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經(jīng)修飾的大分子的制作方法

文檔序號:3694949閱讀:1379來源:國知局

專利名稱::經(jīng)修飾的大分子的制作方法經(jīng)修飾的大分子發(fā)明領域本發(fā)明涉及其表面結(jié)構(gòu)可以受到控制以生產(chǎn)富集比例的拓樸異構(gòu)體的大分子、其生產(chǎn)及其用途,特別是樹枝聚體(dendrimers,也稱為"樹型化合物")。特別地,大分子可以具有2種或更多表面基團,其中至少一種表面基團是藥學活性的。
背景技術
:用于在藥物制備中使用的新化合物的鑒定是尋找更可靠和有效的療法的重要方面。然而,正如重要的是已知化合物的發(fā)展和修飾,減少與新藥物候選物相關的危險以及顯著減少使藥物達到臨床發(fā)展的開發(fā)和成本。許多藥物在臨床試驗中因為其物理性質(zhì)(特別是溶解性)使得其難以配制,或由于緊在給藥后發(fā)生的高藥物濃度期間導致毒性效應的弱治療指數(shù)而失敗。其他缺點包括弱吸收、弱生物利用度、不穩(wěn)定性、由于無法靶向藥物的全身性副作用、以及在施用后無法控制其生物分布、代謝和腎或肝清除。類似地,市場上的某些當前產(chǎn)品可以就此類問題而言進行改善。許多方法已設法改善藥物化合物的特征,包括在脂質(zhì)體、膠束或聚合膠束制劑中配制藥物試劑,以及將藥物試劑共價附著至親水聚合物主鏈。理想的特征改良劑的特性包括良好限定的結(jié)構(gòu),允許精確控制所述化合物的吸收、分布、代謝與排泄(ADME)特性(也稱為藥代動力學)和能夠有利地攜帶多種化合物/試劑或構(gòu)建體。所述化合物的毒性可以通過其從所述試劑或構(gòu)建體中的受控釋放得到改善,機體僅暴露于治療血漿濃度的化合物。近年來,已發(fā)現(xiàn)樹枝狀大分子在生物技術和藥物應用中具有增加的應用。樹枝狀大分子是具有密集分支結(jié)構(gòu)的特定種類的聚合物,其特征在于比普通聚合物更高濃度的官能團/單位分子體積。存在大分子的4個亞類隨機高分支的聚合物;樹枝狀接枝物(dendrigraft)聚合物;樹枝狀基序;和樹枝聚體,其是基于每種樹枝狀結(jié)構(gòu)中存在的結(jié)構(gòu)控制的相對程度進行分類的。特別地樹枝聚體的獨特性質(zhì),例如其高分支程度、多價、球形結(jié)構(gòu)和良好確定的分子量,使得其給予用于藥物遞送的新支架的希望。在過去十年中,關于生物相容性樹枝聚體的設計和合成及其對生物科學的許多領域包括藥物遞送的應用的研究已增加。樹枝狀聚合物作為藥物遞送栽體和藥學活性物的潛在效用近年來已受到越來越多的關注118。然而,盡管文獻充滿例如用于樹枝聚體裝配的合成方案、樹枝聚體-藥物相互作用和藥物裝載效率的描述、以及逐漸增加地樹枝聚體與細胞系的相互作用的體外評估的報告2'3,但描述樹枝聚體的基礎藥代動力學和代謝歸宿的信息極少。樹枝聚體與腸組織的相互作用也已是幾個研究的主題"11,并且同時滲透性和細胞毒性與表面電荷和表面功能性的趨勢已得到確定,相對少的研究已描述樹枝聚體吸入體循環(huán)內(nèi)后的命運。這些少量研究中,Gillies等人已檢查了PEG化的'蝶形(bow-tie),聚酯樹枝聚體的藥代動力學,并顯示樹枝聚體清除機制高度依賴復合物的分子量和彈性,12Kobayashi等人已檢查了結(jié)構(gòu)改變對設計為促進重金屬或抗體絡合作用的樹枝聚體的生物分布的影響(和因此在生物成像中的應用)13_17。然而,迄今為止聚賴氨酸樹枝聚體的固有系統(tǒng)藥代動力學在任何細節(jié)中仍未得到描述。此外,制備這樣的樹枝聚體仍是挑戰(zhàn),所述樹枝聚體在血液中循環(huán)足夠長的時間以在靼位點上積聚,但仍可以以合理速率從體內(nèi)清除以避免長期積累。此外,樹枝聚體的組織定位仍難以事先預測,并需要更多的研究以確定外周樹枝狀基團對這些性質(zhì)的影響。需要研究的另外領域是藥物從樹枝聚體中的釋放。與密集的球形樹枝狀結(jié)構(gòu)相關的空間阻礙使得可酶促切割的鍵的改造變得困難。因此,本發(fā)明的目的是克服或至少減輕與現(xiàn)有技術相關的一個或多個困難和/或缺陷。發(fā)明概述在第一個方面,本發(fā)明提供了具有受控的末端基團化學計量的大分子,所述大分子包括表面層、至少一個次表面層和至少2種末端基團,所述末端基團包括其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;和選擇用于修飾藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。在一個進一步的實施方案中,所述大分子進一步顯示出受控的拓樸學,其中拓樸學描述了一種末端基團和另一種之間就其與大分子的表面或次表面層的連接而言的關系。在一個優(yōu)選實施方案中,第二種末端基團可以包括聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉(例如PEOX)。在一個進一步的實施方案中,第二種末端基團選自下述中的一種或多種修飾藥學活性劑和/或大分子的血漿半衰期的部分;促進藥學活性劑和/或大分子靶向一種或多種細胞或組織類型的部分;和促進藥學活性劑和/或大分子攝入一種或多種細胞或組織類型內(nèi)的部分。在一個優(yōu)選實施方案中,第二種末端基團選擇用于延長藥學活性劑和/或大分子的血漿半衰期。大分子優(yōu)選是樹枝聚體,更優(yōu)選地賴氨酸樹枝聚體。如下所述,根據(jù)本發(fā)明的這個方面的大分子可以在各種應用中使用,其中控制末端基團化學計量和/或拓樸學的能力在提供關于藥學活性劑的一致藥代動力學特征方面是有利的。發(fā)明詳述如本說明書和權(quán)利要求中此處所使用的,除非上下文另有明確指示,單數(shù)形式"一個"、"一種,,、"該"和"所述"包括復數(shù)的所指對象。因此,例如提及"大分子"包括一種或多種此類大分子。如本說明書和權(quán)利要求中此處所使用的,術語"包含"(或其語法變體)等價于術語"包括",并且不應視為排除其他元素或特征的存在。如本說明書和權(quán)利要求中此處所使用的,術語"拓樸學"意指一種末端基團和另一種之間就其與表面或次表面層的連接而言的關系。如本說明書和權(quán)利要求中此處所使用的,術語"拓樸異構(gòu)體"意指具有特定拓樸學的大分子。如本說明書和權(quán)利要求中此處所使用的,術語"表面"意指具有可與"末端基團,,或"封端,,基團反應的表面胺的代構(gòu)建單位的層。如本說明書和權(quán)利要求中此處所使用的,術語"次表面,,意指表面層下方的一層或多層。如本說明書和權(quán)利要求中此處所使用的,術語"表面胺"意指樹枝聚體的任何表面可反應的胺基。如本說明書和權(quán)利要求中此處所使用的,術語"末端基團化學計量"意指在大分子表面上的末端基團的組成(數(shù)目和類型)。如本說明書和權(quán)利要求中此處所使用的,術語"代構(gòu)建單位,,意指形成樹枝聚體的構(gòu)架的重復單位,例如在賴氨酸樹枝聚體的情況下是賴氨酸或賴氨酸類似物。如本說明書和權(quán)利要求中此處所使用的,術語"樹枝狀基序"意指大分子的不連續(xù)區(qū)段。當大分子分支之一在這樣的鍵上進行切割時,所述鍵使代構(gòu)建單位或核的可反應胺之一與附著的代構(gòu)建單位的羧基連接,樹枝狀基序?qū)⒈会尫?。樹枝狀基序的羧基表示獨特的點或頂點,在合成本發(fā)明的大分子的過程中樹枝狀基序?qū)⒃谄渖细街猎鲩L性大分子核。任何大分子可以適合于在本發(fā)明中使用。大分子可以選自一種或多種樹枝狀聚合物,包括樹枝醇(arborols)、樹枝狀接枝物、PAMAM樹枝聚體、賴氨酸樹枝聚體等。樹枝聚體聚合物的制備是眾所周知的,并且例如在美國專利號4,289,872和4,410,688(描述基于賴氨酸單位的層的樹枝聚體聚合物),以及美國專利號4,507,466、4,558,120、4,568,737和4,587,329(描述基于其他單位包括聚酰胺胺或PAMAM樹枝聚體聚合物的樹枝聚體聚合物)中得到描述。這些美國專利中公開的樹枝聚體聚合物描述為適合于下述用途例如表面改良劑、金屬螯合劑、反乳化劑或油/水乳狀液、在紙制備中的濕強度劑、和在水制劑例如涂劑中用于改變粘性的試劑。在美國專利號4,289,872和4,410,688中還提出基于賴氨酸單位的樹枝聚體聚合物可以用作基質(zhì)用于制備藥物劑量。本發(fā)明現(xiàn)在將針對樹枝聚體,特別是基于聚賴氨酸的那些更詳細地進行描述。樹枝聚體在任何給定應用中的效力的一個關鍵決定因素是大分子表面的性質(zhì)。申請人已意外地開發(fā)了通過使其在良好確定和控制的過程中與樹枝聚體綴合來修飾某些藥物化合物的吸收、分布、代謝與排泄(ADME)特征的技術。更具體而言,樹枝聚體大小和/或表面功能性可以進行修飾,以調(diào)整藥物的排泄(清除)、分布和代謝(吸收和重吸收)特征。本發(fā)明的過程可以允許生產(chǎn)精確結(jié)構(gòu),其可以進行改變以滿足藥物的特殊需要。此外,存在以受控方式使多種分子與樹枝聚體附著的能力,允許更高的藥物裝載和更通用的療法。藥物裝栽可以通過改變樹枝聚體的代數(shù)進行進一步修飾。先前研究已暗示在靜脈內(nèi)施用后,未封端的3H標記的聚L-賴氨酸樹枝聚體進行快速代謝以釋放賴氨酸。然而,已驚訝地確定樹枝聚體的PEG化減少樹枝聚體被蛋白水解酶以及血清蛋白質(zhì)識別并抑制吞噬性細胞清除,由此延長血漿循環(huán)時間。此外,PEG化可以增加樹枝聚體的流體力學體積,從而減少腎清除率。例如,本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)^標記的PEG化的賴氨酸樹枝聚體的血漿半衰期和尿清除程度依賴分子量。與更小的樹枝聚體(即O0kD)比較,更大的PEG化的樹枝聚體(即〉30kD)從血漿中相對緩慢地清除到尿內(nèi)。這與下述事實無關更小的樹枝聚體復合物顯示與血漿組分相互作用的跡象,導致產(chǎn)生更高分子量的種類。這些復合物的清除是快速的并且只有完整的樹枝聚體在尿中進行回收。此外,本發(fā)明人已觀察到當藥學活性組分和PEG基團附著至樹枝聚體的表面時,附著至樹枝聚體表面的PEG基團的大小可以決定樹枝聚體是否能夠避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取。因此顯而易見的是通過任何方式增加大小不一定導致樹枝聚體延長的血漿壽命。較大的樹枝聚體發(fā)現(xiàn)在肝和脾中積聚。然而,這經(jīng)過延長的時間段發(fā)生并且積聚的量小于10%的劑量。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中,PEG或聚乙基噁唑啉末端基團可以構(gòu)成樹枝聚體上約25%-75%的末端基團,更優(yōu)選地約25%-50%??梢栽黾訂蝹€PEG或聚乙基噁唑啉基團的相對大小,以維持所需血漿壽命和避免肝攝取。PEG或聚乙基噁唑啉基團的百分比和/或PEG或聚乙基噁唑啉基團的大小可以進行修改和修剪,以適合不同的藥學活性劑。在一個優(yōu)選實施方案中,PEG基團是相對單分散的,并選自200-10,000道爾頓的分子量范圍,更優(yōu)選地PEG基團選自500-5,000道爾頓的分子量范圍。PEG化還可以改善化合物的溶解性,并因此可以幫助與樹枝聚體表面綴合的以其他方式不能溶解的藥物的溶解。本發(fā)明因此提供了通過其具有高毒性或弱溶解性或兩者的藥物可以進行改造的方法,以提供這樣的媒介物,所述媒介物將提供藥物的受控釋放以維持在治療而不是有毒的血漿水平上的長期藥物濃度。攜帶2種不同末端基團的樹枝聚體可以制備為不同拓樸異構(gòu)體,其中拓樸學描述了一種末端基團和另一種之間就其與大分子的表面和次表面層的連接而言的關系。攜帶2種或更多不同的末端基團的樹枝聚體在AU2005905908中得到描述,所述專利的完整公開內(nèi)容通過引用方式合并。其中每種拓樸異構(gòu)體與復合物系統(tǒng)相互作用的方式可以是不同的。因此,能夠針對不同應用控制不同末端基團的表面分布可能是有利的。在相同拓樸學的分子中富集樹枝狀大分子樣品的能力可能是希望的,同樣地其已顯示的是在特定立體異構(gòu)體中富集有機材料是希望的,特別是用于生物學應用。因此大分子中的一種拓樸異構(gòu)體可能在給定應用中比另一種拓樸異構(gòu)體更有效。用于生產(chǎn)具有2種或更多不同的末端基團的樹枝聚體的現(xiàn)有技術方法涉及使用隨機表面官能化法的合成。在第一種現(xiàn)有技術方法中,第一種活性末端基團的亞化學計量的量嘗試用于對在大分子表面上的僅一半活性末端胺部分(表面胺)封端。其余的表面胺隨后可以進行反應,并且在這個二次反應中,過量的第二種活性末端基團可以用于迫使反應完成。在這個方法中,存在產(chǎn)生于反應第一個階段的具有不同末端基團化學計量的產(chǎn)物的統(tǒng)計分布,和此外對2種不同末端基團的拓樸學存在很少的控制或無控制。類似地,在第二種現(xiàn)有技術方法,2種末端基團可以同時與反應表面胺部分反應。在此類方法中,可能可以調(diào)整每個末端基團的化學計量以補償其不同的反應性,但分子與分子變異性仍將出現(xiàn),因為超過一種類型的代構(gòu)建單位或超過一種的末端基團可用于與脫保護的氮基反應,且因此每次反應的可能結(jié)果僅可能通過統(tǒng)計分布得到描述,而且再次不存在對反應的拓樸學結(jié)果的控制。與現(xiàn)有技術的隨機表面官能化比較,如果具有精確指定的末端基團的樹枝狀部分的豐度分數(shù)比其在隨機表面官能化的材料中的豐度分數(shù)大至少2倍(2倍單分散性)和優(yōu)選地4倍(4倍單分散性),那么大分子視為"富集的"。已針對末端基團舉例說明的富集概念也可以應用于表面偶聯(lián)體、四集體和八隅體等,這在AU2005905908中得到詳細描述,所述專利的完整內(nèi)容通過引用方式而合并入本文。大分子可以就特定末端基團化學計量和/或拓樸學進行富集。在末端基團化學計量的富集的極端水平上,每個大分子將具有相同組成(數(shù)目和類型)的末端基團。在富集的較中等水平上,例如在20%時的富集,這視為意指20%的大分子將具有相同組成(數(shù)目和類型)的末端基團。備選地,這種富集可以通過使組成與隨機官能化的大分子組成比較進行指定。例如,如果隨機法提供了在5%的大分子中的特定表面組成,那么富集將構(gòu)成具有特定末端基團組成(數(shù)目和類型)的大分子中超過這個5%水平的增加。因此,2倍富集將意指10%的大分子顯示出特定的末端基團組成。最簡單類型的拓樸學富集是在偶聯(lián)體水平上的富集。樹枝聚體組成可以在末端基團的水平上完全富集,但在偶聯(lián)體水平上無法完全富集。這是因為相同的末端基團可以以許多方式聚合成偶聯(lián)體。例如在所有圖9.1到9.5中,樹枝聚體包含16個末端A基團和16個末端B基團。然而,在圖9.1到9.4中,存在8個(AA)偶聯(lián)體和8個(BB)偶聯(lián)體,而在圖9.5中,存在16個(AB)偶聯(lián)體。更高級別的拓樸學富集是在四集體、八隅體和16聚體(16-tet)水平上的富集,并且在AU2005905908中得到詳細解釋。在另一個方面,提供了包括至少一個賴氨酸或賴氨酸類似物樹枝狀基序具有表面層和至少一個次表面層的大分子,所述大分子包括至少2種末端基團,其包括其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;和選擇用于修飾所述藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。在本發(fā)明的這個方面的一個進一步的實施方案中,大分子進一步顯示出受控的拓樸學,其中拓樸學描述了一種末端基團和另一種之間就其與大分子的表面或次表面層的連接而言的關系。在一個優(yōu)選實施方案中,第二種末端基團可以包括聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉(例如PEOX)基序。在一個進一步的實施方案中,第二種末端基團選擇用于修飾藥學活性劑的血漿半衰期。在一個優(yōu)選實施方案中,第二種末端基團選擇用于延長藥學活性劑的半衰期。在一個進一步的實施方案中,第二種末端基團選擇用于促進藥學活性劑靼向和/或攝入一種或多種細胞或組織類型。17在本發(fā)明的另一個方面,提供了具有受控的封端基團化學計量且具有下式的樹枝聚體核[重復單位L[表面構(gòu)建單位]J封端基團IL[封端基團2]q其中核選自賴氨酸或其衍生物、二胺化合物、三胺化合物或四胺化合物;重復單位選自酰胺胺、賴氨酸或賴氨酸類似物;表面構(gòu)建單位可以與構(gòu)建單位的那種相同或不同,并選自酰胺胺、賴氨酸或賴氨酸類似物;封端基團l是藥學活性劑、其衍生物或為此的前體或其殘基;封端基團2選擇用于修飾藥學活性劑的藥代動力學;m表示樹枝聚體的一個或多個次表面層的重復單位的總和并且是1一32的整數(shù);n表示樹枝聚體的一個或多個表面層的表面構(gòu)建單位的數(shù)目并且是2-32的整數(shù);p表示封端基團l基團的數(shù)目并且是l-64的整數(shù);和q表示封端基團2基團的數(shù)目并且是1-64的整數(shù);其中封端基團化學計量指封端基團的數(shù)目和類型。樹枝聚體聚合物的核可以選自任何合適的化合物。優(yōu)選地,核選自賴氨酸或其衍生物、二胺化合物、三胺化合物或四胺化合物。最優(yōu)選地,核是二苯曱基氨基-賴氨酸(BHALys),或選自下述的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中a、b和c各是O-5的整數(shù),更優(yōu)選地1-3。根據(jù)本發(fā)明的這個實施方案的重復單位可以優(yōu)選地選自下述中的一種或多種<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>其中a是0或1,優(yōu)選地1。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面,樹枝聚體具有賴氨酸或賴氨酸類似物核。賴氨酸樹枝狀核可以選自BHALys、DAH、EDA和TETA,如下文表示的樹枝聚體可以是PAMAM聚合物例如PAMAM32,賴氨酸或賴氨酸類似物聚合物,其中重復單位是[Lys]?;騕Su(NPN)山,其中Q在二價核上是2、6、14、30或62的整數(shù)或在三價核上是3、9、21或45的整數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的樹枝聚體可以通過和需要的一樣多的代延伸。優(yōu)選地,樹枝聚體通過1-5,更優(yōu)選地l-3代延伸根據(jù)本發(fā)明的大分子(特別地樹枝聚體)的藥學活性劑可以包括水不溶性藥物、水溶性藥物、親脂藥物、或其混合物。藥學活性劑可以由但不限于選自表1中的基團中的一種或多種進行例示。表1丙酮血癥制劑同化劑麻醉劑鎮(zhèn)痛藥抗酸劑抗關節(jié)炎藥抗體抗驚厥藥抗真菌劑抗組胺藥抗感染藥消炎藥抗代謝物抗微生物劑抗有絲分裂物抗寄生蟲藥抗原生動物藥抗?jié)V病藥抗病毒藥物4亍為矯正藥物生物制品血液和血液代用品支氣管擴張藥和祛痰藥癌癥療法和相關藥物心血管藥物中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物造影劑避孕藥利尿劑糖尿病療法生長激素生育藥物(Fertilitypharmaceuticals)補血藥生長促進劑激素替代療法止血藥免疫抑制劑免疫刺激劑激素和類似物肌肉木^弛藥礦物質(zhì)自然產(chǎn)物營養(yǎng)制品和營養(yǎng)物肥胖療法眼科藥物骨質(zhì)疏松癥藥物疼痛治療學肽和多肽呼吸藥物鎮(zhèn)靜劑和安定藥移植產(chǎn)物尿道酸化劑疫苗和佐劑維生素本發(fā)明特別適合于這樣的藥物,其即使以極小量也非?;钴S及其持續(xù)的長期施用是尋找的,特別用于克服伴隨標準劑量的毒性問題。非限制性例子包括氨曱蝶呤、抗代謝物、泰素、抗有絲分裂物、zenical、肥胖療法、環(huán)孢菌素、免疫抑制劑和消炎痛、抗炎治療。在一個實施方案中,根據(jù)本發(fā)明的大分子包括2種或更多不同的藥學活性劑、其衍生物、為此的前體、或其殘基作為末端基團。在一個進一步的方面,本發(fā)明提供了具有受控的末端基團化學計量并包括下述的樹枝聚體其為不同的藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的至少2種末端基團;和選擇用于修飾藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的進一步的末端基團,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。根據(jù)本發(fā)明的這個方面的樹枝聚體可以具有在組合療法中的應用。藥學活性劑可以是表l中例示的任何2種或更多類別的組合。示例性組合包括,但不限于,下述組合化學療法藥物;消炎藥和抗關節(jié)炎藥;肥胖療法和糖尿病療法;生長激素和生長促進劑;肌肉松弛藥和消炎藥;呼吸藥物和支氣管擴張藥或抗微生物劑;化學療法和維生素等。更具體的組合在實施例中進行描述。根據(jù)本發(fā)明的大分子,特別是樹枝聚體可以在促進藥物被動靶向?qū)嶓w瘤和炎癥位點方面特別有用。這種靶向是可能的,由于與腫瘤和炎癥相關的針對大分子的增加的脈管系統(tǒng)滲透性,和由于有限的淋巴引流。根據(jù)本發(fā)明的大分子還可以使用樹枝聚體上存在的靶向部分來靶向特定的細胞類型或組織類型。因此,在本發(fā)明的一個進一步的方面,提供了具有受控的末端基團化學計量并包括下述的樹枝聚體其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;和其為用于使藥學活性劑和/或大分子靶向一種或多種特定細胞或組織類型的靶向部分的第二種末端基團,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。合適的靶向部分的例子包括凝集素、抗體和抗體的功能片段。靶向部分還可以包括關于細胞表面受體的配體。許多不同的細胞表面受體可用作用于大分子的結(jié)合和/或攝取的靶。特別地,在本發(fā)明中有用的受體及其相關配體包括但不限于,葉酸鹽受體、腎上腺素受體、生長激素受體、黃體生成素受體、雌激素受體、表皮生長因子受體、成纖維細胞生長因子受體(例如FGR2)、IL-2受體、CFTR和血管上皮生長因子受體。在本發(fā)明的一個進一步的方面,提供了具有受控的末端基團化學計量的大分子,所述大分子包括表面層、至少一個次表面層和至少2種末端基團,所述末端基團包括其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;和能夠充當細胞受體配體的第二種末端基團,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。在本發(fā)明的一個進一步的方面,提供了具有受控的末端基團化學計量的大分子,所述大分子包括表面層、至少一個次表面層和至少2種末端基團,所述末端基團包括其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;和能夠充當細胞受體的第二種末端基團,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。葉酸鹽是核苷酸堿基的生物合成所需的維生素,并因此在增殖細胞中需要很高的量。在癌細胞中,葉酸的這種增加的需要通常在過量表達的葉酸鹽受體中反映,所述葉酸鹽受體負責將葉酸鹽轉(zhuǎn)運通過細胞膜。與之對比,葉酸鹽攝入正常細胞內(nèi)由還原型葉酸鹽載體而不是葉酸鹽受體促進。葉酸鹽受體在許多人癌癥中是上調(diào)的,包括卵巢、腦、腎、乳腺、髓樣細胞和肺的惡性腫瘤中,并且細胞表面上的葉酸鹽受體的密度看起來隨著癌癥發(fā)展而增加。葉酸鹽受體對肺瘤細胞,和特別地對晚期腫瘤細胞的相對特異性,意指葉酸鹽受體配體一一葉酸鹽可以是用于使化學治療藥靶向腫瘤的有用候選物。特異性是葉酸鹽受體與葉酸鹽受體配體-化學治療藥綴合物的相互作用的特異性,其通過某些非轉(zhuǎn)化的和惡性轉(zhuǎn)化的上皮細胞之間葉酸鹽受體的細胞表面表達模式中的差異得到進一步增強。在非轉(zhuǎn)化的細胞中,葉酸鹽受體在細胞的頂端膜表面上優(yōu)先表達,其面對體腔并且難以接近血液中存在的反應物。然而,在轉(zhuǎn)化后,細胞失去其極性和受體變得可接近循環(huán)系統(tǒng)中靶向葉酸鹽受體的藥物。因此,葉酸鹽或葉酸鹽衍生物可以是本發(fā)明的大分子的有用的靶向部分。在本發(fā)明的進一步方面,提供了具有受控的末端基團化學計量的大分子,所述大分子具有2種或更多不同的末端基團,所述末端基團包括其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;和其為葉酸鹽的殘基或葉酸鹽類似物的第二種末端基團,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。在本發(fā)明的這個方面的一個優(yōu)選實施方案中,藥學活性劑是抗腫瘤藥物試劑??梢允褂眉毎拘詣⒓毎蜃?、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑等,或其任何組合。在一個優(yōu)選實施方案中,藥學活性劑選自氨甲蝶呤、泰素、順鉑、卡柏、和多柔比星中的一種或多種。連接體部分可以摻入根據(jù)本發(fā)明的樹枝聚體的合成內(nèi),例如通過替換代構(gòu)建單位或介導末端基團附著至代構(gòu)建單位。因此,在本發(fā)明的一個進一步的方面,提供了具有受控的末端基團化學計量的大分子,優(yōu)選地樹枝聚體,所述大分子具有2種或更多不同的末端基團,所述末端基團包括一種或多種連接體部分;其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;和選擇用于修飾藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團;其中第一種和/或第二種末端基團通過連接體部分附著至大分子構(gòu)架;和其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。在一個進一步的實施方案中,第二種末端基團選自促進藥學活性劑和/或大分子耙向一種或多種細胞或組織類型的部分,和促進藥學活性劑和/或大分子攝入一種或多種細胞或組織類型內(nèi)的部分,和一種或多種連接體部分包括PEG。連接體可以是可切割的或不可切割的,依賴于附著至表面的基團的需要??汕懈畹倪B接體可以設計為酶促切割的,并且可以例如用于乾向表達那些酶的組織的樹枝聚體。備選地,對酸敏感的連接體可以是優(yōu)選的,從而使得與之附著的化合物在酸條件下被釋放,例如在含氧量低的組織中。各種連接體的概述連接體部分可以選自下述中的一種或多種:<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>酰胺連接體(19-21):酰胺鍵的性質(zhì)在確定游離藥物是否將從綴合物中釋放方面是重要的。例如,藥物(即多柔比星)經(jīng)由酰胺鍵與載體的綴合產(chǎn)生水解穩(wěn)定并且在體外不發(fā)揮任何抗癌效應的綴合物。經(jīng)由酰胺鍵直接與載體結(jié)合的藥物也將不能作為游離藥物,而是作為藥物-氨基酸容易地切割,如果載體其自身是可降解的。游離藥物從經(jīng)由直接的酰胺連接體結(jié)合的載體中的釋放將僅在罕見情況下可達到,其中藥物其自身是肽樣分子并且藥物和載體之間的鍵是可酶促切割的。腙、將和亞胺連接體(21-25):腙、肟和亞胺鍵不需要酶的存在以允許藥物與載體的切割。它們在低pH環(huán)境中能夠在C=N鍵上進行水解切割,所述低pH環(huán)境例如腫瘤血管外空間或溶酶體內(nèi)。常用的腙、肟和亞胺連接體分別產(chǎn)生于連接體的肼、烷氧基胺或胺部分與藥學活性部分的羰基(酮或醛)的反應。連接體還可以進行修飾以減慢水解速率,通過修飾C-N鍵部分周圍的烷基的數(shù)目,或通過用吸電子(以增加酸不穩(wěn)定性)或供電子(以減少酸不穩(wěn)定性)部分置換。酯連接體(19,26):可以制備對酸敏感和可代謝的酯連接體。原酸酯已用于使PEG與結(jié)合陰離子膜載體的脂質(zhì)綴合。綴合物在酸性條件下(pH4-6)的穩(wěn)定性依賴酯或原酸酯連接體的結(jié)構(gòu)。一般而言,ot-甲氧基-(o-{N-(2-十八烷氧基-[1,3]二氧戊環(huán)-4-基)甲基酰胺基}-聚乙二醇n。顯示在pH4和5下良好的穩(wěn)定性,oc-甲氧基-co-(N-(2-膽甾醇氧基-[1,3]二氧戊環(huán)-4-基)甲基酰胺基卜聚乙二醇n。在pH5下非常穩(wěn)定但在pH4下適度地較不穩(wěn)定,oc-甲氧基-co-(N-(2-甲基-s-十八烷氧基-[1,3〗二氧戊環(huán)-5-基)酰胺基}-聚乙二醇u。和a-甲氧基-as-{N-2-(3-羥丙基-膽甾醇氨基曱酸酯)-2-甲基-[1,3]二氧戊環(huán)-5-基-酰胺基}-聚乙二醇u。都不穩(wěn)定。在簡單酯與小分子綴合的方面,與比二石?;锔€(wěn)定但不如酰胺鍵穩(wěn)定的單酯比較,二酯官能化提供了用于代謝切割的更多位點。肽連接體(27-33)肽連接體是迄今為止所有可切割連接體中最通用的,因為許多不同的氨基酸組合可以用于控制切割的速率和切割酶。然而,這些連接體具有與其作為用于藥物和載體的綴合物的用途相關的2個問題,1)它們一般可通過遍及機體的非特異性肽酶切割,并且因此可能導致在非腫瘤分布位點上的非特異性藥物毒性,和2)切割可以在連接體內(nèi)的位點上發(fā)生,這導致保持與藥物分子結(jié)合的氨基酸。這可能阻礙藥物分子的化學治療效應。備選地,結(jié)合的氨基酸可能不改變藥物的藥理學效應但可能影響其藥代動力學。然而,這些切割效應可以通過選擇肽連接體中合適的氨基酸得到控制,所述氨基酸直接與藥物分子結(jié)一般地,組織蛋白酶B可切割的連接體已設計為在藥物綴合物經(jīng)由溶酶體系統(tǒng)的胞吞作用后進行切割,因為組織蛋白酶位于溶酶體中并且不釋放在細胞溶質(zhì)中。胞吞作用一般在載體(這通常是針對癌癥特異性細胞表面受體的抗體或針對癌癥特異性細胞表面受體的配體)與細胞膜結(jié)合后起始。非特異性蛋白酶(即對特定肽序列非特異性的蛋白酶)在其在腫瘤組織中已經(jīng)歷足夠的外滲和積聚后可以從PEG化的樹枝聚體切割藥物。應用關于肽切割的速率的下迷指導方針,其中a〉b指示a的切割速率大于關于b的切割速率。對于用作活性藥物和樹枝聚體末端氮之間的連接體的肽序列末端CG〉無末端CG〉末端G=末端GFG〉末端GGG和末端GGGF=末端GPG。注CG鍵由GSH還原。GGG鍵相對于其他肽鍵一般是非常穩(wěn)定的。二肽的切割一般對特定蛋白酶特異,并可以基于腫瘤細胞內(nèi)包含的各種蛋白酶的表達加以控制。戊二醛(34,35):戊二醛一般不用作常規(guī)連接體,而用作穩(wěn)定劑特別是在凝膠制劑中,或使藥物與所需吸收表面共價附著。它還用作不可代謝的間隔物,經(jīng)由交聯(lián)反應在藥物分子和大載體之間產(chǎn)生間隙。PEG-肽(2,36):PEG-肽以與常規(guī)肽類似的方式使用,除了PEG部分提供了對于載體另外的體內(nèi)穩(wěn)定性和質(zhì)量。一般地,它用于使藥物與抗體載體綴合并具有下述優(yōu)點增加Ab和藥物之間的距離同時暴露酶促切割的位點、減少綴合物的免疫原性、增加血液循環(huán)時間和增加復合物的溶解性。綴合物的內(nèi)在化和活性藥物(它不一定作為游離藥物釋放)的酶促釋放后,已針對阿霉素和多卡米星衍生物觀察到抗增殖效應。二硫化物連接體(1,37,38):二硫化物連接體是目前使用的最不穩(wěn)定的連接體并在體外經(jīng)歷快速的還原切割。然而,它們的體內(nèi)穩(wěn)定性一般高于其體外穩(wěn)定性。它們可以經(jīng)由含硫氨基酸之間的二疏鍵或在基于非肽的二硫鍵上形成。它們還顯示在體內(nèi)與其他親核硫醇更大的反應性并因此顯示快速的血漿清除。連接體可切割性的一般概述在循環(huán)中,連接體可切割性的順序如下二硫化物>長鏈肽>酯>腙>四肽(GGGF)=三肽(GFG>GGG=GPG)或>二肽(AV,AP,GP,F(xiàn)L,V-CU)>戊二醛=酰胺。連接體建議各種連接體的穩(wěn)定性基于其與之綴合的基團(即酶與連接體的可接近性)、綴合物在所需活性位點上的行為(即細胞攝取或細胞外積聚)和綴合物的性質(zhì)(即酯對酰胺)。預期二硫化物綴合物與目前系統(tǒng)的體內(nèi)行為是相對無法預測的。盡管長鏈肽更容易由蛋白酶接近用于快速切割,但它們可能太快速地和在非特定位點上進行切割,導致可能不是生物學活性的藥物活性肽/氨基酸種類的釋放?;贑-N的連接體(腙、將或亞胺)、酯或肽綴合物的切割將經(jīng)過至少數(shù)天發(fā)生,這允許綴合物在腫瘤組織中積聚。各自具有其優(yōu)點,但酯或腙連接體可能是優(yōu)選的。使藥學活性物與樹枝聚體連接的酯鍵提供了快速切割的鍵,并且盡管這對于靶位點可能不是特異性的,但切割導致游離藥學活性物的釋放。腙鍵產(chǎn)生的綴合物在一般循環(huán)中比酯更穩(wěn)定,并且經(jīng)由在C-N鍵上的水解在腫瘤位點上以更大的特異性進行切割。然而,藥物活性分子可能需要進行修飾以允許通過摻入羰基或肼部分來形成腙。在一個優(yōu)選實施方案中,連接體部分可能包括2種反應官能團一—F和Y,它們通過一個或多個碳或雜原子,優(yōu)選地通過烴主鏈進行連接。官能團F可以進行激活,以與反應胺部分如樹枝聚體的表面上的那些反應。一般地官能團F是羧化物基團或其殘基。另一種官能團Y是包含保護基團的胺,或它這樣進行選擇使得它具有與所需有機基的反應基團互補的特定反應性,所述所需有機基附著至樹枝狀基序的表面。Y的一般例子包括胺、羥基、巰基、烯基或炔基、腈、鹵化物、羧化物或疊氮基。當連接體部分用于使末端基團與樹枝聚體的表面胺基連接時,連接體和有機基之間的反應可以在連接體部分與樹枝狀基序的表面胺反應之前或之后進行。進行用于向樹枝狀基序引入一個或多個連接體部分的反應,以確保樹枝聚體的所有脫保護的表面胺與連接體部分的完全反應。一般地這通過使用過量的所選擇的連接體部分來完成。除了上文描述的連接體外,本發(fā)明可以使用光可切割的連接體。例如,可以使用異雙功能的、光可切割的連接體。異雙功能的、光可切割的連接體可以是水或有機可溶的。它們包含可以與胺或醇反應的活化酯和可以與巰基反應的環(huán)氧化物。在酯和環(huán)氧化物基團之間的是3,4-二曱氧基-6-硝基苯基光異構(gòu)化基團,當暴露于近紫外線(365nm)時,其釋放完整形式的胺或醇。因此,當使用此類連接體與樹枝聚體連接時,藥學活性組分可以通過使靶區(qū)域暴露于近紫外線以生物學活性或可激活形式釋放。例如,泰素的醇基可以與有機可溶性的連接體活化酯反應。這種產(chǎn)物依次與樹枝聚體的部分硫醇化的表面反應。在順鉑的情況下,藥物的氨基可以與連接體的水溶性形式反應。如果氨基不具有所需反應性,那么可以使用順柏的含伯氨的活性類似物,例如Pt(n)磺胺嘧啶二氯化物。因此綴合時,該藥物是無活性的并因此不損害正常細胞。當綴合物在腫瘤細胞內(nèi)定位時,它暴露于適當?shù)慕黸v波長的激光,引起藥學活性物釋放到細胞內(nèi)。在本發(fā)明的一個進一步的方面,提供了包括具有受控的末端基團化學計量的大分子的藥物組合物,所述大分子具有表面層、至少一個次表面層和至少2種或更多不同的末端基團并包括其為藥學活性劑的殘基;其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;選擇用于修飾藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團;和為此的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。大分子組分可以是樹枝聚體,優(yōu)選地賴氨酸樹枝聚體。藥學活性劑可以選自上文描迷的一種或多種類別的藥學活性劑。優(yōu)選地藥學活性劑是癌癥療法或相關藥物,包括抗有絲分裂物或抗代謝物試劑;肥胖療法試劑;消炎藥;或免疫抑制劑。第二種末端基團可以選擇用于延長藥學活性劑的血漿半衰期。在一個進一步的實施方案中,第二種末端基團選擇用于促進藥學活性劑靶向和/或攝入一種或多種細胞或組織類型。第二種末端基團可以包括聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉(例如PEOX)基序。在本發(fā)明的一個進一步的方面,提供了包括具有受控的末端基團化學計量的大分子的藥物組合物,所述大分子具有表面層、至少一個次表面層和至少2種或更多不同的末端基團,所述末端基團包括其為藥學活性劑的殘基;其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;其為葉酸鹽的殘基或葉酸鹽類似物的第二種末端基團;和為此的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。在本發(fā)明的這個方面的一個優(yōu)選實施方案中,藥學活性劑是抗腫瘤藥物試劑??梢允褂眉毎拘詣⒓毎蜃?、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑等,或其任何組合??鼓[瘤藥物試劑可以選自下述中的一種或多種利妥昔單抗(rituximab)、奧沙利4白(oxaliplatin)、多西他賽(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、依立替康(irinotecan)、紫杉醇(pactitaxel)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、卡鈿(carboplatin)、西妥昔單抗(cetuximab)、多柔比星(doxorubicin)、培美曲塞(pemetrexed)、表柔比星(epiruMcin)、硼替佐米(bortezomib)、托泊替康(topotecan)、阿扎胞苷(azacitidine)、長春瑞濱(vinorelbine)、米托蒽敏(mitoxantrone)、氟達拉濱(fludarabine)、多柔比星(doxorubicin)、阿侖珠單抗(alemtuzumab)、卡莫司汀(carmustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、依達比星(idarubicin)、絲裂霉素(mitomycin)、氟尿嗜咬(fl雨ouracil)、順鈿(cisplatin)、氨甲蝶呤(methotrexate)、美法侖(meiphalan)、肶霜(arsenic)、地尼白介素(denileukindiftitox)、阿糖胞普(cytarabine)、左亞葉酸鉀(calciumlevofolinate)、環(huán)礴酖胺(cyclophosphamide)、依托泊脊(etoposide)、槲寄生(viscumalbum)、美司鈉(邁esna)、吉妥珠單抗(gemtuz畫b)、奧佐米星(ozogamicin)、白消安(busulfan)、噴司他丁(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、博來霉素(bleomycin)、柔紅霉素(da畫rubicin)、苯達莫司汀(bendamustine)、達卡巴漆(dacarbazine)、雷替曲塞(raltUrexed)、長春新堿(vincristine)、福莫司汀(fotemustine)、磷酸依托泊*(etoposidephosphate)、吟汾姆鈉(porfimersodium)和長春堿(vinbiastine)。在一個優(yōu)選實施方案中,藥學活性劑選自氨甲蝶呤、泰素、順鉑、卡鉑、和多柔比星中的一種或多種。藥學上可接受的載體或賦形劑可以選自任何已知的載體或賦形劑,依賴選擇用于活性物的遞送途徑。藥物組合物可以配制用于口部、注射、直腸、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或其他遞送。藥物組合物可以配制在片劑、膠嚢、嚢片(caplet)、可注射的安瓿瓶、或即用型溶液、凍干的材料、栓劑、大丸劑或植入物形式中。此類組合物的配制是本領域技術人員眾所周知的。合適的藥學上可接受的載體和/或稀釋劑包括任何和所有常規(guī)溶劑、分散介質(zhì)、填充劑、固體載體、水溶液、涂層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。用于藥學活性物質(zhì)的此類介質(zhì)和試劑的使用是本領域眾所周知的,并且例如在tay/^OT7's戶力ar邁ace"/c"Sc/e/7ces,第18版,MackPublishingCompany,Pennsylvania,USA中^尋至'J描述。除^,4壬何常規(guī)介質(zhì)或試劑與本文描述的樹枝聚體聚合物的末端基團不相容,考慮其在本發(fā)明的藥物組合物中的使用。補充性活性成分也可以摻入組合物內(nèi)。為了容易施用和劑量的一致性以劑量單位形式配制組合物是特別有利的。如本文所使用的,"劑量單位形式"指適合作為用于待治療的人患者的單元劑量的物理不連續(xù)單位;每個單位包含為產(chǎn)生與所需藥學載體和/或稀釋劑結(jié)合的所需療效而計算的預定量的活性成分。關于本發(fā)明的新型劑量單位形式的規(guī)格由下述指示并直接依賴下述U)活性成分的獨特性質(zhì)和待達到的特定療效,和(b)在配藥法中固有的限制例如用于特定治療的活性成分。在本發(fā)明的另外一個方面,提供了如上文描述的有效量的大分子在人或非人動物患者的預防或治療性療法中,或在用于治療人或非人的動物患者的藥物制備中的用途。在本發(fā)明的另外一個進一步的方面,提供了用于治療哺乳動物包括人患者中的疾病指標或生理學缺陷的方法,所述方法包括給有此療法需要的患者施用預防或治療有效量的如上所述的藥物組合物。各種施用途徑是可用的。當然,選擇的具體方式將依賴于待治療的具體病狀和對于療效所需的劑量。一般而言,本發(fā)明的方法可以使用醫(yī)學上可接受的任何施用方式來實踐,意指產(chǎn)生本發(fā)明的活性組分的治療水平而不引起臨床上不可接受的副作用的任何方式。此類施用方式包括口部、直腸、局部、鼻、吸入、經(jīng)皮或腸胃外(例如皮下、肌內(nèi)和靜脈內(nèi))、眼內(nèi)和玻璃體內(nèi)(即進入眼的玻璃質(zhì)內(nèi))途徑。用于口部施用的制劑包括不連續(xù)的單位例如膠囊、片劑、錠劑等。其他途徑包括直接鞘內(nèi)施用到脊髓液內(nèi)、例如通過本領域普通技術人員眾所周知的各種導管和氣嚢血管成形術裝置直接引入,和實質(zhì)內(nèi)注射到靶區(qū)域內(nèi)。組合物可以方Y(jié)更地以單位劑型呈現(xiàn),并且可以通過藥學領域眾所周知的任何方法進行制備。此類方法包括使活性化合物與栽體結(jié)合的步驟,所述栽體構(gòu)成一種或多種助劑。一般而言,組合物通過下述制備使活性化合物與液體載體、細碎的固體載體或兩者均勻和密切地結(jié)合,和隨后必要時使產(chǎn)物成形。適合于口部施用的本發(fā)明的組合物可以作為不連續(xù)的單位呈現(xiàn),例如在脂質(zhì)體中各自包含預定量的大分子的膠嚢、扁囊劑、片劑或錠劑,或作為在水溶液或非水液體中的懸浮液呈現(xiàn),例如糖漿劑、酏劑或乳狀液。適合于腸胃外施用的組合物方便地包含活性組分的無菌含水制劑,其優(yōu)選與接受者的血液等滲。這種含水制劑可以根據(jù)已知方法使用那些合適的擴散或濕潤劑和懸浮劑進行配制。無菌可注射的制劑還可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液,例如作為在聚乙二醇中的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶劑中是水、和等滲氯化鈉溶液。此外,無菌的、不揮發(fā)性油方便地用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個目的,可以使用任何溫和的不揮發(fā)性油,包括合成的甘油單或二酯。此外,脂肪酸例如油酸可用于注射劑的制備。本發(fā)明的大分子還可以配制用于在設計為鼻內(nèi)或通過吸入施用樹枝聚體聚合物的系統(tǒng)中遞送,例如作為包含活性組分的精細分散的氣霧噴霧器。其他遞送系統(tǒng)可以包括持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)。優(yōu)選的持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)是可以提供本發(fā)明的大分子在持續(xù)釋放的小丸劑或膠嚢中的釋放的那些遞送系統(tǒng)。許多類型的持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)是可用的。這些包括但不限于(a)其中活性組分包含在基質(zhì)內(nèi)的侵蝕系統(tǒng),和(b)其中活性組分以受控速率滲透通過聚合物的擴散系統(tǒng)。此外,可以使用基于泵的金屬制品遞送系統(tǒng),其中某些適合于移植。本發(fā)明的大分子以預防或治療有效量進行施用。預防或治療有效量意指至少部分達到需要的效應、或延遲發(fā)作、抑制進展、或完全停止待治療的具體病狀的發(fā)作或進展所需的量。當然,此類量將依賴待治療的具體病狀、病狀的嚴重度和個體患者參數(shù),包括年齡、身體健康狀況、大小、重量和同時的治療。這些因素是本領域普通技術人員眾所周知的并且可以使用僅僅常規(guī)實驗而解決。一般優(yōu)選使用最大劑量,即根據(jù)合理的醫(yī)學判斷的最高安全劑量。然而,本領域普通技術人員應當理解,由于醫(yī)學原因、心理原因或由于事實上的任何其他原因可以施用較低的劑量或可耐受的劑量。一般地,大分子的日劑量將為約0.01mg/kg/天-1000mg/kg/天。最初可以施用小劑量(0.01-1mg),隨后逐漸增加劑量直至約1000mg/kg/天。在受試者中的應答在此類劑量下不夠的情況下,可以使用甚至更高的劑量(或通過不同、更局限性的遞送途徑的有效更高劑量)至患者耐受允許的程度??紤]多次劑量/天以達到化合物合適的系統(tǒng)水平。在一個進一步的優(yōu)選實施方案中,藥學上可接受的載體或賦形劑可以選自一種或多種無菌含水鹽溶液、懸浮液和乳狀液,包括鹽水和緩沖介質(zhì)、林格氏(Ringer's)葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、和乳酸鹽林格氏溶液。靜脈內(nèi)媒介物包括流體和營養(yǎng)素補充物、電解液補充物,例如基于林格氏葡萄糖的那些等。對于通過非靜脈內(nèi)途徑的施用,載體可以是凝固血漿的形式,優(yōu)選地患者的凝固血漿。備選地,載體可以是無血漿的、生理學相容的、生物可降解的固體或半固體,例如凝膠、懸浮液或水溶性膠凍。阿拉伯樹膠、曱基纖維素和其他纖維素衍生物、海藻酸鈉和黃蓍膠懸浮液或凝膠適合于用作本發(fā)明實踐中的載體,例如羧甲基纖維素鈉2.5%、黃蓍膠1.25%和瓜爾膠0.5%。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中,藥物組合物中的大分子可以包括藥學活性的至少2種不同的末端基團。此類實施方案可以與各種類型的治療組合使用。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中,藥物組合物包括具有受控的末端基團化學計量的大分子,優(yōu)選地樹枝聚體,所述大分子包括至少2種末端基團,所述末端基團包括至少一種可切割的或不可切割的連接體部分;其為藥學活性劑的殘基;其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;選擇用于修飾所述藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團;和為此的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑,其中第一種和/或第二種末端基團通過一種或多種連接體部分附著至大分子構(gòu)架;和其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。在缺乏對腫瘤內(nèi)部的有效營養(yǎng)素供應限制進一步的細胞復制前,癌性腫瘤將快速和不受控制地生長至約2mm的直徑(1)。腫瘤可以保持這個大小多年,直至血管發(fā)生開始給腫瘤提供其自身的血液供應。這可以通過其發(fā)生的一種機制是經(jīng)由低氧誘導因子-loc的活化,所述低氧誘導因子-1oc是在受限的氧和葡萄糖供應的位點處(例如腫瘤團塊的內(nèi)部)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子并負責涉及血管生成的基因的上調(diào)(2)。然而,腫瘤內(nèi)的快速血管化產(chǎn)生在血管內(nèi)皮細胞之間具有大間隙的缺陷結(jié)構(gòu),這允許通常無法透過正常脈管系統(tǒng)的大顆粒積聚。此外,在腫瘤團塊內(nèi)不產(chǎn)生淋巴引流以去除積聚的顆粒,因此存在腫瘤EPR效應(1)。腫瘤內(nèi)的不規(guī)則代謝和血管供應產(chǎn)生與正常細胞比較不同的PH梯度。腫瘤內(nèi)增加的乳酸鹽和碳酸積聚導致微酸性的細胞外環(huán)境(pH~6.5),而由于缺陷的Na/H交換子,細胞內(nèi)環(huán)境是中性或微堿性的(pH7.0-7.4)。這種差異pH梯度阻礙其為弱堿的某些化療藥物例如多柔比星的積聚。酸性細胞外環(huán)境也已與癌癥轉(zhuǎn)移聯(lián)系,由于間質(zhì)基質(zhì)和細胞間間隙連接的降解??梢岳眠@種細胞外酸性以使得能夠pH介導地釋放來自載體分子的抗癌藥物,所述藥物已經(jīng)由對酸敏感的連接體結(jié)合。釋放可以在細胞外間隙(pH~6.5)中或溶酶體隔室(pH~4-5)中發(fā)生。抗癌藥物已與腫瘤靶向基團例如轉(zhuǎn)鐵蛋白進行連接,關于轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體由大多數(shù)肺瘤細胞過量表達。已使用可由在腫瘤溶酶體中過量表達的組織蛋白酶B或D切割的其他連接體。因此在本發(fā)明的一個進一步的方面,提供了用于治療有此療法需要的哺乳動物包括人患者中的腫瘤,包括惡性腫瘤的方法,所述方法包括給患者施用有效量的藥物組合物,所述藥物組合物包括具有受控的末端基團化學計量的大分子,所述大分子具有表面層、至少一個次表面層和至少2種末端基團,所述末端基團包括其為抗腫瘤藥物試劑的殘基;其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;選擇用于修飾抗腫瘤藥物試劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團;和為此的藥學上可接受的載體;稀釋劑或賦形劑,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。在一個實施方案中,大分子進一步包括一種或多種連接體部分,其中一種或多種連接體部分使第一種和/或第二種末端基團附著至大分子構(gòu)架??鼓[瘤藥物試劑可以是任何合適的類型。可以使用細胞毒性劑、細胞因子、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑等,或其任何組合。抗腫瘤試劑可以選自下述中的一種或多種利妥昔單抗、奧沙利鉑、多西他賽、吉西他濱、曲妥珠單抗、依立替康、紫杉醇、貝伐珠單抗、卡鉑、西妥昔單抗、多柔比星、培美35曲塞、表柔比星、硼替佐米、托泊替康、阿扎胞苷、長春瑞濱、米托蒽醌、氟達拉濱、多柔比星、阿侖珠單抗、卡莫司汀、異環(huán)磷酰胺、依達比星、絲裂霉素、氟尿嘧啶、順鉑、氨甲蝶呤、美法侖、砒霜、地尼白介素、阿糖胞苷、左亞葉酸鈣、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、槲寄生、美司鈉、吉妥珠單抗、奧佐米星、白消安、噴司他丁、克拉屈濱、博來霉素、柔紅霉素、苯達莫司汀、達卡巴嗪、雷替曲塞、長春新堿、福莫司汀、磷酸依托泊苷、葉吩姆鈉和長春堿。在一個優(yōu)選實施方案中,抗腫瘤藥物試劑選自氨曱蝶呤、泰素、順鉑、卡鉑、和多柔比星中的一種或多種。第二種末端基團可以選擇用于延長藥學活性物的血漿半衰期。第二種末端基團可以選擇用于促進抗腫瘤藥物試劑靶向和/或攝入一種或多種特定細胞或組織類型。在一個優(yōu)選實施方案中,第二種末端基團包括聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉。藥學上可接受的載體或賦形劑可以選自任何已知的載體或賦形劑,依賴于所選擇用于活性物的遞送途徑。本發(fā)明的大分子特別是樹枝聚體可以用于使藥學活性劑靶向淋巴系統(tǒng)。淋巴系統(tǒng)由遍及機體的脈管區(qū)域分布的專門脈管、結(jié)和聚集的淋巴樣組織的區(qū)域的精細網(wǎng)絡組成。淋巴管主要負責體液平衡的維持,并且在腸吸收和中性脂肪轉(zhuǎn)運中以及在有效的免疫防御機制的維持中起作用。在大多數(shù)毛細血管床中,血管內(nèi)皮是連續(xù)的并與不間斷的基底膜結(jié)合。因為此類血管毛細管對于注入間質(zhì)間隙內(nèi)(例如在皮下或肌內(nèi)注射)的大分子和小顆粒是相對難以滲透的。與之對比,淋巴毛細管由具有不完全的基底層的單層重疊的內(nèi)皮細胞組成。這導致具有比毛細血管中的那些更'開放,的細胞間連接的內(nèi)皮層。細胞間連接距離的估計量為數(shù)微米(3-5)至15-20nm(6-10)。這些大的細胞間連接因此可以促進大分子、膠體和可能地樹枝聚體從間質(zhì)間隙到淋巴管內(nèi)的優(yōu)先轉(zhuǎn)運或引流。就對淋巴管的定向或靶向遞送而言,淋巴還充當用于散播腫瘤轉(zhuǎn)移灶的主要管道,并且已廣泛地用作針對細胞毒性劑的靶,所述細胞毒性劑設計為對抗來自實體瘤的轉(zhuǎn)移灶的傳播。一般而言淋巴中的B和T淋巴細胞的相對高濃度還提供了針對細胞因子例如干擾素和免疫調(diào)節(jié)劑的有吸引力的靶。此外,在淋巴樣組織中增加病毒負荷和增加病毒繁殖的人免疫缺陷病毒(HIV)陽性患者中的近期發(fā)現(xiàn)已提高淋巴作為在HIV和AIDS的治療中的治療耙的興趣。迄今為止,提供藥物至淋巴結(jié)的靼向遞送的幾種脂質(zhì)體制劑已得到開發(fā),特別是對于抗癌藥物多柔比星(Doxil/Caelyx)(16-21)。因此,在本發(fā)明的一個進一步的方面,提供了用于使藥學活性劑靶向遞送給動物的淋巴系統(tǒng)的方法,所述方法包括給動物施用有效量的具有受控的末端基團化學計量的大分子,所述大分子包括表面層、至少一個次表面層和至少2種末端基團,所述末端基團包括其為藥學活性劑的殘基;其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;選擇用于促進藥學活性劑和/或大分子攝入淋巴的第二種末端基團;和為此的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在一個優(yōu)選實施方案中,第二種末端基團是PEG或聚乙基噁唑啉。在一個優(yōu)選實施方案中,PEG基團是相對單分散的,并選自200-10,000道爾頓的分子量范圍,更優(yōu)選地PEG基團選自500-5,000道爾頓的分子量范圍。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中,第二種末端基團是具有超過約1000道爾頓的分子量的PEG。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中,第二種末端基團是具有超過約1500道爾頓的分子量的PEG基序。在一個優(yōu)選實施方案中,樹枝聚體具有超過約20kDa的分子量,優(yōu)選地超過約30kDa,更優(yōu)選地超過約50kDa。在一個優(yōu)選實施方案中,樹枝聚體包括可切割的或不可切割的連接體部分,其使笫一種末端基團附著至樹枝聚體構(gòu)架。在一個優(yōu)選實施方案中,樹枝聚體通過皮下注射施用于動物,包括人。大分子的合成在一個進一步的方面,本發(fā)明提供了制備具有受控的末端基團化學計量的大分子的方法,所述大分子包括表面層、至少一個次表面層和2種或更多不同的末端基團,其中至少一種末端基團是藥學活性劑、其衍生物、為此的前體、或其殘基,和至少一種末端基團選擇用于修飾藥學活性劑的藥代動力學,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。用于合成本發(fā)明的樹枝聚體的過程涉及增長性樹枝聚體的核部分和作為代構(gòu)建化合物的一層或多層賴氨酸或賴氨酸類似物的順次反應。賴氨酸類似物的頂端羧化物F(其代表在合成過程中樹枝狀基序?qū)⒃谄渖细街猎鲩L性大分子核的獨特的位點),將必須在與無保護的胺部分反應前激活。賴氨酸類似物的胺基A和B各自進行保護以防止自身縮合。當代構(gòu)建化合物的羧化物F與增長性樹枝聚體的無保護的氮反應時,代構(gòu)建化合物的胺A和B總是被保護的。此外,無保護的胺和激活的賴氨酸類似物之間的反應以這樣的方式進行,以便確保無保護的胺與所選擇的賴氨酸類似物完全反應。這通過使用化學計量過量的激活的賴氨酸類似物最簡單地完成。用于合成本發(fā)明的樹枝聚體的過程可以包括使增長性樹枝聚體的無保護的胺與連接基團或末端基團,例如藥學活性物、細胞表面配體和PEG反應。在每種情況下,連接體或末端基團的羧化物基團在反應前或在原位被激活用于酰胺鍵形成。連接基團的胺是被保護的或已與末端基團反應。此外,增長性樹枝聚體的無保護的胺與激活的連接體或末端基團之間的反應以這樣的方式進行,以便確保無保護的胺與激活的基團完全反應,一般通過使用過量的激活的基團。保護基團的去除順序可能是確定反應順序中的重要因素,所述反應順序可以用于制備包含不同胺保護基團的樹枝聚體,特別是在一種胺保護基團的切割條件可能導致旁觀的胺保護基團喪失的情況下。下列的保護基團表提供了可分解的和正交的胺保護基團的優(yōu)選組??煞纸獾陌繁Wo基團組定義為關于其存在這樣的去除順序,使得不意欲切割的那些基團對于切割條件是惰性的那些。當保護基團定義為正交的時,這意指每個基團對于去除正交組的其他基團中的每一個所需的切割條件是惰性的。舉例說明性的胺保護基團可以在下列參考文獻中找到來源ProtectivegroupsinOrganicSynthesis,第3版,JohnWileyandSons,NewYork1999,Greene,T.W.andWuts,P.G.M.,ProtectingGroups第3版,ThiemeStuttgart2004,Kocienski,P.J。優(yōu)選的胺保護基團可以選自表2。表2:優(yōu)選的胺保護基團<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>A貧4^岸一w哞/y^^^^^欲與該4^^存it義/i/^^求護崖窗^逸合^:乂^"^r為、岸辨""J成。^遂合魂^"t》庠^",謬么,括矛##^#^窗^^^;|^被^餘^差厲。么措2-戚H:&;^2-iK&。J.就不Z^"^庫邦化不^jHitW逾合。在一個進一步的方面,本發(fā)明提供了用于制備具有受控的末端基團化學計量的大分子的過程,其包括下述步驟(i)提供包括具有官能團和2種或更多不同保護基團的外層的增長性大分子;其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團的前體;和選擇用于修飾藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團的前體,(ii)通過去除第一種保護基團使外層上的官能團脫保護;(Hi)激活第一種或第二種末端基團前體之一;(iv)使脫保護的官能團與激活的末端基團前體反應;(v)通過去除第二種保護基團使外層上的官能團脫保護;(vi)激活第一種或第二種末端基團前體中的另一種;和(iv)使脫保護的官能團與激活的末端基團前體反應;其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。在一個進一步的方面,本發(fā)明提供了用于制備具有受控的末端基團化學計量的大分子的過程,其包括下述步驟(i)提供包括具有官能團和2種或更多不同保護基團的外層的增長性大分子;其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團前體;和選擇用于修飾藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團,和包括羧化物基團和受保護的胺基的連接體部分(ii)通過去除第一種保護基團使外層上的官能團脫保護;(iii)激活連接體部分上的羧化物基團;(iv)使脫保護的官能團與連接體部分上激活的羧化物基團反應;(v)使連接體部分上的胺基脫保護;(vi)激活第一種或第二種末端基團前體之一;(vii)使脫保護的胺基與激活的末端基團前體反應;(viii)通過去除第二種保護基團使外層上的官能團脫保護;(ix)激活第一種或第二種末端基團前體中的另一種;和(x)使脫保護的官能團與激活的末端基團前體反應;其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。用于合成本發(fā)明的大分子的優(yōu)選過程包括提供附著至增長性大分子的表面改性劑化合物的預備步驟。表面改性劑化合物包括羧化物基團,以促進改性劑化合物附著至增長性大分子;其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;和/或選擇用于修飾藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團。末端基團的表面基團化學計量(數(shù)目和類型)可以通過使用樹枝狀基序得到控制,在所述樹枝狀基序中末端胺保護基團表面基團化學計量和拓樸學已確定。已觀察到此類方法可以提供具有高純度的本發(fā)明的樹枝聚體。表面改性劑化合物可以以任何合適的方式進行制備。在一個實施方案中,提供了用于制備表面改性劑化合物的過程,所述過程包括(i)提供具有2種或更多不同的胺保護基團和羧化物基團的賴氨酸或賴氨酸類似物化合物;其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團的前體;和選擇用于修飾所述藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團的前體;(ii)使受保護的賴氨酸或賴氨酸類似物化合物上的第一種胺脫保護;(iii)激活第一種或第二種末端基團前體;(iv)使激活的末端基團前體與脫保護的胺基反應;(v)使保護的賴氨酸或賴氨酸類似物化合物上的第二種胺脫保護;(vi)激活第一種或第二種末端基團前體中的另一種;和(vii)使另一種激活的末端基團前體與第二種脫保護的胺基反應,以提供表面改性劑化合物。表面改性劑化合物優(yōu)選地包括賴氨酸或賴氨酸類似物主鏈。表面用于合成根據(jù)本發(fā)明的表面改性劑化合物的過程可以包括去除一種或多種末端胺保護基團,以提供一種或多種反應胺基。這些反應胺基隨后與第一種或第二種末端基團的前體反應。末端基團前體的羧化物部分將在反應前或在原位被激活用于酰胺鍵形成。此外,賴氨酸或這樣的方式進行,以便確保無保護的胺與激活的末端基團完全反應,一般通過使用化學計量過量的激活的基團。在一個實施方案中,用于制備表面改性劑化合物的過程可以任選前保護所選擇的羧化物基團。用于受保護的羧化物基團的保護基團優(yōu)選對于去除末端胺上存在的保護基團所需的條件是穩(wěn)定的。羧化物保護基團例如甲酯或更優(yōu)選地乙酯是合適的。舉例說明性的羧化物保護基團可以在下歹'J參考文獻中找至!]來源、ProtectivegroupsinOrganicSynthesis,第3版,JohnWileyandSons,NewYork1999,Greene,T.W.andWuts,P.G.M.,ProtectingGroups第3版,ThiemeStuttgart2004,Kocienski,P.J。當表面改性劑化合物的合成在添加末端基團后需要進一步的脫保護步驟時,重要的是考慮這種末端基團對于后續(xù)反應的穩(wěn)定性。在末端基團添加的優(yōu)選順序中,選擇用于修飾藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團首先添加至賴氨酸或賴氨酸類似物主鏈中。此外,在其中藥學活性劑經(jīng)由不穩(wěn)定的連接體附著至賴氨酸或賴氨酸類似物主鏈的情況下,可能必須在賴氨酸或賴氨酸類似物主鏈的必須使藥學活性劑-連接體部分的羧化物基團在無保護的末端胺基的出現(xiàn)前激活。用于合成表面改性劑化合物的過程隨后可以包括末端胺保護基團的進一步去除和與另外的末端基團的反應,以完成表面改性劑化合物的表面修飾。當表面改性劑化合物所選擇的羧化物具有保護基團時,受保護的羧化物將在末端基團已全部安置后進行脫保護,或它將在不穩(wěn)定的連接體安置前進行脫保護。表面改性劑化合物所選擇的羧化物已脫保護后,在無保護的末端胺基和末端基團的羧化物之間形成酰胺鍵的所有后續(xù)反應將要求末端基團的羧化物在引入表面改性劑化合物前激活。用于合成本發(fā)明的大分子的過程隨后通過使增長性大分子的無保護的胺與表面改性劑化合物反應來繼續(xù)。樹枝狀基序的羧化物部分將在反應前或在原位被激活用于酰胺鍵形成。在優(yōu)選方法中,表面改性劑化合物的羧化物部分在原位激活。這種方法是優(yōu)選的并且通過包括水或其他羥基供體,它可以限制酯鍵與大分子的偶然形成,其中暴露的羥基部分存在于增長性大分子核或表面改性劑化合物上。在一個實施方案中,表面改性劑化合物經(jīng)由連接體部分附著至增長性大分子。因此,在本發(fā)明的一個備選實施方案中,提供了用于制備具有受控的末端基團化學計量的大分子的過程,其包括下述步驟(i)提供包括具有官能團和1種或更多保護基團的外層的增長性大分子;和表面改性劑化合物,其包括羧化物基團其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;和選擇用于修飾藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團;(ii)激活表面改性劑化合物上的羧化物基團;(iii)通過去除保護基團使增長性大分子的外層上的官能團脫保護;和(vii)使增長性大分子上脫保護的官能團與表面改性劑化合物上的激活的羧化物基團反應,其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。本發(fā)明的大分子可以包括用于第一種或第二種末端基團獨特的附著點。以這種方式,大分子可以用單一的第一種或第二種末端基團進行合成。優(yōu)選地,附著至獨特的附著點的末端基團是選擇用于修飾藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團。更優(yōu)選地,附著至獨特的附著點的第二種末端基團選擇用于促進藥學活性劑和/或大分子靶向和/或攝入一種或多種細胞或組織類型。在一個備選實施方案中,本發(fā)明的大分子可以包括用于第一種或第二種末端基團的所選擇的單個附著點。存在在用于選擇性單一保護聚胺分子的領域中描述的一般方法。此類方法在Krapcho和KuellSyntheticCommun.1990202559中得到描述。在優(yōu)選方法中,具有獨特的附著點的樹枝聚體由其中僅有1種反應胺部分是受保護的二或三價核進行制備,并使用對在構(gòu)建賴氨酸樹枝聚體的過程中用于去除其他胺保護基團的條件是惰性或正交的保護基團。隨后可以進行賴氨酸縮合和胺脫保護的迭代循環(huán)(iterativecycle),以構(gòu)建1-6代,更優(yōu)選地3-5代的樹枝聚體,并且在所述樹枝聚體中存在通過其獨特的胺保護基團與其他末端胺部分區(qū)別的單個末端胺部分。這種獨特的末端胺代表單個所選擇的分子例如蛋白質(zhì)或肽,或靶向分子可以在其上附著至樹枝聚體的位點。在這個實施方案的優(yōu)選形式中,提供了具有受控的末端基團化學計量的大分子,所述大分子包括表面層、至少一個次表面層和至少2種末端基團,所述末端基團包括其為肽或蛋白質(zhì)的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團,所述第一種末端基團附著至大分子上的單個所選擇的附著點;和選擇用于修飾肽或蛋白質(zhì)和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團;其中末端基團化學計量指末端基團的數(shù)目和類型。在優(yōu)選方法中,獨特的末端胺部分的保護基團被去除,并且末端胺部分在其中形成酰胺鍵的條件下與卣乙酸衍生物、或馬來酰亞胺衍生物例如3-馬來酰亞胺丙酸或4-馬來酰亞胺丁酸反應。用于使含巰基的肽和蛋白質(zhì)與此類巰基活性基團偶聯(lián)的一般方法在Pierce1989HandbookandGeneralCatalog和其中引用的參考文獻中得到描述。本發(fā)明現(xiàn)在將根據(jù)伴隨的實施例更充分地進行描述。然而,應當本發(fā)明的一般性的限制。在附圖中圖1A-Lys8(NH2)"樹枝聚體BHALys[Lys]8[NH2]16的化學結(jié)構(gòu)。8個L-Lys8末端賴氨酸基團中的每一個在生理學pH下貢獻2個正電荷。附著至LySs核的D-Lys基團不是放射標記的,且因此^放射性標記的位點位于Lysw樹枝聚體的Lyss層上。圖1B-L-Lys16(NH2)32樹枝聚體BHALys[Lys]"[冊2]32的化學結(jié)構(gòu)。16個L-Lys"末端賴氨酸基團中的每一個在生理學pH下貢獻2個正電荷。末端賴氨酸上和插入片段中的的星號突出表面賴氨酸基團上的3H放射性標記的位置。R指示表面賴氨酸與樹枝聚體核的附著。圖2-以5mg/kg的劑量給大鼠靜脈內(nèi)施用后的陽離子3H-樹枝聚體的血漿濃度(均值士S.D.,n-3)。實心標記表示BHALys[Lys]8[NH2]16的施用,空心標記表示BHALys[Lys]16[NH丄2的施用。數(shù)據(jù)顯示為ng當量/ml施用的樹枝聚體。圖3-在初步研究中以更高的劑量給大鼠靜脈內(nèi)施用后的陽離子力-樹枝聚體的血漿濃度(n-l)。實心標記顯示在施用24.3mg/kgBHALys[Lys]8[NH2]16后獲得的數(shù)據(jù),空心標記表示在施用22.3mg/kgBHALys[Lys]16[NH2]32后獲得的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示為ng當量/ml施用的樹枝聚體。圖4-以5mg/kg的劑量給大鼠靜脈內(nèi)施用后的陽離子3H-樹枝聚體的全血濃度(均值士S.D.,n-3)。實心標記表示BHALys[Lys]8[簡2〗16的施用,空心標記表示BHALys[Lys]16[冊2]32的施用。數(shù)據(jù)顯示為ng當量/ml施用的樹枝聚體。圖5-以5mg/kg給大鼠靜脈內(nèi)施用后的BHALys[Lys]16[NH2〗32'BHALys[Lys]s[D-Lys]16閣32和L-賴氨酸的血漿濃度(均值±S.D.,n-3)。實心圓圏表示BHALys[Lys]"[冊2]32的施用,空心圓團表示BHALys[Lys〗8[D-Lys]16[NH丄2的施用,和實心三角表示L-賴氨酸的施用。數(shù)據(jù)顯示為ng當量/ml施用的樹枝聚體或賴氨酸。圖6-使用SuperdexPeptide10/300GL尺寸排阻柱獲得的尺寸排阻層析(SEC)語。小圖A-在肝素化的空白血漿中在室溫下溫育1小時后的BHALys[Lys]16[訓2]32和賴氨酸。洗脫體積和語與對于BHALys[Lys]"[NH2]32和賴氨酸獲得的那些相同(譜未顯示)。小圖B-緊在BHALys[Lys]16[NH2]32靜脈內(nèi)施用后(t=0)獲取的血漿樣品。小圖C-在BHALys[Lys]"[NH2]32靜脈內(nèi)施用后3小時(空心標記)和6小時(實心標記)獲取的血漿樣品。小圖D-在L-賴氨酸靜脈內(nèi)施用后30小時獲取的血漿樣品。圖7-來自Superdex75HR10/30尺寸排阻柱的血漿放射性標記(作為洗脫的DPM)的洗脫謙。實心標記表示關于BHALys[Lys]16[冊2]32靜脈內(nèi)施用后6小時獲取的血漿樣品的洗脫譜(左手Y軸上的比例尺)??招臉擞洷硎娟P于L-賴氨酸靜脈內(nèi)輸注后30小時獲取的血漿樣品的洗脫鐠(右手Y軸上的比例尺)。關于各種MW蛋白質(zhì)標準、BHALys[Lys]16[NH2]32和賴氨酸的洗脫時間顯示于圖的頂部。柱的空體積通過注入葡聚糖藍2000(MW2000kDa)進行測定并在圖下方指出(Vo)。圖8-在以5mg/kg給大鼠靜脈內(nèi)施用陽離子力-樹枝聚體后30小時時主要器官中殘留的3H的分布。小圖A是呈現(xiàn)為注入的放射性標記%的數(shù)據(jù),而對于小圖B數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為注入的放射性標記%/克組織(均值±S.D.,n-3)。實心標記表示關于BHALys[Lys]8閣16的組織生物分布,而空心標記表示關于BHALys[Lys]16[冊2]32的組織生物分布。陰影(灰色)標記表示BHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32的組織生物分布。圖9.1至9.5-根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案賴氨酸樹枝狀基序的所選擇的拓樸異構(gòu)體的圖示,所述拓樸異構(gòu)體具有從頂點F起5層的代構(gòu)建單位具有以1:1表面比的末端基團A和B。A,B表示2種不同的保護基團或有機基,和F表示在頂點上的不完全的羧化物。圖10-對大鼠5mg/kgIV給藥后的BHALys[Lys]8[CO-4-Ph(S03Na)]16(實心圓圏)、BHALys[Lys]16[CO+Ph(S03Na)]"空心圓圏)和BHALys[Lys]16[C0-3,5-Ph(S03Na)2]32(三角)的血漿濃度-時間i普。圖11-BHALys[Lys]8[C0-4-Ph(S03Na)]16(黑色)、BHALys[Lys]"[C0-4-Ph(S03Na)]32(淡灰色)、BHALys[Lys]"[C0-3,5-Ph(S03Na)2]32(深灰色)或BHALys[Lys〗16[CO-CH2CH2(C02Na)]32(白色)對大鼠IV給藥后30小時注入的3H的生物分布。小圖A-呈現(xiàn)的注入的3H%/器官。小圖B-呈現(xiàn)的注入的311%/克組織。圖12-在superdex75柱上在血漿和尿中的BHALys[Lys〗16[C0-4-Ph(S03Na)〗32和BHALys[Lys]"[C0-3,5-Ph(S03Na)J32的尺寸排阻譜。小圖A-在PBS(實心圓圈)或新鮮血漿(空心圓圏)中溫育1小時的BHALys[Lys]"[CO+Ph(S03Na)]32的SEC譜。小圖B-在PBS(實心圓圈)或新鮮血漿(空心圓圏)中溫育1小時的BHALys[Lys]"[C0-3,5-Ph(S03Na)2]32的SEC譜。小圖C-在血漿中tO(實心圓圏)和2小時(空心圓圏)時的BHALys[Lys]"[C0-4-Ph(S03Na)]32的SEC鐠。小圖D-在血漿中tO(實心圓圏)或2小時(空心圓圏)時的BHALys[Lys〗"[C0-3,5-Ph(S03Na)2〗32的SEC鐠。小圖E-在O-8小時尿(實心圓圏)和8-24小時尿(空心圓團)中的BHALys[Lys]16[C0-4-Ph(S03Na)]32的SEC鐠。圖13-關于BHALys[Lys〗"[PEG2。。]32(實心圓圏)、BHALys[Lys]"[PEG570]32(空心圓圏)、BHALys[Lys]8[PEG2。。。]16(實心三角)和BHALys[Lys]"[PEG,]"空心三角)的血漿濃度-時間譜。關于BHALys[Lys]8[PEG2。。]16的數(shù)據(jù)未顯示,因為清除是非??焖俚牟⒈魂P于BHALys[Lys]"[PEG2。。]32的數(shù)據(jù)弄混。圖14-IV給藥后的BHALys[Lys]"[PEG謂]32(黑色柱,7天)、BHALys[LysL[PEG藤]"(灰色柱,5天)和BHALys[Lys]"[PEG57。]32(白色柱,30小時)的生物分布。上圖顯示在每種器官中回收的注入的311%,而下圖顯示回收的注入的311%/克每種組織。在IV給藥后30小時在腎中僅回收到0.1%的BHALys[Lys]16[PEG2。。]32,而在用BHALys[Lys]8[PEG綱:L給藥的大鼠的任何器官中未檢測到^(數(shù)據(jù)未顯示)。圖15A-D-在Superdex75柱上5mg/kgIV給藥后在血漿中關于3H標記的BHALys[Lys]6[PEG2。?!?2(小圖A;tO,空心方塊,t-l小時,實心圓圏,t-4小時,空心圓圏)、BHALys[Lys]16[PEG57?!?小圖B;24小時)、BHALys[Lys]8[PEG2。。。]16(小圖C;48小時)、和BHALys[Lys]16[PEG腦〗32(小圖D;48小時)的尺寸排阻i普。箭頭指示完整的樹枝聚體的保留時間。圖16A和B-在BHALys[Lys]16[PEG,]32(小圖A;0-4小時尿,實心圓圏,8-24小時尿,空心圓圏)和BHALys[Lys]"[PEG丄(小圖B;8-24小時尿)IV給藥后在尿中排泄的^的尺寸排阻鐠。箭頭指示完整的樹枝聚體的保留時間。圖17-用于制備BHALys[Lys]"[oc-PEG57。]16[e-MTXL的反應方案3。圖18-用于制備BHALys[Lys]16[a-PEG57。]16[s-COCH2CH2CO-泰素]的反應方案5。圖19A-用于制備BHALys[Lys〗"[s,e-PEG57。]8[COCH2CH2CO-泰素L的反應方案6(部分l)。圖19B-用于制備BHALys[Lys〗"[s,s-PEG"。〗8[COCH2CH2CO-泰素]"的反應方案6(部分2)。圖20-用于制備PEGm廠CO2H、PEG26"-C02H、PEG3974-C02H的反應方案7。圖21舉例說明了實施例36的合成,包括下述步驟i.MeOGly〖NH2.HC1]與PNPO-Lys-cc-Boc-s-CBz和三乙胺在DMF中的反應;ii.MeOGlyLys[a-Boc][s-CBz]與1:1TFA/AcOH的反應;iii.MeOGlyLys[ct-NH2.TFA][e-CBz]與DBL-OPNP和三乙胺在DMF中的反應;iv.MeOGlyLys[ot-Lys][Boc]2[5-CBz]與碳上的催化的鈀和1當量TFA在甲醇中的反應;v.MeOGlyLys[oc-Lys][Boc〗2[s-NH2.TFA]與PNPO-Lys-oc-Boc-s-CBz和三乙胺在DMF中的反應;vi.MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[s,s-CBz]與氬氧化鈉在MeOH/H20隨后為含水硫酸氫鉀中的反應。圖22舉例說明了實施例37的合成,包括下述步驟i.BHALys[NH2.TFA]2與HOGlyLys[Lys〗2[Boc]3[s,s-CBz〗、過量EDCI和HOBt在,中的反應;ii.BHALysBHALys[GlyLys]2[Lys]4[Boc]6[s,e-CBz]2與1:1TFA/AcOH的反應。圖23-皮下給藥的PEG化的樹枝聚體(黑色標記)或非PEG化的苯磺酸鹽樹枝聚體(白色標記)在胸導管淋巴中隨時間的累積回收。結(jié)果為均值土sd(n=l-3)。圖24-PEG化和未封端的Lysw的樹枝聚體的血漿濃度-時間鐠。小圖A顯示在全PEG化的、未封端的和半PEG化的樹枝聚體的血漿濃度中的初始下降。數(shù)據(jù)表示為均值土sd(N=2-3)。圖25-從用5mg/kg氖標記的(G3層)Lys16(PEG57Q)16(NH2)16給藥的大鼠收集的血漿(A)和尿(B)的SEC譜。完整的樹枝聚體的保留時間由箭頭指出。在18和21分鐘時洗脫的產(chǎn)物是賴氨酸重摻入產(chǎn)物。在43分鐘時的峰是標記的賴氨酸。圖26-從用Lys16(NH2)32(6小時樣品)和L-賴氨酸(30小時)給藥的大鼠收集的血漿的SEC鐠。在17和20分鐘時的峰是賴氨酸重摻入產(chǎn)物。在41分鐘時洗脫的峰是氘標記的賴氨酸。圖27-從用5mg/kg氘標記的(G3層)Lys16(PEG57。)16(CH3)16給藥的大鼠收集的血漿和尿的SEC譜。完整的樹枝聚體的保留時間由箭頭指出。在18分鐘時洗脫的產(chǎn)物是賴氨酸重摻入產(chǎn)物。在20分鐘時洗脫的峰可能是與完整的樹枝聚體相關的反常峰,這在完全封端的種類中可見。在43分鐘時洗脫的峰是標記的賴氨酸。在30-40分鐘之間洗脫的峰可能是核分解產(chǎn)物。實施例下述實施例中的樹枝聚體命名法利用下式核[最后一個完整層;構(gòu)建單位L[末端基團]J不完整的外層;構(gòu)建單位]J末端基團]q其中■核是激活的賴氨酸代構(gòu)建單位與之附著的分子并將包括加入第一層賴氨酸構(gòu)建單位中的至少一個胺部分,n是大分子的最外面的完整層的賴氨酸構(gòu)建單位數(shù)目,p是在大分子的不完整的外層上的賴氨酸構(gòu)建單位數(shù)目,m是構(gòu)建單位的最外面的完整層上的末端基團例如藥物活性部分或末端胺保護基團數(shù)目;q是構(gòu)建單位的不完整的外層上的末端基團數(shù)目,任選地,末端基團和/或構(gòu)建單位可以與核附著;這些隨后根據(jù)如上的相同原則表示為[末端基團]r[構(gòu)建單位]s。命名法通過提供核和外層能夠完整描述大分子的大小,因為在這些大分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建中只使用賴氨酸構(gòu)建單位并且核的效價是已知的,并且進一步因為每個大分子層的所有表面胺基在新賴氨酸層的添加期間與賴氨酸完全反應。表3:大分子命名法縮寫和結(jié)構(gòu)<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>實施例1可以在本發(fā)明中使用的藥學活性劑的例子包括下述氨甲蝶呤氨甲蝶呤是癌癥和自身免疫疾病治療中使用的抗代謝藥。它通過完全和可逆地抑制二氳葉酸還原酶來抑制葉酸代謝而起作用。氨甲蝶呤在化學上是N-[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲?;鵠-L-谷氨酸。分子量454.45(:2^2&05和結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>癌癥化學療法中使用的較高劑量的氨曱蝶呤可以引起毒性副作用,以使骨和胃腸粘膜的細胞快速分裂。泰素泰素(紫杉醇)是特別在具有對先前療法無應答的乳腺和卵巢癌的女性中用作治療的抗有絲分裂劑。它通過使微管穩(wěn)定和促進微管組裝而起作用,從而破壞細胞以靈活方式使用其細胞骨架的能力。泰素是三環(huán)二薛和結(jié)構(gòu)式為ZenicalZenical(也稱為賽尼可、Xenecal和Zencal)是用于肥胖管理的重量控制藥物。它通過與胃和胰脂肪酶的活性絲氨酸殘基位點形成共價鍵在胃和小腸的腔內(nèi)發(fā)揮其治療活性。滅活的酶因此無法使飲食脂肪以從甘油三酯到可吸收的游離脂肪酸和甘油單酯的形式水解。Zenical在化學上具有下述結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>Zenical的化學名為(S)-2-甲酰氨基-4-甲基-戊酸(S)-l[[(2S,3S)-3-己基-4-氧-2-氧雜環(huán)丁基]甲基]十二烷基酯。分子式為C29H53N05。Zenical具有495.7的分子量。存在許多不期望的胃腸道副作用,包括腸胃氣脹、排泄緊急、月旨肪/油性大便和稀便。消炎痛消炎痛(也稱為吲哚美辛)是通常用于減少發(fā)燒、疼痛、僵硬和肺脹的非甾體抗炎藥。它通過抑制已知引起這些癥狀的分子前列腺素的產(chǎn)生而發(fā)揮作用。環(huán)孢菌素環(huán)孢菌素是在移植中的移植物抗宿主反應的預防和治療中廣泛使用的免疫抑制劑。它已就其中免疫因子可能具有致病作用的大量各種其他疾病的治療進行測試。實施例2具有氨甲蝶呤的樹枝聚體制備其中約50%-約75%的末端基團是藥物(具體地氨甲蝶呤)的賴氨酸樹枝聚體。氨甲蝶呤可以通過穩(wěn)定的鍵與樹枝聚體綴合,并測定這種構(gòu)建體的清除和生物分布。隨著它們的相對豐度減少,可能希望增加單個PEG基團的大小,以便維持所需的血漿壽命和避免肝攝取。氨甲蝶呤的"不可切割的"性質(zhì)維持構(gòu)建體在血漿暴露期間的完整性?;衔锏脑斒鯞HALys[Lys]BHALys[Lys〗BHALys[Lys]BHALys[Lys]BHALys[Lys]BHALys[Lys]BHALys[Lys]BHALys[Lys]BHALys[Lys]16[a-PEG"o。]u[s-MTX〗"16[£-MTX〗161616[s-MTX]16[Su(NPN)2]"闊16[PEG57o][Su(NPN)2]16[MTX]"[PEG,]:[Su(訓)2]16[MTX]16[PEG1716〗:[Su(訓)2]16[MTX]16[PEG28"]實施例3具有泰素的樹枝聚體具有泰素的樹枝聚體的例子包括下述<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>[a-PEG簡]16[s-(:0-泰素]16[a-PEG1716]16[B-C0CH2CH2C0-泰素〗16[a-PEG2845]16[s-COCH2CH2CO-泰素]16[oc_PEG3974〗16[s-COCH2CH2CO-泰素〗16BHALys[Lysh[Su(NPN)2]16[PEG57。]16[COCH2CH2CO-泰素]BHALys[Lys〗8[Su(NPN)2]16[PEG謂〗"BHALys[Lys〗8[Su(NPN)2]16[PEG1716]16[COCH2CH2C(Kg^r]BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG28"]16[COCH2CH2CO-泰素]BHALys[Lys〗16BHALys[Lys]16BHALys[Lys〗16B亂ys[Lys]16BHALys[Lys〗161616161659BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[MTX]16[PEG3974]16其中MTX表示通過Y-羧化物基團綴合的氨甲蝶呤1。這種方法的關鍵中間產(chǎn)物是根據(jù)Aust.J.Chem.200255635-645中描述的方法制備的3。NH2、,NVN、BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[PEG卵[COCH2CH2CO-泰素]16B緣ys[Lys]16BHALys[Lys]BHALys[Lys]BHALys[Lys]16BHALys[Lys]"1616e-PEG"。]8[COCH2CH2CO-泰素]"e-PEG11Q。]8[COCH2CH2CO-泰素]24s-PEGm山[COCH2CH2CO-泰素]24s-PEG腦]8[COCH2CH2CO-泰素〗24s-PEG397Js[COCH2CH2CO-泰素]24泰素的綴合可以使用2種不同衍生物;2和4來進行(參見下文),2的制備在J.Med.Chem.198932788-792中得到描述。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula>賴氨酸樹枝聚體可以包括約50%-75%的泰素末端基團,其通過各種"可切割的"連接體進行附著。制備為完全Boc保護形式的所有賴氨酸樹枝聚體根據(jù)國際專利申請W095/34595中描述的操作來合成和純化,所述專利的完整內(nèi)容通過引用方式而合并入本文。Boc保護基團的去除根據(jù)W095/34595中描述的操作來進行。當賴氨酸樹枝聚體需要包含氚以便樹枝聚體材料可以使用閃爍計數(shù)技術在生物基質(zhì)中進行檢測時,這些材料通過用非放射性的L-賴氨酸稀釋(4,5-3H)-L-賴氨酸來制備,以提供具有5uCi-15uCi/mg范圍中的比活性的材料。這種氖標記的賴氨酸隨后用于制備di-Boc-賴氨酸的對硝基苯酚活性酯,使用W095/34595中描述的方法將其摻入靶賴氨酸樹枝聚體的外部賴氨酸層內(nèi)。實施例4BHALys[(3H)-Lys〗8[D-Lys〗"[冊2]32的合成在氮下向溶于干DMF(3mL)中的BHALys[(3H)-Lys]8[NH2.TFA]16(38mg,0.01mmol)的攪拌溶液中,加入溶于DMF(4mL)和三乙胺(65JliL,0.46mmo1)中的d-賴氨酸對硝基苯酚酯(181mg,0.38mmol)溶液。允許反應混合物在rt下攪拌16小時,這之后將其傾入乙腈(60mL)內(nèi)并攪拌6小時。所得到的精細固體通過經(jīng)由0.45jam親水聚丙烯膜濾器過濾進行收集,并且在真空中進行干燥。產(chǎn)物BHALys[(3H)-Lys〗8[D-Lys]6[Boc]32是精細乳骨有色固體(40mg,56%)。使BHALys[(3H)-Lys]8[D-Lys]16[Boc]32(34mg,0.005mmol)懸浮于CH2C12(1fflL)中,并冷卻至0°C。逐滴加入TFA(398mL,2.58mol)并使反應于O'C攪拌10分鐘,并且隨后加溫至rt并再攪拌3小時。溶劑在真空下去除,并且將乙醚加入至所得到的油中,研磨溶液導致粉碎掉白色固體。傾析掉乙醚并用乙醚(x3)沖洗固體。乙醚被去除后,將所得到的固體溶解于最小量的水中,并施加到Amberlyst(A-260H)離子交換柱上。從柱中收集100mL水并且通過冷凍干燥去除,以產(chǎn)生作為白色固體U5mg,79%)的BHALys[(3H)-Lys]s[d-Lys]"[NH2]32。LC-MS:(PhilieTFA,去溶劑化temp.300C)Rf(分鐘)8.45.ESI(+ve)m/z=138"(M/3),1040.3(M/4),832.3(M/5)694.0(M/6)594.9(M/7)。實施例5陽離子樹枝聚體材料的血漿清除率和生物分布研究緩沖試劑是AR等級的。水得自MilliQ純水系統(tǒng)(Millipore,Australia)。肝素(10,000IU/mL)得自Faulding,Australia。注射鹽7Jc在來自BaxterHealthcarePtyLtd(NSW,Australia)的100mL聚乙烯袋中獲得。氖標記的L-賴氨酸(1mCi/ml)購自MPBiomedicals(Irvine,CA,USA)。非放射性標記的L-賴氨酸得自SigmaChemicalCo(StLouis,MO,USA)。Starscint閃爍混合物和Soluene—350纟且織增溶劑購自PackardBiosciences(Meriden,CT)。蛋白質(zhì)標準包括葡聚糖藍2000(2000kDa)、無脂肪酸牛血清白蛋白(67kDa)、胃蛋白酶(35kDa)、胰蛋白酶(23.8kDa)、肌紅蛋白(17.6kDa)、核糖核酸酶A(13,7kDa)、細胞色素C(12.4kDa)和維生素B12(1.4kDa),并且全部購自SigmaChemicalCo(StLouis,MO,USA)。關于更高分子量蛋白質(zhì)的洗脫時間通過將20|i1PrecisionPlus蛋白質(zhì)標準注入柱(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上來獲得。制備3H標記的樹枝聚體并作為冷凍干燥的粉末提供。供應前的純化經(jīng)由超濾和尺寸排阻層析法(SephadexLH20,用水洗脫),其中離子交換用于提供游離堿形式的未封端的、胺結(jié)尾的樹枝聚體。純度通過毛細管電泳法、NMR和質(zhì)譜法進行確定。樹枝聚體的比活性和分子量在表5中列出。表5-這項研究中使用的樹枝聚體的所選擇的性質(zhì)樹枝聚體電荷分子量比活性——((aCi/mg,均值士s.d.,n=3)BHALys[Lys8NH21e+1621060,531±0.012BHALys[Lys]16[NH232+3241560.422±0.012BHALys[Lys]BD-Lys〗16[NH2]32+3241564.186±0.0873H-L-賴氨酸(25jaCi)用在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,pH7.4)中的非放射性標記的賴氨酸新鮮稀釋至20juCi/mg的最終比活性用于IV給藥。所有樹枝聚體在PBS中進行稀釋并冷凍于-20t:直至使用?;钚詼y定和閃爍計數(shù)樹枝聚體的比活性通過將包含已知質(zhì)量的母液稀釋到PBS內(nèi)一式三份地進行測定。隨后將等分試樣加入至1mLStarscint中,并在PackardTri-Carb2000CALiquidScinti1lationAnalyser(Meriden,CT)上進行閃爍計數(shù)。一式三份的測定的平均值用于所有后續(xù)計算。體內(nèi)方法所有動物實驗方案得到VictorianCollegeofPharmacyAnimalEthicsCommittee,MonashUniversity,Parkville,VIC,Australia批準。靜脈內(nèi)藥代動力學研究在樹枝聚體施用前,大鼠(雄性,SpragueDawley,250-350g)具有插入頸靜脈和頸動脈內(nèi)的插管(聚乙烯管0.96x0.58mm,PatonScientific,VictorHarbour,Australia),在如Ali等人(1999)/."/o人274:24066-24073中描述的異氟烷麻醉下。插管用肝素化鹽水(2I.U./ml)進行沖洗,并在回收過程中在插入頸背部處皮下袋內(nèi)之前進行火焰密封。允許大鼠在給藥前恢復過夜,盡管食物在給藥前停止12小時?;謴推诤?,大鼠在代謝籠中進行飼養(yǎng)以允許分類收集尿和糞便,并且插管附著至轉(zhuǎn)環(huán)/皮帶裝置以便于藥物施用和采血。隨時允許自由接近水。將樹枝聚體或L-賴氨酸溶解于1ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)內(nèi),并以5mg/kg的劑量經(jīng)由留置的頸靜脈插管通過靜脈內(nèi)輸注經(jīng)過2分鐘施用。插管隨后用0.25ml肝素化的鹽水進行沖洗以確保劑量的完全輸注。血液樣品(0.15ml)隨后在下述指定時間點上從頸動脈獲得給藥前(-5分鐘),在輸注結(jié)束瞬間時(t-0)以及在5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480、1440和1800分鐘時。血液樣品立即置于包含101.U.肝素的管內(nèi)并在3500xg下離心5分鐘。隨后將血漿(50|i1)加入至1mlStarscint閃爍混合物中,并在閃爍計數(shù)前進行渦旋。關于血漿測定法的定量極限(20dpm)使用強化血漿樣品的重復(n=5)分析進行驗證。準確性和精確度在±20%內(nèi)。生物分布研究為了了解樹枝聚體在體內(nèi)的命運,研究對各種主要器官的生物分布。藥代動力學研究(30小時)完成后,通過注射致死劑量的戊巴比妥鈉處死動物并且通過解剖取出下述組織心、肺、肝、脾、胰腺、腎和腦。將組織冷凍(-201C)貯藏于預稱重的聚丙烯管中直至緊在組織處理和分析前。組織通過用5-10mlMilliQ水使樣品在Waring微型混合器(ExtechEquipmentPty.Ltd.,Boronia,Australia)中勻化進行起始處理,共5xlO秒的間隔。在開發(fā)用于測量組織樣品中相對低水平的放射性的方法中,遇到與化學發(fā)光反應和顏色胖滅相關的問題,導致在閃爍計數(shù)中高度可變的本底計數(shù)。這些問題還似乎通過溫度中的增加、暴露于光和樣品的攪拌惡化。為了克服這些問題,組織的后續(xù)處理作為2階段過程來進行。起始'篩選,階段用于確定樣品中的放射性的近似水平。對于這個階段,將來自每種組織勾漿的單一樣品(一般為40-100mg組織)置于包含2mlSoluene的20ml聚丙烯閃爍瓶內(nèi),允許組織消化于60匸發(fā)生過夜,隨后加入異丙醇(2ml)并使溶液于60C再加熱2小時。冷卻至室溫后,向樣品中順次加入2x100jil等分試樣的過氧化氬(30。/。w/v),隨后允許其在室溫下靜置直至起泡已停止。隨后加入Starscint(12ml)并使混合物渦旋,之后將樣品于4X^在黑暗中貯藏96小時不伴隨攪拌。樣品隨后進行閃爍計數(shù),在這期間計數(shù)器使用冷卻的樣品托盤維持于12C。樣品還以6-12個的組進行計數(shù)以使計數(shù)過程中的加溫降到最低。單一樣品還從來自未處理大鼠的器官中獲取并以相似方式進行處理,以獲得由于單獨的處理方法預期的用于本底計數(shù)的值。這些值從在篩選階段期間獲得的值中減去。得自這個篩選階段的數(shù)據(jù)提供在每種樣品中預期的活性量的廣泛指示。這種信息是最終分析運行所需的。在組織計數(shù)過程的第二個'分析,階段中,組織樣品一式三份地進行分析。來自未處理的大鼠的空白對照組織也如上所述進行處理(盡管一式三份)以提供本底校正。一般而言,來自樹枝聚體給藥的大鼠處理,除了采取另外的步驟以校正由于來自組織的"提取,,過程在放射性計數(shù)效率(醉滅)中的任何減少。為了允許校正計數(shù)效率,來自處理大鼠的相同的第二組組織以相同方式進行處理,但在添加Soluene前最初用已知量的放射性標記的樹枝聚體進行強化。組織用近似等價于在篩選樣品中測量的那種(因此需要篩選數(shù)據(jù))的水平的活性進行強化。處理效率隨后如下進行計算,其中效率=(強化的組織卿-組織跳un。。)/強化的SOlllDPM(1)強化的組織DPM是在強化的樣品中測量的質(zhì)量校正的放射性,組織,,是在未添加另外的放射性強化的組織樣品中質(zhì)量校正的放射性,和強化的soln國是加入強化的樣品中已知量的另外放射性。有效地,該計算提供了計數(shù)效率的指示,使用在每種組織中已知(強化的)量的放射性作為參考。關于效率的這個值隨后用于校正處理樣品中的^含量,其中組織腦,,=組織線,/效率(2)已知處理樣品中存在的完整器官的質(zhì)量分數(shù),隨后計算整個器官中的活性。結(jié)果表示為在處死時器官中的注射劑量的百分比,或注射劑量百分比/克組織。由于過程的變異性,可能不容易確定關于每種組織的L0Q。相反,導致超過20。/。的。/。CV的一式三份樣品進行重復,或者當重現(xiàn)性數(shù)據(jù)無法獲得時,分類為在可計量的水平下。全血藥代動力學為了確定全血藥代動力學,分別組的動物施用等量的樹枝聚體溶液,并在與用于收集血漿相同的指定時間期限時將全血樣品(150Ml)收集到肝素化的Eppendorf管內(nèi)。將每種血液樣品的一式兩份的等分試樣(50Ml)加入至2x20ml閃爍瓶內(nèi)。最初,1個小瓶未加處理,同時另一個用已知量(~300-600衰變數(shù)/分鐘(DPM)待研究的樹枝聚體)進行強化以提供全血計數(shù)效率數(shù)據(jù)(如上)。樣品隨后在4ml1:1比率的Soluene-350和異丙醇中于60X:溶解過夜。隨后使樣品冷卻,并在添加Starscint(12ml)前用200|U1過氧化氯(30%w/v)進行漂白。樣品隨后在閃爍計數(shù)前在室溫下放置24小時。得自血液樣品的計數(shù)通過與如上所述對于強化的樣品獲得的數(shù)據(jù)比較就效率進行校正。靜脈內(nèi)施用后血漿和全血中的3H-樹枝聚體的藥代動力學參數(shù)顯示于表6中o表6-以5mg/kg靜脈內(nèi)施用力-樹枝聚體后血漿和全血的藥代動力學參數(shù)(均值±s.d,,n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>尿和糞便來自樹枝聚體給藥大鼠的尿經(jīng)過3個時間間隔進行收集給藥后0-8小時,8-24小時和24-30小時。還收集得自給藥前的每只大鼠的空白對照尿樣品。將來自每個時間間隔的100jal等分試樣的尿加入至1mlStarscint中,并^f吏混合物在閃爍計數(shù)前進行渦旋。本底扣除后,樣品的放射性標記含量就經(jīng)過那個時間間隔收集的尿的總體積進行校正,并且轉(zhuǎn)變成總施用的^劑量百分比。將糞便收集到預稱重的小瓶內(nèi),并且在于60T干燥前通過在Mi11iQ水中浸泡使樣品均質(zhì)化處理成漿。干燥糞便的6個重復樣品(20mg)隨后分成n-3樣品的2個組。一組樣品無需進一步添加進行處理,和一組3個樣品用已知量的放射性樹枝聚體(約500DPM)進行強化,以提供糞便計數(shù)效率數(shù)據(jù)(如上)。樣品隨后使用由Lyons等人(2000)描述的方法進行溶解。簡言之,將2mlSoluene加入至重新弄濕的糞便中,并且于60。C加熱過夜。隨后再加入2ml異丙醇并使樣品再加熱2小時。在添加12mlStarscint前,溶解的樣品隨后用400n1過氧化氬(30%w/v)進行漂白。樣品隨后在室溫下放置4天,之后于4'C冷卻24小時并于12匸后續(xù)閃爍計數(shù)。糞便中排泄的311總量使用收集的糞便的總干重進行計算。關于測定法的LOQ假定為空白對照糞便中平均計數(shù)的3倍,因為產(chǎn)生的糞便團塊廣泛不同,并因此最小的可計量數(shù)目的計數(shù)的測定在某些樣品團塊中是不可能的。這些結(jié)果概括于表7中。表7-在陽離子311樹枝聚體以5mg/kg靜脈內(nèi)施用后從大鼠中經(jīng)過30小時的'H排泄(均值±s.d,n-3)。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>藥代動力學計算血漿/全血樣品中的放射性標記的濃度使用放射性標記的樹枝聚體的比活性轉(zhuǎn)變成ng當量濃度。這些濃度在本文件自始至終已表示為ng當量/ml,然而,應說明的是這種方法假定311放射性標記保持與完整的樹枝聚體結(jié)合,這如下所述在某些情況下并非如此。血漿濃度-時間曲線中的初始下降的速率通過在對數(shù)線性血漿濃度對時間點的起始相中至少3個點的線性回歸進行估計。得自這些數(shù)據(jù)的速率常數(shù)已描述為'消除,速率常數(shù)U),但可能不表示真實的終末消除速率常數(shù),因為消除的迅速使得難以精確描述分布和消除事件。這個初始下降的半衰期由t1/2=0.693/K進行估計。就一切情況而言,初始分布體積(Vc)的評估由劑量/Cp。進行計算,其中Cp。是在t-0時,即在2分鐘輸注完成時血漿中的濃度。數(shù)據(jù)的更詳細的藥代動力學評估,包括真實的清除速率常數(shù)和清除半衰期的鑒定是不可能的,由于來自血漿的非??焖俚钠鹗既コ驮陔S后時間點上的不尋常的譜。實施例6關于來自實施例5的生物樣品的尺寸排阻層析幾種方法用于研究血漿樣品中存在的種類的大小。首先,粗尺寸分離通過從PD10凝膠過濾柱(Pharmacia)洗脫血漿樣品和在重力下收集流分來執(zhí)行。在這種方法中,在施加到預平衡的PD10柱頂端之前,血漿樣品(500p1)用2mlPBS進行稀釋。流分(500|u1)人工收集到微量離心管,并在閃爍計數(shù)前將IOOjLiL等分試樣加入至1mlStarscint中。溶于PBS的完整的樹枝聚體和賴氨酸溶液也通過柱進行洗脫以表征純組分的保留體積。為了提供關于血漿中包含放射性標記的種類的大小的更多信息,與Waters590HPLC泵(MUliporeCorporation,Milford,MA,USA)偶聯(lián)的分析型尺寸排阻柱(SuperdexPeptide10/300GL,AmershamBioscience)隨后用于產(chǎn)生更精確的分離。血漿樣品再次在等體積的PBS中進行稀釋并將100Jli1混合物注入柱上。樣品用包含0.3MNaCl的PBS(pH3.5)以0.5ml/分鐘進行洗脫,并且等分試樣以1分鐘間隔使用GilsonFC10流分收集器(JohnMorrisScientificPty.Ltd.VIC,Australia)進行收集。等分試樣隨后與Starscint(3ml)混合,并通過液體閃爍進行分析以測定每種流分中的放射性。溶于PBS的完整的樹枝聚體和賴氨酸溶液再次通過柱分開洗脫以表征其保留體積。樹枝聚體和賴氨酸也在新鮮的肝素化血漿中溫育1小時,并且樹枝聚體或賴氨酸-血漿混合物通過SEC進行分析。進行這種分析以提供樹枝聚體或賴氨酸與血漿組分的物理相互作用可能導致在血漿中產(chǎn)生高MW種類的可能性的指示。為了獲得存在于血漿中的高MW放射性標記種類的更佳分辨,樣品還使用Superdex75HR10/30尺寸排阻柱進行分析。等分試樣(0.5ml)再次以1分鐘間隔進行收集,在Starscint(3ml)中進行稀釋,并通過液體閃爍計數(shù)進行分析,以測定每種流分中的放射性。蛋白質(zhì)標準用于組成標準曲線(線性112=0.9915),這用于評估洗脫蛋白質(zhì)的分子量。蛋白質(zhì)洗脫在280認處使用Waters486UV檢測器(MilliporeCorporation,Milford,MA,USA)進行監(jiān)控。柱的空體積使用葡聚糖藍2000進行測定。實施例7氚標記的陰離子樹枝聚體的合成BHALys[3H-Lys]16[CO-3,5-Ph(S03Na)2]32的制備將PyBOP(9.56g,18.37mmol)加入至溶于,/DMSO(1:1)(200mL)中的樹枝聚體(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA〗32)(2.12g,0,27mmol)的攪拌溶液中。逐步加入溶于DMF/DMSO(1:1)(150mL)中的3,5-二磺基苯甲酸(5.39g,19.11mmol)和二異丙基乙胺(12.2mL,70.02mmol)溶液。形成粘性ppt。ppt,皮取出,再溶解于DMSO中,并送回反應中。混合物在rt下攪拌16小時。將反應混合物傾入水(3.5L)內(nèi)并通過O.45微米濾器進行過濾。純化通過切向流過濾在Centraniate(3K膜,2L樣品庫)上進行。用Milli-Q水(18L)初始洗滌后,滲余物用3等分試樣的1M碳酸鈉(100mL)進行洗滌,通過Milli-Q水洗涂(1L)分開,隨后過濾繼續(xù)直至濾液pH為中性(約20L)。滲余物在真空中進行濃縮并冷凍干燥,以產(chǎn)生作為灰白色固體(2.34g,61%)的所需產(chǎn)物。lHnmr(300MHz,D20)入(ppm):1.0-2.0(186H);2.8—3.4(62H);4.0-4.4(31H);5.9(1H);7.0-7.3(10H);8.1-8.3(96H)。LC/MS(離子配對)ESI(-ve)m/z=740.83((M-17H)17-);699.94((M-18H)18-);662.83((M-19H)19—);629.99((M-20H)2°—);599.53((M-21H)21_)。數(shù)據(jù)使用最大熵計算進行解巻以產(chǎn)生MW-12614(M-,以H形式)計算的(H形式)(C423H513N630255S64)12612(M-)。W(分鐘)=3.14CE(pH3):98,6分鐘)==10.97CE(pH9):97.6%*尸(分鐘)=12.90BHALys[3H-Lys]8[CO-4-Ph(S03Na)]16的制備將PyBOP(303mg,0.58mmol)加入至溶于DMF(5mL)中的樹枝聚體(BHALys[3H-Lys〗8[NH2.TFA〗16)(68mg,17.3jamol)的攪拌溶液中。逐步加入溶于DMSO/DMF(5mL/10mL)中的4-磺基苯甲酸單鈉鹽(124mg,0.55mmol)和二異丙基乙胺(386pL,2.22mmol)溶液?;旌衔镌趓t下在氬下攪拌24小時,這之后傾入水(200mL)內(nèi)并通過0.45微米濾器進行過濾。純化通過切向流過濾在Minimate(IK膜,250mL樣品庫)上進行,其用水(1.5L)進行洗滌。來自滲余物的溶劑在壓力下減少。將產(chǎn)物再溶解于水(5mL)中并使其經(jīng)歷尺寸排阻柱(LH20,洗脫劑水)并收集1至8的流分。組合的流分在真空中進行濃縮,經(jīng)過離子交換柱(69F,Na+)并冷凍干燥,以產(chǎn)生作為白色固體(20mg,22%)的所需產(chǎn)物BHALys[3H-Lys]s[CO-4-Ph(S03Na)]16。1Hninr(300MHz,D20)入(ppm):1.0-1.9(90H,CH2);2.8-3.3(30H,CH2);4.0-4.4(15H,CH);5.9(1H,CH);7.0—7.2(IOH,Ar-H);7.5-7.8(64H,Ar-H)。MS(直接輸注)ESI(-ve)m/z-5406(M-H)—(M-,以鈉的形式)計算的(鈉形式)(C215H257N31079Nal6S16)5404(M-)。CE(pH7):91%Rf(分鐘)-10.51BHALys[3H-Lys]16[CO-4-Ph(S03Na)]32的制備將PyBOP(448mg,0.86mmol)加入至溶于DMSO(8mL)中的樹枝聚體(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA〗32)(100mg,13mmol)的攪拌溶液中。逐步加入溶于DMSO(12mL)中的4-磺基苯甲酸單鈉鹽(197mg,0.82mmol)和二異丙基乙胺(571|iL,3.28mmol)溶液?;旌衔镌趓t下在氬下攪拌24小時。將反應混合物傾入水(200mL)內(nèi)并通過0.45微米濾器進行過濾。純化通過切向流過濾在攪拌池(5K膜,250mL樣品庫)上進行,其用水(1.5L)進行洗滌。來自滲余物的溶劑在壓力下減少。將產(chǎn)物再溶解于水(5mL)中,經(jīng)過離子交換柱(69F,Na+)并冷凍干燥,以產(chǎn)生作為白色固體(89mg,65%)的所需產(chǎn)物BHALys[Lys〗"[CO+Ph(S03Na)]32。1H證(300MHz,D20)入(ppm):1.0-1.9(186H,CH2);2.8-3.2(62H,CH2);4.0-4.4(31H,CH);5.9(1H,CH);7.0-7.2(10H,Ar-H);7.5-7.8(128H,Ar-H)。MS(直接輸注)ESI(-ve)m/z-10756(M-H)-(M-,以鈉的形式)計算的(鈉形式)(C423H481N630159Na32S32)10754(M-)。CE(pH9):98%Rf(分鐘)=12.17BHALys[3H-Lys]16[COCH2CH2(C02Na)]32的制備將琥珀肝(26mg,0.26mmol)加入至溶于DMF(5mL)中的樹枝聚體(BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32)(32mg,4.1umol)和三乙胺(36uL,0.26mmol)的攪拌溶液中?;旌衔镌趓t下在氬下攪拌24小時。將反應混合物傾入水(50mL)內(nèi)并通過0.45微米濾器進行過濾。純化通過切向流過濾在Minimate(1K膜,70mL樣品庫)上進行。用NaHC03(sat)(100mL)初始洗滌后,滲余物用水(1.5L)進行洗滌。來自滲余物的溶劑在壓力下減少。將產(chǎn)物再溶解于水(2mL)中,經(jīng)過離子交換柱(69F,Na+)并冷凍干燥,以產(chǎn)生作為白色固體(17fflg,52%)的所需產(chǎn)物BHALys[3H-Lys]16[COCH2CH2(C02Na)]32。1Hnmr(300MHz,D20)人(ppm):1.0-1.8(186H,CH2);2.3-2.7(128H,CH2);2.9-3.2(62H,CH2);4.0-4.2(31H,CH);6.0(1H,CH);7.1-7.3(IOH,Ar-H)。MS(直接輸注)ESI(-ve)m/z=7360(M-H)-(M-,以H的形式)計算的(H形式)(C327H513N630127)7359(M-)。CE(pH9):96%Rf(分鐘)=13.02表8-樹枝聚體性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>實施例8陰離子樹枝聚體的血漿清除率和生物分布研究這項研究中使用的方法與實施例5中使用的那些相同。對大鼠5mg/kgIV給藥后BHALys[Lys]8[C0-4-Ph(S03Na)〗16(實心圓圏)、BHALys[Lys]"[CO-4-Ph(S03Na)]32(空心圓圏)和BHALys[Lys〗"[C0-3,5-Ph(S03Na)2〗32(三角)的血漿濃度-時間鐠在圖10中圖解說明。表9-關于陰離子樹枝聚體在IV給藥后的血漿藥代動力學參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表10-陰離子樹枝聚體對大鼠IV給藥后根據(jù)時間在尿中排泄的注入的3H°/o<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>BHALys[Lys]8[C0+Ph(S03Na)]"(黑色),BHALys[Lys]16[C0-4-Ph(S03Na)]32(淺灰),BHALys[Lys]"[C0-3,5-Ph(S03Na)]32(深灰色)或BHALys[Lys]"[CO-CH2CH2(C02Na)]32(白色)對大鼠IV給藥后30小時注入的3H的生物分布在圖11中圖解說明。小圖A-呈現(xiàn)的注入的311%/器官。小圖B-呈現(xiàn)的注入的311%/克組織。實施例9關于來自實施例8的生物樣品的尺寸排阻層析這項研究中使用的方法與用于實施例6的相同。在血漿和尿中的BHALys[Lys]"[CO+Ph(S03Na)]32和BHALys[Lys〗16[CO-3,5-Ph(S03Na)2〗32在superdex75柱上的尺寸排阻i普在圖12中圖解說明。實施例10氖標記的PEG樹枝聚體的合成BHALys[3H-Lys]8[PEG2。。]16的制備向溶于DMF(8mL)的BHALys[3H-Lys〗8[NH2.TFA〗16(125mg,0.03mmol)的攪拌溶液中加入PyBOP(556mg,1.0mmol),隨后加入溶于,(16mL)和DMSO(2mL)的PEG200(240mg,1.Oinmol)、《y^二異丙基乙胺(709nL,4.Ommol)溶液?;旌衔镌谑覝叵聰嚢?6小時。將反應混合物傾入水(180mL)內(nèi),并且進行過濾并用水進行洗滌。將水溶液轉(zhuǎn)移至3K攪拌池并使水經(jīng)過池,剩余水通過冷凍干燥去除,以產(chǎn)生作為自由流動的白色固體(20mg,11%)的BHALys[3H-Lys]8[PEG2。。]16。LC/MS(PhilieTFA):Rf(分鐘)=16.72.ESI(+ve)m/z=5598(M+H+)。BHALys[3H-Lys]16[PEG2。?!?2的制備在氬下向溶于DMF(3mL)的BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(30mg,0.004mmol)的攪拌溶液中加入PyBOP(142mg,0.271mmol),隨后加入溶于DMF(3mL)的PEG200(62mg,0.263mmol)、^^~二異丙基乙胺(182jaL,1.04mmol)溶液。混合物在室溫下攪拌16小時。溶劑在減壓下去除,并將所得到的粗混合物溶解于最小體積的水中。使用水作為洗脫劑通過sephadex柱(LH-20)純化產(chǎn)生在通過冷凍干燥去除水后作為白色固體(20mg,44%)的所需產(chǎn)物BHALys[3H-Lys]16[PEG2。?!?2。LC/MS(Phi1icTFA):Rf(分鐘)-16.74ESI(+ve)m/z=11,141(M+H+)。BHALys[3H_Lys]16[PEG57。]32的制備在氮下向溶于干DMF(2mL)的BHALys[3H-Lys]"[NH2.TFA]32(20mg,0.003mmol)的攪拌溶液中加入三乙胺(36yL,0.261mmol)和PEG685.75、NHS酯(119mg,0.174mmol)?;旌衔镌谑覝叵聰嚢?6小時。將溶液傾入5K攪拌池內(nèi)并使水(600mL)經(jīng)過池,剩余水通過冷凍干燥(x2)去除,以產(chǎn)生作為玻璃狀固體(50mg,88%)的BHALys[3H-Lys]"[PEG57。]32。LC(Phi1icTFA):Rf(分鐘)12.42。BHALys[3H-Lys]8[PEG2KD〗16的制備在氮下向溶于干DMF(2mL)的BHALys[3H-Lys]8[NH2.TFA]16(30mg,0.008mmol)的攪拌溶液中加入PyBOP(141mg,0.271mmol),隨后加入溶于DMF(1.4mL)和DMSO(0.6mL)的PEG2000、NHS酯(612mg,0.306mmol)、^^二異丙基乙胺(182|nL,1.04mmol)溶液。混合物在室溫下攪拌16小時。將反應混合物傾入IOK攪拌池內(nèi)并使水(800mL)經(jīng)過池,剩余水通過冷凍干燥去除,以產(chǎn)生作為自由流動的白色固體(149mg,54Q/o)的BHALys[3H-Lys〗8[PEG』"。BHALys[3H-Lys]16[PEG2KD]32的制備在氮下向溶于干DMF(2mL)的BHALys[3H-Lys]16[NH2.TFA]32(30mg,0.004mmol)的攪拌溶液中加入PyBOP(142mg,0.272mmol),隨后加入溶于DMF(3mL)和DMSO(1mL)的PEG2000、NHS酯(522mg,0.261mmol)、^^二異丙基乙胺(182yL,1.04mmol)溶液。溶液在室溫下攪拌16小時。將反應混合物傾入水內(nèi),并且進行過濾并用水進行洗滌。純化通過切向流過濾在Mini-mate(10K膜,2L水)上進行。溶劑通過冷凍干燥去除,以產(chǎn)生作為自由流動的白色固體(210mg,76%)的BHALys[3H-Lys]16[PEG2KD]32。LC/MS(Phi1icTFA):Rf(分鐘)=16.29ESI(+ve)m/z-67,696(M+H+)表ll-樹枝聚體性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>實施例11PEG樹枝聚體的血漿清除率和生物分布研究這項研究中使用的方法與實施例5中使用的那些相同。表12-樹枝聚體藥代動力學參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>關于BHALys[Lys〗16[PEG2。?!?2(實心圓圏)、BHALys[Lys]16[PEG57。]32(空心圓圏)、BHALys[Lys]8[PEG測]16(實心三角)和BHALys[Lys]16[PEG2。。。]32(空心三角)的血漿濃度-時間譜在圖13中圖解說明。關于BHALys[Lys]s[PEG2。。]16的數(shù)據(jù)未顯示,因為清除是非??焖俚牟⒈魂P于BHALys[Lys]"[PEG2。。]32的數(shù)據(jù)弄混。IV給藥后的BHALys[Lys]"[PEG2Q。。]32(黑色柱,7天)、BHALys[Lys〗8[PEG2000]16(灰色柱,5天)和BHALys[Xys]"[PEG570]32(白色柱,30小時)的生物分布在圖14中圖解說明。實施例12關于來自實施例11的生物樣品的尺寸排阻層析這項研究中使用的方法與用于實施例6的相同。在Superdex75柱上5mg/kgIV給藥后在血漿中關于3H標記的BHALys[Lys]16[PEG2。。]32(小圖A;t0,空心方塊,t=l小時,實心圓圏,t=4小時,空心圓圏)、BHALys[Lys]"[PEG57。]32(小圖B;24小時)、BHALys[Lys〗8[PEG簡]16(小圖C;48小時)、和BHALys[Lys]16[PEG2。。。]32(小圖D;48小時)的尺寸排阻譜在圖15A-D中圖在BHALys[Lys]16[PEG2。。]32(小圖A;0-4小時尿,實心圓圏,8一24小時尿,空心圓圏)和BHALys[Lys〗"[PEG飛]32(小圖B;8-24小時尿)IV給藥后在尿中排泄的3H的尺寸排阻譜在圖16A和B中圖解說明。箭頭指示完整的樹枝聚體的保留時間。概述本申請人已進行了'H標記的聚L-賴氨酸樹枝聚體(其中BHALys[LysL[冊2]16或BHALys[Lys]16[NH2]32已進行制備和表面未被封端)的研究。通過比較,還已檢查了第三種樹枝聚體,其由用D-賴氨酸完全封端的BHALys[Lys]8[冊2]16核組成,在其外層上與D-賴氨酸形成Lys^樹枝聚體BHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32。就一切情況而言,樹枝聚體在生理學pH下用陽離子胺基進行覆蓋。測定關于這些材料的血漿清除率和生物分布(實施例5)。311樹枝聚體的體內(nèi)命運通過使用尺寸排阻層析法分開血漿中存在的不同放射性標記的種類進行進一步研究(實施例6)。數(shù)據(jù)暗示聚L賴氨酸樹枝聚體在靜脈內(nèi)施用后從血漿中快速去除,但隨后進行代謝和釋放的L-賴氨酸重新?lián)饺雰?nèi)源性再合成過程內(nèi)。靜脈內(nèi)施用后,BHALys[Lys〗8[NH2]16和BHALys[Lys]"[NH2]32從血漿中非常快速地被去除,顯示小于IO分鐘的起始血漿半衰期(圖2)。這種起始的快速喪失不顯著依賴劑量(圖3),并且當檢查全血(與血漿相反)鐠時(圖4),以及當L-賴氨酸表面基團變成D-賴氨酸時(圖5),同樣很明顯。對于這些相對高分子量的種類,初始分布體積(V。)令人驚訝地很高,和更高分子量的第4代樹枝聚體BHALys[Lys]"[NH丄2和BHALys[Lys]8[D-Lys]16[NH2]32的V。高于更小的第3代比較物。因此,關于第3和4代樹枝聚體的V。值看起來與表面電荷,而不是分子量更加高度相關。數(shù)據(jù)與初始'分布,過程一致,反映聚陽離子樹枝聚體在由靜電相互作用驅(qū)動的過程中與血管內(nèi)皮的快速結(jié)合,導致從循環(huán)血漿中喪失。與之對比,一般的外滲過程看起來不太可能,因為快速穿過血管內(nèi)皮對于此類高度帶電的大分子將是很難的,并且將預期伴隨分子量和表面電荷中的減少而增加—而事實上觀察到的正好相反。這些趨勢在全血藥代動力學中也很明顯,盡管在更小的樹枝聚體的情況下,Cp。值低約2倍(和相應的V。值高2倍),暗示樹枝聚體與紅血細胞的結(jié)合對于較不高度帶電的第3代樹枝聚體更低??傊?,目前數(shù)據(jù)已顯示未封端的聚L-賴氨酸樹枝聚體在靜脈內(nèi)注射后從血漿中快速去除,并且在隨后的時間點上,與完整的樹枝聚體初始結(jié)合的放射性標記與種類結(jié)合再出現(xiàn)在血漿中,所述種類在SEC上與游離賴氨酸和許多較大分子量(可能是類似蛋白質(zhì)的)的材料包括白蛋白共洗脫。數(shù)據(jù)還指出高度帶電的陽離子樹枝聚體在注射后立刻與內(nèi)皮細胞表面快速結(jié)合,并且隨后進行水解以產(chǎn)生循環(huán)游離賴氨酸,其自身最終重新?lián)饺氲鞍踪|(zhì)生物合成途徑內(nèi)。據(jù)我們所知,這些數(shù)據(jù)首次描述了聚L-賴氨酸樹枝聚體的體內(nèi)生物降解和再吸收。因此聚L-賴氨酸樹枝聚體的表面性質(zhì)的合適處理可以增強在血漿中的初始停留時間。未封端的聚L-賴氨酸樹枝聚體表面因此可以提供基于生物可降解的和生物可吸收的樹枝聚體的藥物遞送系統(tǒng)。分開的研究已調(diào)查了用陰離子芳基磺酸鹽基團或烷基羧化物基團對聚L-賴氨酸樹枝聚體核的表面封端在給大鼠靜脈內(nèi)施用后對樹枝聚體藥代動力學和生物分布模式的影響。在外層分別用苯磺酸鹽(C0-4-Ph(S03Na))或苯二磺酸鹽(CO-3,5-Ph(S03Na)2)末端基團封閉頂端的、具有8和16個賴氨酸基團的2種不同大小的樹枝聚體核BHALys[Lys〗8[冊2]16和BHALys[Lys]16[NH丄2用于促進樹枝聚體大小和表面電荷的影響的區(qū)別(合成實施例7)。4種氖標記的賴氨酸樹枝聚體BHALys[Lys]8[C0-4-Ph(S03Na)]16;BHALys[Lys]"[CO-4-Ph(S03Na)]32;BHALys[Lys]"[CO-3,5-Ph(S03Na)2]32和BHALys[Lys]16[CO-CH2CH2(C02Na)]32進行靜脈內(nèi)施用(5mg/kg),并且在血漿、尿和糞便中的放射性經(jīng)過30小時的監(jiān)控(實施例8)。動物在給藥后30小時被處死,并且取出主要器官、均質(zhì)化處理并就放射性標記進行測定。血漿濃度-時間鐠表明BHALys[Lys]8[C0-4-Ph(S03Na)]16的血漿清除率和分布體積高于Lys"樹枝聚體的血漿清除率和分布體積,盡管關于所有4種樹枝聚體的清除半衰期是基本上相同的(約1小時)。約30%注入的與BHALys[Lys]8[C0-4-Ph(S03Na)]16和BHALys[Lys]16[C0-4-Ph(S03Na)]32樹枝聚體結(jié)合的放射性標記在給藥后30小時的時期中被排泄到尿中,而經(jīng)過相同時間段僅3%劑量的高度帶電的BHALys[Lys]"[C0-3,5-Ph(S03Na)2]32被清除到尿內(nèi)。關于琥珀酸鹽樹枝聚體的清除語明顯不同于其他陰離子樹枝聚體的清除譜,并且琥珀酸鹽樹枝聚體在靜脈內(nèi)注射后從血漿中非??焖俚乇蝗コ3跏挤植俭w積(I)也高于其他陰離子樹枝聚體的初始分布體積,并且接近陽離子樹枝聚體的初始分布體積,暗示與血液組分或內(nèi)皮表面的初始相互作用,該相互作用從血漿中快速清除放射性標記(圖4)。在血漿中經(jīng)過前20分鐘的初始喪失速率也是非常快速的,并再次經(jīng)過與陽離子樹枝聚體可見的那種相似的時間尺度發(fā)生。初始快速下降后,放射性標記似乎更慢地被清除,在給藥后30小時仍存在可計量的放射性標記量。第二種較慢的清除速率是否反映標記重新分布到血漿內(nèi)(如先前用陽離子系統(tǒng)可見的)是未知的。陰離子樹枝聚體似乎從紅細胞中幾乎被完全排除。與其他陰離子樹枝聚體形成對比,大多數(shù)注入的與琥珀酸鹽樹枝聚體結(jié)合的放射性標記被排泄到尿中(63.71±8.98%),而非常小但可計量的放射性標記量在合并的糞便中被回收(1.21±0.97%)(表3)。來自BHALys[Lys]"[C0-4-Ph(S03Na)]32和BHALys[Lys]"[C0-3,5-Ph(S03Na)2]32給藥的大鼠的血漿樣品的尺寸排阻層析揭示2種陰離子樹枝聚體都與血漿組分快速結(jié)合,形成高分子量種類(<67kDa)。盡管在血漿中未鑒定到分解產(chǎn)物,但在尿中的放射性標記主要與具有近似于Lys-芳基磺酸鹽單體的分子量的種類結(jié)合。有趣的是在尿中的放射性標記經(jīng)過其間血漿放射性水平極低的時間尺度(給藥后8-24小時)被大部分排泄。器官沉積模式揭示在每種樹枝聚體給藥后30小時存在的殘留的放射性主要集中在肝、脾和腎中。對于BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(S03Na)2]32回收的放射性在肝中特別高(劑量的~50%)。數(shù)據(jù)表明在苯磺酸鹽樹枝聚體從血漿中清除后,代謝發(fā)生,其隨后促進分解產(chǎn)物的尿清除。與之對比,在尿中源自BHALys[Lys]16[CO-3,5-Ph(S03Na)2]32的放射性的低回收可能反映對代謝減少的敏感性,可能是由樹枝聚體增加的表面電荷密度造成的,這依次導致在肝中較高的回收。因此,陰離子樹枝聚體的血漿清除率比先前對于未封端的陽離子聚L-賴氨酸樹枝聚體見到的血漿清除率慢。其次,在陰離子系列內(nèi),血漿清除率主要由樹枝聚體大小而不是表面電荷指示。然而,最后,表面電荷的確指示腎清除和生物分布的模式,并且可能起因于苯磺酸鹽對苯二磺酸鹽封端的樹枝聚體的代謝敏感性中的差異。PEG化已知減少蛋白質(zhì)被蛋白水解酶識別并抑制蛋白質(zhì)和膠體的吞噬細胞性清除,由此延長血漿循環(huán)時間。像這樣在本申請中,PEG化(合成實施例10)對3H標記的聚L-賴氨酸樹枝聚體的血漿譜、生物分布模式和尿清除的影響已在靜脈內(nèi)施用5mg/kg樹枝聚體后在大鼠中進行研究(PK和生物分布實施例11)。一般而言,PEG化的樹枝聚體的血漿半衰期和尿清除程度依賴于分子量,并且較大的PEG化的樹枝聚體(即〉30kDa)相對較慢地從血漿中清除(t1/21-3天),而較小的種類(即〈20kDa)從血漿中快速地清除到尿內(nèi)(t1/21-10小時)。較大的樹枝聚體似乎最終集中在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的器官(肝和脾)中,然而,這經(jīng)過延長的時間段發(fā)生,且積聚的絕對程度很低(<10%的劑量)。通過SEC,用最小的(200Da)PEG鏈衍生的樹枝聚體顯示與血漿組分相互作用的某些跡象,導致明顯更高的分子量種類的產(chǎn)生,然而,清除到尿內(nèi)是非常迅速的并且在尿中僅回收到完整的樹枝聚體。用較大的PEG化的種類(即2000Da)衍生的樹枝聚體作為親本(未改變的)樹枝聚體存在于血漿和尿中。因此PEG化的聚L-賴氨酸樹枝聚體復合物的大小可以進行處理,以最佳地適合其藥代動力學。有差別地受保護的中間產(chǎn)物和部分PEG結(jié)構(gòu)的例子實施例15BHALys[Lys]s[a-Boc]s[e-NH2L的制備i.BHALys[Lys]8[oc-Boc]8[s—CBz]8的制備向BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8(1.59mmol)、三乙胺(4.50ml,32.30mmol)和DMF(30ml)的磁力攪拌溶液中加入作為固體的PNPO-a-Boc-s-CBz-Lys(7.75g,15.45mmol),并且以一份在室溫下。反應懸浮液在顏色方面立刻變成亮黃色,并且在攪拌ca.5分鐘后活性酯已完全溶解。攪拌在室溫下再繼續(xù)22小時。將粗反應混合物傾入包含水水的大燒瓶內(nèi),并形成精細的黃沉淀物。懸浮液進行過濾并且因此保留的固體在抽吸下過夜風干。將產(chǎn)生的干燥的、淡黃色的有色團塊粉碎成細碎粉末并重懸于乙腈中。懸浮液在室溫下攪拌30分鐘隨后進行過濾。保留的固體再次進行風干,再次粉碎并重懸于乙腈中,之后進行過濾和過夜風干,以產(chǎn)生作為無色固體(5.52g,87%)的B亂ys[Lys]8[cx-Boc]8[e-CBz〗8t。LC/MS(Phobic/TFA):觀察到的ESI(+ve)[M+H/3]+m/z=1328;對于C207H305N31O47計算的3979.9;Rf(分鐘)-20.22分鐘。ii.BHALys[Lys]8[ot-Boc〗8[£-麗2]8的制備將BHALys[Lys〗8[oc-BocL[s-CBz]8(500mg,0.126mmol)懸浮于9:1DMF/H20(12.5ml)中,并加入甲酸銨(127mg,2.01mmol),并且在攪拌5分鐘后,加入Pd/C(10%w/w,266mg)并繼續(xù)攪拌2小時。反應通過過濾掉催化劑而終止,并且濾器用9:1DMF/H20(10ml)隨后為水(2ml)進行沖洗。組合的濾液在真空中進行濃縮以產(chǎn)生無色糖漿,其用水(10ml)進行處理,所述水在真空中被去除,隨后在水中冷凍干燥,以產(chǎn)生作為精細白色親液膠體鹽(lyophilate)(155mg,42。/。)的BHALys[Lys]8[oc-Boc]8[s-NH2]8。LC/MS(親水的/TFA):ESI(+ve)m/z=969.83[M+3H]/3+,727,67[M+4H]/4+,582.39[M+5H]/5+;計算的(C143H257N31031)2906.8g/mol。數(shù)據(jù)使用轉(zhuǎn)化計算進行解巻以產(chǎn)生mw-2906.5。Rf(分鐘)=14.7。實施例16BHALys[Lys]8[oc-NH2.TFA]8[£-冊2]8的制備將BHALys[Lys]s[cx-BocL[s-CBz〗8(1000mg,0.251mmol)懸浮于乙酸(5.5ml)中,并在OX:下進行攪拌,同時逐滴加入三氟乙酸(5.5ml)。允許反應化合物加溫至室溫并攪拌17小時,在這時在二乙醚中對反應化合物進行研磨。所得到的懸浮液攪拌10分鐘,并且通過離心和傾析去除液體。剩余的沉淀物通過與二乙醚一起攪拌10分鐘進行洗滌,其再次通過離心和傾析來去除,隨后使沉淀物在真空中進行干燥,溶解于水中并冷凍干燥,以產(chǎn)生作為白色粉末(840mg,1(J5。/o)的BHALys[Lys]8[a-NH2.TFA]8[s-CBz]8。LC/MS(親水的/TFA):ESI(+ve)m/z-1060.70[M+3H]/3+,795,51[M+4H〗/4+,636.30[M+5H〗/5+;計算的(C167H241N31031)3178.95g/mol。數(shù)據(jù)使用轉(zhuǎn)化計算進行解巻以產(chǎn)生mw=3178.0。Rf(分鐘)=19.1。實施例17BHALys[Lys]"[a-Boc]"[s-冊2]16的制備i.BHALys[Lys〗16[ot-Boc]"[s-CBz]"的制備向BHALys[Lys]4[NH2.TFA]16(0.81mmol)、三乙胺(4.50ml,32.30mmol)和DMF(30ml)的攪拌溶液中加入作為固體的PNPO-a-Boc-e-CBz-Lys(7.94g,15.83mmol),并且以一份在室溫下。反應懸浮液在顏色方面立刻變成亮黃色,并且在攪拌ca.5分鐘后活性酯已完全溶解。攪拌在室溫下再繼續(xù)22小時。將粗反應混合物傾入包含冰水的大燒瓶內(nèi),并形成精細的黃沉淀物。懸浮液進行過濾并且因此保留的固體在抽吸下過夜風干。將產(chǎn)生的干燥的、淡黃色的有色團塊粉碎成細碎粉末并重懸于乙腈中。懸浮液在室溫下攪拌30分鐘隨后進行過濾。保留的固體過夜風干,以產(chǎn)生作為無色固體的BHALys[Lys]"[a-Boc]"[s-CBz]16(5.79g,91%)。LC/MS(Phobic/TFA):觀察到的ESI(+ve)[M+H/4]+m/z-1977;對于C407腦9N63095計算的7904.9[M+H/5]+m/z-1582;Rf(分鐘)-23.51分鐘。H.BHALys[Lys]16[a-Boc]"[s-冊2]"的制備BHALys[Lys]16[cc-Boc]16[s-CBz]16(50mg,0.006mmol)、10%Pd/C(53mg)和乙酸(2ml)的懸浮液在氮下在室溫下劇烈攪拌16小時。黑色懸浮液進行過濾。濾液在真空中濃縮提供作為淡黃色油的產(chǎn)物(26mg,71%)。LC/MS(Phobic/TFA):觀察到的ESI(+ve)[M+H/5]+m/z-1152;[M+H/6]+m/z-961;[M+H/7]+m/z-824;[M+H/8]+m/z=721;對于C279H513N63063計算的5758.53[M+H/9]+m/z-641;Rf(分鐘)=2.37分鐘。實施例18BHALys[Lys]16[a-肌.TFA]16[e-CBz]u的制備將BHALys[Lys]16[a-Boc]16[s-CBz〗16(1000mg,0.127mmol)懸浮于乙酸(5.5ml)中,并在0r下進行攪拌,同時逐滴加入三氟乙酸(5.5ml)。允許反應化合物加溫至室溫并攪拌17小時。在二乙醚(150ml)中對反應化合物進行研磨,并將所得到的懸浮液攪拌10分鐘。通過離心(4000rpm,10分鐘)和傾析去除液體,并且剩余的沉淀物通過與二乙醚(150ml)—起攪拌10分鐘進行洗滌,其再次通過離心和傾析來去除。隨后使沉淀物在真空中進行干燥,溶解于水(50ml)中并冷凍干燥,以產(chǎn)生作為白色粉末(832mg,114%)的BHALys[Lys〗"[a-NH2.TFA〗16[s-CBz]16。LC/MS(親水的/TFA):ESI(+ve)m/z=1576.85[M+4H]/4+,1261*34[M+5H]/5+,1051.27[M+6H]/6+,901.15[M+7H]/7+;計算的(C327H481N63063)6302.83g/mo1。數(shù)據(jù)使用轉(zhuǎn)化計算進行解巻以產(chǎn)生mw=6301.5。Rf(分鐘)=19.0。實施例19BHALys[Lys]8[oc-NH2〗8[e-Boc〗8的制備i.BHALys[Lys]8[a-CBz]8[s-BocL的制備向BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8(1.59mmol)、三乙胺(4.40ml,31.57mmol)和DMF(32ml)的磁力攪拌溶液中加入作為固體的PNPO-oc-CBz-s-Boc-Lys(7.69g,15.33mmol),并且以一份在室溫下。反應懸浮液在顏色方面立刻變成亮黃色,并且在攪拌ca.5分鐘后活性酯已完全溶解。攪拌在室溫下再繼續(xù)19小時。將粗反應混合物傾入包含乙腈(ca.300ml)的大燒瓶內(nèi)。懸浮液進行過濾并且因此保留的固體在抽吸下過夜風干。將產(chǎn)生的干燥的、淡黃色的有色團塊粉碎成細碎粉末(研缽和研棒)并重懸浮于乙腈(400ml)中。懸浮液在室溫下磁力攪拌60分鐘隨后進行過濾。保留的固體再次進行風干,再次粉碎并重懸浮于乙腈中,之后進行過濾和過夜風干,以產(chǎn)生作為灰白色固體的BHALys[Lys]8[a-CBz]8[s-Boc]8(5.41g,85%)。LC/MS(Phobic/TFA/SpeedyRamp):觀察到的ESI(+ve)[M+H/3]+m/z=1328;對于C207謂5N31047計算的3979.9;Rf(分鐘)=12.98分鐘ii.BHALys[LysL[ot-NH2]8[s-BocL的制備將BHALys[Lys]s[oc-CBz]8[s-Boc]8(5.0mg,1.26pimol)懸浮于9:1DMF/H20(2ml)中,在環(huán)境溫度下攪拌,并加入甲酸銨(2.5mg,40.2jamol),隨后加入Pd/C(10%w/w,2.7mg)并繼續(xù)攪拌20小時。反應通過過濾掉催化劑而終止,并且濾器用9:1DMF/H20(1ml)進行沖洗。濾液在真空中進行濃縮以產(chǎn)生無色糖漿,其用水(lml)進行處理,所述水在真空中被去除,隨后在水(lml)中冷凍干燥,以產(chǎn)生作為精細白色lyophilate(2mg,42%)的BHALys[Lys]8[ot-NH2]8[s-BocL。LC/MS(親水的/TFA):ESI(+ve)m/z-969.88[M+3H]/3+,727.56[M+4H]/4+;計算的(C143H257N31031)2906.8g/mo1。數(shù)據(jù)使用轉(zhuǎn)化計算進行解巻以產(chǎn)生mw=2906.5。Rf(分鐘)=17.2。實施例20BHALys[Lys]s[ct-CBzL[s-NH2.TFA]8的制備將BHALys[Lys〗8[cx-CBz]8[s-Boc〗8(20.0mg,0.005imnol)懸浮于乙酸(109jLi1)中并在水浴中進行攪拌。小心地加入三氟乙酸(109jil),以溶解所有固體材料,并繼續(xù)在環(huán)境溫度下攪拌16小時。反應通過在真空中去除所有揮發(fā)物而終止,產(chǎn)生澄清的、無色油。在二乙醚中對這種油進行研磨,并且所得到的白色沉淀物用二乙醚進行洗滌,并在真空中干燥,以產(chǎn)生作為白色固體的BHALys[Lys]8[cc-CBz]8[s-NH2.TFA]8(12.1mg,76%)。LC/MS(親水的/TFA):ESI(+ve)m/z=1060.43[M+3H]/3+,795.63[M+4H]/4+,636.79[M+5H]/5+;計算的(C167H241N31031)3178.95g/mol。數(shù)據(jù)使用轉(zhuǎn)化計算進行解巻以產(chǎn)生mw=3179.25。Rf(分鐘)=16.6。實施例21BHALys[Lys]"[oc-NH2]16[e-Boc]"的制備i.BHALys[Lys]16[oc-Fmoc]"[s-BocL的制備向BHALys[Lys〗s[NH2.TFA]16(0.54mmol)、DIPEA(3.0ml,17.22mmol)和DMF(11ml)的攪拌溶液中加入作為固體的五氟苯氧基-oc-Fmoc-s-Boc-Lys(6.58g,10.36mmol),并且以一份在室溫下。反應懸浮液在顏色方面立刻變成亮黃色,并且在攪拌ca.IO分鐘后活性酯已完全溶解。攪拌在室溫下再繼續(xù)18小時。這之后,粗反應混合物已變得如此粘稠使得磁力攪拌無法再繼續(xù)。向反應燒瓶中加入乙腈(ca.300ml),并借助于抹刀將固體團塊充分打碎以便允許攪拌繼續(xù)(1小時)。將懸浮液過濾并允許在真空下過夜風干。所得到的接近無色的團塊用研缽和研棒粉碎,并將精細固體并重懸于乙腈(500ml)中2小時。這之后將懸浮液過濾并且收集無色固體并在rt下過夜風干。所需產(chǎn)物作為灰白色固體(4.72g,94%)獲得。這種產(chǎn)物表征為Fmoc脫保護的衍生物BHALys[Lys〗16[oc-NH2]16[s-Boc]16(參見ii)。ii.BHALys[Lys]"[ot-NH2]16[s-Boc]H的制備以一份在室溫下向BHALys[Lys]"[ct-Fmoc]"[s-Boc]"(1.0g,0.108mmol)和DMF(10ml)的磁力攪拌懸浮液中加入純哌啶(1ml,10.llmmol)。懸浮液再攪拌17小時,這之后,粗反應混合物變成淡黃色溶液。混合物在減壓下進行濃縮,以提供灰白色固體,所述灰白色固體隨后懸浮于二乙醚(ca.100ml)中。在室溫下攪拌30分鐘后,懸浮液進行過濾,并且收集的固體進行過夜風干。所需產(chǎn)物作為無色固體(0.60g,97%)獲得。LC/MS(Phobic/TFA):觀察到的ESI(+ve)[M+H/4]+m/z=1441;[M+H/5]+ffl/z=1153;+m/z=961;對于C279H513N63063計算的5758.5;Rf(分鐘)=2.95分鐘。實施例22BHALys[Lys]"[a-Boc]16[s-NH2Boc]16的制備BHALys[Lys]16[a-Boc〗16[s-Fmoc]16的制備和BHALys[Lys]16[oc-Boc〗"[s-Fmoc]i6的制備在氮下以逐滴的方式向BHALys[Lys]16[a-CBz]"[s-Boc]16(0.01mmol)和二氯甲烷(0.5ml)的攪拌混合物中加入純TFA(0.5ml)。攪拌在室溫下繼續(xù)18小時。揮發(fā)性反應組分在真空中去除,并且獲得的粘性殘渣用二乙醚進行處理以誘導鹽產(chǎn)物的沉淀。懸浮液進行過濾并且收集的固體用二乙醚進行洗滌。將獲得的固體溶解于水中并通過冷凍干燥過夜?jié)饪s至干燥。產(chǎn)物作為絮狀、無色固體獲得。LC/MS(親水的/TFA):觀察到的ESI(+ve)[M+H/4]+m/z-1577;[M+H/5]+m/z=1262對于CmlUN63063計算的6302.8實施例23BHALys[Lys]16[a-CBz]"[e-NH2.TFA]16的制備在氮下以逐滴的方式向BHALys[Lys]16[a-CBz]16[s-Boc]16(0.01mmol)和二氯甲烷(0.5ml)的攪拌混合物中加入純TFA(0.5ml)。攪拌在室溫下繼續(xù)18小時。揮發(fā)性反應組分在真空中去除,并且獲得的粘性殘渣用二乙醚進行處理以誘導鹽產(chǎn)物的沉淀。懸浮液進行過濾并且收集的固體用二乙醚進行洗滌。將獲得的固體溶解于水中并通過冷凍干燥過夜?jié)饪s至干燥。產(chǎn)物作為絮狀、無色固體獲得。LC/MS(親水的/TFA):觀察到的ESI(+ve)[M+H/4]+m/z-1577;[M+H/5〗+m/z=1262對于"71^63063計算的6302.8實施例24BHALys[Lys]16[a,ot-Boc〗8[a,s-Boc]8[e,a-Boc]8[s,s-CBzL的制備i.BHALys[Lys]8[s—CBz]s[a-Lys]s[Boc]"的制備將DBL-OPNP(3.6g,7.2mmol)和三乙胺(2.lmL,15mmol)加入至溶于DMF(30mL)的BHALys[Lys]8[s-CBz]8[ct-NH2.TFA]8(3g,0.75mmol)的攪拌溶液中。所得到的黃色溶液在室溫下攪拌16小時。將反應混合物加入至攪拌的乙腈(300mL)中,產(chǎn)生在黃色溶液中的白色沉淀物。這種沉淀物通過過濾進行收集,并用乙腈進行洗涂以去除殘留的有色材料。沉淀物隨后在真空下在室溫下進行干燥,以提供作為白色固體(4.2g,98%)的BHALys[Lys]8[e-CBz]8[oc-Lys]8[Boc]16。LC/MS(快速疏水的/TFA):Rf(分鐘)=13.70;ESI(+ve)m/z=1936([M+3]/3),1452([M+4]/4),1062([M+5-Boc]/5).;Calc,C295H465N47071.M+l.5083.4ii.BHALys[Lys]8[s-NH2]8[ot-Lysh[Boc]u的制備向溶于乙酸(30mL)的BHALys[Lys〗s[s-CBz]s[ot-Lys]8[Boc〗16(2.2g,0.38mmol)的攪拌溶液中加入10%Pd/C(101mg,0.095mmol)'所得到的均質(zhì)混合物在室溫下在氮下16小時。溶液進行過濾并且在真空中進行濃縮。將所得到的粘性殘渣重溶解于水中并冷凍干燥,以通過包含少許乙酸殘渣的BHALys[LysL[s-NH2]8[oc-Lys〗8[Boc]"(1.97g,0.38mniol)。LC/MS(親水的/TFA):Rf(分鐘)-18.53;ESI(+ve)m/z=1184([M+4]/4),947([M+5]/5),790([M+6]/6);Calc.C231H417N47055.M+1.4731.1iii.BHALys[Lys〗i6[oc,oc-Boc]8[a,s-Boc]8[e,ot-Boc]8[s,s-CBzL的制備將P鵬-cx-Boc-s-CBz-Lys(90mg,0.18mmo1)和三乙胺(0.05mL,0.35nimo1)加入至溶于DMF(10niL)的BHALys[Lys]8[s-NH山[cc-Lys〗8[Boc]16(90mg,0.019mmol)的攪拌溶液中。所得到的黃色溶液在室溫下攪拌16小時。將反應混合物加入至攪拌的乙腈(100mL)中,產(chǎn)生在黃色溶液中的白色沉淀物。這種沉淀物通過過濾進行收集,并用乙腈進行洗滌以去除殘留的有色材料。沉淀物隨后在真空下在室溫下進行干燥,以提供BHALys[Lys]16[oc,a-Boc]8[a,e-Boc]8[s,ct-Boc]8[s,s-CBz]"51mg,35%)。LC/MS(PhobicTFASpeedyRp):Rf(分鐘)=14.32;ESI(+ve)m/z=2544([M+3]/3),1909([M+4]/4),1527([M+5]/5).;Calc.C383H625N63095.M+1.7629實施例25BHALys[Lys]i6[oc,oc-Boc〗8[oc,s-Boc]8[s,oc-Boc]8[s,e-Fmoc]s的制備將PFP-Lys-ct-Boc-s-Fmoc(96mg,0.15畫1)和三乙胺(0.04mL,0.27mmol)加入至溶于DMF(10mL)的BHALys[Lys]8[e-NH2]8[ot-Lys]8[Boc]16(lOOmg,0.017mmol)的攪拌溶液中。溶液在室溫下攪拌16小時。然后將反應混合物加入攪拌的乙腈(lOOmL)中,產(chǎn)生澄清的凝膠狀沉淀。這種沉淀物通過過濾進行收集并用乙腈進行洗涂。沉淀物隨后在室溫下進行干燥,以提供BHALys[Lys]16[ot,a-Boc]8[a,s-Boc]8[s,a-Boc]8[s,s-Fmoc]8(30mg,21%)。LC/MS(疏水的/TFA):Rf(分鐘)=7.72;ESI(+ve)m/z=1667([M+5]/5),1389([M+6]/6),1191([M+7]/7).;Calc.C439H657N63095.M+l8332限定的PEG1.7KD的制備向溶于DMF(6mL)的H02C-PEG1146-NH2(245mg,0.21mmol,1,07eq)和PEG57。-NHS(136mg,0.2mmol)的攪拌溶液中加入2mL緩沖液(pH8.5,通過將2.5mL0.1MHCl溶液加入Na2HP04(100mL)的攪拌溶液內(nèi)進行制備,并在添加完成后攪拌5分鐘)。允許反應混合物在rt下攪拌過夜。溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上去除以產(chǎn)生作為殘渣的PEG1716-C02H,所述殘渣通過LC進行純化以產(chǎn)生所需產(chǎn)物(產(chǎn)量80%)。實施例26BHALys[Lys]8(a-NH2.TFA)8(e-PEG571)8的制備i.BHALys[Lys]8(a-Boc)8(s-PBG571)8的制備在氮下向溶于干DMF(1mL)和DMSO(1mL)的BHALys[Lys〗8(a-Boc)8(s-NH2.TFA)8(9.2mg,0.003mmol)的攪拌溶液中加入NHS-PEG685.75(26mg,0.45mmol)和三乙胺(10juL,0.108mmol)。允許反應混合物在rt下攪拌16小時,并隨后在減壓下進行濃縮以產(chǎn)生粗制油,所述粗制油通過prep.HPLC[C18prep.柱WatersXterraPrepRP18,10inm,19x250mm。環(huán)境溫度。梯度10-45%MeCN經(jīng)過80分鐘。Rf(分鐘)85]進行純化,以產(chǎn)生作為澄清油(18mg,75%)的BHALys[Lys]8(a—Boc)8(s-PEG571)8。LC-MS:(Phobic,TFA)Rf(分鐘)12.81.ESI(+ve)m/z-1246.3(M/6),1068.2(M/7),934.8(M/8)831.2(M/9)。ii.BHALys[Lys]8(a-NH2.TFA)8(s-PEG571)8的制備在0'C下向溶于CH2C12(3mL)的BHALys[Lys]8(a-Boc)8(e-PEG571)8(18mg,0.002mmol)的攪拌溶液中加入TFA(45|uL,0.58mmol),攪拌在OX:下繼續(xù)20分鐘隨后在rt下繼續(xù)2小時。溶劑在減壓下被去除以產(chǎn)生作為油(16mg,88%)的BHALys[Lys]8(ot-NH2.TFA)8(5-PEG571)8。LC-MS:(PhiHc,TFA)Rf(分鐘)10.36.ESI(+ve)m/z=954(M/7),834(M/8),742(M/9)。實施例27BHALys[Lys]"[ot-PEG57。]16[e-MTX]"的制備標題化合物的制備由反應方案3(圖17)圖解說明。反應方案如下使BHALys[Lys]16[a-Fmoc]"[s-Boc]",結(jié)構(gòu)2,圖17(R,sFmoc,R2-Boc)與旅咬在,中反應以產(chǎn)生BHALys[Lys〗16[a-NH2]16[s-Boc]",結(jié)構(gòu)3f(H=H,R2=Boc);隨后使結(jié)構(gòu)3f與過量PEG"。-NHS在酵和DIPEA中反應以產(chǎn)生BHALys[Lys]"[a-PEG57?!?[e-Boc]",結(jié)構(gòu)3g=PEG57。,R2=Boc);隨后^f吏結(jié)構(gòu)3g與溶于DCM的TFA(20%)反應,隨后與離子交換樹脂((OH-)形式)反應,以產(chǎn)生BHALys[Lys]16[ct-PEG57。]16[s-NH2]",結(jié)構(gòu)3h(R!=PEG570,R2=NH2),隨后使結(jié)構(gòu)3h與過量a-tBu-Y-MTX-0H、EDC、HOBt和DIPEA在DMSO中反應以產(chǎn)生BHALys[Lys]"[a-PEG57?!?6[s-(a-tBu-MTX)]16,結(jié)構(gòu)3i=PEG57。,R2=a-tBu-MTX),隨后使結(jié)構(gòu)3i與TFA反應以產(chǎn)生BHALys[Lys]"[oc-PEG57。]16[s-MTX]16,結(jié)構(gòu)3j(K=PEG57。,R2=MTX)。用PEGm6、PEG簡和PEG卵取代PEG57。-NHS提供了具有增加的PEG大小的樹枝聚體構(gòu)建體,并需要備選反應條件,由此結(jié)構(gòu)3f與過量PEGMW-C02H、HOBt和EDC在DMF和DIPEA中反應以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)3g(^=PEG冊R2-CBz)BHALys[Lys]"[oc-PEGMW]16[e-CBz]16。實施例28BHALys[Lys〗16[a-PEG57。]16[s-COCH2CH2CO-泰素]"的制備標題化合物的制備由反應方案5(圖18)圖解說明。反應方案如下使BHALys[Lys]"[a-PEG57。]16[e-NH2]",結(jié)構(gòu)3h(^=PEG57。,R2=H)和TFA(16當量)與過量H02CCH2CH2CO-泰素、EDC、HOBt和DIPEA在DMF中反應以產(chǎn)生BHALys[Lys]]6[a-PEG57。]16[s-0)0{20120)-泰素]16,結(jié)構(gòu)31(R!-PEG"。,R2=(:0(^20120)-泰素)。在結(jié)構(gòu)3h中用PEG1716、PEG""和PEG卵取代PEG,提供具有增加的PEG大小的樹枝聚體構(gòu)建體。實施例29BHALys[Lys]"[e,s-PEG570〗8[COCH2CH2CO-泰素]24的制備i.BHALys[Lys]8[a-匪山[s-CBzL的制備中間化合物的制備由反應方案6(部分l)(圖19A)圖解說明。反應方案如下使BHALys[Lys〗4[NH2.TFA]8,結(jié)構(gòu)4(Id-H.TFA)與過量PNPO-ct-Boc-s-CBz-Lys和DIPEA在腳中反應以產(chǎn)生BHALys[Lys]8[a-Boc]8[s-CBz]s,結(jié)構(gòu)5a(Id-BocR2=CBz);使結(jié)構(gòu)5a與TFA/乙酸隨后與離子交換樹脂((OH-)形式)反應,以產(chǎn)生BHALys[Lys]8[cc-NH山[s-CBz]8,結(jié)構(gòu)5b(R!=HR2-CBz)。ii.BHALys[Lys〗16[s,s-PEG"。]824的制備標題化合物的制備由反應方案6(部分2)(圖19B)圖解說明。反應方案如下使BHALys[Lys]8[ot-NH2]8[s_CBz]8,結(jié)構(gòu)5b(艮-HR2=CBz)和TFA(8當量)與過量DBL-OPNP和DIPEA在DMF中反應以產(chǎn)生BHALys[Lys]8[S-CBz〗8[Lys]8[ot,oc-Boc]8[a,s-Boc!h,結(jié)構(gòu)6a(^=BocR2=CBz);使結(jié)構(gòu)6a與[12和Pd(10%)在碳上在乙酸中隨后與離子交換樹脂((OH-)形式)反應,以產(chǎn)生BHALys[Lys]8[e-NH2]8[Lys〗8[ct,ct-Boc]8[oc,s-Boch,結(jié)構(gòu)6b(R!=BocR2=H);使結(jié)構(gòu)6b和TFA(8當量)與過量PNPO-ot一Boc-s-CBz-Lys和DIPEA在DMF中反應以產(chǎn)生BHALys[Lys〗16[s,e-CBz〗8[Boc]",結(jié)構(gòu)7a(^=BocR2=CBz);使結(jié)構(gòu)7a與112和Pd(10%)在碳上在乙酸中隨后與離子交換樹脂((OH-)形式)反應,以產(chǎn)生BHALys[Lys〗16[s,s-NH2〗8[Boc]24,結(jié)構(gòu)7b(R!=BocR2=H);使結(jié)構(gòu)7b與過量PEG57Q-NHS在DMF和DIPEA中反應以產(chǎn)生BHALys[Lys]16[s,s-PEG57。〗8[Boc〗24,結(jié)構(gòu)7c(Id-BocR2=PEG57。);使結(jié)構(gòu)7c與TFA反應以產(chǎn)生BHALys[Lys]16[s,s—PEG57。]8[NH2.TFA]24,結(jié)構(gòu)7d(Id-H.TFAR2-PEG57。);使結(jié)構(gòu)7dI與過量H02CCH2CH2CO-泰素、EDC、HOBt和DIPEA在DMF中反應以產(chǎn)生BHALys[Lys〗"[s,s-PEG57。]824,結(jié)構(gòu)7e(Ri=COCH2CH2CO-泰素R2-PEG"。)。用PEGm6、PEG簡和PEG洲取代PEG57。-NHS提供了具有增加的PEG大小的樹枝聚體構(gòu)建體,并需要備選反應條件,由此結(jié)構(gòu)7b與過量PEGm-C02H、HOBt和EDC在DMF和DIPEA中反應以產(chǎn)生BHALys[Lys]"[£,e-PEGMW〗8[Boc]24,結(jié)構(gòu)7c(^-BocR2-PEGMW)。實施例30限定的PEG部分PEGm6、PEG簡、PEG3974的制備在上文反應方案中用于取代的上述備選PEG部分的制備由反應方案7(圖20)圖解說明。反應方案如下i.使H02C-PEG,-冊2與PEG57。-NHS在DMF緩沖液pH8.5中反應以產(chǎn)生PEG1716_C02H;ii.使PEGI716-C02H與DCC和NHS隨后與H02C-PEGn"-NH2在DMF緩沖液pH8.5中反應以產(chǎn)生PEG2845-C02H;iii.使PEG鵬-C02H與DCC和NHS隨后與H02C-PEGu"-冊2在DMF緩沖液pH8.5中反應以產(chǎn)生PEG3974-C02H。實施例31BHALys[Lys]2[Su(NPN)山[a-tBu-MTX]4[PEG"山的制備i.N-(芐氧羰基)-3-溴丙胺的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage91</formula>將TEA(6.91g,68.5minol)逐滴加入至溶于DCM(200mL)的3-溴丙胺氫溴酸鹽(10.Og,45.6mmol)和N-(節(jié)氧羰酰氧基)-琥珀酰亞胺(11.22g,47.9mmo1)的水冷混合物中。允許攪拌混合物加溫至室溫過夜,隨后用水(3x)、囟水洗滌,干燥(MgS04),過濾和濃縮,提供作為淡黃色油的U.43g(92%)N-(千氧羰基)-3-溴丙胺。ii.[BOC][Cbz][NPNL的制備在室溫下將TEA(17.1mLs,123.5mmol)逐滴加入至溶于DMF(150mLs)的N-(爺氧羰基)-3-溴丙胺(11.20g,41.2mmol)和N-BOC丙二胺(7.16g,41.2mmol)的攪拌混合物中。使混合物加熱至70"C并持續(xù)1小時,隨后ca.三分之二的溶劑在真空中被去除。隨后用水(400mL)稀釋濃縮的DMF混合物并用乙醚(3x200mLs)進行洗滌,以去除大多數(shù)過烷基化的副產(chǎn)品。DMF/水混合物隨后進行堿化(1.0MNaOH),并用乙醚(5x200mL)萃取。組合的乙醚萃取物隨后用水(3x200mL)進行洗滌,以去除任何未反應的N-BOC丙二胺,干燥(MgSOj,過濾并濃縮,以提供作為澄清的無色油的7.13g(47%)[BOC][Cbz][訓]2。[Cbz][固LSuOH的制備OH在室溫下向溶于甲苯(60mL)的[BOC][Cbz〗[訓]2(6.55g,17.9mmol)的攪拌混合物中加入琥珀酐(1.79g,17.9mmo1)。使混合物加熱至70匸并持續(xù)1小時,隨后進行濃縮。然后將殘渣溶解于EA/乙醚(5:1)中并用NaOH(1.0M,2x100mL)進行洗滌。堿洗滌物隨后用乙醚進行洗滌,隨后進行中和(HC1,1.0M,2x100mL)。含水混合物隨后用EA(3x250mL)進行洗滌,干燥(MgS04),過濾并濃縮,以提供作為無色粘性油的6.97g(84%)[BOC][Cbz][NPN]2SuOH。iv.[BOC][Cbz〗[NPN]2SuOPNP的制備在室溫下向溶于EA(150mL)的4-硝基苯酚(1.91g,13.7mmol)和[BOC][Cbz][NPN]2SuOH(6.39g,13.7mmol)的攪拌混合物中加入溶解于EA(50mL)中的DCC(2.97g,14.4mmol)。使混合物在室溫下攪拌過夜,隨后進行過濾(以去除DCU)?;旌衔镫S后用K2CO3(1.0M)/卣水1:1(3x300mL)、卣水進行洗滌,干燥(MgS04),過濾并濃縮,以提供作為粗制材料的[BOC][Cbz〗[NPN]2SuOPNP(7.80g)。v.[BOC][Cbz〗[NPN]2SuOEt的制備使溶于EtOH(100mL)的[BOC][Cbz][訓]2SuOPNP(1.16g,1.98mmol)和TEA(2.0mL,14.4mmol)的攪拌混合物于70"C加熱2天,濃縮,并吸收到乙酸乙酯(120mL)中?;旌衔镫S后用〖20)3溶液(5%,4x200mL)、卣水進行洗滌,干燥(MgS04),過濾并濃縮,以提供作為無色粘性油的0.87g(90%)[BOC][Cbz][NPN〗2SuOEt。LCMS(LC:philic,甲酸鹽,RT-9.3分鐘.;MS(Mcalc.C25H39N307=493.61):511([M+NH4〗+,13%),494([M+H]+,100%),438([M一HBu+H]+,15%),394([M-BOC+H]+,13%)。力(CDC13):57.30—7.38(m,5H),5.70(brs,0.5H),5.25(brs,0.5H),5.10(brs,0.5H),5.10,5.08(2s,2H),4.70(brs,0.5H),4.12(q,J=9.0Hz,2H),2.95-3.45(m,8H),2.52-2.70(m,4H),1.73-1.90(m,2H),1.60-1.70(m,2H),1.42,1.44(2s,9H),1.25(t,J-9.OHz,3H)。vi.[BOC][NH2][NPN]2SuOEt的制備向溶于DMF/H20(9:1,20mL)的[BOC][Cbz〗[NPN]2SuOEt(0.88g,1.77mmol)的攪拌混合物中加入甲酸銨(224mg,3.55mmol)和Pd/C(10%,470mg)。使混合物在rt下攪拌2小時,隨后進行過濾(0.2ILimPALL濾片)和濃縮。將殘渣吸收到水中并進行濃縮(2x)。這隨后用MeOH和DCM進行重復,提供作為澄清的無色油的0.54g(84%)[BOC][NH2][NPN]2SuOEt。LCMS(LC:phi1ic,TFA,RT-6.2分鐘;MS(McalcC17H33N305=359.47):360([M+H]+,100%)。'H(CDC13):55.30(brs,1H),4.80(brs,1H),4.12(q,J=9.0Hz,2H),3.29-3.46(m,4H),3.14(m,1H),3.07(m,IH),2.56-2.80(m,6H),1,60-1.90(m,4H),1.42,1.43(2s,9H),1.25(f,J=9.OHz,3H)。vii.[BOC][PEG570][NPN]2SuOEt的制備。向溶于DCM(2mL)的[B0C][NH2][訓]2SuOEt(157mg,0.44mmol)的攪拌混合物中加入作為DCM(2mL)溶液的TEA(121jul,0.87mmol)和PEG,-NHS(300mg,0.44mmol)?;旌衔镌趓t。/n下進行攪拌,濃縮,然后通過fee(2-10%MeOH/DCM)進行純化,提供作為澄清的無色油的331mg(82%)[BOC][PEG57。〗[NPN]2SuOEt。LCMS(LC:phi1ic,TFA,RT-8.2分鐘;MS(Mc"cC"H83N3018=930.15):948([M+NH4]+,12%),931([M+H]+,2%),416(1/2[M-BOC+2H+],100%)。力(CDC13):57.10(brs,1H),7.03(brs,1H),4.16U,J-9.0Hz,2H),3.72(m,2H),3.58-3.66(m,36H),3.52-3.56(m,2H),3.47(s,2H),2.96-3.42(m,7H),3.37(s,4H),2.70(s,4H),2.60(m,4H),2.47(m,2H),1.60-1.90(m,4H),1.41,1.43(2s,9H),1.24(t,J=9.0Hz,3H)。viii.[NH2.TFA][PEG570][NPN]2SuOEt的制備向溶于DCM(2mL)的[BOC][PEG57?!絒翻]2SuOEt(180mg,0.19mmol)的攪拌混合物中加入TFA(0.50mL)。使混合物在rt下攪拌6小時,濃縮,加入H20并濃縮(2x)。然后將殘渣再次吸收到H20(20mL)中,過濾(0.2jamPALL濾片)隨后冷凍干燥,提供作為澄清的無色油的0.17g(93%)[NH2.TFA][PEG57。][NPN]2SuOEt。LCMS(LC:philic,TFA,RT=5.9分鐘;MS(McalcC38H75N3016=830.03):831([M+H]+,7%),425(1/2[M+Na++Hi,30%),416(1/2[M+2『],100%)。'H(D20):54.17(q,J=9.0Hz,2H),3.80(t,J=6.0Hz,2H),3.62-3.75(m,43H),3.38-3.53(m,4H),3.40(s,3H),2.90-3.31(m,4H),2.77(s,4H),2.64-2.89(m,4H),2.52-2.58(m,2H),1.72-2.11U,4H),1.13(t,J-9.0Hz,3H)。ix.[ot-tBu-MTX][PEG57?!絒固]2SuOEt的制備在OX:下向溶于DMF(0.5mL)的[NH2.TFA][PEG57。][NPN]2SuOEt(30mg,31.7iumol)和oc-tBu-y-MTX-OH(16.2mg,31.7pmol){C.L.Francis,Q.Yang,N.K.Hart,F.Widmer,M,K.Manthey和H.MingHe-Williams,/.C力e邁.2002,55,635}的攪拌混合物中加入PyBOP(18mg,34.8"mol)和DIPEA(23"L,0.127mmol)。使混合物在OC下攪拌30分鐘,隨后在rt下攪拌3小時。去除DMF,并且通過PTLC(7%MeOH,93%DCM,Rf-0.3)純化殘渣,提供作為橙色油的23mgs(55%)[ct-tBu-MTX][PEGl"?!絒NPN〗2SuOEt。LCMS(LC:philic,TFA,RT=8.0分鐘;MS(McalcC62HmN02。-1322.57):1323([M+H]+,2%),662(1/2[M+2H+〗,17%),634(1/2[M-tBu+2『〗,82%)。x.[oc-tBu-MTX][PEG57。][NPN]2SuOH的制備向溶于THF/H20(2:1,9ml)的[oc-tBu-MTX〗[PEG157。〗[NPN]2SuOEt(109mg,82.4jimol)的攪拌混合物中加入NaOH(0.16mL,1.OM)。使反應在rt下攪拌16小時,并且需要時添加另外的NaOH(反應通過tlc判斷)。反應完全后,用HC1(1.0M)將pH調(diào)整至中性。然后去除溶劑,將殘渣吸收在MeOH中,并過濾以去除鹽。殘渣隨后通過PTLC(18%MeOH,82%DCM,Rf-0.4)進行純化,提供作為橙色油的52mgs(49%)[ot-tBu-MTX][PEG"。][NPN]2SuOH。LCMS(LC:philic,TFA,RT=6.8分鐘;MS(Mcal。Cm^NuOm=1294.52):1317([M+Na]+,3%),1295([M+H]+,2%),648(l/2[M+2『],10%),620(1/2[M-tBu+2H+],74%),419(100%)。xi.BHALys[Lys〗2[Su(NPN)丄[a-tBu-MTX]4[PEG57。〗4的制備在OX:下向溶于DMF(1.2mL)的[a-tBu-MTX][PEG57?!絒NPN]2SuOH(lOmg,7.7jumol)和BHALys[Lys]2[NH2.TFA]4(1.43mg,1.4jamol)的攪拌混合物中加入PyBOP(4.0mg,7.7mol)和DIPEA(3.9jaL,22.4iamol)。使混合物在下攪拌30分鐘,隨后在rt下攪拌3小時。去除DMF,并且通過PREPHPLC(WatersXterraMSC18,10pm,19x250mm,30-60%ACN,0.1%TFA,8mL/分鐘,RT=34分鐘)純化殘渣,提供2mg(25。/。{大部分在空隙中出現(xiàn)})BHALys[Lys]2[Su(NPN)2]4[a-tBu-MTX]4[PEG57。]"LCMS(LC:philic,TFA,RT-8.O分鐘;MS:1136(1/5[M+5H+〗,18%),946U/6[M+6H+],100%),812(1/7[M+7H+],22%)轉(zhuǎn)化成5,673.34。(McalcC271H437N51079=5,673.80)。實施例32BHALys[Lys〗4[Su(NPN)丄[ct-tBu-MTX]8[PEG"山的制備BHALys[Lys]4[NH2.TFA]8與[a-tBu-MTX〗[PEG57?!絒NPN]2SuOH的反應使用與實施例31中描述的那種相似的方法提供BHALys[Lys]4[Su(NPN)2〗8[oc-tBu-MTX]8[PEG57?!?(10mg)(51%)PREPHPLC(5-60%ACN,90分鐘,RT54分鐘)。LCMS(LC:philie,TFA,RT=9.0分鐘;MS:1614(1/7[M+7H+],26%),1413(1/8[M+8H+〗,73。/。),1256(1/9[M+9H+〗,100%)轉(zhuǎn)化成11,294.54。(McalcCwHmUs-11,292.52)。實施例33BHALys[Lys〗8[Su(NPN)2]16[oc-tBu-MTX]16[PEG57。]16的制備BHALys[Lys]s[NH2.TFA]"與[a-tBu-MTX][PEG57。][NPN]2SuOH的反應使用與實施例31中描述的那種相似的方法提供BHALys[Lys]8"[PEG57?!?6(6mg)(46%)PREPHPLC(5-60%ACN,90分鐘,RT66分鐘)。LCMS(LC:philic,TFA,RT-9.0分鐘;MS:2254(1/10[M+10H+],24%),2049(1/11[M+11H+〗,56%),1879(1/12[M+12H+],100%),1734(1/13[M+13H+],55%)轉(zhuǎn)化成22,531.91(McalcC1063H1745N207O319=22,529.73)。BHALys[3H-Lys〗8[Su(NPN)2〗16[a-tBu-MTX]16,57?!?6以相似方式進行制備,15mg(65%),1.27mCi/g實施例34BHALys[Lys]16[Su(NPN)2]32[a-tBu-MTX]32[PEG570]32BHALys[Lys]"[NH2.TFA]32與[a-tBu-MTX][PEG57Q][NPN〗2SuOH的反應使用與實施例31中描述的那種相似的方法提供BHALys[Lys]16[Su(NPN)2]32[a-tBu-MTX]32[PEG57Q]32(7mg)(44%)PREPHPLC(5-60%ACN,90分鐘,RT71分鐘)。LCMS(LC:philic,TFA,RT=9.2分鐘;MS:(McalcC2119H3489N"50639=45,004.27)實施例35i.[BOC][PEG測][NPN]2SuOEt的制備向溶于DMF(2mL)的[BOC][NH2〗[NPN]2SuOEt的攪拌混合物中加入作為匿/DCM(2mL)溶液的TEA(2eq)和PEG腦NHS(1eq)。混合物在rt0/n下進行攪拌,濃縮,然后通過fcc進行純化,提供作為澄清的無色油的[BOC][PEG簡][NPN]2SuOEt。ii.[NH2.TFA][PEG,][NPN]2SuOEt的制備向溶于DCM(2mU的[BOC][PEG,][NPN]2SuOEt(180mg)的攪拌混合物中加入TFA(0.50mL)。使混合物在rt下攪拌6小時,濃縮,加入&0并濃縮(2x)。然后將殘渣再次吸收到H20(20mL)中,過濾(0.2jumPALL濾片)隨后冷凍干燥,提供作為澄清的無色油的[NH2.TFA][PEG110。][NPN]2SuOEt。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage99</formula>在OX:向溶于DMF(0.5fflL)的[NH2.TFA][PEG。。][NPN]2SuOEt和oc-tBu-y-MTX-0H(1eq){C.L.Francis,Q.Yang,N.K.Hart,F(xiàn).Widmer,M.K.Manthey和H.MingHe-Wi11iams,/.C/e瓜2002,55,635)的攪拌混合物中加入PyBOP(1.2eq)和DIPEA(3eq)。使混合物在01C下攪拌30分鐘,隨后在rt下攪拌3小時。去除DMF,并且通過PTLC純化殘渣,提供作為橙色油的[oc-tBu-MTX][PEGU。。][NPN]2SuOEt。[PEG謂][NPN]2Su0H的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage99</formula>向溶于THF/H20(2:1,9ml)的[a-tBu-MTX][PEG園][NPN〗2Su0Et的攪拌混合物中加入NaOH(2eq,1.0M)。使反應在rt下攪拌16小時,并且需要時添加另外的NaOH(反應通過tlc判斷)。反應完全后,用HCl(1.0M)將pH調(diào)整至中性。然后去除溶劑,將殘渣吸收在MeOH中,并過濾以去除鹽。殘渣隨后通過PTLC進行純化,提供作為橙色油的[ot-tBu-MTX][PEG訓〗[翻h(huán)SuOH。v.BHALys[Lys]8[Su(NPN)2]16[a-tBu-MTX]16[PEG謂]16的制備在O"C下向溶于DMF(1.2mL)的[oc-tBu-MTX][PEG謂][NPN]2SuOH(1.1eq/NH2)和BHALys[Lys]8[NH2.TFA]16的攪拌混合物中加入PyBOP(1.2eq/NH2)和DIPEA(3eq/NH2)。使混合物在Ot:下攪拌30分鐘,隨后在rt下攪拌3小時。去除DMF,并且通過PREPHPLC(WatersXterraMSC18,10jum,19x250mm)純化殘渣,提供BHALys[Lys]s[Su(NPN)2]16[oc-tBu-MTX]"[PEGU。。]16。實施例36HOGlyLys[Lys]2[Boc〗3[e,e—CBz]的制備該合成在圖21中示意性圖解說明。i.MeOGlyLys[ot-Boc][e-CBz]的制備將PNPO-oc-Boc-s-CBz-Lys(50.15g,0.100mol)加入至溶于三乙胺(30.36g,0.300mol)和二甲基曱酰胺(200ml)混合物的甘氨酸曱酯鹽酸鹽(12.56g,0.110邁ol)的攪拌懸浮液中。在環(huán)境溫度下攪拌16小時后,揮發(fā)性組分在真空中蒸發(fā),并且殘渣在乙酸乙酯(200ml)和5%含水碳酸鈉(175ml)之間分開。水相被棄去,并且乙酸乙酯相用更多的5%含水碳酸鈉(4x200ml)進行洗滌,隨后用0.25M鹽酸(2x50ml),再隨后用飽和的含水氯化鈉(50ml)洗滌。乙酸乙酯溶液進行干燥(疏酸鎂)、過濾并在真空中蒸發(fā)溶劑,以產(chǎn)生作為無色油的MeOGlyLys[ot-Boc][s-CBz](44.39g,98%)。卞匿(300MHz,CD30D)5(ppm):1.3-1.8(m,6H);1.44(s,9H);3.13(t,J6.6Hz,2H);3.70(s,3H);3.88U,J17.7Hz,1H);3.99(d,J17.7Hz,1H);4.04(m,1H);5.06(s,2H);7.2-7.4(m,5H)。LC/MS(疏水的/甲酸鹽)觀察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z=452.0;對于(:2211^307計算的452.2。Rf(分鐘)-5.2。ii.MeOGlyLys[a-NH2.TFA][s-CBz]的制備將MeOGlyLys[a-Boc][s-CBz](43.36g,96.0mmol)溶解于乙酸(150ml)中,并使溶液在水浴溫度下攪拌直至乙酸開始冷凍。去除水浴,并伴隨攪拌緩慢加入三氟乙酸直至乙酸結(jié)晶溶解。將溶液再次置于冰浴中,并且緩慢加入剩余的三氟乙酸(總共150ml);乙酸的冷凍不再發(fā)生。去除水浴,并使溶液在環(huán)境溫度下攪拌5小時,隨后在真空中盡可能充分地蒸發(fā)揮發(fā)性組分。將殘留的粘性油溶解于甲醇(200ml)中,并再次在真空中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至油。這個過程用甲醇的5個另外200ml等分試樣進行重復,之后在真空中在0.1Torr下盡可能多地去除的殘留甲醇。產(chǎn)物MeOGlyLys[a-NH2.TFA][s-CBz]作為淡黃色油(46.04g,由于仍存在某些甲醇所以理論上為103%)獲得。力nmr(300MHz,CD3OD)5(ppm):1.5-1.6(m,4H);1.8-2.0(m,2H);1.44(s,9H);3.15(t,J6.8Hz,2H);3.71(s,3H);3.88(t,J6.4Hz,1H);3.94(d,J17.6Hz,1H);4.08(d,J17.6Hz,1H);5.07(s,2H);7.2-7.4(m,5H)。LC/MS(親水的/甲酸鹽)觀察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z=352.1;對于(^17^^05計算的352.2。Rf(分鐘)-12.3。iii.MeOGlyLys[e-CBz〗[a-Lys][Boc]2的制備將DBL-OPNP(49.37g,0.106mol)加入至溶于二甲基甲酰胺(200ml)的MeOGlyLys[a-NH2.TFA][s-CBz](46.0g,96.0mmol)和三乙胺(24.3g,0.240mol)的攪拌溶液中。在環(huán)境溫度下攪拌17小時后,加入溶于水(50ml)的甘氨酸溶液(3.98g,53.0mmol),并將渾濁溶液攪拌24小時。向充分攪拌的混合物中加入水(150ml),并且白色固體開始沉淀。隨后加入片水(200g)并繼續(xù)攪拌直至水已融化。固體通過過濾進行收集,懸浮于5%含水碳酸鈉中,并超聲處理0.5小時,用抽吸變得半干,并隨后用更多的5%含水碳酸鈉(2x200ml)進行洗滌,隨后用水(3x200ml)洗滌。亮黃色固體隨后在另外200ml5%含水碳酸鈉中進行攪拌,并進行過濾以產(chǎn)生淡黃色粉末。固體用水(2x200ml)進行洗滌,隨后懸浮于更多的水(200ml)中,并超聲處理1.5小時。過濾和抽吸干燥以及隨后在真空中千燥產(chǎn)生61.0g茶色粉末。從乙酸乙酯中再結(jié)晶產(chǎn)生作為白色固體的MeOGlyLys[s-CBz][a-Lys][Boc]2(50,05g,77%)。'H匿(300MHz,CD30D)5(ppm):1.2-2.O(m,30H);3.03(t,J6.6Hz,2H);3.12(t,J6.8Hz,2H);3.69(s,3H);3.87(d,J17.6Hz,1H);4.00(d,J17.6Hz,1H);4.01(dd,J3.3,7.4Hz,1H);4.38(dd,J5.4,8.4Hz,1H);5.06(s,2H);7.2-7.4(m,5H)。LC/MS(親水的/甲酸鹽)觀察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z-680.0;對于C33Hs4NA。計算的680.4;觀察到的[M+NH4]+m/z-697.0;對于C33^NA。計算的697.4。Rf(分鐘)=8.0。iv.MeOGlyLys[e-NH2.TFA][ot-Lys][Boc]2的制備在氫和大氣壓下將溶于甲醇(10ml)的MeOGlyLys[s-CBz][a-Lys][Boc]2(680mg,1.00mmol)和三氟乙酸(77jul,1.0畫l)溶液加入至在碳上的10。/。w/w鈀的懸浮液(106mg,0.10mmolPd)。混合物在環(huán)境溫度下攪拌1小時,并隨后通過硅藻土床進行過濾。曱醇在真空中蒸發(fā),將殘渣再溶解于甲醇(5ml)中,并使溶液經(jīng)過O.2iam濾器。甲醇在真空中的蒸發(fā)產(chǎn)生作為脆性白色泡沫的MeOGlyLys[s-NH2.TFA][ct-Lys][Boc]2(640mg,97%)。力nmr(300MHz,CD3OD)5(ppm):1.2-2.O(m,30H);2.93(t,J7.5Hz,2H);3.03(t,J6.6Hz,2H);3.72(s,3H);3.89(d,J17.7Hz,1H);3.98(dd,J5.4,9.0Hz,1H);4.02(d,J17.7Hz,1H);4.42(dd,J5.7,8.4Hz,1H)。LC/MS(親水的/甲酸鹽)觀察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z-546.2;對于(:251508計算的546.3。Rf(分鐘)-14.2。v.MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[s,e—CBz]的制備將P訓-a-Boc-s-CBz-Lys(535mg,1.07mmol)加入至溶于二甲基甲酰胺(IOml)的MeOGlyLys[s-NH2.TFA][a-Lys][Boc]2(640mg,0.97mmol)的攪拌溶液中。加入三乙胺(340jul,2.43mmol),并使溶液在環(huán)境溫度下攪拌20小時。加入溶于水(5ml)的甘氨酸溶液(40mg,0.54mmol),并將渾濁溶液攪拌2小時。二曱基甲酰胺在真空中蒸發(fā),并且殘留的油在乙酸乙酯(20ml)以及5%含水碳酸鈉和飽和含水氯化鈉的3:1混合物(20ml)之間分開。水相被棄去,并且乙酸乙酯相用更多的碳酸鈉/氯化鈉混合物(3x20ml)進行洗滌,隨后用0.20M鹽酸(2x20ml),再隨后用飽和的含水氯化鈉(20ml)洗滌。將乙酸乙酯溶液進行千燥(疏酸鎂)、過濾并在真空中蒸發(fā)溶劑,以產(chǎn)生作為脆性白色泡沫的MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[s,s-CBz](818mg,93%)。'H匿(300MHz,CD3OD)5(ppm):1.2-2.O(m,45H);3.03(t,J6.6Hz,2H);3.12(t,J6.6Hz,2H);3.19(m,2H);3.71(s,3H);3.88(d,J17.4Hz,1H);3.93-4.06(m,2H);4.00(d,J17.7Hz,1H);4.38(dd,J5.4,8.4Hz,1H);5.07(s,2H);7.25-7.45(m,5H)。LC/MS(疏水的/甲酸鹽)觀察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z-908.4;對于C"H4NA3計算的908.5;觀察到的[M+冊4]+m/z-925.4;對于C"H"Ns(^計算的925.5。Rf(分鐘)-9.5。vi.HOGlyLys[Lys〗2[Boc]3[s,s-CBz]的制備將MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[s,s-CBz](500mg,0.55mmol)溶解于溶于甲醇(8ml)和水(4ml)的氫氧化鈉溶液(44mg,1.10腿ol)中。使溶液在環(huán)境溫度下攪拌4小時,并且在真空中蒸發(fā)溶劑。將殘渣溶解于水(10ml)并加入1M硫酸氫鉀(2ml)。將所得到的白色沉淀物萃取到乙酸乙酯(10ml)內(nèi),并棄去水相。乙酸乙酯相用飽和的含水氯化鈉(10ml)進行洗滌、干燥(硫酸鎂)、過濾并在真空中蒸發(fā)溶劑,以產(chǎn)生作為無定形白色固體的HOGlyLys[Lys]2[Boc]3[s,5-CBz](481mg,96%)。力薩(300MHz,CD30D)5(ppm):1.2-2.0(m,45H);3.03(t,J6.6Hz,2H);3.12(t,J6.6Hz,2H);3.19(m,2H);3.84(d,J18.0Hz,1H);3.95-4.07(m,2H);3.97(d,J17.7Hz,1H);4.39(dd,J5.4,8.4Hz,1H);5.07(s,2H);7.25-7.38(m,5H)。LC/MS(疏水的/TFA):觀察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z=894.3;對于。晶晶013計算的894.5。Rf(分鐘)-8.4。實施例37BHALys[GlyLys]2[Lys〗4[Boc]6[s,e-CBz〗2(C105H163N17O25MW2063.5)的制備該合成在圖22中示意性圖解說明。將EDCI(0.90mmol)加入至溶于二曱基甲酰胺(10ml)的HOGlyLys[Lys]2[Boc〗3[s,s-CBz](536mg,0.60,1)、BHALys[NH2.TFA]2(135mg,0.250mmol)、4,4-二甲氨基處梵(7.3mg,60畫l)和三乙胺(210ul,1.50mmol)的溶液中。溶液在環(huán)境溫度下攪拌15小時,并隨后在真空中去除揮發(fā)性組分。硅膠層析法(曱醇/二氯甲烷梯度)產(chǎn)生BHALys[GlyLys]2[Lys]4[Boc]6[s,s-CBz]2(245mg,47%)。少量樣品(20mg)用乙酸/TFA以通常方式進行處理以提供分析數(shù)據(jù)。LC/MS(Philic/TFA):觀察到的ESI(+ve)[M+H]+m/z-1463.2;對于(:75仏16^7013計算的1462.9。實施例38BHALys[Lys〗"[ct-PEG57。]"[C0CH丄6的制備將乙酸酐(1.5eq/NH2)加入至溶于DMF和TEA(3eq/NH2)的BHALys[Lys]16[oc-PEG57?!?6[NH2.TFA]16的攪拌溶液中,并允許反應攪拌過夜。將反應濃縮,并且殘渣通過尺寸排阻層析法在SephadexG-25上進行純化,用水作為洗脫劑以提供BHALys[Lys]"[a-PEG57。]6[COCH3]16。實施例39樹枝聚體的淋巴靶向大鼠經(jīng)由胸淋巴導管(使用MBoyd等人(2003)/o"r加/o尸泡擺co7,a/7(/7b;r/co/o^r#"/o&49:115-120中描述的方法)和右頸靜脈(用于輸注鹽水)進行插管。允許大鼠恢復過夜,并隨時供應食物和水。動物經(jīng)由在右足跟上方注射皮下施用5mg/kg劑量的(10mg/ml,50p1/100g體重)樹枝聚體(Lys"(PEG2。。)32、Lys"(PEG57。)32、Lys16(PEG2。。。)32或Lys16(BS)32)。Lys"(BS)32充當非PEG化的對照樹枝聚體。引流到胸淋巴導管內(nèi)的淋巴經(jīng)過30-48小時進行收集并且就氮放射性標記進行閃爍計數(shù)。這項研究的結(jié)果證實高達40。/。皮下劑量的PEG化的聚L-賴氨酸樹枝聚體可以在注射劑量的48小時內(nèi)由淋巴吸收(圖23)。這依賴于樹枝聚體的大小,其中38.5+0.7%(均值±SD,n=3)的Lys16(PEG腦)32(68kDa)在48小時中吸收到淋巴內(nèi),和28.8±6,6%的Lys16(PEG57。)32(22kDa)經(jīng)過30小時回收到淋巴內(nèi),而僅3.8%(n-1)的Lys16(PEG2。。)32(11kDa)在胸淋巴中回收。PEG化用于使樹枝聚體增加攝入淋巴內(nèi),因為僅l.7±1.5%(均值土SD,n-3)的非PEG化的苯磺酸鹽樹枝聚體(11kDa)在30小時(均值±SD,n-3)中進入淋巴內(nèi)。約0.3%劑量的Lys16(PEG57。)u和Lys"(PEG簡)32樹枝聚體在處死時在右腿彎部的結(jié)和髂骨的結(jié)中共同回收。這代表在淋巴結(jié)中回收的約2-3。/。劑量/g,其顯著高于在IV給藥后30-168小時在主要器官中一般回收的放射性標記的濃度(高達1.5。/。劑量/g組織)??傊?,顯著量的更大(>20kDa)PEG化的樹枝聚體在皮下給藥后吸收到局部淋巴管內(nèi),而少得多的量的更小(11kDa)PEG化或非PEG化的樹枝聚體在淋巴結(jié)中回收。在非PEG化的材料的情況下,這還可能反映來自注射位點減少的引流。小百分比的劑量在皮下給藥后30-48小時在局部淋巴結(jié)中回收,盡管考慮到它們的小質(zhì)量(約0.1-0.2g),但這代表在淋巴結(jié)中相對高濃度的樹枝聚體。PLL樹枝聚體的PEG化與更大的PEG基團可以進一步增加淋巴回收。這些結(jié)果突出PEG化增加藥物-樹枝聚體復合物在皮下給藥后攝入淋巴內(nèi)的潛能。實施例4050%-PEG57。封端的聚L-賴氨酸樹枝聚體的藥代動力學進行下述研究以確定1)部分表面PEG化和2)用PEG和藥物/乙?;鶊F的組合完全封閉樹枝聚體的表面如何影響在對大鼠5mg/kgIV給藥后的樹枝聚體藥代動力學。下述氚標記(G3)的樹枝聚體在這項研究中使用Lys16(NH2)32(MW4.1kDa),BHALys[3H-Lys]16[NH2〗32,在本文中也稱為未封端的樹枝聚體Lys16(PEG57。)32(MW23kDa),BHALys[3H-Lys]"[PEG"。]32,在本文中也稱為完全PEG化的樹枝聚體Lys16(PEG,)16(NH2)"(MW13.3kDa),BHALys[3H-Lys〗16[ot-PEG57。]16[s-NH2]16,在本文中也稱為半PEG化的樹枝聚體)Lys16(PEG57。)16(CH3)16(MW14kDa),BHALys[3H-Lys]16[ct-PEG57。]16[s-COCH3]16,在本文中也稱為半乙?;臉渲垠w)Lys16(PEG570)16(MTX耽胺)16'(MW22.5kDa),BHALys[3H-Lys]8[Su(NPN)2]"[PEG57。]16[ot-tBu-MTX]",在本文中也稱為MTX樹枝聚體,其中MTX是氨甲蝶呤)*氨甲蝶呤經(jīng)由穩(wěn)定的酰胺連接體與未PEG化的位點綴合。方法SD大鼠(約300g)經(jīng)由留置在右頸靜脈中的插管通過直接靜脈內(nèi)輸注經(jīng)過2分鐘施用5mg/kg劑量的氚標記的樹枝聚體(溶于1ml鹽水)。這之后,收集來自右頸動脈中(0.2ml)的留置插管的tO血液樣品用于評估CpO(在靜脈內(nèi)輸注結(jié)束時血漿中的樹枝聚體濃度)。其后在5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480、1440和1800分鐘時將血液收集到肝素化的管內(nèi)。血液樣品離心后,4吏100n1等分試樣的血漿與1-2mlStarscint在6ml閃爍管中混合,并就氚放射性進行計數(shù)。尿在樹枝聚體施用后以0-8小時,8-24小時和24-30小時的間隔進行收集。等分試樣(100ju1)的尿就氚放射性類似地進行計數(shù)。尿和血漿樣品通過尺寸排阻層析法在Superdex75SEC柱上進行分析,用50mMPBS+0.3MNaCl(pH3.5)進行洗脫。從柱中洗脫的流分以l分鐘(0.5ml)間隔進行收集,與2mlStarscint在6ml閃爍瓶中混合,并就氚放射性進行閃爍計數(shù)。關于樹枝聚體與血管或組織表面結(jié)合的潛力通過測量與作為替代物的肝勻漿的結(jié)合如下進行評估來自麻醉大鼠的肝用鹽水進行灌注以去除脈管系統(tǒng)中的大部分血液。肝隨后進行分離并在玻璃勻漿器中在l:lw/v鹽水中磨碎。大鼠用致死劑量的Lethabarb經(jīng)由心臟穿刺來殺死。肝明顯均質(zhì)化后,將約lml肝勻漿加入微量離心管中并在3500rpm下離心5分鐘。去除上清液并將另外500iul鹽水加入每個管中。每個管短暫渦旋并再次離心。這個過程確??扇苄缘鞍讖膭驖{中盡可能多地去除以使蛋白質(zhì)的量降到最低,所述蛋白質(zhì)可能潛在地與樹枝聚體結(jié)合并作為未結(jié)合的樹枝聚體計數(shù)。向每個管中加入另外500ji1鹽水,并向每個管中加入50jigLys16(PEG57。)16(CH3)16、Lys16(PEG57。)16(NH2)16或Lys8(D-lys)16。D-lys樹枝聚體用作陽離子、未封端的樹枝聚體對照,因為它不經(jīng)歷可能影響結(jié)合實驗結(jié)果的快速代謝。每個管在37r下在旋轉(zhuǎn)混合器上溫育30分鐘,這之后將管再次離心。收集上清液并就'未結(jié)合的,樹枝聚體進行分析。剩余的肝勻漿如其他地方所述進行溶解以確保剩余的樹枝聚體與肝組織結(jié)合。結(jié)果Lys16(PEG57。)16(NH2)16施用半PEG化的樹枝聚體后,血漿放射性標記經(jīng)過第一個小時的具有8.6±0.3分鐘的半衰期的快速下降(圖24B)。為了比較,完全未封端的(Lys16(NH2)32)樹枝聚體的血漿譜顯示于圖24A中。關于完全未封端的和半PEG化的樹枝聚體之間的初始血漿/分布動力學中的差異的解釋可能在組織結(jié)合數(shù)據(jù)中是顯而易見的(表13)。因此,未封端的樹枝聚體被認為與組織或脈管系統(tǒng)快速結(jié)合(使用肝勻漿作為替代物進行測試),導致從血漿中幾乎立即去除。與之對比,即使部分PEG化的材料也具有低得多的組織或血管結(jié)合活性。1小時后,血漿放射性標記中的下降明顯減慢,具有22.1±2.1小時的終末半衰期(經(jīng)過6-30小時的時間段計算)。尺寸排阻層析法(圖25A)暗示在給藥后2小時時血漿中氚標記的賴氨酸的存在,并進一步表明血漿中存在的主要種類明顯大于樹枝聚體。約1天的終末半衰期因此可能反映由釋放的氚標記的賴氨酸重新?lián)饺氘a(chǎn)生的血漿蛋白質(zhì)的清除。關于完全未封端的種類的血漿藥代動力學和SECi普暗示,在30分鐘后連續(xù)'供應,的賴氨酸可用于驅(qū)動血漿蛋白質(zhì)的合成(即在給藥后6-30小時在血漿放射性標記中沒有明顯的下降,延長的血漿i瞽在本文中未顯示)。然而,來自半PEG化的樹枝聚體的血漿藥代動力學和SEC鐠暗示,盡管可能發(fā)生類似的降解和重新?lián)饺脒^程,但它似乎經(jīng)過更短的時間段而發(fā)生,因為重新?lián)饺氘a(chǎn)物伴隨反映白蛋白周轉(zhuǎn)率(約24小時)的半衰期而清除。這個相對短暫的驅(qū)動蛋白質(zhì)生物合成的氚標記的賴氨酸供應期與觀察到的相對溫和的腎清除率一致,其中經(jīng)過30小時取樣期后,73.5±2.8%施用的與半PEG化的樹枝聚體結(jié)合的氚在尿中得到回收。這與來自Lys16(NH2)u和Lys"(PEG57。)32(分別為約5和40%)的注射的放射性標記的回收形成鮮明對比。通過SEC在尿中鑒定的種類與完整的樹枝聚體共洗脫(圖25B)。表13:在于37。C溫育30分鐘后不與肝勻漿結(jié)合的樹枝聚體的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>來自半乙?;臉渲垠w的放射性標記的初始血漿鐠類似于半PEG化的樹枝聚體的放射性標記的初始血漿i瞽(半衰期-9.3±0.42分鐘)(圖24)。然而,與半PEG化的樹枝聚體不同,半乙?;臉渲垠w的終末半衰期很短,并且與完全PEG化的種類的終末半衰期更一致(關于半乙?;臉渲垠w的13.9士0.3小時對關于完全PEG化的樹枝聚體的9.45±0.42小時)。這可能是由于與半PEG化的樹枝聚體相比,關于半乙?;臉渲垠w的較慢的核代謝速率(圖27A)。血漿SECi普顯示在t0時血漿放射性標記完全歸于完整的樹枝聚體。在給藥后2小時收集的血漿顯示出歸于完整的樹枝聚體的小峰,和在20分鐘時的寬峰(這個峰在完整的樹枝聚體前2分鐘洗脫),然而,游離賴氨酸并不明顯。如同半PEG化的樹枝聚體一樣,大多數(shù)注入的放射性標記被排泄到30小時尿中(72.3±1.2%),并且其大部分未改變地被排泄。歸于樹枝聚體代謝的產(chǎn)物的幾種小MW種類在8一24小時尿中得到鑒定(圖27B,注意關于8-24小時的不同的比例尺)。Lys16(PEG57。)16(MTX酰胺)16盡管MTX樹枝聚體的分子量類似于全PEG化的樹枝聚體,但血漿譜更緊密地模擬半乙?;臉渲垠w的譜。初始血漿半衰期為15.4土2.4分鐘,這比其他半封端的樹枝聚體略微更慢。終末清除半衰期與完全PEG化的樹枝聚體(9±0.2小時)基本上相同,可能反映終末血漿清除對總體分子量的依賴性。小于三分之一的施用劑量的氖標記的樹枝聚體經(jīng)由尿經(jīng)過30小時(29±3.4)被清除。其大部分在IV給藥后經(jīng)過前8小時被排泄。尿中排泄的MTX樹枝聚體的量比1)其他半封端的樹枝聚體和2)完全PEG化的樹枝聚體低得多(42.9+2.7%)。盡管這種少量的腎清除無法得到充分解釋,但可能是1)樹枝聚體的大尺寸在某種程度上阻礙腎清除,2)其余劑量集中于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的器官中,和3)某些樹枝聚體可能已通過與葉酸鹽結(jié)合位點相互作用由器官保留(因為MTX是關于葉酸鹽在葉酸鹽受體上的竟爭性拮抗劑)。結(jié)論1)具有50%表面用PEGs7。封端(但剩下50%表面位點不封端)的賴氨酸樹枝聚體相對快速地從血漿中被清除,并且似乎進行分解以釋放游離賴氨酸。然而,它們似乎不顯示與完全未封端的種類相同程度的血管結(jié)合。2)當與其中50%的表面胺未被封端的樹枝聚體比較時,在具有50%表面PEG化的樹枝聚體上未封端的位點的乙?;瘻p少樹枝聚體的生物降解,然而,血漿的最初清除率/分布基本上相同。3)在表面上具有50。/。PEG封端基團和50。/。MTX封端基團的賴氨酸樹枝聚體顯示出與半乙?;臉渲垠w相似的初始血漿i普。4)與類似大小的完全PEG化的樹枝聚體,或50%乙?;南到y(tǒng)基團和SO。/。MTX封端基團的賴氨酸樹枝聚體的更小比例劑量在IV施用后在尿中得到回收。這可能反映由MTX與RES中的吞噬細胞或葉酸鹽受體的相互作用引起的經(jīng)由RES增力口的攝入。參考文獻1Frechet,丄M.丄Dendrimersandotherdendriticmacromolecules:Frombuildingblockstofunctionalassembliesinnanoscienceandnanotechnology丄Polym.Sci.A.2003,41,3713-3725.2Beezer,A.E.;King,A.S.H.;Martin,I.K.;Mitchel,丄C.;Twyman,L丄;Wain,C.F.Dendrimersaspotentialdrugcarriers;encapsulationofacidichydrophobeswithinwatersolublePAMAMderivatives.Tetrahedron2003,59,3873-3880.3Kojima,C.;Kono,K.;Maruyama,K.;Takagishi,T.Synthesisofpolyamidoaminedendrimershavingpoly(ethyleneglycol)graftsandtheirabilitytoencapsulateanticancerdrugs.Bioconjug.Chem.2000,",910-917.4Tajarobi,F.;El-Sayed,M.;Rege,B.D.;Polli,丄E.;Ghandehari,H.TransportofpolyamidoaminedendrimersacrossMadin-Darbycaninekidneycells.Int.丄Pharm,2001,215,263-267.5El-Sayed,M.;Ginski,M.;Rhodes,C.;H.,G.Transepithelialtransportofpoly(amidoamine)dendrimersacrossCaco-2cellmonolayers.丄Control.Release2002,81,355-365.6Malik,N.;Wiwattanapatapee,R.;Klopsch,R.;Lorenz,K.;Frey,H.;Weener,丄W.;Meijer,E.W.;Paulus,W.;Duncan,R.Dendrimers:Relationshipbetweenstructureandbiocompatibilityinvitro,andpreliminarystudiesonthebiodistributionofl-125-labelledpolyamidoaminedendrimersinvivo.丄Control.Release2000,65,133-148.7Wiwattanapatapee,R.;Carreno-Gomez,B.;Malik,N.;Duncan,R.AnionicPAMAMdendrimersrapidlycrossadultratintestineinvitro:ApotentialoraldeliverysystemPharm.Res.2000,17、991-998.8Jevprasesphant,R.;Penny,丄;Jalal,R.;Attwood,D.;McKeown,N.B.;D'Emanuele,A.TheinfluenceofsurfacemodificationonthecytotoxicityofPAMAMdendrimers.Int.丄Pharm.2003,252,263-266.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage112</formula>17Margerum,L.D.;Campion,B.K.;Koo,M.;Sharg川,N.;Lai,丄丄;Marumoto,A.;Sontum,P.C.Gadolinium(lll)D03Amacrocyclesandpolyethyleneglycolcoupledtodendrimers-Effectofmolecularweightonphysicalandbiologicalpropertiesofmacromolecularmagneticresonanceimagingcontrastagents,丄AlloysCompounds1997,249,185-籃18McCarthy,T.D.;Karellas,P.;Henderson,SA;Giannis,M.;O'Keefe,D.F,;Heery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利要求38的藥物組合物,其中所述藥學活性劑選自氨曱蝶呤;泰素;消炎痛;zenical和環(huán)孢菌素。43.用于治療有此療法需要的患者中的腫瘤的方法,其包括給所述患者施用有效量的藥物組合物,所述藥物組合物包括具有受控的末端基團化學計量的大分子,所述大分子具有表面層和至少一個次表面層以及至少2種末端基團,所述末端基團包括其為抗腫瘤藥學活性劑的殘基;其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;選擇用于修飾所述抗胂瘤藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團;和為此的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑,其中末端基團化學計量指所迷末端基團的數(shù)目和類型。44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法,其中所述抗腫瘤藥學活性劑選自氨曱蝶呤;泰素;順鉑;卡鉑和多柔比星。45.根據(jù)權(quán)利要求43的方法,其中所述第二種末端基團是聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉。46.根據(jù)權(quán)利要求43的方法,其中所述第二種末端基團是葉酸鹽的殘基或葉酸鹽衍生物。47.用于使藥學活性劑靶向遞送給動物的淋巴系統(tǒng)的方法,其包括給所述動物施用有效量的具有受控的末端基團化學計量的大分子,所述大分子包括表面層、至少一個次表面層和至少2種末端基團,所述末端基團包括其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;選擇用于促進所述藥學活性大分子攝入所述淋巴的第二種末端基團;和為此的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑,其中末端基團化學計量指所述末端基團的數(shù)目和類型。48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法,其中所述第二種末端基團是聚乙二醇(PEG)或聚乙基噁唑啉。49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法,其中所述第二種末端基團是具有大于約1000道爾頓的平均分子量的PEG。全文摘要本發(fā)明涉及具有受控的末端基團化學計量的大分子,所述大分子包括表面層、至少一個次表面層和至少2種末端基團,所述末端基團包括其為藥學活性劑的殘基、其衍生物或為此的前體的第一種末端基團;和選擇用于修飾所述藥學活性劑和/或大分子的藥代動力學的第二種末端基團,其中末端基團化學計量指所述末端基團的數(shù)目和類型。文檔編號C08G81/00GK101420962SQ200680053811公開日2009年4月29日申請日期2006年5月15日優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日發(fā)明者B·D·凱利,B·J·伯伊德,C·J·H·波特,G·Y·克里普納,L·M·卡敏斯卡斯,P·卡爾拉斯,P·拉茲諾,S·帕利什,Z·吳申請人:星藥股份有限公司
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