專利名稱：：鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其中包含聚乙二醇部分以及兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的羧酸基團(tuán)與鬼臼毒素類的羥基通過酯鍵而結(jié)合，本發(fā)明還涉及所述鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鬼臼毒素是一種包含在美國盾葉鬼臼的根和莖的水提取物中的具有生理活性的物質(zhì)，所述美國盾葉鬼臼是鬼臼屬的一種多年生植物，已知鬼臼毒素及其衍生物具有抗癌活性。但是，這些化合物當(dāng)中的許多水溶性差，因此為了進(jìn)一步改進(jìn)其效果，對鬼臼毒素類的水溶性高分子量衍生物等進(jìn)行了研究。例如，專利文獻(xiàn)1描述了與聚乙二醇結(jié)合的鬼臼毒素類的高分子量衍生物。但是，在這些鬼臼毒素類的高分子量衍生物中，因為鬼臼毒素的結(jié)構(gòu)，每個聚乙二醇分子僅與一個到兩個鬼臼毒素分子相結(jié)合，因此為了給予有效量的藥物，需要大量的聚合物。專利文獻(xiàn)2描述了一種分子，其中藥物與聚乙二醇和聚天冬氨酸的嵌段共聚物結(jié)合，所述嵌段共聚物形成膠束，具有水溶性。專利文獻(xiàn)3描述了一種聚合物載體，其中疏水性物質(zhì)與聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物的側(cè)鏈中的羧酸基團(tuán)結(jié)合，所述嵌段共聚物起聚合物藥物載體的作用。專利文獻(xiàn)4描述了喜樹堿的高分子量衍生物，其中聚乙二醇和聚谷氨酸的嵌段共聚物的側(cè)鏈中的羧酸基團(tuán)與喜樹堿的酚羥基相結(jié)合。但是專利文獻(xiàn)2-4沒有描述鬼臼毒素類的結(jié)合體。日本專利申請公開(KOHYO)第10-513187號[專利文獻(xiàn)2]日本專利第2694923號[專利文獻(xiàn)3]日本專利第3268913號4[專利文獻(xiàn)4]國際專利申請公開第WO2004/39869號，小冊子
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問題。專利文獻(xiàn)1中所述聚乙二醇部分和藥物之間的鍵可被體內(nèi)的水解酶斷裂開，由此可以對藥物的遞送和釋放進(jìn)行控制。但是，人們認(rèn)為，不同物種之間，以及在相同物種的個體之間體內(nèi)的水解酶會發(fā)生很大的變化。因此，人們存在一種擔(dān)心，即當(dāng)與藥物連接的鍵的斷裂取決于水解酶的時候，不同個體之間釋放的藥物的效果可能會有很大的不同。對于專利文獻(xiàn)2中所述的阿霉素結(jié)合體，其中嵌段共聚物通過酰胺鍵與阿霉素結(jié)合，其功效很成問題，因為酰胺鍵是化學(xué)穩(wěn)定的鍵合形式，所以通過水解的藥物釋放相當(dāng)緩慢。依托泊苷和鬼臼噻吩苷之類的鬼臼毒素類是有效的抗癌藥，因此人們需要水溶性和具有極佳的抗癌活性的新穎的衍生物。解決問題的方法為了解決上述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了深入而細(xì)致的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以下現(xiàn)象，當(dāng)包含羥基的化合物通過酯鍵與琥珀酸單酰胺的游離羧酸結(jié)合的時候，由于所述琥珀酸單酰胺的結(jié)構(gòu)改變?yōu)榄h(huán)狀結(jié)構(gòu)(琥珀酸酰亞胺)，所述包含羥基的化合物可以很容易地釋放?；谶@一點，本發(fā)明人制備了鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其中包含聚乙二醇部分和琥珀酸單酰胺部分的聚合物能夠與鬼臼毒素類的羥基通過酯鍵而結(jié)合，還發(fā)現(xiàn)如此制得的高分子量結(jié)合體能夠在無需依賴水解酶的情況下釋放鬼臼毒素類，從而完成了本發(fā)明。具體來說，本發(fā)明涉及以下(1)至(10)項。(1)一種鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其中包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的羧酸基團(tuán)與所述鬼臼毒素的羥基通過酯鍵而結(jié)合。(2)如上面(1)所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其中所述包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺的聚合物是嵌段共聚物。(3)如上面(2)所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其中所述兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分構(gòu)成聚天冬氨酸。(4)如上面(3)所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其由式(I)表示C02R4R1-04CH2CH20>t-R2-[(NHCOCH>d.(NHCOCH2CH>,-(NHCOCH)f-CH2C02R4CH2COR5COR5C02HII"(NHCOCH2CH》g"(NHCOCH)h，COCH2CH)i-(NCOCH,il-NHR3II/CH2C02HCOCH2{I>其中Rl表示氫原子或(C1-C6)垸基；R2表示連接基團(tuán)；R3表示氫原子或(Cl-C6)?；?；R4表示鬼臼毒素類的羥基的殘基；R5表示選自以下的基團(tuán)(C1-C30)垸氧基,(C7-C30)芳垸氧基，(Cl-C30)垸基氨基，二(C1-C30)垸基氨基,以及帶有保護(hù)的羧基的氨基酸，以及-N(R6)CONH(R7)，其中R6和R7可以是相同或不同的，它們各自表示任選地被叔氨基取代的(C3-C6)環(huán)烷基或(Cl-C5)烷基;t表示5-11，500的整數(shù)；d,e,f，g,h，i和j各自獨立地表示0-200的整數(shù)，前提是d+e表示1-200的整數(shù)，d+e+f+g+h+i+j表示3-200的整數(shù)，相應(yīng)的聚天冬氨酸的組成單元以任意的順序結(jié)合。(5)如上面(4)所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其中Rl是(C1-C6)烷基；R2是(C2-C6)亞垸基；R3是(C1-C6)?；?；t是8-2300的整數(shù)；d，e，f,g，h,i和j各自獨立地是0-100的整數(shù)，前提是d+e是1-100的整數(shù)，d+e+f+g+h+i+j是6-100的整數(shù)。(6)如上面(5)所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其中Rl是(C1-C3)垸基；R2是(C2-C4)亞垸基；R3是(C1-C3)?；?；t是100-300的整數(shù)；d，e，f，g，h,i和j各自獨立地是0-90的整數(shù)，前提是d+e是1-90的整數(shù)，d+e+f+g+h+i+j是15-90的整數(shù)。(7)如上面(l)-(6)中任一項所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其中所述鬼臼毒素類是鬼臼毒素、依托泊苷或鬼臼噻吩苷。(8)—種鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其通過在有機(jī)溶劑中使用脫水縮合劑，使包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的羧酸基團(tuán)與所述鬼臼毒素的羥基通過酯鍵結(jié)合而制得。(9)一種制備以上(1)至(7)中任一項所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體的方法，該方法包括在有機(jī)溶劑中使用脫水縮合劑，使包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的羧酸基團(tuán)與所述鬼臼毒素的羥基通過酯鍵而結(jié)合。(10)—種抗癌藥，包含上面(1)至(8)中任一項所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體作為活性組分。發(fā)明的效果本發(fā)明的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體能夠在無需依賴體內(nèi)的水解酶的情況下釋放藥物，幾乎不會受到個體差異的影響，可預(yù)期具有高的療效。具體實施例方式本發(fā)明的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體的特征是，包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的羧酸基團(tuán)與所述鬼臼毒素類的羥基通過酯鍵而結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"琥珀酸單酰胺部分"表示以下結(jié)構(gòu)-HNCO-C-C-C02H，例如其例子包括琥珀酸單酰胺(-HNCO-CHrCH2-C02H),天冬氨酸內(nèi)的兩個羧酸基團(tuán)中的一個酰胺化的結(jié)構(gòu)(-HNCO-CH(-NH-)-CH2-C02Hor-HNCO-CH2-CH(-NH-)-C02H),等等。這些琥珀酸單酰胺部分可以構(gòu)成聚合物主鏈，例如對于聚天冬氨酸就是這種情況，或者可以與由以下物質(zhì)組成的主鏈聚合物的官能團(tuán)結(jié)合聚醇，例如葡聚糖，聚胺，例如聚賴氨酸，或者除了聚天冬氨酸以外的聚羧酸(例如聚乳酸等)。包含聚乙二醇部分以及兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的例子包括接枝型聚合物，其中聚乙二醇部分和琥珀單酰胺部分以梳狀形式從聚合物主鏈分支出來，還包括嵌段型聚合物(嵌段共聚物)，其中包含聚乙二醇部分和琥珀酸單酰胺部分的聚合物串聯(lián)排列，等等。當(dāng)所述兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分形成聚天冬氨酸的時候，所述接枝型聚合物還包括具有以下特征的聚合物其中聚乙二醇部分是部分地與所述聚天冬氨酸主鏈結(jié)合，等等；而嵌段類聚合物包括具有以下特征的聚合物其中聚天冬氨酸的末端與所述聚乙二醇部分的末端結(jié)合，等等。本發(fā)明的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體的聚合物中的聚乙二醇部分包括兩個末端或者一個末端被改性的聚乙二醇。當(dāng)兩個末端都被改性的時候，所述改性基團(tuán)可以是相同的或不同的。改性基團(tuán)的例子包括任選包含取代基的(Cl-C6)烷基。任選包含取代基的(C1-C6)烷基中烷基的例子包括以下的烷基，優(yōu)選是(C1-C4)烷基，包括例如甲基、乙基、正丙基、正丁基等。任選包含取代基的(C1-C6)垸基中取代基的例子包括例如氨基、甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基等。所述聚乙二醇部分的分子量約為300-500,000,優(yōu)選約為500-100,000，更優(yōu)選約為1000-50,000。根據(jù)本發(fā)明包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的分子量約為500-600,000,優(yōu)選約為600-110,000,更優(yōu)選約為800-80,000。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"分子量"表示通過GPC法測定的重均分子量。在本發(fā)明的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體中，以羧酸基團(tuán)的總數(shù)為基準(zhǔn)計，與所述包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物結(jié)合的鬼臼毒素類的量為1-100%，優(yōu)選為1-90%,更優(yōu)選為2-60%。根據(jù)本發(fā)明，所述鬼臼毒素類并無特別限制，只要它們是具有羥基和抗腫瘤活性的鬼臼毒素類即可。鬼臼毒素類的例子包括以下式(n)表示的鬼臼毒素，以下式(III)表示的依托泊苷，以下式(IV)表示的鬼臼噻吩苷等。鬼臼毒素類的羥基的例子包括例如以下式(n)所示的醇羥基，糖部分上的醇羥基或者下式(in)或(iv)的苯環(huán)上的酚羥基，對羥基的取代位置沒有限制。本發(fā)明的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體可包括通過鬼臼毒素類的醇羥基形成的結(jié)合體，或者通過鬼臼毒素類的酚羥基形成的結(jié)合體，或者它們的混合物。或者還可采用一種高分子量結(jié)合體，其中通過酚羥基結(jié)合的鬼臼毒素類以及通過酚酸性基團(tuán)結(jié)合的鬼臼毒素類還可在一個分子上混合。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>優(yōu)選聚天冬氨酸作為根據(jù)本發(fā)明的兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分。本發(fā)明優(yōu)選的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體包括上面通式(l)表示的化合物，其中Rl表示氫原子或(C1-C6)垸基；R2表示連接基團(tuán)；R3表示氫原子或毒素類的羥基的殘基；R5表示選自以下的基團(tuán)(C1-C30)烷氧基,(C7-C30)芳烷氧基，(Cl-C30)烷基氨基，二(C1-C30)烷基氨基,以及帶有保護(hù)的羧基的氨基酸，以及-N(R6)CONH(R7)，其中R6和R7可以是相同或不同的，它們各自表示任選地被叔氨基取代的(C3-C6)環(huán)烷基或(C1-C5)烷基；t表示5-11,500的整數(shù)；d，e,f，g，h，i和j各自獨立地表示0-200的整數(shù)，前提是d+e表示1-200的整數(shù)，d+e+f+g+h+i+j表示3-200的整數(shù)，相應(yīng)的聚天冬氨酸的組成單元以任意的順序結(jié)合。所述通式(l)中Rl的(C1-C6)烷基的例子包括直鏈或支鏈的(C1-C6)烷基，包括例如甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，叔丁基，正戊基，異戊基，正己基等，優(yōu)選的是直鏈或支鏈的(C1-C4)烷基，特別優(yōu)選的是直鏈或支鏈的(C1-C3)垸基，包括例如甲基，乙基，正丙基，異丙基，更特別優(yōu)選的是甲基。通式(I)中R2表示的連接基團(tuán)的例子包括但不特別限于(C2-C6)亞烷基。優(yōu)選的是(C2-C4)亞烷基，包括例如亞乙基，1,3-亞丙基，亞丁基等，特別優(yōu)選的是1,3-亞丙基。通式(I)中R3的(C1-C6)?；睦影ǖ惶貏e限于甲?；?，乙?；?丙?；?，新戊酰基等。優(yōu)選的是(C1-C3)酰基，特別優(yōu)選的是乙酰基。對于通式(I)中R4的鬼臼毒素類的羥基的殘基，鬼臼毒素類的例子包括上述鬼臼毒素類，它們沒有特別的限制，只要所述鬼臼毒素類包括能夠使用脫水縮合劑通過酯鍵與聚合物的羧酸部分結(jié)合的羥基，而且具有抗腫瘤活性即可。鬼臼毒素類的例子包括上面式(n)表示的鬼臼毒素，上面式(m)表示的依托泊苷，上面式(IV)表示的鬼臼噻吩苷等。通式(I)中的R5表示選自以下的基團(tuán)(Cl-C30)垸氧基，(C7-C30)芳垸氧基，(Cl-C30)垸基氨基，二(C1-C30)烷基氨基，帶有保護(hù)的羧酸的氨基酸，以及-N(R6)CONH(R7)，其中R6和R7可以是相同或不同的，是任選地被叔氨基取代的(C3-C6)環(huán)垸基或者(C1-C5)烷基。通式(I)中的R5在一個分子中可以是相同或不同的，所述鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體中的聚合物可以包括單獨種類或混合種類的R5。(C1-C30)垸氧基的例子包括直鏈或支鏈的(C1-C30)垸氧基，優(yōu)選的是10直鏈或支鏈的(C1-C10)垸氧基，包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基等。(C7-C30)芳烷氧基的例子包括直鏈或支鏈的(C7-C12)芳烷氧基，優(yōu)選的是直鏈或支鏈的(C1-C10)芳烷氧基，包括例如4-苯基丁氧基等。(C1-C30)垸基氨基或二(C1-C30)烷基氨基的例子包括直鏈或支鏈的(C1-C30)垸基氨基或二(C1-C30)垸基氨基，優(yōu)選是直鏈或支鏈的(C1-C20)烷基氨基或二(C1-C20)氨基氨基，包括例如甲基氨基，乙基氨基，正丙基氨基,異丙基氨基，正丁基氨基，叔丁基氨基，二甲基氨基，二乙基氨基，二(正丁基)氨基等。帶有保護(hù)的羧基的氨基酸的例子包括通常用于肽合成的其中羧基被保護(hù)的氨基酸，包括例如苯基丙氨酸芐酯等。基團(tuán)-N(R6)CONH(R7)[其中R6和R7可以是相同或不同的，為任選地被叔氨基取代的(C3-C6)環(huán)垸基或(C1-C5)垸基]包括但不特別限于，例如環(huán)己基氨基羰基環(huán)己基氨基，異丙基氨基羰基異丙基氨基等。本發(fā)明的通式(I)表示的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體中兩個或更多個琥珀酸單酰胺組成的聚天冬氨酸包括a-氨基酸類、(3-氨基酸類、環(huán)狀種類的組成單元等。這些組成單元以任意的順序結(jié)合，可以結(jié)合形成嵌段型或無規(guī)型的形式。通式(I)表示的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體的聚天冬氨酸中天冬氨酸殘基的總數(shù)用"d+e+f+g+h+i+j"表示，可以通過例如用來制備嵌段共聚物的天冬氨酸衍生物的量確定。天冬氨酸殘基的數(shù)量(d+e+f+g+h+i+j)約為3-200,優(yōu)選約為6-100,特別優(yōu)選為15-90。以天冬氨酸殘基的總數(shù)(d+e+f+g+h+i+j)為基準(zhǔn)計，與鬼臼毒素類結(jié)合的天冬氨酸殘基的數(shù)量(d+e)所占的比例為1-100%，優(yōu)選為3-90%,更優(yōu)選為4-60%。另外，天冬氨酸殘基的數(shù)量(d+e)約為1-200,優(yōu)選約為1-100,特別優(yōu)選為1-90。與鬼臼毒素類結(jié)合的天冬氨酸殘基的數(shù)量(d+e)可以通過例如下面實施例中所述，在有機(jī)溶劑中，進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，通過酯鍵連接鬼臼毒素類之后，反應(yīng)液體中剩余的未反應(yīng)的鬼臼毒素類的量來確定。以天冬氨酸殘基的總數(shù)(d+e+f+g+h+i+j)為基準(zhǔn)計，oc-氨基酸類的比例(d+f+h)為10-100%,優(yōu)選為20-100%。p-氨基酸類(e+g+i)的比例為0-90%,優(yōu)選為0-80%。例如可通過適當(dāng)?shù)剡x擇聚天冬氨酸等中保護(hù)基團(tuán)的去保護(hù)條件適當(dāng)?shù)馗淖兯霰壤?。在通?I)中，t是約為5-11,500的整數(shù)，優(yōu)選約為8-2,300的整數(shù)，更優(yōu)選約為100-300的整數(shù)。本發(fā)明的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體可形成具有聚乙二醇部分的膠束作為處于水中的外殼。本發(fā)明的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體通過在有機(jī)溶劑中使用脫水縮合劑使包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的羧酸基團(tuán)與鬼臼毒素的羥基通過酯鍵結(jié)合而制得，本發(fā)明還包括該制備方法；也就是說，例如在0-180。C、優(yōu)選5-5(TC的溫度下，在有機(jī)溶劑中，使用脫水縮合劑，使通過專利文獻(xiàn)2所述的方法制備的聚乙二醇部分-聚天冬氨酸的嵌段共聚物,和鬼臼毒素類發(fā)生反應(yīng)，所述鬼臼毒素類中除了要反應(yīng)的基團(tuán)以外的官能團(tuán)根據(jù)需要進(jìn)行保護(hù)，所述脫水縮合劑包括例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC),二異丙基碳二亞胺(DIPC),鹽酸l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(WSC)或者1-乙氧基羰基-2-乙氧基-l，2-二羥基喹啉酮(quinolinone)(EEDQ),所述有機(jī)溶劑能夠溶解上述兩種反應(yīng)物質(zhì)，優(yōu)選是非質(zhì)子極性溶劑，例如N，N-二甲基甲酰胺(DMF),1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)或者N-甲基吡咯烷酮(NMP)。另夕卜，在縮合反應(yīng)中還可以使用反應(yīng)助劑，例如N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)?？s合反應(yīng)之后，根據(jù)需要進(jìn)行去保護(hù)，可以采用常規(guī)的分離和純化等操作，以制得鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體。另夕卜，其中R5是-N(R6)CONH(R7)基團(tuán)(其中R6和R7可以是相同或不同的，各自是任選地被叔氨基取代的(C3-C6)環(huán)烷基或(C1-C5)垸基)的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體還可通過使用上述碳二亞胺類作為縮合劑的反應(yīng)制得。作為用來將(C1-C30)烷氧基、(C7-C30)芳垸氧基、(Cl-C30)垸基氨基、二(Cl-C30)烷基氨基或者帶有保護(hù)的羧基的氨基酸作為R5引入通式(I)的化合物中的方法，可提及首先對聚合物的羧酸基團(tuán)進(jìn)行活化，然后在堿性條件下，與一定量的需要加入的相應(yīng)的醇、相應(yīng)的胺、或者帶有保護(hù)的羧基的氨基酸等進(jìn)行反應(yīng)的方法；首先使得相應(yīng)的醇、相應(yīng)的胺、帶有保護(hù)的羧基的氨基酸等活化，然后與聚合物反應(yīng)的方法；等等。在對聚合物進(jìn)行純化之后，可以通過相同的反應(yīng)對聚合物中任意未反應(yīng)的羧酸基團(tuán)進(jìn)行再活化，所述再活化的羧酸基團(tuán)可以與鬼臼毒素類的羥基縮合?；蛘撸渌拇?、胺等可以重復(fù)地反應(yīng)，以合成包含各種取代基作為R5的聚合物的混合物，然后鬼臼毒素類可以與該混合物縮合。另外，在使聚合物與鬼臼毒素類縮合之后，可以引入(C1-C30)烷氧基、(C7-C30)芳垸氧基(Cl-C30)垸基氨基，二(C1-C30)烷基氨基帶有保護(hù)的羧基的氨基酸等。用來制備本發(fā)明的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體的方法不限于上述方法。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體作為活性組分的抗癌藥。所述高分子量結(jié)合體可以常用的劑型使用，包括例如注射劑、片劑、粉末等。在配制的過程中，可以使用藥學(xué)上可接受的常用載體，例如粘合劑、潤滑劑、崩解劑、溶劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、防腐劑、安慰劑、著色劑、香料等。其中優(yōu)選以注射劑的形式使用，通?？梢允褂美缢?、生理鹽水、5%的葡萄糖或甘露醇溶液，水溶性有機(jī)溶劑(例如甘油、乙醇、二甲亞砜、N-甲基吡咯垸酮、聚乙二醇、克列莫佛(cremophor)等，以及它們的混合物)，水和水溶性有機(jī)溶劑的混合物等。當(dāng)然，本發(fā)明的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體的劑量可以根據(jù)患者的性別、年齡、生理條件、病理等因素變化，所述高分子量結(jié)合體胃腸道外給藥，通常對于成年人每天的劑量(按活性組分)為0.01-500毫克/米2,優(yōu)選0.1-250毫克/米2。注射給藥通過靜脈注射、動脈注射、作用位點(腫瘤位點)注射等進(jìn)行。實施例下面，將結(jié)合實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1化合物l(依托泊苷和嵌段共聚物的結(jié)合體，所述嵌段共聚物是分子量為12000的甲氧基聚乙二醇部分以及聚合度為35的聚天冬氨酸部分的嵌段共聚物通式(I)，其中Rl-Me(甲基)，R2-l,3-亞丙基R3-酰基(乙?；?,R4-依托泊苷殘基尺5=異丙基氨基羰基異丙基氨基,d+e+f+g+h+i+j=35,t-273)的合成將根據(jù)專利文獻(xiàn)3所述方法制備的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(天冬氨酸的聚合度35,1.80克)以及市售的依托泊苷(700毫克)溶解在DMF(70毫升)中，向其中加入DMAP(72毫克)和DIPC(1.25毫升)。所述混合物在25°<3下攪拌20小時。向反應(yīng)液體中加入乙醇(105毫升)、乙酸乙酯(105毫升)和二異丙醚(840毫升)，該混合物在室溫下攪拌120分鐘。然后通過過濾收集沉淀，用乙醇/二異丙醚(1/4(v/v)，100毫升)洗滌。所得的沉淀溶解在乙腈/水(1/1(v/v),210毫升)中，然后使得溶液通過離子交換樹脂柱(陶氏化學(xué)公司(DowChemicalCompany)制造，Dowex50(H+)，15毫升)，用乙腈/水(1/1(v/v),30毫升)洗脫。將水(140毫升)加入由此制得的洗脫級分中，減壓蒸餾掉乙腈，然后對殘余物進(jìn)行冷凍干燥，制得化合物1(2.06克)。根據(jù)通過HPLC(高效液相色譜)測得的反應(yīng)液中未反應(yīng)的依托泊苷的量,確定化合物1中依托泊苷的含量為16.5%(w/w),確定(d+e)與(d+e+f+g+h+i+j)之比為15%。在化合物1中，未柃測到游離的依托泊苷。根據(jù)該方法，異丙基氨基羰基-異丙基氨基可以作為R5加入，基團(tuán)的豐度比使用溶解在氘氧化鈉(sodiumdeuteroxide)/氧化氘/氘代乙腈的化合物1通過iH-NMR(氫核磁共振譜)測定?；衔?的異丙基氨基羰基-異丙基氨基與聚天冬氨酸之比，即(f+g)與(d+e+f+g+h+i+j)之比為19.6%。剩余的天冬氨酸殘基為游離羧酸(h+i)或環(huán)狀結(jié)構(gòu)(j)的形式。實施例2化合物2(鬼臼毒素和嵌段共聚物的結(jié)合體，所述嵌段共聚物是分子量為12000的甲氧基聚乙二醇部分以及聚合度為35的聚天冬氨酸部分的嵌段共聚物通式(I)，其中Rl-Me(甲基),R24,3-亞丙基R3:酰基(乙?；?，R4:鬼臼毒素殘基，115=異丙基氨基羰基異丙基氨基,d+e+f+g+h+i+j=35,1=273)的合成將根據(jù)專利文獻(xiàn)3所述方法制備的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(天冬氨酸的聚合度35,226毫克)以及市售的鬼臼毒素(106毫克)溶解在DMF(5毫升)中，向其中加入DMAP(12毫克)和DIPC(0.16毫升)。所述混合物在25。C下攪拌20小時。向反應(yīng)液體中加入乙醇(15毫升)和二異丙醚(60毫升)，該混合物在室溫下攪拌120分鐘。然后通過過濾收集沉淀，用乙醇/二異丙醚(l/4(v/v),10毫升)洗滌。所得的沉淀溶解在乙腈/水(1/1(v/v),IO毫升)中,14然后使得溶液通過離子交換樹脂柱(陶氏化學(xué)公司(DowChemicalCompany)制造，Dowex50(H+)，2.5ml),用乙腈/水(1/1(v/v)，5毫升)洗脫。將水(IO毫升)加入由此制得的洗脫級分，然后減壓蒸餾掉乙腈。然后對殘余物冷凍干燥，制得化合物2(220毫克)。根據(jù)通過HPLC(高效液相色譜)測得的反應(yīng)液中未反應(yīng)的鬼臼毒素的量，確定化合物2中鬼臼毒素的含量為10.6%(wAv),確定(d+e)與(d+e+f+g+h+i+j)之比為13.1%。在化合物2中，未檢測到游離的鬼臼毒素。根據(jù)該方法，異丙基氨基羰基-異丙基氨基可以作為R5加入，基團(tuán)的豐度比使用溶解在氘氧化鈉(sodiumdeuteroxide)/氧化氘/氘代乙腈的化合物2通過iH-NMR(氫核磁共振譜)測定?；衔?的異丙基氨基羰基-異丙基氨基與聚天冬氨酸之比，即(f+g)與(d+e+f+g+h+i+j)之比為15.2%。剩余的天冬氨酸殘基為游離羧酸(h+i)或環(huán)狀結(jié)構(gòu)(j)的形式。實施例3化合物3(鬼臼毒素和嵌段共聚物的結(jié)合體，所述嵌段共聚物是分子量為12000的甲氧基聚乙二醇部分以及聚合度為33的聚天冬氨酸部分的嵌段共聚物通式(I)，其中Rl-Me(甲基)，R24,3-亞丙基R3:酰基(乙?；?，R4:鬼臼毒素殘基，R5-異丙基氨基羰基異丙基氨基或O-芐基-苯基丙氨酰基，d+e+f+g+h+i+j=33,t二273)的合成將根據(jù)專利文獻(xiàn)3所述方法制備的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(天冬氨酸的聚合度33,464.4毫克)以及市售的鬼臼毒素(100毫克)溶解在DMF(6毫升)中，向其中加入DMAP(12毫克)和DIPC(0.09毫升)。所述混合物在15。C下攪拌20小時。然后加入鹽酸苯基丙氨酸芐酯(36.8毫克)，三乙胺(0.02毫升)和DIPC(0.23毫升)，該混合物在15。C攪拌20小時，然后在25。C再攪拌4小時。向反應(yīng)液體中加入乙酸乙酯(10毫升)、乙醇(IO毫升)和二異丙醚(80毫升)，該混合物在室溫下攪拌30分鐘。然后通過過濾收集沉淀，用乙醇/二異丙醚(1/4(v/v),20毫升)洗滌。所得的沉淀溶解在乙腈/水(1/1(v/v)，20毫升)中，然后使得溶液通過離子交換樹脂柱(陶氏化學(xué)公司(DowChemicalCompany)制造，Dowex50(H+)，3ml)，用乙腈/水(1/1(v/v),20毫升)洗脫。將水(25毫升)加入由此制得的洗脫級分中，減壓蒸餾掉乙腈，然后對殘余物進(jìn)行冷凍干燥，制得化合物3(580毫克)。根據(jù)通過HPLC(高效液相色譜)測得的反應(yīng)液中未反應(yīng)的鬼臼毒素的量,確定化合物3中鬼臼毒素的含量為13.7%(w/w)，確定(d+e)與(d+e+f+g+h+i+j)之比為19%。在化合物3中，未檢測到游離的鬼臼毒素。作為R5之一引入的0-芐基-苯基丙氨酰基通過對4(TC下在乙腈-氫氧化鈉水溶液中使化合物3水解6小時釋放出的芐醇的量進(jìn)行定量而確定。O-芐基-苯基丙氨?；c聚天冬氨酸之比，即計入(f+g)的O-芐基-苯基丙氨酰基與(d+e+f+g+h+i+j)之比為13%。另外，異丙基氨基羰基-異丙基氨基也可以作為R5加入，基團(tuán)的豐度比使用溶解在氖氧化鈉(sodiumdeuteroxide)/氧化氖/気代乙腈的化合物3通過^H-NMR(氫核磁共振譜)測定。異丙基氨基羰基異丙基氨基基團(tuán)與聚天冬氨酸之比，即計入(f+g)的異丙基氨基羰基異丙基氨基與(d+e+f+g+h+i+j)之比為15%。結(jié)果，R5的總量與聚天冬氨酸之比，艮P(f+g)與(d+e+f+g+h+i+j)之比為28%。剩余的天冬氨酸殘基為游離羧酸(h+i)或環(huán)狀結(jié)構(gòu)(j)的形式。比較例1比較化合物l(依托泊苷和嵌段共聚物的結(jié)合體，所述嵌段共聚物包含分子量為12000的甲氧基聚乙二醇部分以及聚合度為23的聚谷氨酸部分)的合成將根據(jù)日本專利申請公開(公開)第5-955號所述的方法制備的甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(21毫克)和市售的依托泊苷(9.6毫克)溶解在DMF(l毫升)中，將DMAP(0.6毫克)和DIPC(0.01毫升)加入其中。所述混合物在25°C下攪拌20小時。向反應(yīng)液體中加入乙醇(1.5毫升)、乙酸乙酯(1.5毫升)和二異丙醚(12毫升)，該混合物在室溫下攪拌30分鐘。然后通過過濾收集沉淀，用乙醇/二異丙醚(1/4(v/v),2毫升)洗滌。所得的沉淀溶解在乙腈/水(1/1(v/v),3毫升)中，然后使得溶液通過離子交換樹脂柱(陶氏化學(xué)公司(DowChemicalCompany)制造，Dowex50(H+)，0.2毫升)，用乙腈/水(1/1(v/v)，1毫升)洗脫。將水(l毫升)加入由此制得的洗脫級分中，減壓蒸餾掉乙腈，然后對殘余物進(jìn)行冷凍干燥，制得比較化合物1(28.0克)。基于通過HPLC測得的反應(yīng)液中未反應(yīng)的依托泊苷的量，確定比較化合物1中依托泊苷的含量為23.8%(w/w)。在比較化合物1中，未檢測到游離的依托泊苷。比較例2比較化合物2(鬼臼毒素和嵌段共聚物的結(jié)合體，所述嵌段共聚物包含分子量為12000的甲氧基聚乙二醇部分以及聚合度為23的聚谷氨酸部分)的合成將根據(jù)日本專利申請公開(公開)第5-955號所述的方法制備的甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(52毫克)和市售的鬼臼毒素(IO毫克)溶解在DMF(l毫升)中，將DMAP(2毫克)和DIPC(0.03毫升)加入其中。所述混合物在25°0下攪拌20小時。向反應(yīng)液體中加入乙醇(3毫升)和二異丙醚(12毫升)，該混合物在室溫下攪拌30分鐘。然后通過過濾收集沉淀，用乙醇/二異丙醚(l/4(v/v)，2毫升)洗滌。所得的沉淀溶解在乙腈/水(l/l(v/v),3毫升)中，然后使得溶液通過離子交換樹脂柱(陶氏化學(xué)公司(DowChemicalCompany)制造，Dowex50(H+)，0.2毫升)，用乙腈/水(1/1(v/v),1毫升)洗脫。將水(l毫升)加入由此制得的洗脫級分，然后減壓蒸餾掉乙腈。然后對殘余物冷凍干燥，制得比較化合物2(64.3毫克)?；谕ㄟ^HPLC測得的反應(yīng)液中未反應(yīng)的鬼臼毒素的量，比較化合物2中鬼臼毒素的含量為16.0%(w/w)。在比較化合物2中，未檢測到游離的鬼臼毒素。測試實施例1在不存在酶的條件下藥物從化合物1中釋放將化合物1或比較化合物1溶解在PBS(磷酸鹽緩沖的生理鹽7K;p1^7.1)中，使得聚合物濃度為1毫克/毫升，該溶液在37X:培養(yǎng)。通過HPLC將從高分子量結(jié)合體釋放的依托泊苷分離，并通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較對其定量。圖l顯示了以由高分子量結(jié)合體的藥物含量確定的總藥物量為基準(zhǔn)計的定量值的比例。從圖1可看出，本發(fā)明的高分子量結(jié)合體(化合物l)在不存在水解酶的條件下，在24小時內(nèi)釋放出了等于或大于85%的依托泊苷，而不含琥珀酸單酰胺部分的比較化合物1在24小時內(nèi)實際上不釋放依托泊苷。該結(jié)果表明本發(fā)明的依托泊苷的高分子量結(jié)合體在不存在酶的條件下具有極佳的藥物釋放性能。測試實施例2在不存在酶的條件下藥物從化合物2和3釋放將化合物2或3，或者比較化合物2溶解在PBS(磷酸鹽緩沖的生理鹽水;pH=7.1)中，使得聚合物濃度為1毫克/毫升，該溶液在37。C培養(yǎng)。通過HPLC將高分子量結(jié)合體釋放的鬼臼毒素分離，并通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較對其定量。圖2顯示了以由高分子量結(jié)合體的藥物含量確定的總藥物量為基準(zhǔn)計的定量值的比例。從圖2可看出，本發(fā)明的高分子量結(jié)合體(化合物2或3)在不存在水解酶的條件下，在24小時內(nèi)釋放出了10-60%或者更多的鬼臼毒素，而不含琥珀酸單酰胺部分的比較化合物2在24小時內(nèi)實際上不釋放鬼臼毒素。該結(jié)果表明本發(fā)明的鬼臼毒素的高分子量結(jié)合體在不存在酶的條件下具有極佳的藥物釋放性能。另外，表明藥物釋放性能可以自由控制。測試實施例3化合物1的抗腫瘤效果通過在小鼠內(nèi)的連續(xù)皮下繼代培養(yǎng)保持的小鼠結(jié)腸癌，Colon26,被切碎成約2-毫米見方的碎片，然后用套針將這些碎片皮下移植到雌性CDF1小鼠的背部。腫瘤移植七天之后，將本發(fā)明的高分子量結(jié)合體(化合物l)或者對照藥物(依托泊苷，ETP)對小鼠的尾部靜脈進(jìn)行一次靜脈給藥。對照組表示沒有給藥的組。將化合物1溶解在5%的葡萄糖溶液中，供注射和使用。對于ETP,Rastet注射藥(日本化藥株式會社(NipponKayakuCo.,Ltd.)生產(chǎn))用5%的葡萄糖溶液稀釋，供注射和使用。給藥之后，用卡尺測量腫瘤的主軸(L毫米)和次軸(W毫米)，通過公式(LxW2)/2計算腫瘤體積。表1顯示了以給藥那天的腫瘤體積為基準(zhǔn)計的相對腫瘤體積。表1中還顯示了這段時間內(nèi)體重的變化，以給藥那天的體重為基準(zhǔn)計的相對體重表示。18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2表明本發(fā)明的高分子量結(jié)合體在造成休重減輕程度與POD(15毫克/千克/天，連續(xù)給藥5天)相同的給藥量下(75毫克/千克)，盡管是單次給藥，仍具有優(yōu)于后者的抗癌活性，因此可以作為抗癌藥。附圖簡要說明圖l顯示了以結(jié)合的依托泊苷的總量為基準(zhǔn)計，在PBS溶液中(pH二7.1，37°0從化合物l(高分子量衍生物，其中依托泊苷與嵌段共聚物的聚天冬氨酸結(jié)合)或者比較化合物l(高分子量衍生物，其中依托泊苷與嵌段共聚物的聚谷氨酸結(jié)合)釋放的依托泊苷的量的百分?jǐn)?shù)。在圖1中，-參-表示從本發(fā)明的化合物1釋放的量的百分?jǐn)?shù)，-O-表示從比較化合物1釋放的量的百分?jǐn)?shù)。圖2顯示了以結(jié)合的鬼臼毒素的總量為基準(zhǔn)計，在PBS溶液中(pH二7.1，37'C)從本發(fā)明的化合物2或化合物3(高分子量衍生物，其中鬼臼毒素與嵌段共聚物的聚天冬氨酸結(jié)合)或者比較化合物2(高分子量衍生物，其中鬼臼毒素與嵌段共聚物的聚谷氨酸結(jié)合)釋放的鬼臼毒素的量的百分?jǐn)?shù)。在圖2中，-令-表示本發(fā)明的化合物2釋放的量的百分?jǐn)?shù)，-蠱-表示化合物3釋放的量的百分?jǐn)?shù),-O-表示比較化合物2釋放的量的百分?jǐn)?shù)。權(quán)利要求1.一種鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其中，包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的羧酸基團(tuán)與所述鬼臼毒素類的羥基通過酯鍵而結(jié)合。2.如權(quán)利要求1所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其特征在于，所述包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物是嵌段共聚物。3.如權(quán)利要求2所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其特征在于，所述兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分構(gòu)成聚天冬氨酸。4.如權(quán)利要求3所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其特征在于，該結(jié)合體由式(I)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中Rl表示氫原子或(C1-C6)烷基；R2表示連接基團(tuán)；R3表示氫原子或(Cl-C6)?；籖4表示鬼臼毒素類的羥基的殘基；R5表示選自以下的基團(tuán)(C1-C30)垸氧基，(C7-C30)芳烷氧基，(Cl-C30)垸基氨基，二(C1-C30)垸基氨基,以及帶有保護(hù)的羧基的氨基酸，以及-N(R6)CONH(R7)，其中R6和R7可以是相同或不同的，它們各自表示任選地被叔氨基取代的(C3-C6)環(huán)垸基或(C1-C5)垸基;t表示5-11,500的整數(shù);d,e，f,g,h,i和j各自獨立地表示0-200的整數(shù)，前提是d+e表示1-200的整數(shù)，d+e+f+g+h+i+j表示3-200的整數(shù)，相應(yīng)的聚天冬氨酸的組成單元以任意的順序結(jié)合。5.如權(quán)利要求4所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其特征在于，Rl是(C1-C6)烷基；R2是(C2-C6)亞烷基；R3是(C1-C6)酰基；t是8-2300的整數(shù)；d,e,f,g,h,i和j各自獨立地是0-100的整數(shù)，前提是d+e是1-100的整數(shù)，d+e+f+g+h+i+j是6-100的整數(shù)。6.如權(quán)利要求5所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其特征在于，Rl是(C1-C3)烷基；R2是(C2-C4)亞垸基；R3是(C1-C3)?；?；t是100-300的整數(shù)；d,e,f,g,h,i和j各自獨立地是0-90的整數(shù)，前提是d+e是1-卯的整數(shù)，d+e+f+g+h+i+j是15-90的整數(shù)。7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其特征在于，所述鬼臼毒素類是鬼臼毒素、依托泊苷或鬼臼噻吩苷。8.—種鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體，其通過在有機(jī)溶劑中使用脫水縮合劑，使包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的羧酸基團(tuán)與所述鬼臼毒素類的羥基通過酯鍵結(jié)合而制得。9.一種制備以上權(quán)利要求1至7中任一項所述的鬼臼毒素類的高分子量結(jié)合體的方法，該方法包括在有機(jī)溶劑中使用脫水縮合劑，使包含聚乙二醇部分和兩個或更多個琥珀酸單酰胺部分的聚合物的羧酸基團(tuán)與所述鬼臼毒素類的羥基通過酯鍵而結(jié)合。10.—種抗癌藥，包含上面權(quán)利要求1至8中任一項所述的鬼臼毒素類銜高分子量諒合體作為^i^組-分。全文摘要人們需要一種新穎的鬼臼毒素衍生物，其能夠在無需依賴生物酶的條件下釋放藥物，能夠預(yù)期其具有有效的療效，而且可溶于水。提供了一種包含聚乙二醇結(jié)構(gòu)單元以及兩個或更多個琥珀酸單酰胺結(jié)構(gòu)單元的聚合物，特別是鬼臼毒素的聚合物結(jié)合體，其中聚乙二醇/聚天冬氨酸共聚物的羧酸基團(tuán)與鬼臼毒素的羥基通過酯鍵連接。文檔編號C08G81/00GK101448875SQ200780017780公開日2009年6月3日申請日期2007年5月16日優(yōu)先權(quán)日2006年5月18日發(fā)明者北川正行,山本啟一朗,柴田雅夫,石川惠三,高鹽一俊申請人:日本化藥株式會社