L-谷氨酸(0.10g)白色粉末。通過1H-NMR由1.4ppm處OtBu基團的峰的消失證實了聚合物的結(jié)構(gòu)。
實施例3 根據(jù)圖3例示的一般反應(yīng)式如下制備聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺) 將基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為49,000道爾頓的聚谷氨酸鈉鹽(10.0g)、EDC(33.8g)、HOBt(15.9g)和H-asp(OtBu)-(OtBu)-HCl(32.0g)在DMF(700mL)中混合。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌15至24小時，然后傾入水溶液中。形成白色沉淀，過濾并用水洗滌。然后將中間體聚合物冷凍干燥。通過1H-NMR由1.4ppm處OtBu峰的存在證實了中間體聚合物的結(jié)構(gòu)。
用TFA(200mL)處理中間體聚合物5小時。然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)部分除去TFA。向殘余物中加入水并將殘余物用半透膜纖維素(分子量截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析過夜(換水4次)。聚-(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)透析后在水中pH為7時是透明的。冷凍干燥后獲得聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)(15.0g)白色粉末。通過1H-NMR由1.4ppm處O-tBu峰的消失證實了聚合物的結(jié)構(gòu)。測定聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)的平均分子量，結(jié)果為99,400道爾頓。
實施例3a-3b 用實施例3的操作用具有不同平均分子量(基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)為19,800和9,400道爾頓)的起始聚谷氨酸鈉鹽進行聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)的合成，測定所得聚合物聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)的平均分子量，結(jié)果分別為39,700和17,700道爾頓。
實施例4 根據(jù)圖4例示的一般反應(yīng)式如下制備聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺) 將基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為19,800道爾頓的聚谷氨酸鈉鹽(0.40g)、EDC(1.60g)、HOBt(0.72g)和H-glu(OtBu)-(OtBu)-HCl(1.51g)在DMF(30mL)中混合。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌15至24小時，然后傾入蒸餾水溶液(200mL)中。形成白色沉淀，過濾并用水洗滌。然后將中間體聚合物冷凍干燥。通過1H-NMR由1.4ppm處O-tBu峰的存在證實了中間體聚合物的結(jié)構(gòu)。
用TFA(20mL)處理中間體聚合物5至8小時。然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)部分除去TFA。向殘余物中加入水并將殘余物用半透膜纖維素(分子量截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析過夜(換水4次)。聚(γ-L-谷氨?；劝滨０?透析后在水中pH為7時是透明的。冷凍干燥后獲得聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)(0.6g)白色粉末。通過1H-NMR由1.4ppm處O-tBu峰的消失證實了聚合物的結(jié)構(gòu)。測定聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)的分子量，結(jié)果為38,390道爾頓。
實施例4a-4c 用實施例4的操作用具有不同平均分子量(基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)為49,000、19,450和10,900道爾頓)的聚谷氨酸鈉鹽進行聚-(γ-L-谷氨?；劝滨０?的合成。測定所得聚合物聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)的平均分子量，結(jié)果分別為110,800、37,400和19,800道爾頓。
實施例5 根據(jù)圖5例示的一般反應(yīng)式如下制備聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)-聚L-谷氨酸 將基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為49,000道爾頓的聚谷氨酸鈉鹽(0.50g)、EDC(0.26g)、HOBt(0.11g)和H-glu(OtBu)-(OtBu)-HCl(0.05g)在DMF(30mL)中混合。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌15至24小時，然后傾入水溶液(500mL)中。形成白色沉淀，過濾并用水洗滌。然后將中間體聚合物冷凍干燥。通過1H-NMR由1.4ppm處O-tBu峰的存在證實了中間體聚合物的結(jié)構(gòu)。
用TFA(20mL)處理中間體聚合物5至8小時。然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)部分除去TFA。向殘余物中加入水并將殘余物用半透膜纖維素(分子量截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析過夜(換水4次)。聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)-聚L-谷氨酸透析后在水中pH為7時是透明的。冷凍干燥后獲得聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)-聚L-谷氨酸(0.25g)白色粉末。通過1H-NMR由1.4ppm處O-tBu峰的消失證實了聚合物的結(jié)構(gòu)。測定聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)的平均分子量，結(jié)果為57,400道爾頓。
實施例6 根據(jù)圖6例示的一般反應(yīng)式如下制備本文稱為PGA-97-A-德克薩斯紅的聚合物軛合物 將平均分子量為99,400道爾頓的聚谷氨酸鈉鹽(100mg)部分地溶解在DMF(3mL)中。加入無水DCC(130mg)、德克薩斯紅-NH2染料(15mg)、吡啶(200μL)和DMAP(10mg)。在120℃下用微波方法使反應(yīng)進行30分鐘。然后將反應(yīng)冷卻至室溫。將反應(yīng)混合物過濾入酸性水溶液(200mL，基于pH試紙的pH小于2)中。形成紫色沉淀，過濾并用水洗滌。然后將紫色沉淀溶解在丙酮(50mL)中。將溶液過濾入碳酸氫鈉溶液(0.5M)中并用半透膜纖維素(分子量截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析過夜(換水4次)。冷凍干燥后獲得PGA-97-A-德克薩斯紅(80mg)紫色固體。
實施例7 根據(jù)圖7例示的一般反應(yīng)式如下制備本文稱為PGA-97-A-DTPA的聚合物軛合物 將平均分子量為99,400道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)(100mg)溶解于DMF(5mL)中。然后向溶液中加入DCC(200mg)。將DMF(5mL)中的p-NH2-Bn-DTPA-五(叔丁酯)(400mg)也加入到反應(yīng)混合物中。然后加入無水吡啶(300μL)和催化劑DMAP(20mg)。攪拌混合物并在微波條件下加熱至高達120℃并保持30分鐘。然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并形成一些沉淀。將沉淀過濾并用在水中稀釋的鹽酸將上清液酸化至pH約2。含有中間體聚合物的溶液用纖維素膜(分子量截止10,000道爾頓)在水中透析2天，并將中間體聚合物冷凍干燥。用1H-NMR證實中間體聚合物的結(jié)構(gòu)。
用TFA處理中間體聚合物4小時。然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA。將殘余物溶解于水中并將溶液用纖維素膜(分子量截止10,000道爾頓)透析。聚(γ-L-谷氨?；劝滨０?-聚-L-谷氨酸透析后在水中pH為7時是透明的。然后將聚合物冷凍干燥。通過1H-NMR證實PGA-97-A-DTPA的結(jié)構(gòu)。
實施例8 根據(jù)圖8例示的一般反應(yīng)式如下制備本文稱為PGA-97-A-DTPA-Gd(III)的聚合物軛合物 將實施例7獲得的PGA-97-A-DTPA在緩沖液中用醋酸Gd(III)處理4小時。在水中用纖維素膜(分子量截止10,000道爾頓)透析反應(yīng)溶液3天并冷凍干燥，獲得聚合物(86mg)。通過電感耦合等離子體-光發(fā)射光譜(ICP-OES)測定對Gd(III)進行定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gd(III)的存在量根據(jù)釓ICP標準(Ricca Chemical Company，Arlington，Texas(Cat No.PGD1KN-500))為聚合物重量的7％重量比。
實施例9 根據(jù)圖9例示的一般反應(yīng)式如下制備本文稱為PGA-97-A-10的聚合物軛合物 將平均分子量為99,400道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)(351mg)部分地溶解于DMF(40mL)中。分別向溶液中加入DCC(120mg)和紫杉醇(44mg)。然后向混合物中加入DMF(10mL)和催化量的DMAP(100mg)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1天。用TLC確認游離紫杉醇的消失來證實反應(yīng)的完成。將混合物傾入氯仿(300mL)中并形成沉淀。過濾后獲得殘余物，然后將殘余物再次溶解在甲醇中。加入0.2N鹽酸水溶液誘導(dǎo)沉淀并在10,000rpm下離心，然后分離殘余物。然后將殘余物再次溶解在0.5M碳酸氫鈉溶液中。將聚合物溶液在去離子水中用纖維素膜(分子量截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析1天。獲得澄清溶液并冷凍干燥。獲得PGA-97-A-10(340mg)并用1H-NMR證實。PGA-97-A-10中紫杉醇的含量通過UV光譜法測定為10％重量比。游離紫杉醇的消失也通過TLC證實。
實施例10 根據(jù)圖10例示的一般反應(yīng)式如下制備本文稱為PGA-97-A-20的聚合物軛合物 將平均分子量為99,400道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)(750mg)部分的溶解于DMF(50mL)中。分別向溶液中加入EDC(450mg)和紫杉醇(210mg)。將用作催化劑的DMAP(100mg)加入混合物中。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1天。用TLC證實反應(yīng)的完成。將混合物傾入0.2N鹽酸水溶液(300mL)中。沉淀形成，并在10,000rpm下離心后收集。將殘余物再次溶解在0.5M碳酸氫鈉溶液中。將聚合物溶液在去離子水中用纖維素膜(分子量截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析1天(換水4次)。獲得澄清溶液并冷凍干燥。獲得PGA-97-A-20(700mg)并用1H-NMR證實結(jié)構(gòu)。PGA-97-A-20中紫杉醇的含量通過UV光譜法測定為20％重量比。
實施例10a-10b 用實施例10的操作用平均分子量分別為39,700和17,700道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)聚合物合成本文稱為PGA-44-A-20和PGA-21-A-20的聚合物軛合物。用UV光譜法測定聚合物中紫杉醇的含量為20％重量比。
實施例10c 用實施例10的操作用平均分子量為39,700道爾頓的的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)合成本文稱為PGA-44-A-19的聚合物軛合物，對操作的變化是加入紫杉醇和3H-紫杉醇的混合物，而不是僅加入紫杉醇。用UV光譜法測定聚合物中紫杉醇的含量為19％重量比。
實施例11 根據(jù)圖11例示的一般反應(yīng)式如下制備本文稱為PGA-97-G-20的聚合物軛合物 將平均分子量為110,800道爾頓的聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)(1.0g)部分地溶解于DMF(55mL)中。向混合物中分別加入EDC(600mg)和紫杉醇(282mg)。將用作催化劑的DMAP(300mg)加入混合物中。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1天。用TLC證實反應(yīng)的完成。將混合物傾入0.2N稀釋的鹽酸水溶液(300mL)中。沉淀形成，并在10,000rpm下離心后收集。將殘余物再次溶解在0.5M碳酸氫鈉溶液中。將聚合物溶液在去離子水中用纖維素膜(分子量截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析1天(換水4次)。獲得澄清溶液并冷凍干燥。獲得PGA-97-G-20(1.1g)并用1H-NMR證實結(jié)構(gòu)。PGA-97-G-20中紫杉醇的含量通過UV光譜法測定為20％重量比。
實施例11a-11c 用實施例11的操作用平均分子量分別為38,390、37,400和19,800道爾頓的聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)聚合物合成本文稱為PGA-44-G-20、PGA-32-G-20和PGA-21-G-20的聚合物軛合物。每一聚合物中紫杉醇的含量用UV光譜法測定為20％重量比。通過增加紫杉醇的量，實現(xiàn)了較高的紫杉醇負載。例如，使用實施例11的操作用平均分子量為37,400道爾頓的聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)聚合物制備了PGA-32-G-40。紫杉醇的含量通過UV光譜法測定為40％重量比。
實施例12a-12c 用實施例11的操作用平均分子量分別為11,800、37,400和19,800道爾頓的聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)聚合物合成本文稱為PGA-97-G-24、PGA-32-G-19和PGA-21-G-19的聚合物軛合物，對操作的變化是加入紫杉醇和3H-紫杉醇的混合物而不是僅加入紫杉醇。PGA-97-G-24、PGA-32-G-19和PGA-21-G-19中紫杉醇的含量通過UV光譜法分別測定為24％重量比、19％重量比和19％重量比。
實施例13 合成C2’-PTX-Glu保護的和C7-PTX-glu保護的
將Z-Glu-OBzl(2.6g)、紫杉醇(2.0g)、EDC(1.5g)和DMAP(300mg)在DMF(20mL)中混合并攪拌15小時。通過TLC的測定表明混合物中沒有游離紫杉醇留下。然后將混合物傾入0.2N的鹽酸水溶液(100mL)中并將有機物萃取如乙酸乙酯(2×50mL)。將有機相合并，并用0.5M碳酸氫鈉(100mL)洗滌。然后將有機相用無水硫酸鈉干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，并將產(chǎn)物用硅膠色譜純化(己烷∶乙酸乙酯，1∶1)。1H-NMR證實所得產(chǎn)物是C2’-PTX-Glu保護的(2.2g)和C7-PTX-glu保護的(0.42g)。
實施例13a C2’-PTX-Glu的合成
將C2’-PTX-Glu保護的(2.2g)和10％Pd/C(0.20g)在脫氧的甲醇(150mL)中攪拌。用氣球引入氫氣。將反應(yīng)氫化4小時。用TLC證實反應(yīng)的完成。將溶液通過0.2μm過濾器過濾。溶液澄清并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇。將粗產(chǎn)物通過反相HPLC用梯度的水和乙腈進一步純化。HPLC純化和冷凍干燥后獲得C2’-PTX-Glu(600mg)，并用LC-MS證實該產(chǎn)物。結(jié)果如圖11所示。C2’-PTX-Glu的HPLC時間為約32分鐘，LC-MS時間為約6.2分鐘。
實施例13b C7-PTX-Glu的合成
將C7-PTX-Glu保護的(250mg)和10％Pd/C(0.20g)在脫氧的甲醇溶液(150mL)中攪拌。用氣球?qū)錃庖肴芤?，并將反?yīng)氫化4小時。通過TLC測試顯示反應(yīng)完成后，將溶液通過0.2μm過濾器過濾。溶液澄清并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇。粗產(chǎn)物通過反相HPLC用梯度水和乙腈進一步純化。HPLC純化和冷凍干燥后獲得C7-PTX-Glu(30mg)，并用LC-MS證實該產(chǎn)物。結(jié)果如圖11所示。C7-PTX-Glu的HPLC時間為約35分鐘，LC-MS時間為約6.4分鐘。
實施例14 根據(jù)圖12例示的一般反應(yīng)式如下制備本文稱為PGA-97-G-27的聚合物軛合物 將聚L-谷氨酸(210mg)溶于DMF(10mL)中。向混合物中加入EDC(65％摩爾比)和NHS(65％摩爾比)并攪拌15小時。然后向混合物中加入C2’-PTX-Glu(105mg)的DMF(2mL)溶液。接著，加入0.5M碳酸氫鈉溶液(3mL)。將反應(yīng)混合物攪拌3小時，然后傾入稀釋的0.2N鹽酸水溶液(300mL)中。沉淀形成并在10,000rpm下離心后收集。
然后將殘余物再次溶解在0.5M碳酸氫鈉溶液中。將聚合物溶液在去離子水中用纖維素膜(截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析1天(換水4次)。獲得澄清溶液并冷凍干燥。所得產(chǎn)物是PGA-97-G-27(1.1g)并用1H-NMR證實。PGA-97-G-27中紫杉醇的含量通過UV光譜法測定為27％重量比。
實施例15 PGA-97-G-阿霉素的合成
將聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)(70mg)、阿霉素(30mg)、EDC(50mg)和HOBt(15mg)溶于DMF(4mL)中。在120℃下將混合物在微波中放置10分鐘。然后傾入0.2N鹽酸溶液中。沉淀形成并收集。將殘余物再次溶解在稀釋的0.5M碳酸氫鈉溶液中并在去離子水中用纖維素膜(截止10,000道爾頓)在反滲透水中透析1天(換水4次)。獲得澄清紅色溶液并冷凍干燥。所得產(chǎn)物PGA-97-G-阿霉素(80mg)的結(jié)構(gòu)用1H-NMR證實。
實施例16 PGA-97-G-喜樹堿的合成
將聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)(70mg)、甘氨酰-喜樹堿(30mg)、EDC(50mg)和HOBt(15mg)溶于DMF(4mL)中。在120℃下將混合物在微波中加熱10分鐘。將混合物傾入DCM(150mL)溶液中，并形成沉淀。將殘余物在稀釋的0.2N鹽酸溶液中超聲處理15分鐘。將所得固體過濾、用蒸餾水洗滌然后冷凍干燥。收集PGA-97-G-喜樹堿(50mg)，為淺黃色固體。
實施例17 溶解度 在不同pH水平下測試各種聚合物的溶解度并與平均分子量為19,800的聚L-谷氨酸對照(PGA-19,800)進行比較。所測試的聚合物是平均分子量為19,800的聚(γ-谷氨?；?-聚L-谷氨酰胺(PGPG-19,800)；平均分子量為37,400的聚(γ-谷氨?；?-聚L-谷氨酰胺(PGPG-37,400)；由起始聚合物PGA-19,800制備并且紫杉醇含量為20％重量比的聚L-谷氨酸鹽-紫杉醇-20％(PGA(32k)-PTX-20)；由起始聚合物聚(γ-谷氨酰基)-聚L-谷氨酰胺-19,800制備并且紫杉醇含量為20％重量比的PGA-21-G-20和由起始聚合物聚(γ-谷氨?；?-聚L-谷氨酰胺-37,400制備并且紫杉醇含量為20％重量比的PGA-32-G-20。
將每一聚合物(5mg)加入pH緩沖液(1mL)中并超聲處理2分鐘。然后將混合物在室溫下放置30分鐘。用肉眼觀測溶解度并用1至10的等級記錄，其中，1為高度不溶，5為絮狀懸浮，10為高度澄清溶液。結(jié)果如下面的表1所示。
表1-溶解度
實施例18a 細胞培養(yǎng)和制備 B16F0細胞購自ATCC(CRL-6322，ATCC美國典型微生物菌種保藏中心，Rockville，MD)并用10％牛血清和100單位/mL青霉素在Dulbecco修飾的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中生長。細胞于37℃下在5％的CO2環(huán)境中生長。將培養(yǎng)基除去并丟棄。用Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS)淋洗細胞，加入胰島素-乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(0.5mL)，并在倒置顯微鏡下觀察以確保它們被分散。加入完全生長培養(yǎng)基(6.0mL至8.0mL)并小心抽吸以吸出細胞。將適當?shù)确莸募毎鞈乙恨D(zhuǎn)移至新培養(yǎng)板中。在進一步試驗前允許細胞于37℃下在5％的CO2中生長24小時。
實施例18b 體外細胞吸收研究 將PGA-97-A-德克薩斯紅和德克薩斯紅染料(TR)分別溶解在DPBS中。將兩種含有染料的溶液都以0.1μM至10μM的最終濃度加入細胞中。將含有化合物的細胞在37℃下孵育8至24小時，之后將細胞用DPBS洗滌三次。在OLYMPUS熒光顯微鏡下檢查處理過的細胞，并分別在591nm和612nm處測定激發(fā)和發(fā)射波長。結(jié)果顯示細胞確實從PGA-97-A-德克薩斯紅中吸收德克薩斯紅染料，但不從單獨的德克薩斯紅中吸收。
含有大致相同數(shù)目的B16F0黑素瘤細胞的三個樣品容器分別與1μM的PGA-97-A-德克薩斯紅、0.1μM的PGA-97-A-德克薩斯紅以及10μM單獨的德克薩斯紅孵育24小時。用Olympus熒光顯微鏡系統(tǒng)上的照相機拍攝每一容器的體外細胞吸收的照片。在含有1μM的PGA-97-A-德克薩斯紅的樣品的照片中，約30％的細胞是紅色的。在含有0.1μM的PGA-97-A-德克薩斯紅的樣品的照片中，約10％的細胞是紅色的。在含有10μM單獨的德克薩斯紅的樣品的照片中，0％的細胞是紅色的。這些結(jié)果顯示細胞從PGA-97-A-德克薩斯紅中吸收染料，但不從單獨的德克薩斯紅中吸收染料。聚合物對細胞間藥物輸送是有效的。
實施例18c 還通過共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)證實了細胞吸收。將細胞核用Hoechst 33342染色5至20分鐘，用DPBS洗滌2至3次并在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。分別在405nm和461nm處測定Hoechst33342的激發(fā)波長和發(fā)射波長。用543nm激光激發(fā)德克薩斯紅(TR)，并于37℃在5％CO2的環(huán)境中在615nm處檢測。結(jié)果顯示，暴露24小時之后，PGA-97-A-德克薩斯紅中的德克薩斯紅染料被B16F0細胞吸收。PGA-97-A-德克薩斯紅中的德克薩斯紅染料在細胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，而被細胞核排斥。
用共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)拍攝顯示1μM下PGA-97-A-德克薩斯紅的體外細胞吸收的照片，以比較細胞質(zhì)中的吸收和細胞核中的吸收。照片顯示PGA-97-A-德克薩斯紅在暴露24小時后被吸收。PGA-97-A-德克薩斯紅在細胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，而被細胞核排斥。
實施例19 同源腫瘤模型 動物Nu/nu小鼠，雌性，6至8周(22g至25g)。通過向右股皮下注射2×105鼠黑素瘤細胞(B16F0)產(chǎn)生孤立性腫瘤。5-7天后當腫瘤達到約500mm3時，向腫瘤皮下注射PGA-97-A-德克薩斯紅或德克薩斯紅染料。
實施例20 PGA-97-A-德克薩斯紅或TR給藥及冰凍切片 在向動物給藥前將PGA-97-A-德克薩斯紅和德克薩斯紅各自溶解在DPBS中并通過0.2μm過濾器過濾。使用實施例19中的同源腫瘤模型向腫瘤靜脈內(nèi)注射100μl PGA-97-A-德克薩斯紅(TR負載為2.5％)和0.1mM至10mM的德克薩斯紅。將腫瘤切開，在最佳切割溫度下植入并在液氮中冷凍。制作冰凍切片(6μm至15μm)并在冰上用含有0.03M蔗糖的4％多聚甲醛固定10至30分鐘。用DPBS洗滌切片兩次，用Hoechst 33342(1μg/ml)染色10分鐘并再次用DPBS洗滌。然后將所述切片用熒光固定介質(zhì)(DakoCytomation)固定并用蓋片覆蓋。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察腫瘤的冰凍切片。圖像顯示，在將PGA-97-A-德克薩斯紅靜脈內(nèi)給藥24小時后，來自PGA-97-A-德克薩斯紅的德克薩斯紅染料在體內(nèi)向腫瘤細胞中聚集，但對于單獨的德克薩斯紅染料未顯示該現(xiàn)象。
拍攝了PGA-97-A-德克薩斯紅和單獨的德克薩斯紅染料的體內(nèi)腫瘤組織吸收的冷凍切片的照片。對于每一染料，拍攝三個不同的橫截面，總共6個圖像。單獨的德克薩斯紅染料的不同橫截面的三張照片經(jīng)觀察為綠色、橙黃色和基本黑色。PGA-97-A-德克薩斯紅的不同橫截面的三張照片經(jīng)觀察為綠色、橙黃色和某些紅色區(qū)域。在其中一張照片的腫瘤組織中觀察到了來自PGA-97-A-德克薩斯紅的德克薩斯紅染料。另一方面，在單獨的德克薩斯紅的類似照片中沒有觀察到德克薩斯紅染料。這些結(jié)果顯示，在將PGA-97-A-德克薩斯紅靜脈內(nèi)給藥24小時后，來自PGA-97-A-德克薩斯紅的德克薩斯紅染料在體內(nèi)向腫瘤細胞中聚集，但對于單獨的德克薩斯紅染料未顯示該現(xiàn)象。
此外，在沿腫瘤血管的內(nèi)皮細胞中也能夠看到來自PGA-97-A-德克薩斯紅的德克薩斯紅染料。拍攝了該腫瘤組織另一冷凍切片的另外的照片。將PGA-97-A-德克薩斯紅在尾部靜脈進行靜脈內(nèi)給藥24小時后沿血管觀察到了紅色染料。結(jié)果顯示在沿腫瘤血管的內(nèi)皮細胞中能夠看到PGA-97-A-德克薩斯紅。
實施例21 體外細胞毒性MTT研究 在若干不同的藥物濃度下評價本文所述的含紫杉醇的聚合物軛合物對B16F0黑素瘤細胞增殖的影響。如Monks et al.JNCI 1991，83，757-766中所報道的進行細胞毒性MTT測定，其整體在此引入作為參考。如實施例10a，從基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為39,700道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-44-A-20，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為20％重量比。如實施例10，從基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為99,400道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-97-A-20，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為20％重量比。PGA(97k)-PTX-20用作本實施例的對照聚合物并根據(jù)以前的文獻操作(參見Li et al，“Complete Regression of Well-established tumors using a novel watersoluble poly(L-glutamic acid)-paclitaxel conjugates(用新型水溶性聚(L-谷氨酸)-紫杉醇軛合物使充分確立的腫瘤完全衰退).”Cancer Research1998，58，2404-2409)從基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為49,000道爾頓的聚(L-谷氨酸)來制備，聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為20％重量比。結(jié)果示于圖13。如圖13所示，隨著藥物濃度的增加，黑素瘤細胞的存活率降低。這些結(jié)果表明PGA-44-A-20和PGA-97-A-20是有效的抗癌劑。
實施例22 體外細胞毒性MTT研究 將含有紫杉醇的聚合物軛合物與不含紫杉醇的對照聚合物和不含聚合物的紫杉酚對照相比較以觀察其在若干不同的藥物濃度下對B16F0黑素瘤細胞增殖的影響。如Monks et al.JNCI 1991，83，757-766中所報道的進行細胞毒性MTT測定。如實施例9，從基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為99,400道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-97-A-10，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為10％重量比。PGA(97k)-PTX-10用作本實施例的對照聚合物并根據(jù)以前的文獻(Li et al，“Complete Regression of Well-established tumorsusing a novel water soluble poly(L-glutamic acid)-paclitaxel conjugates(用新型水溶性聚(L-谷氨酸)-紫杉醇軛合物使充分確立的腫瘤完全衰退).”Cancer Research 1998，58，2404-2409)從基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為49,000道爾頓的聚L-谷氨酸制備，聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為10％重量比。不含紫杉醇的聚合物是聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)鈉鹽。
結(jié)果如圖14所示。不含抗腫瘤藥物的鈉鹽聚合物對黑素瘤細胞存活率的影響很小。此外，PGA-97-A-10與含有抗腫瘤藥物的對照聚合物滿意地相比。如圖14所示，PGA-97-A-10作為有效的抗癌劑起作用。
實施例23 用于藥物動力學(xué)研究的動物和腫瘤模型 裸小鼠(6至7周，體重25g至30g，雌性)購自Charles River Lab(Willington，MA)。B16F0細胞系購自ATCC(CRL-6322，ATCC美國典型微生物菌種保藏中心，Rockville，MD)。在添加有10％胎牛血清、2μM谷氨酰胺、1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)B16F0細胞。對從組織培養(yǎng)液中采集的B16F0細胞進行計數(shù)并重新懸浮至5×106每mL的濃度。使用TB注射器對每一小鼠經(jīng)由皮下注射給予0.4mL(總共2×106細胞)。在每一動物的右肩、左肩、右臀、左臀處接種四個腫瘤。
實施例23a 當來自實施例23的小鼠的整個群體的平均腫瘤體積達到200mm3至300mm3(直徑6mm至8mm)時，每一患腫瘤的動物經(jīng)由尾部靜脈接受單一IV團注3H-紫杉酚(對照)或PGA-44-A-19。
如實施例10c，從基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為99,400道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-44-A-19，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為19％重量比。本實施例的對照是紫杉酚。游離3H-紫杉酚(對照)和PGA-44-A-19的劑量是20mg紫杉醇當量/kg。對于每一藥物，在多個時間點麻醉4個小鼠的組(每一單位為小時)0(即IV注射后盡快)、0.083、0.25、1.0、2.0、4.0、8.0、48、72、96、120和144。將通過心臟或眼球后穿刺收集的0.5mL血液置于肝素化的管中。此后，在從麻醉中蘇醒之前將小鼠處死。將每一小鼠的血液樣品在11,000rpm下離心。采集血液樣品的上層血漿(0.2mL至0.3mL)并轉(zhuǎn)移到新的小瓶中。將每一樣品的0.1mL血漿分別轉(zhuǎn)移到新的10mL小瓶中，向小瓶中加入液體閃爍溶液(5mL)。使用液體閃爍LS6500計數(shù)系統(tǒng)(Beckman)分析并用每一樣品的標準曲線計算紫杉醇的含量。結(jié)果如圖15所示。PGA-44-A-19的紫杉醇濃度在較長時期內(nèi)維持較高。這些結(jié)果表明PGA-44-A-19中的紫杉醇與單獨的紫杉酚相比在血液循環(huán)中有更長期的效果。
實施例24 當來自實施例23的小鼠的整個群體的平均腫瘤體積達到200mm3至300mm3(直徑6-8mm)時，每一患腫瘤的動物(裸nu/nu小鼠)經(jīng)由尾部靜脈接受單一IV團注3H-紫杉酚(對照)或PGA-44-A-19。
如實施例10c，從基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為39,700道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-44-A-19，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為19％重量比。游離3H-紫杉酚(對照)和PGA-44-A-19的劑量是20mg紫杉醇當量/kg。對于每一藥物，在多個時間點麻醉4個小鼠的組(每一單位為小時)0(即IV注射后盡快)、0.083、0.25、1.0、2.0、4.0、8.0、48、72、96、120和144。獨立地獲取兩臀和兩肩的腫瘤。此后，在從麻醉中蘇醒之前將小鼠處死。將約80mg至180mg的每一腫瘤置于閃爍瓶中，并用Soluene(組織增溶劑)(1mL)消化腫瘤。然后，將0.1mL被消化的組織轉(zhuǎn)移至10mL小瓶中，向小瓶中加入液體閃爍液(5mL)。使用液體閃爍LS6500計數(shù)系統(tǒng)(Beckman)分析并用每一樣品的標準曲線計算紫杉醇的含量。將PGA-44-A-19與紫杉酚對照進行比較。結(jié)果如圖16所示。PGA-44-A-19的紫杉醇腫瘤聚集在較長時期內(nèi)維持較高。這些結(jié)果表明來自PGA-44-A-19的紫杉醇與單獨的紫杉酚相比在腫瘤中具有改善的聚集。
實施例25 用于體內(nèi)效能研究的動物與腫瘤模型 裸小鼠(6至8周，體重21g至25g，雄性)購自Charles River Lab(Willington，MA)。B16-F0-EGFP穩(wěn)定細胞保持在添加有10％牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。接種前將細胞分裂48小時使得在采集時它們在對數(shù)生長期。使用胰島素-EDTA從組織培養(yǎng)液采集細胞，并在血細胞計數(shù)器中在臺盼藍的存在下進行計數(shù)以測定存活細胞的數(shù)目。在沒有血漿的DMEM培養(yǎng)基中將細胞懸浮至5×106每ml的濃度。通過注射0.1mL腫瘤細胞混懸液而使用1cc胰島素注射器在5×106每ml的濃度下在每一肩和每一臀上接種腫瘤細胞混懸液(每一小鼠4處)。
在接種腫瘤的當天，將小鼠順序置于6組中的一組并將3只飼養(yǎng)在籠子中，總共12只籠子。在接種腫瘤時的麻醉下對每一小鼠進行耳穿孔使得在整個試驗中能夠獨特地識別。將每一只籠子用藥物、對其含有的動物給予的藥物劑量及其含有的動物的數(shù)目來標記。
實施例25a 測定了根據(jù)實施例11a-11c制備的聚合物在最大耐受劑量(MTD)下的重量減輕毒性。MTD在此被定義為在兩周內(nèi)產(chǎn)生最大15％體重減輕的劑量。如實施例11c和11b所公開的方法，從基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量分別為19,800和37,400道爾頓的起始聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)聚合物分別制備PGA-21-G-20和PGA-32-G-20，并且每一聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為20％。將PGA-21-G-20和PGA-32-G-20以50mg/mL溶解在生理鹽水中。本實施例的對照抗癌藥是被FDA批準為抗癌藥的Abraxane。生理鹽水也用作無抗腫瘤藥物的陰性對照。從每一動物的體重測定所注射藥物的實際量。當小鼠的全部群體的平均腫瘤尺寸達到約15mm3至約50mm3(腫瘤尺寸從公式(w2×l)/2估計，其中“l(fā)”是腫瘤的最長直徑且“w”是以毫米為單位測量的垂直于最長直徑的直徑)時，將首劑藥物給予小鼠。小鼠在連續(xù)兩天中經(jīng)尾部靜脈注射無麻醉地給藥接受2劑藥物。儲庫溶液在注射當天新鮮制備。將儲庫溶液吸入1-cc注射器中并靜脈注射。將小鼠稱重，精確至0.1g。與在100mg/kg紫杉醇當量的劑量下的Abraxane相比，用175mg/kg劑量下的PGA-21-G-20和150mg/kg劑量下的PGA-32-G-20的較高劑量注射裸nu/nu小鼠。隨時間(天)獨立地觀察并記錄每一藥物治療后的體重改變(％)。結(jié)果如圖17所示。PGA-21-G-20在高得多的劑量下顯示很小的體重減輕。PGA-32-G-20在高得多的劑量下顯示與Abraxane相當?shù)捏w重減輕。這些結(jié)果表明與抗癌藥軛合的本發(fā)明的優(yōu)選聚合物對小鼠毒性較小。
實施例26 體內(nèi)效能研究 測定了PGA-21-G-20、PGA-32-G-20和Abraxane在最大耐受劑量(MTD)下在如實施例25所述的裸nu/nu小鼠中對B16F0-EGF黑素瘤腫瘤的抗腫瘤效果，以生理鹽水為陰性對照。將PGA-21-G-20和PGA-32-G-20以50mg/mL溶于生理鹽水中。本實施例的對照抗癌藥是FDA批準為抗癌藥的Abraxane。生理鹽水用作不含抗腫瘤藥物的另一對照。從每一動物的體重測定所注射藥物的實際量。在研究中的小鼠的全部群體的平均腫瘤尺寸達到15mm3至50mm3時給予小鼠首劑藥物。小鼠在連續(xù)兩天中經(jīng)尾部靜脈注射無麻醉地給藥接受2劑藥物。儲庫溶液在注射當天新鮮制備。將儲庫溶液吸入1-cc注射器中并靜脈注射。測量腫瘤尺寸，精確至0.1mm。與在100mg/kg紫杉醇當量的劑量下的Abraxane相比，用175mg/kg劑量下的PGA-21-G-20和150mg/kg劑量下的PGA-32-G-20的較高劑量注射裸nu/nu小鼠。隨時間(天)獨立地觀察并記錄每一藥物治療后的腫瘤體積改變(％)。結(jié)果如圖18所示。PGA-21-G-20和PGA-32-G-20都顯著抑制了腫瘤生長。這些結(jié)果表明與抗癌藥軛合的本發(fā)明的優(yōu)選聚合物是有效的抗癌劑。
實施例27 測定了根據(jù)實施例11制備的聚合物在MTD下的重量減輕毒性。根據(jù)實施例11所描述的方法制備PGA-97-G-20。起始原料是基于我們具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為110,800道爾頓的聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)。聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)是20％。將PGA-97-G-20以50mg/mL溶于生理鹽水中。本實施例的對照抗癌藥是FDA批準為抗癌藥的紫杉酚和Abraxane。生理鹽水用作不含抗腫瘤藥物的陰性對照。從每一動物的體重測定所注射藥物的實際量。在研究中的小鼠的全部群體的平均腫瘤尺寸達到15mm3至50mm3時給予小鼠首劑藥物。小鼠在連續(xù)兩天中經(jīng)尾部靜脈注射無麻醉地接受2劑藥物。儲庫溶液在注射當天新鮮制備。將藥物儲庫溶液吸入1-cc注射器中并靜脈注射。將小鼠稱重，精確至0.1g。與在其紫杉醇當量下的Abraxane(100mg/kg)和紫杉酚(50mg/kg)相比，用更高劑量(60mg/kg)的PGA-97-G-20注射裸nu/nu小鼠。隨時間(天)獨立地觀察并記錄每一藥物治療后的體重改變(％)。結(jié)果如圖19所示。如圖19所示，PGA-97-G-20在高得多的劑量下顯示與對照相當?shù)捏w重減輕。這些結(jié)果表明與抗癌藥軛合的本發(fā)明的優(yōu)選聚合物與臨床批準的藥物毒性相當。
實施例28 體內(nèi)效能研究 測定了PGA-97-G-20、紫杉酚和Abraxane在最大耐受劑量(MTD)下在裸nu/nu小鼠中對B16F0-EGF黑素瘤腫瘤隨時間變化的抗腫瘤效果，以生理鹽水為陰性對照。將PGA-97-G-20以50mg/mL溶于生理鹽水中。本實施例的對照抗癌藥是FDA批準為抗癌藥的紫杉酚和Abraxane。生理鹽水用作不含抗腫瘤藥物的陰性對照。從每一動物的體重測定所注射藥物的實際量。在研究中的小鼠的全部群體的平均腫瘤尺寸達到15mm3至50mm3時給予小鼠首劑藥物。小鼠在下一天經(jīng)IV尾部靜脈注射無麻醉地接受2劑藥物。儲庫溶液在注射當天新鮮制備。將藥物儲庫溶液吸入1-cc注射器中并靜脈注射。測量腫瘤尺寸，精確至0.1mm。與在其紫杉醇當量下的100mg/kg劑量下的Abraxane和50mg/kg劑量下的紫杉酚相比，用60mg/kg劑量下的PGA-97-G-20的較高劑量注射裸nu/nu小鼠。隨時間(天)獨立地觀察并記錄每一藥物治療后的腫瘤體積改變(％)。結(jié)果如圖20所示。如圖20所示，與紫杉酚和Abraxane相比，PGA-97-G-20對腫瘤生長有顯著影響并具有更好的性能。這些結(jié)果表明與抗癌藥軛合的本發(fā)明的優(yōu)選聚合物是有效的抗癌劑。
實施例29 測定了含有紫杉醇的聚合物軛合物在最大耐受劑量下相對于與紫杉醇軛合的聚谷氨酸的重量減輕毒性。根據(jù)實施例11b所描述的方法制備PGA-32-G-20。起始原料是基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為37,400道爾頓的聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)，并且每一聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)是20％。將PGA-32-G-20與分子量為19,450道爾頓(基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng))的與紫杉醇軛合使得聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為20％的聚谷氨酸對照(PGA(32k)-PTX-20)進行比較。生理鹽水用作不含抗腫瘤藥物的對照。從每一動物的體重測定所注射藥物的實際量。在研究中的小鼠的全部群體的平均腫瘤尺寸達到15mm3至50mm3時給予小鼠首劑藥物。小鼠在下一天經(jīng)IV尾部靜脈注射無麻醉地接受2劑藥物。儲庫溶液在注射當天新鮮制備。將藥物儲庫溶液吸入1-cc注射器中并靜脈注射。將小鼠稱重，精確至0.1g。與在100mg/kg紫杉醇當量的劑量下的PGA(32k)-PTX-20相比，用125mg/kg的較高劑量的PGA-32-G-20注射裸nu/nu小鼠。隨時間(天)獨立地觀察并記錄每一藥物治療后的體重改變(％)。結(jié)果如圖21所示。PGA-32-G-20在高得多的劑量下顯示與對照相當?shù)捏w重減輕。這些結(jié)果表明與抗癌藥軛合的本發(fā)明的優(yōu)選聚合物與研究藥物的毒性相當。
實施例30 體內(nèi)效能研究 測定了PGA-32-G-20和PGA(32k)-PTX-20在最大耐受劑量(MTD)下在裸nu/nu小鼠中對B16F0-EGF黑素瘤腫瘤隨時間變化的抗腫瘤效果，以生理鹽水為陰性對照。將PGA-32-G-20和PGA(32k)-PTX-20以50mg/mL溶于生理鹽水中。從每一動物的體重測定所注射藥物的實際量。在研究中的小鼠的全部群體的平均腫瘤尺寸達到15mm3至50mm3時給予首劑藥物。小鼠在下一天經(jīng)IV尾部靜脈注射無麻醉地給藥接受2劑藥物。儲庫溶液在注射當天新鮮制備。將藥物儲庫溶液吸入1-cc注射器中并靜脈注射。將小鼠稱重，精確至0.1g。與在100mg/kg紫杉醇當量的劑量下的PGA(32k)-PTX-20相比，用125mg/kg劑量下的PGA-32-G-20的較高劑量注射裸nu/nu小鼠。測量腫瘤尺寸，精確到0.1mm。隨時間(天)獨立地觀察并記錄每一藥物治療后的腫瘤體積改變(％)。結(jié)果如圖22所示。與PGA(32k)-PTX-20相比，PGA-32-G-20對腫瘤生長有顯著影響并具有更好的性能。這些結(jié)果表明與抗癌藥軛合的本發(fā)明的優(yōu)選聚合物是有效的抗癌劑。
實施例31 測試了聚合物軛合物以確定紫杉醇釋放速率與選擇不同分子量的聚合物的關(guān)聯(lián)。將PGA-21-G-20、PGA-32-G-20、PGA-97-G-20和PGA(97k)-PTX-20對照以2mg/mL的濃度置于磷酸鹽緩沖液中并測定釋放速率。在37℃下孵育聚合物-紫杉醇軛合物的溶液。在不同時間點取出50μl的等份并冷凍。然后用LC-MS分析所有的等份。測定HPLC圖譜上釋放藥物峰的積分面積。從標準曲線計算釋放的紫杉醇的量。結(jié)果如圖23所示，并顯示隨著聚合物軛合物的分子量增加，釋放的紫杉醇的百分比減少。這些結(jié)果表明能夠通過選擇聚合物的不同分子量來控制紫杉醇的釋放速率。
實施例32 用于藥物動力學(xué)研究的動物和腫瘤模型 裸小鼠(6至7周齡，體重25g至30g，雌性)購自Charles River Lab(Willington，MA)。B16F0細胞系購自ATCC(CRL-6322，ATCC美國典型微生物菌種保藏中心，Rockville，MD)。在添加有10％胎牛血清、2μM谷氨酰胺、1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)B16F0細胞。對從組織培養(yǎng)液采集的B16F0細胞進行計數(shù)并重新懸浮至5×106每mL的濃度。使用TB注射器對每一小鼠經(jīng)由皮下注射給予0.4mL(總共2×106細胞)。在每一動物的右肩、左肩、右臀、左臀處接種四個腫瘤。
實施例32a 相對于紫杉酚對照測試各種與藥物軛合的聚合物以確定血漿中紫杉醇濃度隨時間的變化。當來自實施例32的小鼠的整個群體的平均腫瘤體積達到200mm3至300mm3(直徑6mm至8mm)時，每一患腫瘤的動物經(jīng)由尾部靜脈接受單一IV團注3H-紫杉酚(對照)、PGA-21-A-19、PGA-32-A-19和PGA-97-A-24。
從分子量為19,800道爾頓的反應(yīng)物聚合物聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-21-G-19，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為19％重量比。從分子量為37,400道爾頓的反應(yīng)物聚合物聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-32-G-19，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為19％重量比。從分子量為110,800道爾頓的反應(yīng)物聚合物聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-97-G-24，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為24％重量比。
游離3H-紫杉酚(對照)、PGA-21-A-19、PGA-32-A-19和PGA-97-A-24的劑量是20mg紫杉醇當量/kg。對于每一藥物，在多個時間點麻醉4個小鼠的組(每一單位為小時)0(即IV注射后盡快)、1.0、2.0、4.0和24。將通過心臟或眼球后穿刺獲得的0.5mL血液置于肝素化的管中。此后，在從麻醉中蘇醒之前將小鼠處死。將每一小鼠的血液樣品在11,000rpm下離心。采集血液樣品的上層血漿(0.2mL至0.3mL)并轉(zhuǎn)移到新的小瓶中。將每一樣品的0.1mL血漿分別轉(zhuǎn)移到新的10-mL小瓶中，向小瓶中加入液體閃爍溶液(5mL)。使用液體閃爍LS6500計數(shù)系統(tǒng)(Beckman)分析并用每一樣品的標準曲線計算紫杉醇的含量。結(jié)果如圖24所示。這些結(jié)果顯示本發(fā)明的優(yōu)選聚合物軛合物中的紫杉醇藥物與紫杉酚相比在血漿中有更長的持續(xù)期。
實施例33 相對于紫杉酚對照測試各種與藥物軛合的聚合物以確定腫瘤中紫杉醇濃度隨時間的變化。當來自實施例32的小鼠的整個群體的平均腫瘤體積達到200mm3至300mm3(直徑6mm至8mm)時，每一患腫瘤的動物經(jīng)由尾部靜脈接受單一IV團注3H-紫杉酚(對照)、PGA-21-A-19、PGA-32-A-19和PGA-97-A-24。
從分子量為19,800道爾頓的反應(yīng)物聚合物聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-21-G-19，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為19％重量比。從分子量為37,400道爾頓的反應(yīng)物聚合物聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-32-G-19，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為19％重量比。從分子量為110,800道爾頓的反應(yīng)物聚合物聚(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-97-G-24，并且聚合物中紫杉醇的重量百分數(shù)為24％重量比。
游離3H-紫杉酚(對照)、PGA-21-A-19、PGA-32-A-19和PGA-97-A-24的劑量是20mg紫杉醇當量/kg。對于每一藥物，在多個時間點麻醉4個小鼠的組(每一單位為小時)0(即IV注射后盡快)、1.0、2.0、4.0和24。獨立地從兩臀和兩肩收集腫瘤。此后，在從麻醉中蘇醒之前將小鼠處死。將大約80mg至180mg的每一腫瘤放在閃光管中，并用Soluene(組織增溶劑)(1mL)消化腫瘤。然后，將0.1mL被消化組織轉(zhuǎn)移到新的10-mL小瓶中，向小瓶中加入液體閃爍液(5mL)。使用液體閃爍LS6500計數(shù)系統(tǒng)(Beckman)分析并用每一樣品的標準曲線計算紫杉醇的含量。結(jié)果如圖25所示。這些結(jié)果顯示本發(fā)明的優(yōu)選聚合物軛合物中的紫杉醇藥物與紫杉酚相比隨時間更濃縮在腫瘤中。
實施例34 動物和腫瘤模型 裸小鼠(6至7周齡，體重25g至30g，雄性)購自Charles River Lab(Willington，MA)。B16F0細胞系購自ATCC(CRL-6322，ATCC美國典型微生物菌種保藏中心，Rockville，MD)。在添加有10％胎牛血清、2μM谷氨酰胺、1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RMPI 1640中培養(yǎng)B16F0細胞。對從組織培養(yǎng)液采集的B16細胞進行計數(shù)并重新懸浮至5×106每mL的濃度。使用TB注射器對每一小鼠經(jīng)由皮下注射給予0.2mL(總共1×106細胞)。在每一動物的右臀處接種一腫瘤。接種之前剃去腫瘤接種位置的毛使得在隨著腫瘤生長時更容易測量。
實施例35 腫瘤聚集的磁共振圖像 造影前和造影后使用膝關(guān)節(jié)線圈在GE 3T MR掃描儀上獲得小鼠的圖像。以下的成像參數(shù)為TEminful、TR＝250ms、FOV8和24片/板和冠狀切片厚度1.0mm。如實施例7-8，從基于具有MALS檢測器的Heleos系統(tǒng)的平均分子量為99,400道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)制備PGA-97-A-DTPA-Gd(III)。本實施例的對照物質(zhì)是Omniscan-Gd(III)-(DTPA-BMA(0.1mmol Gd(III)/kg)。PGA-97-A-DTPA-Gd(III)的注射劑量是0.1mmol Gd(III)/kg。OmniscanTM的注射劑量是0.1mmol Gd(III)/kg。經(jīng)由尾部靜脈向麻醉的小鼠注射兩化合物并在注射前和造影劑注射后的6分鐘至4小時獲取圖像。MRI的結(jié)果示于圖26。如圖26所示，在腫瘤組織中聚集的PGA-97-A-DTPA-Gd(III)螯合物的量大于小分子Omniscan-Gd(III)。這些結(jié)果表明PGA-97-A-DTPA-Gd(III)螯合物具有增加的特異性和保留。
實施例36 納米顆粒形成的研究 除非另有說明，將各種溶液(通過0.2μm過濾器過濾)加入到分子量為99,400道爾頓的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)上至1mg/mL。均勻溶解所有的溶液。通過光散射ZetalPals(Brookhaven InstrumentCorporation)測量粒徑、多分散性和基線指數(shù)。結(jié)果總結(jié)于表2中。MilliQ水是指通過具有0.2μm過濾器的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)過濾的水。
表2.聚谷氨酸鹽-天冬氨酸形成納米顆粒 實施例37 PGA-97-A-10的納米顆粒的形成 將PGA-97-A-10以各種濃度溶解在去離子水中。通過光散射(ZetalPals，Brookhaven Instrument Corporation)測量粒徑、多分散性和基線指數(shù)。結(jié)果如下面的表3所示。
表3-去離子水中PGA-97-A-10納米顆粒的形成 濃度(μg/mL) 尺寸(nm) 多分散性 基線指數(shù) 722 438.90.1339.7 289 379.00.1698.8 100 357.50.2269.1 50 309.40.2159.5 10 209.60.2209.3 5194.90.2088.1 1178.00.1727.4 0.5 N/A 0.1220 實施例38 由Nano Analytical Laboratory(納米分析實驗室)(San Francisco，CA)拍攝與藥物軛合的聚合物的冷凍斷裂電鏡圖像。聚合物是從分子量為39,700的聚(γ-L-天冬氨酰-谷氨酰胺)制備并且紫杉醇的重量百分數(shù)為20％的PGA-44-A-20。超聲處理(約5min)之后將它在生理鹽水中配制成1mg/mL的濃度。此后，將它包在封口膜中并立即送到公司(總共約一天的運輸)。到達后，將它儲存在4℃。然后將聚合物放置在生理鹽水溶液中以確定是否會形成納米顆粒。電子顯微圖像的復(fù)制如圖27所示。從圖像中能夠看出，在將聚合物軛合物置于水溶液中時形成本發(fā)明優(yōu)選的與藥物軛合的聚合物的納米顆粒。
實施例39 測試與藥物軛合的聚合物的顆粒以確定各種藥物濃度下的穩(wěn)定性。PGA-44-A-20和PGA-97-A-20在各種藥物濃度下形成顆粒并測定粒徑。結(jié)果如圖28所示。甚至在藥物濃度增加時顆粒仍在納米粒徑范圍內(nèi)并且是穩(wěn)定的。這些結(jié)果表明能夠在很寬的藥物濃度范圍內(nèi)形成穩(wěn)定的納米顆粒。
實施例40 測試與藥物軛合的聚合物顆粒以確定在各種藥物濃度下的穩(wěn)定性。PGA-21-G-20和PGA-32-G-20在各種藥物濃度下形成顆粒并測定粒徑。結(jié)果如圖29所示。甚至在藥物濃度增加時顆粒仍在納米粒徑范圍內(nèi)并且是穩(wěn)定的。這些結(jié)果進一步表明能夠在很寬的藥物濃度范圍內(nèi)形成穩(wěn)定的納米顆粒。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，能夠做出許多不同的修改而不偏離本發(fā)明的精神。因此，應(yīng)當清楚地理解，本發(fā)明的形式僅是示例性的而非旨在限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.包含通式(I)重復(fù)單元和通式(II)重復(fù)單元的聚合物
其中
每一n獨立地是1或2；
每一A1是氧或NR5；
每一A2是氧；
R1和R2各自獨立地選自C1-10烷基、C6-20芳基、銨、堿金屬、多配位基配體、具有受保護的氧原子的多配位基配體前體或包含藥劑的化合物；
其中所述藥劑選自抗癌藥、靶向藥劑、光學(xué)顯像劑或磁共振
顯像劑；
其中R1和R2中的至少一個是包含藥劑的基團；
R3和R4彼此獨立地選自氫、銨或堿金屬；
其中所述聚合物軛合物包含的藥劑量基于所述藥劑與所述聚合物軛合物的質(zhì)量比為約1％至約50％(重量/重量)；
R5為氫或C1-4烷基；以及
其中選擇所述藥劑的量、所述通式(I)重復(fù)單元的百分比和所述通式(II)重復(fù)單元的百分比以使所述聚合物軛合物的溶解度大于包含基本相同量的所述藥劑的對照聚谷氨酸軛合物的溶解度，當在約22℃的0.9重量％的NaCl水溶液中包含至少5mg/mL的所述聚合物軛合物的測試聚合物軛合物溶液在較寬的pH范圍內(nèi)光學(xué)透明度大于對照測試聚谷氨酸軛合物溶液時所述聚合物軛合物的溶解度更大。
2.如權(quán)利要求1所述的聚合物軛合物，其還包括通式(III)重復(fù)單元
其中R6是氫、銨或堿金屬。
3.如權(quán)利要求1-2中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中包含所述藥劑的所述化合物還包括連接基團。
4.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述藥劑是光學(xué)顯像劑。
5.如權(quán)利要求4所述的聚合物軛合物，其中所述光學(xué)顯像劑選自吖啶染料、香豆素染料、若丹明染料、呫噸染料、花青染料或芘染料。
6.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述藥劑是抗癌藥。
7.如權(quán)利要求6所述的聚合物軛合物，其中所述抗癌藥選自紫杉烷類、喜樹堿或阿霉素。
8.如權(quán)利要求7所述的聚合物軛合物，其中所述紫杉烷類選自紫杉醇。
9.如權(quán)利要求8所述的聚合物軛合物，其中紫杉醇在與C2’碳相連接的氧原子處與通式(I)重復(fù)單元軛合。
10.如權(quán)利要求8所述的聚合物軛合物，其中紫杉醇在與C7碳相連接的氧原子處與通式(I)重復(fù)單元軛合。
11.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述藥劑是磁共振顯像劑。
12.如權(quán)利要求11所述的聚合物軛合物，其中所述磁共振顯像劑包含Gd(III)化合物。
13.如權(quán)利要求12所述的聚合物軛合物，其中所述Gd(III)化合物包括
14.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述多配位基配體包含
其中每一R7獨立地是氫、銨和堿金屬。
15.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述具有受保護的氧原子的多配位基配體包含
16.如權(quán)利要求1或3-15中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述聚合物包含基于通式(I)和(II)重復(fù)單元總摩爾數(shù)的約1摩爾％至約30摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。
17.如權(quán)利要求1或3-15中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述聚合物軛合物包含基于通式(I)和(II)重復(fù)單元總摩爾數(shù)的約1摩爾％至約20摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。
18.如權(quán)利要求1或3-15中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述聚合物軛合物包含基于通式(I)和(II)重復(fù)單元總摩爾數(shù)的約1摩爾％至約10摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。
19.如權(quán)利要求2-15中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述聚合物軛合物包含基于通式(I)、(II)和(III)重復(fù)單元總摩爾數(shù)的約1摩爾％至約99摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。
20.如權(quán)利要求2-15中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述聚合物軛合物包含基于通式(I)、(II)和(III)重復(fù)單元總摩爾數(shù)的約1摩爾％至約30摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。
21.如權(quán)利要求2-15中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述聚合物軛合物包含基于通式(I)、(II)和(III)重復(fù)單元總摩爾數(shù)的約1摩爾％至約20摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。
22.如權(quán)利要求2-15中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述聚合物軛合物包含基于通式(I)、(II)和(III)重復(fù)單元總摩爾數(shù)的約1摩爾％至約10摩爾％的通式(I)重復(fù)單元。
23.如權(quán)利要求1-22中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中至少一個n是1。
24.如權(quán)利要求1-22中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中至少一個n是2。
25.如權(quán)利要求1-22中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述堿金屬是鈉。
26.如權(quán)利要求1-25中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述較寬的pH范圍是至少約3個pH單位。
27.如權(quán)利要求1-25中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述較寬的pH范圍是至少約8個pH單位。
28.如權(quán)利要求1-25中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述較寬的pH范圍是至少約9個pH單位。
29.如權(quán)利要求1-25中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述較寬的pH范圍包括約2至約5的范圍中的至少一個pH值。
30.如權(quán)利要求1-25中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述測試聚合物軛合物溶液包含至少約10mg/mL的所述聚合物軛合物。
31.如權(quán)利要求1-25中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述測試聚合物軛合物溶液包含至少約25mg/mL的所述聚合物軛合物。
32.如權(quán)利要求1-25中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述測試聚合物軛合物溶液包含至少約100mg/mL的所述聚合物軛合物。
33.如權(quán)利要求1-25中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物，其中所述測試聚合物軛合物溶液包含至少約125mg/mL的所述聚合物軛合物。
34.權(quán)利要求1-33中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物的制備方法，其包括將聚合反應(yīng)物溶解或部分溶解在溶劑中以形成溶解或部分溶解的聚合反應(yīng)物；以及使所述溶解或部分溶解的聚合反應(yīng)物與第二反應(yīng)物反應(yīng)，其中所述第二反應(yīng)物包含所述多配位基配體、所述具有受保護的氧原子的多配位基配體前體和包含所述藥劑的所述化合物中的至少一個。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述聚合反應(yīng)物包含通式(IV)重復(fù)單元
其中
每一n獨立地是1或2；
每一A3是氧；以及
R7和R8各自獨立地選自氫、銨或堿金屬。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述聚合反應(yīng)物包含通式(V)重復(fù)單元
其中R9是氫、銨或堿金屬。
37.如權(quán)利要求34-36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述第二反應(yīng)物包含選自羥基或胺基的取代基。
38.如權(quán)利要求34-36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述藥劑選自抗癌藥、靶向藥劑、光學(xué)顯像劑或磁共振顯像劑。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述光學(xué)顯像劑選自吖啶染料、香豆素染料、若丹明染料、呫噸染料、花青染料或芘染料。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述抗癌藥選自紫杉烷類、喜樹堿或阿霉素。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述紫杉烷類選自紫杉醇。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中紫杉醇在與C2’碳相連接的氧原子處與通式(I)重復(fù)單元軛合。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中紫杉醇在與C7碳相連接的氧原子處與通式(I)重復(fù)單元軛合。
44.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述磁共振顯像劑包含Gd(III)化合物。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述Gd(III)化合物包含
46.如權(quán)利要求34-36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述多配位基配體包含
其中每一R7獨立地是氫、銨或堿金屬。
47.如權(quán)利要求34-36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述具有受保護的氧原子的多配位基配體前體包含
48.如權(quán)利要求34-47中任一權(quán)利要求所述的方法，其還包括在偶聯(lián)劑的存在下使所述溶解或部分溶解的聚合反應(yīng)物反應(yīng)。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述偶聯(lián)劑選自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)、1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1，1’-羰基-二咪唑(CDI)、N，N’-琥珀酰亞氨基碳酸酯(DSC)、六氟磷酸N-[(二甲氨基)-1H-1，2，3-三唑并-[4，5-b]吡啶-1-基-亞甲基]-N-甲基甲銨鹽N-氧化物(HATU)、六氟磷酸2-[(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基銨鹽(HBTU)、六氟磷酸2-[(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基銨鹽(HCTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷基鏻鹽
六氟磷酸溴代-三吡咯烷基鏻鹽
四氟硼酸2-[(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基銨鹽(TBTU)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三(二甲氨基)鏻鹽(BOP)。
50.如權(quán)利要求34-49中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述溶劑是極性非質(zhì)子溶劑。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述溶劑選自N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、N-甲基-2-吡啶酮(NMP)或N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)。
52.如權(quán)利要求34-51中任一權(quán)利要求所述的方法，其還包括在催化劑的存在下使所述溶解或部分溶解的聚合反應(yīng)物反應(yīng)。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述催化劑是4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
54.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至33中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物以及選自藥物可接受的賦形劑、載體和稀釋劑中的至少一種。
55.治療或改善疾病或疾病狀態(tài)的方法，其包括向有需要的哺乳動物給予有效量的權(quán)利要求1至33中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物。
56.診斷疾病或疾病狀態(tài)的方法，其包括向哺乳動物給予有效量的權(quán)利要求1至33中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物。
57.權(quán)利要求1至33中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物在制備用于治療或改善疾病或疾病狀態(tài)的藥物中的用途。
58.權(quán)利要求1至33中任一權(quán)利要求所述的聚合物軛合物在制備用于診斷疾病或疾病狀態(tài)的藥物中的用途。
全文摘要
制備了包含通式(I)和(II)重復(fù)單元的多種生物可降解的聚谷氨酸鹽-氨基酸。這樣的聚合物可用于藥物、生物分子和顯像劑輸送等各種應(yīng)用。
文檔編號C08G69/10GK101321806SQ200680045816
公開日2008年12月10日 申請日期2006年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月5日
發(fā)明者磊 俞, 剛 趙, ?！し? 桑吉博·庫馬爾·達斯, 馮中靈, 付曉麗, 王興和 申請人:日東電工株式會社