專利名稱：：帶有水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬殼聚糖季銨鹽
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種帶有水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法和應(yīng)用。技術(shù)背景殼聚糖具有生物相容性好、生物黏附性強、可生物降解等優(yōu)點，且來源廣泛，可作為藥物載體和醫(yī)用輔料。但殼聚糖在生理條件下溶解性較差，pH中性條件下易發(fā)生沉淀。因此，一些殼聚糖衍生物被合成并用作殼聚糖的替代物。如羧甲基殼聚糖(R.A.A.Muzzarelli,F.Tanfani，M.Emanuellli,etal.CarbohydrateResearch,1982,107:199-214)，O-羧甲基殼聚糖(R.A.A.Muzzarelli，CarbohydratePolymer,1988,8:1-21)，殼聚糖季銨鹽(Z,Jia,D.Shen,W.Xu,CarbohydrateResearch,2001,333:1-16)等。其中，殼聚糖季銨鹽為一種已被廣泛研究的殼聚糖衍生物，全pH范圍內(nèi)，其均具有良好的溶解性，且?guī)д姾梢孜剿幬?。但殼聚糖季銨鹽陽離子性導致其可與血液或胃腸道細胞細胞膜上帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生細胞毒性(D.Fischer,etal.Biomaterials，2003,24:1121-1131)，因此，它的生物相容性受到質(zhì)疑，給藥途徑受到限制。為了克服現(xiàn)有的殼聚糖季銨鹽納米粒的不足，研究者嘗試制備了一種帶有水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒，親水聚合物修飾程度為34%，生物相容性有所提高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所需解決的技術(shù)問題之一是提供具有更高親水化合物修飾度的殼聚糖季銨鹽獲得；本發(fā)明所需解決的技術(shù)問題之二是提供一種具有更高親水化合物修飾程度的殼聚糖季銨鹽的制備方法；本發(fā)明所需解決的技術(shù)問題之三是提供具有更高親水化合物修飾度的殼聚糖季銨鹽納米粒；本發(fā)明所需解決的技術(shù)問題之四是提供一種具有更高親水化合物修飾程度的殼聚糖季銨鹽納米粒的制備方法；本發(fā)明所需解決的技術(shù)問題之五是提供一種具有更高親水化合物修飾程度的殼聚糖季銨鹽納米粒的應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺陷。本發(fā)明構(gòu)思如下殼聚糖季銨鹽是殼聚糖的衍生物，由殼聚糖和甲基丙烯酸氧乙基三甲基氯化銨反應(yīng)制備，殼聚糖的氨基被取代。親水性聚合物的活性酯在溫和條件下即可以和殼聚糖季銨鹽鏈上的剩余氨基反應(yīng)，生成共聚物。由于兩次修飾都發(fā)生在氨基上，所以通過控制原料投料比，可以得到不同季銨鹽化程度和不同親水聚合物接枝率的一系列共聚物。通過控制材料的投料比，制備得具有更高親水化合物修飾程度的殼聚糖季銨鹽納米粒子，親水聚合物修飾程度可達5090%，由不同親水聚合物修飾程度的共聚物所制得的納米粒具有不同的表面性質(zhì)，其抗溶血、抑酶等作用都與親水聚合物修飾程度成正相關(guān)。本發(fā)明提供的親水聚合物-殼聚糖季銨鹽共聚物，其結(jié)構(gòu)式如下其中m大于1的整數(shù)，n二40150的整數(shù)，自由氨基的親水聚合物修飾度為5090%。所述的親水性聚合物為聚乙二醇、聚氧乙烯、聚乙二醇-氧乙烯共聚物中的一種或一種以上的混合物。所述的親水性聚合物的分子量為2000-5000。一種親水聚合物-殼聚糖季銨鹽共聚物的制備方法如下將殼聚糖季銨鹽溶于蒸餾水中，于室溫、攪拌條件下加入親水性聚合物活性酯的二甲基亞砜溶液，兩者投料比1:41:6，w/w，反應(yīng)1024小時，純化，得共聚物水溶液。其中所述的親水性聚合物為聚乙二醇，聚氧乙烯，聚乙二醇-氧乙烯共聚物中的一種或一種以上。其中優(yōu)選聚乙二醇2000。所述的親水性聚合物活性酯為聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亞胺酯、聚乙二醇羧甲基琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亞胺酯和單甲氧基聚乙二醇羧甲基琥珀酰亞胺酯中的一種或一種以上。其中優(yōu)選單甲氧基聚乙二醇羧甲基琥珀酰亞胺酯。所述的親水性聚合物活性酯溶液的濃度為5%7.5%，w/v。如其用量低于5%，則接枝率偏低。步驟中投料比為l:4l:6(w/w)，太低則接枝率偏低，太高則親水聚合物量過量，體系中存在過多未反應(yīng)的親水聚合物。步驟中反應(yīng)時間為1024h，時間過短則反應(yīng)不完全。優(yōu)選12h-18h。一種水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒，其組成按重量百分比計親水聚合物-殼聚糖季銨鹽共聚物為85~95%，藥物為515%。所述的水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒，其直徑為200300nm。一種水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒制備方法如下-將藥物溶液加至親水聚合物-殼聚糖季銨鹽共聚物溶液中，其中藥物溶液pH高于藥物等電點，兩者投料比為8:115:1，w/w，攪拌l10min，即可生成水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒。所述的親水聚合物-殼聚糖季銨鹽共聚物，其修飾度為50%~90%。步驟中投料比為8:115:1，w/w，太低時無法生成納米粒，太高時亦無法生成納米粒。優(yōu)選投料比為10:1-12:1。步驟中攪拌時間為110min，時間過短則反應(yīng)不完全。優(yōu)選2min-5min。所述的藥物可包載至少如下的活性成分中的一種(1)蛋白質(zhì)和多肽胰島素、血紅蛋白、白蛋白、細胞色素、干擾素、抗原、抗體、紅細胞生成素、生長激素、白介素、集落刺激因子等條件生長因子等。(2)疫苗單獨或與至少一種抗原結(jié)合。(3)核酸RNA、DNA、低聚核苷酸和多核苷酸。(4)上述各種活性成分的混合物。殼聚糖季銨鹽共聚物抗溶血試驗大鼠斷頭取血，2000rpm離心10min，棄去上清液，生理鹽水洗滌沉淀。稀釋沉淀，計數(shù)得紅細胞數(shù)濃度為5.0Xl(^個/ml。取濃度為lmg/ml的聚二乙醇化殼聚糖季銨鹽共聚物溶液(pH7.4)lml與20^1紅細胞混懸液混合，37。C培養(yǎng)lh，陽性對照為Triton-X溶液。12000rpm離心30min，541nm處測定吸光值。與陽性對照比較，計算得溶血百分比。數(shù)據(jù)如表l所示表1不同聚乙二醇化修飾度的殼聚糖季銨鹽抗溶血百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與修飾度為34%的聚合物相比。經(jīng)t-Test檢驗，p值均小于0.05，表明與修飾度為34%的聚乙二醇化殼聚糖季銨鹽共聚物相比，修飾度為70%和90%的聚乙二醇化殼聚糖季銨鹽共聚物的溶血程度顯著降低。殼聚糖季銨鹽共聚物抑酶試驗稱取lg蛋白質(zhì)底物，溶于100ml0.065mol/L鹽酸溶液中。另外稱取胃蛋白酶0.02g溶于20ml0.065mol/L鹽酸溶液中。量取不同修飾度的聚乙二醇化殼聚糖季銨鹽共聚物溶液各2ml，與2ml酶溶液混合，室溫培養(yǎng)10min后，各取1ml置于37'C水浴中保溫5min。各管加入5ml底物溶液，搖勻，計時，37匸水浴中保溫10min后，加入5ml5%三氯乙酸溶液，搖勻，終止反應(yīng)。待沉淀完全后，過濾，取濾液于275nm處測定吸光度。每個樣品重復三次試驗。計算抑酶率。數(shù)據(jù)如表2所示表2不同聚乙二醇化修飾度的殼聚糖季銨鹽胃蛋白酶抑制率共聚物1234親水聚合物修飾度(％)40507090酶抑制率(％)17.535.651,163.5P值a<0.01<0.01<0.01與修飾度為40%的聚合物相比。經(jīng)t-Test檢驗，；？值均小于0.01，表明與修飾度為40%的聚乙二醇化殼聚糖季銨鹽共聚物相比，修飾度為50%、70%和卯％的聚乙二醇化殼聚糖季銨鹽共聚物的抑酶率極顯著提咼。本發(fā)明的有益效果如下(1)本發(fā)明的納米粒，具有更高的親水聚合物修飾度，可達5090%。經(jīng)過具有柔韌性和親水性的高分子的修飾，可在納米粒表面形成更為致密的親水包衣，更好地屏蔽殼聚糖季銨鹽的電荷，提高聚合物的生物相容性。(2)本發(fā)明的納米粒，更為致密的親水包衣具有空間位阻效應(yīng)，口服可以有效地抑制酶類降解藥物。(3)本發(fā)明的納米粒粒徑較小，具有靶向性，可提高胞內(nèi)藥物濃度減輕藥物的不良反應(yīng)。(4)本發(fā)明中親水聚合物包衣納米粒，作用于血液，可以減少紅細胞破裂溶血，減少血液內(nèi)調(diào)理蛋白的吸附，降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取，提高藥物的生物利用度。(5)本發(fā)明在制備過程中未引入有機試劑，且無須高能量，利于保持藥物的生物活性，同時，制備方法工藝安全，簡單有效，符合環(huán)保要求，可通過調(diào)整投料比得到不同屬性的納米粒，適用性廣泛。圖l納米粒透射電鏡圖。其中A實施例15:納米粒聚乙二醇修飾度為90%;B實施例13:納米粒聚乙二醇修飾度為50%。具體實施方式通過下面的具體實施例可進一步了解本發(fā)明。但它們不是對本發(fā)明的限定。實施例1:將殼聚糖季銨鹽水溶液與單甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液于室溫混合，投料比為1:4，攪拌24小時，純化，得修飾度為50%的殼聚糖季銨鹽水溶液。對胃蛋白酶的抑制率達到35.6%。實施例2:將殼聚糖季銨鹽水溶液與單甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液于室溫混合，投料比為1:5，攪拌24小時，純化，得修飾度為70%的殼聚糖季銨鹽水溶液。對胃蛋白酶的抑制率達到51.1%。實施例3:將殼聚糖季銨鹽水溶液與單甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液于室溫混合，投料比為1:6，攪拌24小時，純化，得修飾度為90%的殼聚糖季銨鹽水溶液。對胃蛋白酶的抑制率達到63.5%。實施例4:將殼聚糖季銨鹽水溶液與單甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液于室溫混合，投料比為1:6，攪拌10小時，純化，得修飾度為85%的殼聚糖季銨鹽水溶液。實施例5:將殼聚糖季銨鹽水溶液與單甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液于室溫混合，投料比為1:6，攪拌12小時，純化，得修飾度為88%的殼聚糖季銨鹽水溶液。實施例6:將殼聚糖季銨鹽水溶液與單甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液于室溫混合，投料比為1:6，攪拌18小時，純化，得修飾度為89%的殼聚糖季銨鹽水溶液。實施例7:將殼聚糖季銨鹽水溶液與聚氧乙烯-聚乙二醇羧甲基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液于室溫混合，投料比為1:6，攪拌18小時，純化，得修飾度為80%的殼聚糖季銨鹽水溶液。實施例8:將殼聚糖季銨鹽水溶液與單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液于室溫混合，投料比為1:6，攪拌18小時，純化，得修飾度為85%的殼聚糖季銨鹽水溶液。實施例9:量取實施例1中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml,與1mg/ml的胰島素溶液按8:1混合，攪拌10分鐘后即可生成納米粒，包封率為80%。實施例10:量取實施例1中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml,與1mg/ml的胰島素溶液按10:1混合，攪拌10分鐘后即可生成納米粒，包封率為88%。實施例11:量取實施例1中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml,與1mg/ml的胰島素溶液按15:1混合，攪拌10分鐘后即可生成納米粒，包封率為90%。實施例12:量取實施例1中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml,與1mg/ml的胰島素溶液按15:1混合，攪拌1分鐘后即可生成納米粒，包封率為85%。實施例13:量取實施例1中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml,與1mg/ml的胰島素溶液按15:1混合，攪拌5分鐘后即可生成納米粒，包封率為89%。實施例14:量取實施例2中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml，與1mg/ml的胰島素溶液按10:1混合，攪拌2分鐘后即可生成納米粒，包封率為68%。實施例15:量取實施例3中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml,與1mg/ml的胰島素溶液按10:1混合，攪拌5分鐘后即可生成納米粒子，包封率為59%。實施例16:量取實施例1中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml,與1mg/ml的牛血清白蛋白溶液按15:1混合，攪拌5分鐘后即可生成納米粒，包封率為82%。實施例17:量取實施例2中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml,與1mg/ml的牛血清白蛋白溶液按15:1混合，攪拌5分鐘后即可生成納米粒，包封率為66%。實施例18:量取實施例1中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml,與0.5mg/ml的DNA溶液按10:1混合，攪拌5分鐘后即可生成納米粒，包封率為81%。實施例19:量取實施例1中共聚物溶液1ml,用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋到2ml,與0.5mg/ml的DNA溶液按15:1混合，攪拌5分鐘后即可生成納米粒，包封率為89%。權(quán)利要求1、一種親水聚合物-殼聚糖季銨鹽共聚物，其特征在于結(jié)構(gòu)式如下其中m大于1，n＝40～150，自由氨基的親水聚合物修飾度為50～90％；所述的親水性聚合物為聚乙二醇、聚氧乙烯、聚乙二醇-氧乙烯共聚物中的一種或一種以上。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的共聚物，其特征在于所述的親水性聚合物的分子量為2000-5000。3、一種如權(quán)利要求1所述的親水聚合物-殼聚糖季銨鹽共聚物的制備方法，其特征在于具體步驟如下將殼聚糖季銨鹽溶于蒸餾水中，于室溫攪拌條件下加入親水性聚合物活性酯的二甲基亞砜溶液，兩者投料比1:41:6，w/w，反應(yīng)1024小時，純化，得共聚物水溶液；其中，所述的親水性聚合物為聚乙二醇，聚氧乙烯，聚乙二醇-氧乙烯共聚物中的一種或一種以上。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的共聚物的制備方法，其特征在于所述的親水性聚合物活性酯為聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亞胺酯、聚乙二醇羧甲基琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亞胺酯和單甲氧基聚乙二醇羧甲基琥珀酰亞胺酯中的一種或一種以上。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的共聚物的制備方法，其特征在于所述的親水性聚合物活性酯溶液濃度為5%7.5%，w/v。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的共聚物的制備方法，其特征在于反應(yīng)時間為12h-18h。7、一種水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒，其特征在于組成為按重量百分比計，親水聚合物-殼聚糖季銨鹽共聚物為8595%，藥物為515%，粒徑為200300nm。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒，其特征在于所述藥物包載至少如下活性成分中的一種(1)蛋白質(zhì)和多肽胰島素、血紅蛋白、白蛋白、細胞色素、干擾素、抗原、抗體、紅細胞生成素、生長激素、白介素或集落刺激因子；(2)疫苗單獨或與至少一種抗原結(jié)合；(3)核酸RNA、DNA、低聚核苷酸或多核苷酸。9、一種如權(quán)利要求7或8所述的水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒的制備方法，其特征在于具體步驟如下將藥物溶液加至親水聚合物-殼聚糖季銨鹽共聚物溶液中，其中藥物溶液pH高于藥物等電點，兩者投料比為8:115:1，w/w，攪拌l10min，即可生成水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒。全文摘要本發(fā)明公開了一種水化層包衣的殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法。本發(fā)明的納米粒由殼聚糖季銨鹽與帶電荷的藥物通過靜電作用生成，同時，共價連接在季銨鹽上的親水性聚合物在粒子表面形成水化層包衣。其按如下步驟制備將親水性聚合物活化后，與殼聚糖季銨鹽溶液共價結(jié)合形成共聚物，純化后再加入帶負電荷的藥物溶液，即得納米粒。親水性聚合物修飾度可達到90％，自然分布于離子表面而形成包衣結(jié)構(gòu)。其可用作藥物載體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該納米粒具有更好的生物穩(wěn)定性、生物相容性及長循環(huán)特性。該制備工藝過程簡單、易控、無需使用有毒試劑。文檔編號C08J3/12GK101130575SQ200710044250公開日2008年2月27日申請日期2007年7月26日優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日發(fā)明者印春華,朱司宇,鋒錢申請人:復旦大學