專利名稱：：低分子量肝素及其用途的制作方法低分子量肝素及其用途本申請(qǐng)要求于2006年5月25日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/809,136號(hào)、于2006年10月4日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/849,578號(hào)和于2006年10月5日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/849,628號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
：凝血是參與維持哺乳動(dòng)物正常止血的生理途徑。在血管受傷的情況下，凝血途徑受到激發(fā)而形成血液凝塊，阻止血液損失。血管受傷發(fā)生后，血小板立即開(kāi)始在受傷部位凝集形成物理堵塞物以阻止血液流失。此外，受傷血管通過(guò)血管收縮來(lái)減少流經(jīng)此區(qū)域的血流，而血纖維蛋白則開(kāi)始凝集形成覆蓋破裂區(qū)域的不溶性網(wǎng)絡(luò)或凝塊。當(dāng)凝血途徑傾向于過(guò)量凝結(jié)的不平衡狀態(tài)時(shí)，其結(jié)果是血栓趨勢(shì)的形成，通常表現(xiàn)為心臟病發(fā)作、中風(fēng)、深靜脈血栓和急性冠狀動(dòng)脈綜合征，例如心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛。此外，血栓可以引發(fā)栓塞，并造成肺栓塞或包括中風(fēng)或短暫性缺血發(fā)作在內(nèi)的腦血管栓塞。目前與凝血途徑中的不平衡相關(guān)的病變的治療方法存在很多風(fēng)險(xiǎn)，必須進(jìn)行謹(jǐn)慎的控制。肝素和低分子量肝素(LMWH)、復(fù)合物、從內(nèi)源分離的硫酸酯化多糖是止血的強(qiáng)效調(diào)節(jié)劑。廣泛用作臨床抗凝血?jiǎng)┑母嗡厥怯煞蚀蠹?xì)胞產(chǎn)生的高度硫酸酯化的肝素樣葡胺聚糖(HLGAG)，并且是最初的生物聚合物藥物之一和少數(shù)的糖類藥物之一。肝素及其衍生的分子是用于多種臨床表現(xiàn)的強(qiáng)效抗凝血?jiǎng)?，特別是用于血栓栓塞性疾病，包括預(yù)防和治療深靜脈血栓和肺栓塞、動(dòng)脈血栓形成和急性冠狀動(dòng)脈綜合征(例如心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛)。肝素和LMWH與凝血級(jí)聯(lián)中的多個(gè)組分發(fā)生相互作用以抑制血液凝結(jié)過(guò)程。肝素主要通過(guò)兩個(gè)機(jī)制發(fā)揮其作用，這兩個(gè)機(jī)制均涉及抗凝血酶III(AT-III)與所述聚合物中包含的特異性五糖序列HNAC/S,6SGHNS，3S,6SI2SHNS,6S的結(jié)合。首先，AT-m與五糖結(jié)合引發(fā)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，介導(dǎo)所述蛋白質(zhì)對(duì)Xa因子的抑制。第二步，凝血酶(IIa因子)也在緊接五糖/AT-in結(jié)合位點(diǎn)的位置與肝素結(jié)合。AT-III、凝血酶和肝素間三元復(fù)合物的形成導(dǎo)致凝血酶的失活。與肝素的抗Xa活性僅需要AT-III五糖結(jié)合位點(diǎn)不同，肝素的抗IIa活性在需要負(fù)責(zé)抗Xa活性的五糖單元以有效形成AT-III、凝血酶和肝素間三元復(fù)合物之外，還具有位點(diǎn)依賴性。肝素還介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織因子途徑抑制物(TFPI)。肝素輔助因子TFPI是直接結(jié)合并抑制X因子的絲氨酸蛋白酶。TFPI是一種強(qiáng)效抗血栓形成劑，特別是在與肝素共同施用的情況下。盡管肝素對(duì)于多種臨床表現(xiàn)都非常有效，并具有用于多個(gè)其它方面的潛力，但肝素療法與多種不同副作用相關(guān)。在過(guò)去65年中，抗凝血是普通肝素(unfractionatedheparin,UFH)的主要臨床應(yīng)用。由于其不穩(wěn)定的靜脈內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)并缺乏皮下生物利用度，現(xiàn)已將UFH以靜脈注射施用。此外，UFH作為抗凝血?jiǎng)┑膽?yīng)用也受到多種副作用的妨礙，這些副作用與結(jié)合到UFH的非特異性血漿蛋白相關(guān)。這導(dǎo)致人們對(duì)低分子量肝素(LMWH)的產(chǎn)生和利用進(jìn)行研發(fā)以使其作為UFH有效替代物。LMWH提供了更可預(yù)見(jiàn)的藥理學(xué)活性，降低的副作用和比UFH更高的生物利用度。由于商購(gòu)LMWH制劑未經(jīng)魚(yú)精蛋白完全中和，可能發(fā)生具有嚴(yán)重不良作用的意外反應(yīng)。使用S2mg魚(yú)精蛋白/100IU抗Xa活性的LMWH僅能將依諾肝素(enoxaparin)和其它LMWH的抗Xa活性中和至約40%的程度。使用^2mg魚(yú)精蛋白/100IU抗Xa活性的LMWH僅能將抗IIa活性中和至約60%的程度。(另一方面，使用S2mg硫酸魚(yú)精蛋白/100IU抗Xa活性的UFH可幾乎完全中和(〉90Q/。)UFH的抗Xa和抗IIa活性)。這些通常從豬腸粘膜分離的多糖藥物制劑在長(zhǎng)度和組成方面各不相同。因此，僅有一部分的制劑具有抗凝血活性。在最好的情況下，肝素或LMWH的藥物制劑中的大部分多糖鏈?zhǔn)Щ?，在最差的情況下，這些鏈非特異性地與血漿蛋白質(zhì)相互作用從而產(chǎn)生與肝素療法相關(guān)的副作用。因此，開(kāi)發(fā)保留了UFH的抗凝血活性和其它所需活性，但具有較少副作用的新型LMWH非常重要。主要由于其鏈較短和分散性較低，LMWH顯示出顯著減少的非特異性血漿蛋白結(jié)合性。然而，目前臨床使用的所有LMWH同樣具有低于UFH的抗IIa活性。因?yàn)檫@一活性的降低，需要較大劑量(與UFH相比)的LMWH以達(dá)到類似的抗Xa和抗IIa活性，并且用于檢測(cè)UFH活性、活化部分凝血活酶時(shí)間(aPTT)或活化凝血時(shí)間(ACT)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)也不能使用，因?yàn)檫@些試驗(yàn)主要依賴于抗IIa活性以獲得讀數(shù)。最廣泛用于監(jiān)測(cè)LMWH水平的試驗(yàn)是抗Xa活性試驗(yàn)，其依賴于具有足夠抗凝血酶ni(ATIII)的樣品，而實(shí)際情況不總是如此。此試驗(yàn)非常昂貴(遠(yuǎn)超過(guò)$100.00)，而且因?yàn)橥ǔ１仨殞悠匪偷酵饷娴膶?shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析，此試驗(yàn)并不是常規(guī)試驗(yàn)或易于實(shí)施。因此，迄今為止LMWH的用途仍主要限制于血栓形成的預(yù)防而非治療，而且可施用LMWH的患者群也受到限制小兒科患者，經(jīng)RFI、尿素、肌氨酸、磷、腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)或血液和尿液BUN(血尿素氮水平)檢測(cè)患有腎功能異常的患者以及介入性心臟病患者群均被排除在外。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明部分地基于對(duì)具有改進(jìn)性質(zhì)的LMWH制劑的開(kāi)發(fā)，例如經(jīng)設(shè)計(jì)而具有改進(jìn)性質(zhì)(例如，提供臨床優(yōu)勢(shì)的性質(zhì))。此類功能性質(zhì)包括，例如應(yīng)答硫酸魚(yú)精蛋白的可逆性、可預(yù)期的或改進(jìn)的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、與例如依諾肝素相比改進(jìn)的抗IIa活性；在約30180分鐘的期間內(nèi)抗Xa活性與抗IIa活性比值的相對(duì)恒定；可檢測(cè)的活性水平；皮下生物利用度；導(dǎo)致肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HIT)的可能性下降。本文公開(kāi)的LMWH還具有可將其與其它商購(gòu)LMWH區(qū)分開(kāi)的結(jié)構(gòu)特征。例如，本文提供的LMWH制劑可具有一種或多種以下性質(zhì)基本上不能測(cè)得到的連接區(qū)域、與可商購(gòu)的LMWH制劑相比增加的3-0硫酸酯數(shù)量、一些鏈在非還原末端具有未硫酸酯化的AU、一些鏈(例如大部分鏈或基本上所有的鏈)在還原末端具有N-乙?；禾前?、△UHNAC，6SGHNS,3S，6S與AU2sHNs，6sIHNAe，6sGHNs,3s,6s的比值為約1:1至1:4(例如，約1:2、2:1、3:1、4:1)以及基本未經(jīng)修飾的還原末端結(jié)構(gòu)。本發(fā)明包括具有以上的一種或多種性質(zhì)和特征的LMWH制劑，以及制備和使用此類制劑的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了在生產(chǎn)此類LMWH制劑過(guò)程中，分析起始原料、加工、中間體和終產(chǎn)物的方法。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面公開(kāi)了具有下述特征的LMWH組合物重均分子量為約50009000Da，例如約50008300Da，約55008000Da，約57007900Da，約58006800Da;禾口約50300IU/mg的抗IIa活性，例如約70280IU/mg，約90250IU/mg，約100250IU/mg，約100140IU/mg，150200IU/mg，約130190IU/mg，約155195IU/mg。本發(fā)明的第二方面公開(kāi)了具有下述特征的LMWH組合物重均分子量為約50009000Da，例如約50008300Da，約50008000Da，約55008000Da，約57007900Da，約58006800Da，和例如通過(guò)活化部分凝血活酶時(shí)間(ACT)或活化部分凝血活酶時(shí)間(aPTT)測(cè)量，魚(yú)精蛋白中和了至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%或100M的抗na活性。優(yōu)選在施用魚(yú)精蛋白后5、10、15、30分鐘內(nèi)，LMWH的抗IIa活性被中和了至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%或100%。本發(fā)明的第三方面公開(kāi)了具有下述特征的LMWH組合物重均分子量為約50009000Da，例如約50008300Da，約55008000Da，約57007900Da，約58006800Da，和例如通過(guò)摩爾％測(cè)定，AUHNAe,6sGH眠3s,6s占組合物的5%至15%，例如7%至14%，9%至12%。優(yōu)選例如通過(guò)摩爾％測(cè)定，位于分子非還原性末端的AUHNAe,6sGHNs,3s，6s占組合物的鏈的約5。/。至15。/Q，例如7%至14%，9%至12%。本發(fā)明的第四方面公開(kāi)了具有下述特征的LMWH組合物平均鏈長(zhǎng)為約918個(gè)二糖或818個(gè)二糖，例如約916或816個(gè)二糖；和例如通過(guò)摩爾％測(cè)定，AUH區(qū)e,6sGHNs，3s,6S占組合物的5°/。15%，例如7%14%，9%12%。優(yōu)選例如通過(guò)摩爾％測(cè)定，位于分子非還原性末端的AUHNAc,6sGHNs,3s,6s占組合物鏈的約5。/。15。/。，例如7%14%，9%12%。本發(fā)明的第五方面公開(kāi)了具有下述特征的LMWH組合物重均分子量為約50009000Da，例如約50008300Da，約55008000Da，約57007卯0Da，約58006800Da;禾口12抗Xa與抗IIa比值為3:1或更小，例如2:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1或0.5:1。優(yōu)選在施用LMWH制劑的療程期間維持相對(duì)恒定的抗Xa與抗IIa比值，例如在約30、60、120、180、240、300分鐘的期間內(nèi)抗Xa與抗IIa比值的變化不超過(guò)約士1.5、土l、±0.5或±0.2。例如，如果初始抗Xa活性與抗IIa活性比值為2，則在初始施用后的第二時(shí)間(例如，在約30、60、120、180、240、300分鐘)測(cè)量的比值優(yōu)選小于3，并優(yōu)選等于2或在2附近。本發(fā)明的第七方面公開(kāi)了具有下述特征的LMWH組合物任選地，重均分子量為約50009000Da，例如約50008300Da，例如約55008000Da，例如約57007900Da，例如約58006800Da;和在通過(guò)使用肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III消化以及毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析時(shí)，存在表10A中列出所有峰1-14。在優(yōu)選的實(shí)施方案中根據(jù)使用肝素酶i、肝素酶n和肝素酶in消化以及毛細(xì)管電泳的分析，LMWH組合物中各個(gè)峰值與在表IOA列出的類似，各個(gè)峰值均在表IOA提供的范圍之內(nèi)，峰10和峰11的值在表IOA提供的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的第八方面公開(kāi)了具有下述特征的LMWH組合物任選地，具有約50009000Da，例如約50008300Da、約55008000Da、約57007900Da、約58006800Da的重均分子量；和通過(guò)2D核磁共振(NMR)分析，存在表11A中列出的各結(jié)構(gòu)的質(zhì)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中通過(guò)2DNMR分析，LMWH組合物中各個(gè)結(jié)構(gòu)的量與在表11A列出的類似。本發(fā)明的第九方面公開(kāi)了具有下述一個(gè)或多個(gè)特征的LMWH組合物所述組合物基本不包含(例如，至少85%、90%、95%或更多的鏈不包含)經(jīng)修飾的還原末端結(jié)構(gòu)；至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%的組合物鏈在還原末端具有HNAe;組合物90%、95%、98%、99°/。的鏈在非還原末端均不具有硫酸酯化AU，優(yōu)選所述組合物的所有鏈在非還原末端均不具有硫酸酯化AU;組合物中基本不存在連接區(qū)域(例如，小于0.1%的連接區(qū)域)；所述聚合物中帶有3-0硫酸酯的鏈多于可商購(gòu)的LMWH(例如，依諾肝素或達(dá)肝素)；組合物中AUHNAe，6SGHNS,3s，6S與AU2SHNS,6sIHNAe,6SGHNS,3S,6s的比值為約1:1至4:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物具有兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或全部以Jr」特征。本發(fā)明的第十方面公開(kāi)了具有以下結(jié)構(gòu)的LMWH組合物其中R是H或S03X;Ri是S03X或COCH3;X是單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子；n=250，例如240;并且所述組合物的n的平均值優(yōu)選為916，816或815。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有以下結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中:R是H或S03X;R4是S03X或COCH:X是單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子；n=250，例如240;并且所述組合物的n的平均值優(yōu)選為916，816或815。本發(fā)明的第十一方面公開(kāi)了具有以下結(jié)構(gòu)的LMWH組合物:其中X是Na或Ca，R是H或S03Na;R4是S03Na或COCH3;n=245，例如235;并且所述組合物的n的平均值優(yōu)選為711或812。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有以下結(jié)構(gòu):X是Na或Ca，R是H或S03Na;R!是S03Na或COCH3;n=245，例如235;并且所述組合物的n平均值優(yōu)選為711或812。此組合物可作為L(zhǎng)MWH生產(chǎn)中的中間體存在，例如作為快速移動(dòng)組分的酶消化產(chǎn)物(如本文所述)。其中-本發(fā)明的第十二方面公開(kāi)了具有以下結(jié)構(gòu)的LMWH組合物:H其中X是Na或Ca，R是H或S03Na;R,是S03Na或COCH3;n=250，例如240;并且所述組合物的n的平均值優(yōu)選為815(例如1015)或916(例如1116)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有以下結(jié)構(gòu)H其中X是Na或Ca，R是H或S03Na;R4是S03Na或COCH3;n=250，例如240;和所述組合物的n的平均值優(yōu)選為815(例如1015)或916(例如1116)。此組合物可作為L(zhǎng)MWH生產(chǎn)中的中間體(或稱中間產(chǎn)物)存在，例如作為快速移動(dòng)組分的沉淀產(chǎn)物(如本文所述)。本文所述的LMWH(例如上文所述的LMWH)可具有其它性質(zhì)，例如上述組合物之一可進(jìn)一步具有一個(gè)或多個(gè)下文所述的功能或結(jié)構(gòu)性質(zhì)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有的抗Xa活性為約100400IU/mg，例如約120380IU/mg，例如約150350IU/mg，例如約170330IU/mg，例如約180300IU/mg，例如約150200IU/mg，約200300IU/mg，約130220IU/mg，約225274IU/mg。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，經(jīng)抗Xa活性、ACT或aPTT測(cè)定，所述LMWH組合物具有的抗Xa活性至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%、100%可被中和。優(yōu)選在使用魚(yú)精蛋白后5、10、15分鐘內(nèi)，抗Xa活性被中和了至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%或100%。例如，在以每100IU血漿抗Xa活性的LMWH組合物施用約1、2、3mg劑量的魚(yú)精蛋白后的5、10、15、30分鐘之內(nèi)，抗Xa活性被中和至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%或100%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有一個(gè)或多個(gè)以下性質(zhì)可通過(guò)aPTT和/或ACT監(jiān)測(cè)組合物的活性;所述組合物的多分散性小于1.6，例如多分散性約為1.61.1，例如1.5L1，1.41.1，1.31.1，L2l.l;所述組合物中小于70%、60%、50%、45%、40%、35%、30%的鏈具有大于7500Da或8000Da的分子量；所述組合物中小于40°/。、35°/。、30%、25%的鏈具有小于5500Da或5000Da的分子量；所述組合物在鏈的非還原末端具有AU和I/G結(jié)構(gòu)的混合；所述組合物中具有PF4結(jié)合位點(diǎn)的鏈少于依諾肝素、達(dá)肝素、UFH。在一個(gè)實(shí)施方案中，LMWH組合物中約15%、20%、25%、30%、35%、45%、50%的鏈在非還原末端具有AU。優(yōu)選所述組合物中約15%50%的鏈(例如15%35%的鏈，20%35%的鏈)在非還原末端具有八U。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有高于依諾肝素或達(dá)肝素的硫酸酯化程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物組合物中具有多于依諾肝素或達(dá)肝素的三硫酸酯化二糖，例如通過(guò)摩爾％測(cè)定，所述LMWH組合物具有約50%65%的三硫酸酯化二糖，例如55%60%、55%58%、57%60%的三硫酸酯化二糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含的AUHNAe,6SGHNS,3S,6S水平高于依諾肝素、達(dá)肝素和/或UFH，例如包含約515摩爾％，714摩爾％，912摩爾％的AUHNAe,6sGH眠3s，6s水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有小于3%、2.5%、2%、1.5%、1.0%的1丐含量和/或低于30%、25%、20%、15%、10%的鈉含量。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有少于1000ng/mg、750ng/mg、500ng/mg、250ng/mg的肝素酶(例如本文所述的肝素酶)；少于1.0%、0.5%、0.3%w/w17的甲醇；少于1.0%、0.5%、0.3%、0.1。/ow/w的乙醇；少于2.0%、1.75%、1.25%、1.0%、0.5%、0.3%、0.15%的氯化物；少于15重量％、10重量％、5重量％、2.5重量％的水；少于2000ppm、1500ppm、1000ppm、950ppm、900ppm、850ppm、800ppm、750ppm、700ppm、650ppm、600ppm、550ppm、500ppm、450ppm、400ppm、350ppm、300ppm的游離硫酸酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物提供了大于依諾肝素的TFPI釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，與依諾肝素相比，LMWH提供的TFPI釋放至少增加了2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有約30分鐘至3小時(shí)的靜脈內(nèi)半衰期，例如約12小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有約30分鐘至3.0小時(shí)或3.5小時(shí)的皮下半衰期，例如約1.52.5小時(shí)(例如約2小時(shí))的皮下半衰期。在上述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十個(gè)方面的任意一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有一個(gè)或多個(gè)下述特征所述組合物基本不包含(例如，至少85%、90%、95%或更多的鏈不包含)經(jīng)修飾的還原末端結(jié)構(gòu)；所述組合物至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%的鏈在還原末端具有HNAe;所述組合物90%、95%、98%、99%的鏈在非還原末端均不具有硫酸酯化AU，優(yōu)選所述組合物的所有鏈在非還原末端均不具有硫酸酯化AU;組合物中基本不存在連接區(qū)域(例如，小于0.1%的連接區(qū)域)；所述組合物中帶有3-0硫酸酯的鏈多于可商購(gòu)的LMWH(例如，依諾肝素或達(dá)肝素);組合物中AUHNAc,6SGHNS,3S,6S與AU2SHNS,6sIHNAc,6sGHNS,3S,6S的比值為約1:1至4:1(例如1:1，2:1，3:1或4:1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或全部以上特征。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了具有以下性質(zhì)的LMWH組合物約50009000Da的重均分子量；約50300IU/mg的抗IIa活性；例如通過(guò)ACT或aPTT測(cè)定，至少50%的抗IIa活性可被魚(yú)精蛋白中禾口；AUHNAc，6SGHNS,3S,6S占組合物約5%15%，優(yōu)選AUHnac,6sGH織3s,6s位于5%15%的組合物的非還原末端；約916個(gè)二糖的平均鏈長(zhǎng)；抗Xa活性與抗IIa活性的比值為3:1或以下；在施用LMWH的療程期間維持相對(duì)恒定的抗Xa與抗IIa比值，例如在約30、60、120、180、240、300分鐘的時(shí)間內(nèi)抗Xa與抗IIa比值的變化不超過(guò)約士1.5、±1、±0.5或±0.2。例如，如果抗Xa與抗IIa的初始比值為2，則在初始施用后第二時(shí)間(例如，在約30、60、120、180、240、300分鐘)測(cè)量的比值優(yōu)選小于3，并優(yōu)選等于2或在2附近。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有以下結(jié)構(gòu)R是H或S03Na;R4是S03Na或COCH3;n=250，例如240;并且所述組合物的n的平均值優(yōu)選為916或815。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有一個(gè)或多個(gè)以下性質(zhì)約100400IU/mg的抗Xa活性；例如通過(guò)ACT或aPTT檢測(cè)組合物的抗Xa活性，至少50%的抗Xa活性可被中和；所述組合物的多分散性小于1.6;所述組合物中小于70%、60%、50。/。的鏈具有大于7500Da的分子量；其中:19所述組合物中小于40%的鏈具有小于5000Da的分子量；所述組合物在鏈的非還原末端具有AU和I/G結(jié)構(gòu)的混合；所述組合物基本不具有經(jīng)修飾的還原末端結(jié)構(gòu)；所述組合物中具有PF4結(jié)合位點(diǎn)的鏈少于依諾肝素、達(dá)肝素或UFH;所述組合物中至少60%、70%、80%、90%的鏈在還原末端具有HNAc;所述組合物中約15%35%的鏈在非還原末端具有AU;所述組合物90%、95%、98%、99%的鏈在非還原末端均不具有硫酸都化AU，優(yōu)選所述組合物的所有鏈在非還原末端均不具有硫酸酯化AU。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有以下性質(zhì)具有高于依諾肝素或達(dá)肝素的硫酸酯化程度；組合物中三硫酸酯化二糖多于依諾肝素或達(dá)肝素，例如通過(guò)摩爾％測(cè)定，所述LMWH組合物具有約50%65%的三硫酸酯化二糖；具有高于依諾肝素、達(dá)肝素和/或UFH的AUI^ac,6sGHws,3s，6s水平，例如存在約515摩爾％的AUHNAe，6SGHNS,3S,6S。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有以下性質(zhì)具有小于3%的鈣含量和/或低于20%的鈉含量；具有少于1000ng/mg的肝素酶；具有少于1.(P/。w/w的甲醇；具有少于1.0%W/W的乙醇；具有少于2.0%的氯化物；具有少于15重量％的水；具有少于2000ppm的游離硫酸酯。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有以下性質(zhì)可提供的組織因子途徑抑制物(TFPI)釋放大于依諾肝素。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有約30分鐘至3小時(shí)的靜脈內(nèi)半衰期。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了制備LMWH的方法。所述方法包括使用水性醇(例如，乙醇)對(duì)UFH進(jìn)行一次或一系列分步沉淀(至少有一個(gè)步驟使用鈉鹽(或非鈣鹽的其它鹽))，從普通肝素中提取低分子量組分(例如，快速移動(dòng)組分)以得到第一中間產(chǎn)物，其中所述第一中間產(chǎn)物具有1016個(gè)二糖的平均鏈長(zhǎng)；在2552°C(例如37"C)下，pH約59(例如pH78)的緩沖水溶液(例如，鹽水緩沖液、乙酸鈉緩沖液)中，使用切割未硫酸酯化糖醛酸中的糖苷鍵的試劑(例如，酶(例如本發(fā)明所述的酶)或化學(xué)試劑)，消化所述第一中間產(chǎn)物以產(chǎn)生第二中間產(chǎn)物，其中優(yōu)選所述第二中間產(chǎn)物具有814個(gè)二糖(例如8-12個(gè)二糖)的平均鏈長(zhǎng)；通過(guò)基于分子大小的步驟(例如，體積排阻色譜(SEC)的步驟)從來(lái)自較低活性材料的所述第二中間產(chǎn)物中分離高分子量、高抗Xa因子和抗IIa因子的組分以產(chǎn)生第三中間產(chǎn)物，其中所述第三中間產(chǎn)物具有916個(gè)二糖的平均鏈長(zhǎng)；并任選地，將所述第三中間產(chǎn)物溶解在純化水中，過(guò)濾(例如，通過(guò)0.2pm濾器)，并冷凍干燥成原料藥。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)本文所述方法制備的LMWH組合物。另一方面，所述方法包括來(lái)自于本文所述LMWH組合物的制備或分析方法的中間產(chǎn)物或反應(yīng)混合物。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了包括本文所述LMWH組合物的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物為適合全身給藥的劑型。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物適合于皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、玻璃體內(nèi)、硬膜上、硬膜下或胸腔內(nèi)給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于全身給藥的藥物組合物可以是等滲溶液，例如帶有或不帶有防腐劑的等滲溶液。所述防腐劑的實(shí)例包括但不限于苯甲醇、甘露醇和亮氨酸?？蓪挝粍┝康谋景l(fā)明藥物組合物置于適合施用的包裝或裝置中，例如可將適合皮下給藥的組合物置于用于皮下給藥的注射器中，可將適合靜脈內(nèi)給藥的組合物置于用于靜脈給藥的注射器中或置于用于靜脈內(nèi)給藥的其它裝置中，例如靜脈點(diǎn)滴袋或點(diǎn)滴瓶中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物為適合局部侵入性給藥的劑型，例如包被于適合植入的裝置或置于適合植入的裝置內(nèi)。適合植入的裝置包括但不限于支架和體外電路。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物是適合于皮下植入、植入到組織或器官(例如，冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、腎動(dòng)脈、其它外周動(dòng)脈、靜脈、腎臟、心臟、角膜、玻璃體和大腦)，或植入到組織或器官的間隙中(例如，腎囊、心包膜、胸腔或腹膜腔)的劑型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物為適合于非侵入性給藥的劑型，例如外用(topical)、透皮、肺部、鼻、口、耳道、直腸或陰道給藥。可將單位劑量的本發(fā)明藥物組合物置于適合此類給藥的包裝或裝置中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物是凍干的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物是液態(tài)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了包含所述藥物組合物的容器，例如安瓿、注射器或小瓶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物的存在形式為每mL藥學(xué)上可接受的載體所對(duì)應(yīng)的該組合物的抗Xa活性為1500IU、2000IU、2500IU、3000IU、3500IU、4000IU、4500IU、5000IU、5500IU、6000IU。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物具有約200400mOsm/L，例如約250350mOsm/L，約280330mOsm/L的滲透度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物進(jìn)一步包含氯化鈉和水。另一個(gè)方面，本發(fā)明公開(kāi)了治療受試者的方法，該方法包括向受試者施用本文公開(kāi)的LMWH。所述治療可以是治療性的，例如緩解、減輕或改善存在的不良病癥或其癥狀，或是預(yù)防性的，例如延遲(例如阻止)不良病癥或其癥狀發(fā)生的治療。本文所述LMWH組合物可用于治療可使用UFH或商購(gòu)LMWH(例如，依諾肝素、達(dá)肝素或亭扎肝素)治療的病變。本發(fā)明包括用于治療具有病變或病癥或具有發(fā)生所述病變或病癥的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，其中所述病變或病癥選自于以下組成的組與凝血相關(guān)的病變，例如深靜脈血栓(DVT)或肺栓塞；血栓癥或心血管疾病，例如急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS);穩(wěn)定型或不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死，例如ST段抬高心肌梗死(STEMI)或非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI);血管病癥或心房纖顫；偏頭痛；動(dòng)脈硬化癥；炎性疾病，例如自身免疫疾病或過(guò)敏性疾病、牛皮癬、關(guān)節(jié)炎、膿血癥；彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC);過(guò)敏性反應(yīng)或呼吸系統(tǒng)病變，例如哮喘、肺氣腫、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、囊腫性纖維化或肺再灌注損傷；狹窄或再狹窄；癌癥或轉(zhuǎn)移性病變；遺傳性病變；纖維化病變，例如主要器官纖維化、纖維增生性病變和外傷相關(guān)的疤痕；骨質(zhì)疏松癥；阿茲海默癥；骨折，例如髖部骨折。所述受試者可正在進(jìn)行或己經(jīng)進(jìn)行過(guò)外科手術(shù)，例如器官移植、整形外科手術(shù)、關(guān)節(jié)替換(例如髖關(guān)節(jié)替換或膝關(guān)節(jié)替換)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)、支架置入、血管成形術(shù)(angioplasty)或冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)(CABG)。給具有一種或多種所述病變或者具有發(fā)生一種或多種所述病變風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用有效量的本發(fā)明組合物來(lái)治療所述病變或病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一歩包括使用凝結(jié)試驗(yàn)(例如，使用ACT和/或aPTT)監(jiān)測(cè)受試者體內(nèi)LMWH組合物的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在施用LMWH組合物后施用硫酸魚(yú)精蛋白以中和LMWH組合物的部分或全部活性，例如部分或全部抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，LMWH組合物的約50%、60%、70%、80%、90%、95。/。或全部抗IIa活性被中和，例如，在施用魚(yú)精蛋白后的5、10、15、20、25、30、40分鐘之內(nèi)，LMWH組合物的約50%、60%、70%、80%、90%、95。/?；蛉靠笽Ia活性被中和。在一個(gè)實(shí)施方案中，LMWH組合物的約50%、60%、70%、80%、90%、95%或全部抗IIa活性被中和，例如，在施用魚(yú)精蛋白后的5、10、15、20、25、30、40分鐘之內(nèi)，LMWH組合物的約50%、60%、70%、80%、90%、95%或全部抗IIa活性被中和。在一個(gè)實(shí)施方案中，每100IU血漿抗Xa活性的LMWH組合物施用約lmg、2mg、3mg、5mg劑量的魚(yú)精蛋白。例如，可通過(guò)ACT和/或aPTT測(cè)定對(duì)抗Xa活性和/或抗IIa活性的中和。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了治療(例如，治療性或預(yù)防性治療)受試者所患疾病(例如血栓性疾病)的方法。所述方法包括使用本文所述的LMWH組合物從而治療所述疾病，優(yōu)選預(yù)防所述疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是ACS、心肌梗塞(例如NSTEMI或STEMI)、穩(wěn)定型心絞痛和不穩(wěn)定型心絞痛中的一種或多種。優(yōu)選，所述血栓性疾病是動(dòng)脈血栓癥，例如包括STEMI。所述疾病可以與外科手術(shù)介入相關(guān)，例如PCI、支架置入或血管成形術(shù)。例如，受試者可經(jīng)歷外科手術(shù)，具有接受外科手術(shù)的可能或正處于外科手術(shù)康復(fù)期，所述外科手術(shù)例如為心血管手術(shù)(例如，血管成形術(shù)、PCI、支架置入)。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有接受(例如，被考慮接受)外科手術(shù)(例如CABG)的可能。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)靜脈向受試者施用LMWH組合物，例如以約0.03mg/kg0.45mg/kg的劑量施用，例如，0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.22mg/kg、0.25mg/kg、0.27mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.37mg/kg、0.4mg/kg、0.44mg/kg。在優(yōu)選實(shí)施方案中，以約0.10.3mg/kg的劑量經(jīng)靜脈施用LMWH組合物，例如劑量為0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.20mg/kg、0.22mg/kg、0.25mg/kg、0.27mg/kg或0.30mg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)皮下向受試者施用LMWH組合物，例如以約0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.44mg/kg、0.47mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.60mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg的劑量施用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，以約0.151.0mg/kg、0.200.9mg/kg、0.250.9mg/kg、0.300.50mg/kg的劑量經(jīng)皮下施用LMWH組合物，例如劑量為0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.42mg/kg、0.44mg/kg、0.47mg/kg或0.50mg/kg。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使用凝結(jié)試驗(yàn)(例如，使用ACT和/或aPTT)監(jiān)測(cè)受試者體內(nèi)的LMWH組合物的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在外科手術(shù)(例如，血管成形術(shù)、PCI、支架置入)之前、期間或之后監(jiān)測(cè)抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如，通過(guò)ACT和/或aPTT進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在施用LMWH組合物之前、期間或之后監(jiān)測(cè)抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如，通過(guò)ACT和/或aPTT進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)ACT監(jiān)測(cè)抗Xa活性和/或抗IIa活性，并且施用的LMWH劑量可達(dá)到約200350秒的ACT。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在施用LMWH組合物后施用硫酸魚(yú)精蛋白以中和LMWH組合物的部分或全部活性，例如部分或全部抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，LMWH組合物的至少約50M、60%、70%、80%、90%、95%或全部抗IIa活性被中和，例如，在施用魚(yú)精蛋白后的5、10、15、20、25、30、40分鐘之內(nèi)，LMWH組合物的約50%、60%、70%、80%、90%、95。/。或全部抗IIa活性被中和。在一個(gè)實(shí)施方案中，LMWH組合物的至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或全部抗IIa活性被中和，例如，在施用魚(yú)精蛋白后的5、10、15、20、25、30、40分鐘之內(nèi)，LMWH組合物的約50%、60%、70%、80%、90%、95%或全部抗IIa活性被中和。在一個(gè)實(shí)施方案中，每100IU血漿抗Xa活性的LMWH組合物施用約l-5mg劑量(例如，lmg、2mg、3mg、5mg)的硫酸魚(yú)精蛋白。例如，可通過(guò)ACT和/或aPTT測(cè)定抗Xa活性和/或抗IIa活性的中和。在一個(gè)實(shí)施方案中，可在使用硫酸魚(yú)精蛋白之前、期間和/或之后檢測(cè)抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如通過(guò)ACT和/或aPTT進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在外科手術(shù)之前、期間或之后中和抗Xa活性和/或抗IIa活性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可在外科手術(shù)(例如血管成形術(shù)或PCI)期間或之后中和抗Xa活性和/或抗Ia活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在外科手術(shù)(例如CABG)之前中和LMWH組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)患者的不良反應(yīng)，例如硬膜上或脊髓血腫、大出血或出血。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)靜脈或皮下施用所述LMWH組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，將LMWH組合物與其它治療劑組合施用，所述其它治療劑例如為抗凝血?jiǎng)┗蚩寡ㄐ纬蓜?，例如比伐盧定(Angiomax)、ASA、GPIIbIIIa抑制劑(例如，埃替非巴肽(eptifibatide)或阿昔單抗)、ADP抑制劑(例如，Plavix)、rPA、TNKase、阿斯匹林、P2Y12抑制劑、血小板抑制劑、華法林及其組合。本文公開(kāi)的可逆性(可中和)且可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物可在治療患者過(guò)程中提供改進(jìn)的適應(yīng)性，例如對(duì)住院并接受心血管治療(例如手術(shù))可能性評(píng)估的患者。因此，本發(fā)明另一方面公開(kāi)了治療(例如，治療性或預(yù)防性治療)患者所患疾病(例如血栓性疾病或心血管疾病)的方法。所述方法包括25任選地向患者施用本文所述的可逆性且可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物；將患者(已施用或?qū)⑹┯肔MWH組合物)分成不需要外科手術(shù)(例如，將患者分成在出院之前不需要外科手術(shù))和很可能在出院前需要接受外科手術(shù)(即外科手術(shù)介入的候選人)的類別；任選地，如果患者被分到出院前需要接受外科手術(shù)介入的候選人類別，則進(jìn)行監(jiān)測(cè)(例如，使用本文所述的凝結(jié)試驗(yàn)，例如ACT禾f]/或aPTT)所述可逆且可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物和/或中和(例如，使用本文所述施用的硫酸魚(yú)精蛋白)所述可逆且可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)靜脈向受試者施用LMWH組合物，例如以約0.03mg/kg0.45mg/kg的劑量施用，例如，0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.22mg/kg、0.25mg/kg、0.27mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.37mg/kg、0.4mg/kg、0.44mg/kg的劑量施用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，以約0.10.3mg/kg的劑量經(jīng)靜脈施用LMWH組合物，例如，0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.20mg/kg、0.22mg/kg、0.25mg/kg、0.27mg/kg或0.30mg/kg的劑量施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)皮下向受試者施用LMWH組合物，例如以約0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.44mg/kg、0.47mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.60mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg的劑量施用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，以約0.151.0mg/kg、0.200.8mg/kg、0.250.90mg/kg、0.300.50mg/kg的劑量經(jīng)皮下使用LMWH組合物，例如0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.42mg/kg、0.44mg/kg、0.47mg/kg或0.50mg/kg的劑量。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，患者被分到出院前需要接受外科手術(shù)介入(例如，PCI、支架置入或血管成形術(shù))的候選人類別，且對(duì)可逆性且可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物的作用進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)行外科手術(shù)，并且在手術(shù)之前、期間和之后中的一個(gè)或多個(gè)或所有時(shí)間監(jiān)測(cè)可逆性且可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在外科手術(shù)(例如，PCI)之前和/或期間監(jiān)測(cè)患者的ACT為約200350。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，患者被分到出院前需要接受外科手術(shù)介入(例如CABG)的候選人類別，且對(duì)可逆性且可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物的作用進(jìn)行監(jiān)測(cè)和/或中和。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)行外科手術(shù)，并且在手術(shù)之前、期間和之后中的一個(gè)或多個(gè)或所有時(shí)間監(jiān)測(cè)可逆性且可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在外科手術(shù)(例如CABG)之前監(jiān)測(cè)患者的ACT為約400600(例如400500)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者正在接受對(duì)血栓性疾病的治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是ACS、心肌梗塞(例如NSTEMI或STEMI)、穩(wěn)定型心絞痛和不穩(wěn)定型心絞痛中的一種或多種。優(yōu)選地，所述血栓性疾病是動(dòng)脈血栓癥，例如包括ST段抬高心肌梗死(STEMI)。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了對(duì)使用本文所述可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物治療的患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法。所述方法包括任選地向受試者施用本文所述可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物；和對(duì)受試者(己施用可監(jiān)測(cè)的LMWH組合物)的aPTT和/或ACT進(jìn)行評(píng)估。在一個(gè)實(shí)施方案中，在使用LMWH治療受試者之前測(cè)定基線aPTT和/或ACT。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)接受LMWH的患者的aPTT禾口/或ACT與基線aPTT和/或ACT進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，在以下階段中的一個(gè)、多個(gè)或全部階段中監(jiān)測(cè)受試者接受LMWH組合物之前、期間和之后。在一個(gè)實(shí)施方案中，在外科手術(shù)(例如，PCI、支架置入或血管成形術(shù))之前、期間和/或之后監(jiān)測(cè)受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，在外科手術(shù)(例如PCI)之前和/或期間監(jiān)測(cè)LMWH組合物的ACT為約200350。在一個(gè)實(shí)施方案中，在外科手術(shù)(例如CABG)之前監(jiān)測(cè)LMWH組合物的ACT為約400600(例如400500)。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了對(duì)已經(jīng)施用本文所述可逆性LMWH組合物的患者的治療方法。所述方法包括任選地向患者施用本文所述的可逆性LMWH組合物；和中和(例如，如本文所述(例如施用硫酸魚(yú)精蛋白)可逆性LMWH組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在以下階段中的一個(gè)、多個(gè)或全部階段中監(jiān)測(cè)受試者施用硫酸魚(yú)精蛋白之前、期間和之后。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了對(duì)具有高抗IIa活性的LMWH(例如，本文所述的LMWH組合物)的使用提供建議或使用說(shuō)明(例如，書面說(shuō)明、口頭說(shuō)明或計(jì)算機(jī)生成的說(shuō)明書)的方法。所述方法包括對(duì)患者提供關(guān)于使用的說(shuō)明，例如，具有腎功能異?；蛱悄虿』蚺c凝血塊結(jié)合的凝血酶(clotboundthrombin)的患者；接受PCI、支架置入、CABG、血管成形術(shù)等的候選患者；介入性心臟病患者；需要對(duì)先前施用的LMWH進(jìn)行中和的患者，例如使用硫酸魚(yú)精蛋白進(jìn)行中和；具有硬膜上血腫或脊髓血腫、大出血和/或出血風(fēng)險(xiǎn)的患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述使用說(shuō)明適合于LMWH組合物針對(duì)ACS、心肌梗塞(例如NSTEMI或STEMI)、穩(wěn)定型心絞痛和不穩(wěn)定型心絞痛的施用，例如在患者亞群中的施用，例如患有腎功能異常的患者或老年患者(例如60歲以上的患者)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述使用說(shuō)明適合于LMWH組合物針對(duì)血栓性疾病的施用，例如與外科手術(shù)介入(例如，PCI、支架置入或血管成形術(shù))相關(guān)的血栓性疾病。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了對(duì)本文所述LMWH組合物的使用提出建議的方法，該方法包括提供關(guān)于使用ACT和/或aPTT監(jiān)測(cè)抗Xa活性和/或抗IIa活性的說(shuō)明。另一個(gè)方面，本發(fā)明公開(kāi)了生產(chǎn)LMWH組合物(例如本文所述的LMWH組合物)的方法。所述方法包括以下一個(gè)或多個(gè)步驟(1)例如，使用極性有機(jī)溶劑(例如，如乙醇的醇類)、極性非有機(jī)溶劑(例如水)和鹽(例如，如乙酸鈉的鈉鹽或如乙酸鈣的鈣鹽)對(duì)包含葡胺聚糖(GAG)的樣品(例如UFH)進(jìn)行第一次沉淀以獲得第一上清液；(2)例如，使用極性有機(jī)溶劑(例如，如乙醇的醇類)和極性非有機(jī)溶劑(例如水)對(duì)所述第一上清液進(jìn)行第二次沉淀以獲得沉淀物(可用于提供如本文其它部分討論的快速移動(dòng)組分)；(3)將所述沉淀物優(yōu)選溶于水中并使用切割未硫酸酯化糖醛酸中的糖苷鍵(例如，與N-乙酰葡糖胺殘基相鄰的未硫酸酯化糖醛酸中的糖苷鍵)的試劑切割已溶解的沉淀物。一個(gè)實(shí)例為本文所述的肝素酶III，優(yōu)選MOll，優(yōu)選在乙酸鈉存在的條件下，且優(yōu)選完成切割反應(yīng)(例如，通過(guò)UV平臺(tái)表明完成切割反應(yīng))以提供經(jīng)切割的制劑；(4)沉淀經(jīng)切割的制劑，例如，使用鹽(例如鈉鹽，優(yōu)選氯化鈉)和極性有機(jī)溶劑(例如，如甲醇的醇類)以形成含糖類的固體，所述糖類具有814個(gè)二糖(例如812個(gè)二糖)的平均鏈長(zhǎng)。(5)將來(lái)自所述固體的材料進(jìn)行純化，例如色譜純化(如分子大小篩選(排阻色譜)、離子交換色譜)或過(guò)濾，以提供平均分子量高于步驟(4)的制品。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述平均分子量較高的制品具有916個(gè)二糖的平均鏈長(zhǎng)或50009000Da的平均分子量。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了制備具有約916個(gè)二糖的平均鏈長(zhǎng)的LMWH組合物的方法。所述方法包括提供平均鏈長(zhǎng)小于916個(gè)二糖(優(yōu)選約814個(gè)二糖，例如812個(gè)二糖)的LMWH組合物前體；禾口加工所述LMWH組合物前體以獲得平均鏈長(zhǎng)為約916個(gè)二糖的LM麗。優(yōu)選地，所述加工包括基于大小的篩選，例如依據(jù)大小的分離(例如通過(guò)一個(gè)或多個(gè)體積排阻色譜)、離子交換色譜或過(guò)濾。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LMWH組合物前體是具有約814個(gè)二糖(例如，812個(gè)二糖)的平均鏈長(zhǎng)的制劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中通過(guò)包括鹽沉淀和對(duì)較高分子量制劑(例如UFH)的酶消化獲得所述LMWH組合物前體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹽是單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子的鹽?？墒褂玫乃鰡蝺r(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子的實(shí)例包括，例如鈉、鉀、銣、銫、鋇、鈣、鎂、鍶及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子的鹽是單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子的乙酸i卜rm。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于消化的一個(gè)或多個(gè)酶切割未硫酸酯化糖醛酸中的一個(gè)或多個(gè)糖苷鍵，例如，與N-乙酰葡糖胺殘基臨近的未硫酸酯化糖醛酸中的糖苷鍵。可使用的酶的實(shí)例包括，例如肝素酶III，肝素酶III突變體，例如美國(guó)專利第5,896,789號(hào)所述的肝素酶III突變體(例如，將一個(gè)或多個(gè)組氨酸殘基取代為丙氨酸的肝素酶III突變體，其中所述組氨酸殘基選自于由His36、His105、HisllO、His139、His152、His225、His234、His241、His424、His469禾BHis539組成的組)，以及來(lái)自多形擬桿菌(^zcteraW^f/^to/oto畫/mw)的肝素硫酸酯葡胺聚糖裂解酶III。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于消化的酶是將氨基酸序列中第225位丙氨酸取代成丙氨酸的突變肝素酶III。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過(guò)以下步驟獲得組合物前體(1)對(duì)包含葡胺聚糖(GAG)的樣品(例如UFH)進(jìn)行第一次沉淀以獲得第一上清液例如，使用極性有機(jī)溶劑(例如，如乙醇的醇類)、極性非有機(jī)溶劑(例如水)和鹽(例如，如乙酸鈉的鈉鹽或如乙酸鈣的鈣鹽)對(duì)包含葡胺聚糖(GAG)的樣品(例如UFH)進(jìn)行第一次沉淀以獲得第一上清液；C2)對(duì)所述第一上清液進(jìn)行第二次沉淀，例如，使用極性有機(jī)溶劑(例如，如乙醇的醇類)和極性非有機(jī)溶劑(例如水)對(duì)所述第一上清液進(jìn)行第二次沉淀以獲得沉淀物(該沉淀物可用于提供如本文其它部分討論的快速移動(dòng)組分)；(3)將所述沉淀物溶解并使用肝素酶III(優(yōu)選MOll)切割溶解的沉淀物，優(yōu)選在乙酸鈉存在的條件下，且優(yōu)選完成切割反應(yīng)(例如，通過(guò)大于9.8的UV吸收表明完成切割)，以獲得切割后的制劑；本發(fā)明的一個(gè)方面公開(kāi)了制備LMWH組合物(例如本文所述LMWH組合物)的方法。所述方法包括(1)對(duì)包含葡胺聚糖(GAG)的樣品(例如UFH)進(jìn)行第一次沉淀以獲得第一上清液例如，使用極性有機(jī)溶劑(例如，如乙醇的醇類)、極性非有機(jī)溶劑(例如水)和鹽(例如，如乙酸鈉的鈉鹽或如乙酸鈣的鈣鹽)對(duì)包含葡胺聚糖(GAG)的樣品(例如UFH)進(jìn)行第一次沉淀以獲得第一上清液；(2)對(duì)所述第一上清液進(jìn)行第二次沉淀以獲得沉淀物例如，使用極性有機(jī)溶劑(例如，如乙醇的醇類)和極性非有機(jī)溶劑(例如水)對(duì)所述第一上清液進(jìn)行第二次沉淀以獲得沉淀物(可用于提供如本文其它部分討論的快速移動(dòng)組分)；(3)任選地將所述沉淀物溶解并使用本文所述的酶切割溶解的沉淀物，其中優(yōu)選在乙酸鈉存在的條件下，且優(yōu)選完成切割反應(yīng)(例如，通過(guò)大于9.8的UV吸收表明完成切割)，以獲得切割后的制劑；和(4)任選地加工所得組分以產(chǎn)生LMWH組合物。30在一個(gè)實(shí)施方案中，用于消化的一個(gè)或多個(gè)酶切割未硫酸酯化糖醛酸中的一個(gè)或多個(gè)糖苷鍵，例如，與N-乙酰葡糖胺殘基臨近的未硫酸酯化糖醛酸中的糖苷鍵?？墒褂玫拿傅膶?shí)例包括，例如肝素酶ni，肝素酶in突變體，例如美國(guó)專利第5,896,789號(hào)所述的肝素酶III突變體(例如，將一個(gè)或多個(gè)組氨酸殘基取代為丙氨酸的肝素酶III突變體，其中所述組氨酸殘基選自于由His36、His105、HisllO、His139、His152、His225、His234、His241、His424、His469和His539組成的組)，以及來(lái)自多形擬桿菌的肝素硫酸酯葡胺聚糖裂解酶in。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于消化的酶是將氨基酸序列中第225位丙氨酸取代成丙氨酸的突變肝素酶III。在一個(gè)實(shí)施方案中，消化后的組分為終產(chǎn)物。在其它實(shí)施方案中，所述方法可包括一個(gè)或多個(gè)其它加工步驟以獲得終產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括加工消化后的組分以獲得平均鏈長(zhǎng)為916個(gè)二糖的LMWH組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用體積排阻色譜、離子交換色譜和/或過(guò)濾以獲得平均鏈長(zhǎng)為916個(gè)二糖的LMWH組合物。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了評(píng)價(jià)或加工如UFH的GAG的方法以確定GAG是否適合用于加工成LMWH組合物，例如本文所述的LMWH組合物。所述方法包括測(cè)定GAG制劑中存在的N-乙酰基的數(shù)量，將測(cè)得的數(shù)量與預(yù)選的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，并基于是否滿足預(yù)選的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)GAG制劑做出判定。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)是否滿足預(yù)選的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)做出判定或采取步驟，例如將GAG制劑分類、接受或放棄、加工成原料藥或藥物產(chǎn)物或進(jìn)行記錄或修改記錄以反映所述判定。在一些實(shí)施方案中，如果不能滿足預(yù)選的標(biāo)準(zhǔn)，可做出改變LMWH組合物生產(chǎn)過(guò)程中一個(gè)或多個(gè)步驟的判定。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)是如通過(guò)摩爾％測(cè)定，相對(duì)于總葡糖胺含量，GAG制劑中存在的N-乙?；繛榧s11%或更多?？蓪⒕哂写朔秶鷥?nèi)的N-乙?；康腉AG制劑表示為適合于加工成LMWH組合物(例如本文所述的LMWH組合物)的GAG帝lj劑。在此類實(shí)施方案中，在滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)的條件下，可接受GAG制劑并將其加工成中間產(chǎn)物、原料藥或藥物產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用例如核磁共振(NMR)測(cè)定GAG制劑中存在的N-乙?；?。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從加工的觀點(diǎn)來(lái)看，木文公開(kāi)的方法是有用的，例如監(jiān)測(cè)或保證批次間的一致性或質(zhì)量，或由預(yù)選的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估樣品。本發(fā)明一方面公開(kāi)了評(píng)價(jià)或加工LMWH中間制劑(例如通過(guò)本文所述方法生產(chǎn)的)以確定所述中間制劑是否適合用于加工成LMWH組合物。所述LMWH中間制劑是通過(guò)如本文所述的使用鈉鹽或乙酸鈉在溶劑中沉淀包含葡胺聚糖(GAG)的樣品而獲得的快速移動(dòng)組分。所述方法包括將LMWH中間制劑中一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)部分(例如，硫酸酯化艾杜糖、與糖醛酸連接的N-硫酸酯化己糖胺、環(huán)氧化物和6-0硫酸酯化己糖胺)的量與普通肝素起始原料中相同結(jié)構(gòu)部分的量進(jìn)行比較，并基于是否滿足起始原料和LMWH中間制劑之間的預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中間LMWH制劑做出判定。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)否滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)來(lái)做出判定或采取步驟，例如將中間LMWH制劑分類、接受或放棄、加工成原料藥或藥物產(chǎn)物或進(jìn)行記錄或修改記錄以反映所述判定。在一些實(shí)施方案中，如果不能滿足預(yù)選的標(biāo)準(zhǔn)，可做出改變LMWH組合物生產(chǎn)過(guò)程中一個(gè)或多個(gè)步驟的判定。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)是與起始原料相比，中間制劑中的硫酸酯化艾杜糖醛酸減少。可將硫酸酯化艾杜糖醛酸含量減少的中間制劑表示為適合于進(jìn)一步加工成LMWH組合物(例如本文所述的LMWH組合物)的中間制劑。在此類實(shí)施方案中，在滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)的條件下，可接受中間制劑并將其加工成進(jìn)一步的中間產(chǎn)物、原料藥或藥物產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)是與起始原料相比，中間制劑中與糖醛酸(例如，艾杜糖醛酸和/或葡萄糖醛酸)連接的N-硫酸酯化己糖胺增加?？蓪⑴c糖醛酸連接的N-硫酸酯化己糖胺含量增加的中間制劑表示為適合于進(jìn)一步加工成LMWH組合物(例如本文所述的LMWH組合物)的中間制劑。在此類實(shí)施方案中，在滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)的條件下，可接受中間制劑并將其加工成進(jìn)一歩的中間產(chǎn)物、原料藥或藥物產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)是與起始原料相比，中間制劑中的環(huán)氧化物減少。可將環(huán)氧化物含量減少的中間制劑表示為適合于進(jìn)一步加工成LMWH組合物(例如本文所述的LMWH組合物)的中間制劑。在此類實(shí)施方案中，在滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)的條件下，可接受中間制劑并將其加工成進(jìn)一步的中間產(chǎn)物、原料藥或藥物產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)是與起始原料相比，中間制劑中的6-0硫酸酯化己糖胺增加?？蓪?-0硫酸酯化己糖胺含量增加的中間制劑表示為適合于進(jìn)一步加工成LMWH組合物(例如本文所述的LMWH組合物)的中間制劑。在此類實(shí)施方案中，在滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)的條件下，可接受中間制劑并將其加工成進(jìn)一步的中間產(chǎn)物、原料藥或藥物產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用核磁共振(NMR)、毛細(xì)管電泳(CE)和高效液相色譜(HPLC)中的一個(gè)或多個(gè)測(cè)定起始原料和/或中間制劑中的結(jié)構(gòu)部分的量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從加工的角度來(lái)看，本文公開(kāi)的方法是有用的，例如可用于監(jiān)測(cè)或保證批次間的一致性或質(zhì)量，或由預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估樣品。UFH樣品的某些特征可使其成為用于生產(chǎn)本發(fā)明LMWH的更優(yōu)選的起始原料。因此，本發(fā)明的另一方面提供了評(píng)價(jià)UFH制劑作為生產(chǎn)本文所述LMWH組合物的起始原料的方法。所述方法包括根據(jù)與UFH樣品是否適合用于制備本文所述LMWH相關(guān)的參數(shù)對(duì)UFH制劑提供評(píng)價(jià)；并且，任選地提供關(guān)于測(cè)定的參數(shù)值(例如，與存在、量、分布或不存在相關(guān)的值)是否滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)的判定，例如，存在或存在量在預(yù)選范圍之內(nèi)，從而評(píng)估UFH樣品。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)得到滿足，并且選擇UFH樣品并將其加工成LMWH。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述參數(shù)為表2列出的結(jié)構(gòu)的存在或數(shù)量，優(yōu)選與LMWH的生產(chǎn)方法中的步驟的效率相關(guān)的的結(jié)構(gòu)，例如促進(jìn)肝素酶切割或正相關(guān)于肝素酶切割的結(jié)構(gòu)(例如Hnac(帖))。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括檢測(cè)UFH樣品中Hwac(to:)的量是否具有與參考值的預(yù)定關(guān)系，例如等于或大于預(yù)選的參考值。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，還要對(duì)用于生產(chǎn)LMWH的中間產(chǎn)物的參數(shù)值進(jìn)行測(cè)定，并且任選地，該參數(shù)值也必須滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)以選擇用于生產(chǎn)LMWH的UFH。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了評(píng)價(jià)UFH制劑作為制備本文所述LMWH組合物的起始原料的方法。33所述方法包括，任選地操作(例如，沉淀)UFH樣品以提供中間產(chǎn)物(優(yōu)選用于產(chǎn)生此中間產(chǎn)物的步驟和中間產(chǎn)物與用于生產(chǎn)LMWH的方法的步驟和中間產(chǎn)物相同)；根據(jù)與中間制劑是否適合用于制備本文所述LMWH相關(guān)的參數(shù)對(duì)UFH制劑提供評(píng)價(jià)；和任選地提供關(guān)于測(cè)定的參數(shù)值(例如，與存在、量、分布或缺失相關(guān)的值)是否滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)的判定，例如，存在或存在于預(yù)選范圍之內(nèi)，從而評(píng)估UFH制劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)得到滿足，并且選擇UFH樣品并將其加工成LMWH。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述參數(shù)為表2列出的結(jié)構(gòu)的存在或量，優(yōu)選與生產(chǎn)LMWH方法中的步驟的效率相關(guān)的參數(shù)，例如促進(jìn)或正相關(guān)于肝素酶切割的結(jié)構(gòu)(例如HwAe②在))。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括檢測(cè)中間體樣品中HwAe(^)的量是否具有與參考值的預(yù)定關(guān)系，例如等于或大于預(yù)選的參考值。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，還要對(duì)UFH的參數(shù)值進(jìn)行測(cè)定，并且任選地，該參數(shù)值也必須滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)以選擇用于制備LMWH的UFH。在這些方法中的一個(gè)方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)是否滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)而做出判定或采取步驟，例如將樣品分類、選擇、接受或放棄、釋放或保留、加工成藥物產(chǎn)物、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)移到不同位置、配制、標(biāo)記、包裝、投放到市場(chǎng)中，或銷售或許諾銷售，或進(jìn)行記錄或修改記錄以反映所述判定。例如，基于判定結(jié)果或是否存在一種或多種受試實(shí)體，或基于與參考標(biāo)準(zhǔn)的比較，從而對(duì)取樣的該批次進(jìn)行加工，例如，進(jìn)行本文所述的加工。在任一方法中，優(yōu)選的實(shí)施方案包括使用NMR分析樣品。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，任一方法可包括提供測(cè)定參數(shù)值與一個(gè)或多個(gè)參考值的比較，從而對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)估。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述比較包括檢測(cè)試驗(yàn)值是否具有與參考值的預(yù)定關(guān)系，例如測(cè)定其是否滿足參考值。所述值不需要為數(shù)值，但也可以是僅表明受試實(shí)體是否存在的標(biāo)志。任一方法的優(yōu)選實(shí)施方案可包括測(cè)定檢測(cè)值是否等于或大于參考值，是否小于或等于參考值，或是否處于范圍之內(nèi)(包括或不包括端點(diǎn)中的一個(gè)或兩個(gè))。在任一方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，可保存所述檢測(cè)值或關(guān)于是否滿足預(yù)選34標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)志，例如保存在計(jì)算機(jī)可讀的記錄中。在任一方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)以下一個(gè)、多個(gè)或全部步驟制備中間產(chǎn)物(1)例如，使用極性有機(jī)溶劑(例如，如乙醇的醇類)、極性非有機(jī)溶劑(例如水)和鹽(例如，如乙酸鈉的鈉鹽)對(duì)UFH樣品進(jìn)行第一次沉淀以獲得第一上清液；(2)例如，使用極性有機(jī)溶劑(例如，如乙醇的醇類)和極性非有機(jī)溶劑(例如水)對(duì)所述第一上清液進(jìn)行第二次沉淀以獲得沉淀物(可用于提供如本文其它部分討論的快速移動(dòng)組分)；(3a)將所述沉淀物溶解，優(yōu)選溶于水中；(3b)使用切割未硫酸酯化糖醛酸中的糖苷鍵(例如，與N-乙酰葡糖胺殘基臨近的未硫酸酯化糖醛酸中的糖苷鍵)的一個(gè)或多個(gè)酶(例如肝素酶III，優(yōu)選MOll)切割溶解的沉淀物，優(yōu)選在乙酸鈉存在的條件下，且優(yōu)選完成切割反應(yīng)(例如，通過(guò)大于9.8的UV吸收表明完成切割反應(yīng))，以產(chǎn)生經(jīng)切割的制劑；盡管所述方法可使用其它中間產(chǎn)物，但優(yōu)選步驟(2)或(3a)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。另一方面，本發(fā)明提供了評(píng)估本文所述LMWH制劑的方法。所述方法包括，提供本文所述LMWH制劑；測(cè)定所述制劑是否存在或具有本文所述的結(jié)構(gòu)、活性或功能，從而評(píng)估本文所述LMWH制劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述測(cè)定包括測(cè)定所述結(jié)構(gòu)、活性或功能是否處于預(yù)選水平或在預(yù)選范圍內(nèi)，例如本文公開(kāi)的水平或范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了評(píng)估或加工本文所述LMWH組合物的方法。所述方法包括提供與表10A中列出的峰相關(guān)的參數(shù)的評(píng)估。此類參數(shù)可包括峰的存在、相對(duì)分布或峰值或是峰的存在、相對(duì)分布或峰值的函數(shù)，并且任選地確定測(cè)定的參數(shù)值(例如，與存在、量、分布或缺失相關(guān)的值)是否滿足預(yù)選的標(biāo)準(zhǔn)(例如，存在或存在于預(yù)選的范圍之內(nèi))，從而評(píng)估或加工混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)電泳(例如毛細(xì)管電泳)對(duì)肝素酶i、肝素酶n、肝素酶m消化樣品的降解物進(jìn)行分析(例如分離)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括評(píng)價(jià)樣品以確定是否存在一個(gè)或多個(gè)表10A中列出的峰。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法可包括提供測(cè)定參數(shù)值與一個(gè)或多個(gè)參考值的比較，從而對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)估。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述比較包括測(cè)定檢測(cè)值是否具有與參考值的預(yù)定關(guān)系，例如是否滿足參考值。所述值不需要為數(shù)值，但也可以是僅表明受試實(shí)體是否存在的標(biāo)志。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括測(cè)定測(cè)定值是否等于或大于參考值，是否小于或等于參考值，或是否處于范圍之內(nèi)(包括或不包括端點(diǎn)中的一個(gè)或兩個(gè))。舉例來(lái)說(shuō)，可測(cè)定表10A中列出的峰值，并且任選處于預(yù)選范圍之內(nèi)的峰值，例如對(duì)應(yīng)于表10A中范圍的范圍。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，各個(gè)峰值與在表10A列出的類似，各個(gè)峰值均在表10A提供的范圍之內(nèi)，峰lO和峰ll的值在表10A提供的范圍之內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可保存所述檢測(cè)值或關(guān)于是否滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)志，例如保存在計(jì)算機(jī)可讀的記錄中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)是否滿足預(yù)選的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)做出判定或采取歩驟，例如將樣品分類、選擇、接受或放棄、釋放或保留、加工成藥物產(chǎn)物、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)移到不同位置、配制、標(biāo)記、包裝、投放到市場(chǎng)中，或銷售或許諾銷售，或記錄或修改記錄以反映所述判定。例如，基于判定結(jié)果或是否存在一種或多種受試實(shí)體，或基于與參考標(biāo)準(zhǔn)的比較，從而對(duì)取樣的該批次進(jìn)行加工，例如，進(jìn)行本文所述的加工?？墒褂胏e測(cè)定表10A中的結(jié)構(gòu)，并且在必要時(shí)通過(guò)其它分析方法進(jìn)行另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了評(píng)估或加工本文所述LMWH制劑的方法。所述方法包括提供經(jīng)肝素酶i、肝素酶n、肝素酶m消化并經(jīng)如ce的分離技術(shù)分離的LMWH制劑；檢測(cè)是否存在表10A中列出的一個(gè)或多個(gè)峰。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括測(cè)定表10A列出的峰是否在表IOA中的預(yù)選范圍之內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，各個(gè)峰值與在表10A列出的類似，各個(gè)峰值均在表IOA提供的范圍之內(nèi)，峰10和峰11的值在表10A提供的范圍之內(nèi)。另一方面，本發(fā)明提供了評(píng)估或加工本文所述LMWH組合物的方法。本發(fā)明包括提供對(duì)與表11A中一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的參數(shù)的評(píng)估。此類參數(shù)可包括峰的存在、相對(duì)分布或峰值或是峰的存在、相對(duì)分布或峰值的函數(shù)，并且任選地確定測(cè)定的參數(shù)值(例如，與存在、量、分布或缺失相關(guān)的值)是否滿足預(yù)選的標(biāo)準(zhǔn)(例如，存在或存在于預(yù)選的范圍之內(nèi))，從而評(píng)估或加工混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括使用2D-NMR分析所述組合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括評(píng)估樣品以確定是否存在表11A中提供的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括提供測(cè)定參數(shù)值與一個(gè)或多個(gè)參考值的比較，從而對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)估。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述比較包括測(cè)定檢測(cè)值是否具有與參考值的預(yù)定關(guān)系，例如測(cè)定檢測(cè)值是否滿足參考值。所述值不需要為數(shù)值，但也可以是僅表明所述結(jié)構(gòu)是否存在的標(biāo)志。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括測(cè)定檢測(cè)值是否等于或大于參考值，是否小于或等于參考值，或是否處于范圍之內(nèi)(包括或不包括端點(diǎn)中的一個(gè)或兩個(gè))。舉例來(lái)說(shuō)，可測(cè)定表11A中列出結(jié)構(gòu)的量，并且任選地處于預(yù)選范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)，例如對(duì)應(yīng)于表11A中范圍的范圍。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，各結(jié)構(gòu)的量與在表11A列出的類似，各結(jié)構(gòu)的量均在表11A提供的范圍之內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可保存所述檢測(cè)值或關(guān)于是否滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)志，例如保存在計(jì)算機(jī)可讀的記錄中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)是否滿足預(yù)選的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)做出判定或采取步驟，例如將樣品分類、選擇、接受或放棄、釋放或保留、加工成藥物產(chǎn)物、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)移到不同位置、配制、標(biāo)記、包裝、投放到市場(chǎng)中，或銷售或許諾銷售，或記錄或修改記錄以反映所述判定。例如，基于判定結(jié)果或是否存在一種或多種結(jié)構(gòu)，或基于與參考標(biāo)準(zhǔn)的比較，從而對(duì)取樣的該批次進(jìn)行加工，例如，進(jìn)行本文所述的加工?？墒褂?DNMR測(cè)定表11A中的結(jié)構(gòu)，并且在必要時(shí)通過(guò)其它分析方法進(jìn)行測(cè)定。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了評(píng)估或加工本文所述LMWH制劑的方法。所述方法包括提供經(jīng)2DNMR分析的LMWH制劑，測(cè)定是否存在表11A中列出的一種或多種結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括測(cè)定表11A中列出的結(jié)構(gòu)是否位于預(yù)選范圍之內(nèi)，例如對(duì)應(yīng)于表11A中范圍1的范圍。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，各結(jié)構(gòu)的量與在表11A列出的類似，各結(jié)構(gòu)的量均在表11A提供的范圍之內(nèi)。本文所述的一些方法包括對(duì)受試實(shí)體是否以預(yù)選水平出現(xiàn)或是否在預(yù)選范圍內(nèi)做出判斷，并且將所述水平或范圍表示為特定測(cè)量單位，例如，摩爾%，例如以X-Y摩爾c/。的范圍存在。任何人均可實(shí)施以摩爾％為單位測(cè)定受試實(shí)體的量的方法，并隨后將測(cè)定量與表示為摩爾％(在此實(shí)例中為X-Y摩爾%)的參考進(jìn)行比較。然而，以摩爾％為單位進(jìn)行的測(cè)定并不一定與也以摩爾%表示的參考值進(jìn)行比較。在以摩爾％的單位表示時(shí)，所述樣品具有的受試實(shí)體的實(shí)際水平可被表示為X-Y。也可使用其它單位，例如使用重量％表示所述實(shí)際水平。不管用什么單位表示，所述實(shí)際水平都是相同的。本方法中摩爾％的說(shuō)法僅用來(lái)表明受試實(shí)體的實(shí)際含量。只要以其它單位表示的參考值與以摩爾％(在此實(shí)例中為X-Y摩爾％)表示的參考值對(duì)應(yīng)于相同的受試實(shí)體量，就可使用其它單位測(cè)量受試實(shí)體的水平并且以其它單位表示參考值。因此，要求以X-Y摩爾。/。表示受試實(shí)體的存在量的方法可通過(guò)用其它測(cè)量單位(例如，重量％、鏈的數(shù)量或e/。AUC)表示該受試實(shí)體的存在范圍，其中，用其它測(cè)量單位表示的范圍對(duì)應(yīng)于以摩爾％(在此實(shí)例中為X-Y摩爾。/。)給出的相同量的受試實(shí)體?？山Y(jié)合本說(shuō)明書實(shí)施本領(lǐng)域已知方法建立其它測(cè)量單位的函數(shù)等價(jià)范圍。例如，可提供在X-Y摩爾。/。范圍之內(nèi)的樣品，并隨后建立這些樣品的以其它測(cè)量單位表示的對(duì)應(yīng)范圍。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)可體現(xiàn)于以下具體實(shí)施方案和權(quán)利要求書中。首先簡(jiǎn)要描述附圖。圖l:描述M118-REH生產(chǎn)過(guò)程四個(gè)步驟的流程圖。圖2A:描述經(jīng)肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III消化的依諾肝素的毛細(xì)管電泳圖譜。圖2B:描述經(jīng)肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III消化的M118-REH的毛細(xì)管電泳圖譜。圖3:描述對(duì)經(jīng)離子對(duì)RPHPLC分析的M118-REH降解物進(jìn)行柱后標(biāo)記后產(chǎn)生的UV圖譜和熒光圖譜的比較。上側(cè)跡線表示232nm下的UV檢測(cè)，下側(cè)跡線表示410nm下的熒光檢測(cè)。箭頭標(biāo)記的位置顯示主要存在于熒光圖譜中但未在UV圖譜中觀察到的物質(zhì)；他們表示M118-REH中來(lái)自起始UFH的非還原性末端糖。圖4:描述M118-REH的二維NMRHSQC分析圖。圖5:描述還原性和非還原性末端形成的示意圖。圖6:可注射M118-REH的生產(chǎn)流程圖。圖7:描述通過(guò)硫酸魚(yú)精蛋白在體外中和LMWH的示意圖。較淺點(diǎn)表示"M118"(M118-REH在此圖中的簡(jiǎn)稱)；較深點(diǎn)表示依諾肝素鈉。圖7由乘lj余抗Xa活性百分比對(duì)魚(yú)精蛋白/LMWH活性比值繪制。圖8:描述使用0.01mg/ml的不同肝素后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)釋放TFPI的示意圖(孔的數(shù)量n=3,平均值±STDEM)。在溫育24和48小時(shí)后，M118(M118-REH在此圖中的簡(jiǎn)稱)(各組中從左起的第二個(gè))與對(duì)照(各組中從左起的第一個(gè))和對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)顯著性(pO.Ol)。圖9:描述向NHP模型靜脈注射M118-REH后，通過(guò)ACT和aPTT測(cè)定的所述M118-REH藥效學(xué)的示意圖。圖10:描述向氯化鐵誘發(fā)的血栓癥模型靜脈注射0.5mg/kg(第三個(gè))和1mg/kg(第六個(gè))M118-REH，2mg/kg、3mg/kg和4mg/kg(分別為第二、第四和第五個(gè))依諾肝素鈉后，TTO的比較示意圖。與對(duì)照(第一個(gè))相比，所有的處理組均具有顯著延長(zhǎng)的TTO。M118-REH(1mg/kg)和依諾肝素鈉(3mg/kg)之間存在統(tǒng)計(jì)顯著性(pO.Ol)。圖11:描述通過(guò)硫酸魚(yú)精蛋白中和Sprague-Dawley大鼠模型中肝素(M118-REH、依諾肝素鈉和UFH)的抗Xa活性的示意圖。圖ll是剩余抗Xa活性百分比與時(shí)間的曲線圖，比例為0.5mg或1mg魚(yú)精蛋白/100IU抗Xa活性肝素(在UFH中為0.5mg或1mg魚(yú)精蛋白lmgUFH)。圖12:描述ACT測(cè)定與M118-REH(三角和實(shí)線)、依諾肝素(實(shí)心圓和虛線)和UFH(方塊和虛線)的抗Xa活性之間相關(guān)性的示意圖。此數(shù)據(jù)表明與依諾肝素或UFH相比，特定劑量的M118-REH表現(xiàn)出ACT與抗Xa活性之間的最佳相關(guān)性(r、0.85)。圖13:犬深動(dòng)脈血栓模型(Lucchesi模型)中抗Xa因子活性(上圖)和抗IIa因子活性(下圖)與時(shí)間關(guān)系的示意圖。圖中顯示的溶劑對(duì)照組隨后接受150IU/kg的M118-REH。誤差范圍是士SE。UFH，普通肝素。圖14:犬深動(dòng)脈血栓模型(Lucchesi模型)中抗Xa因子活性與抗IIa因子活性之間的相關(guān)性。各個(gè)點(diǎn)代表來(lái)自單個(gè)動(dòng)物的數(shù)據(jù)。顯示了所有處理組的全部動(dòng)物。M118-REH和普通肝素(UFH)組的相關(guān)系數(shù)(r^分別為0.890和0.465。圖15:犬深動(dòng)脈血栓模型中抗Xa因子活性/抗IIa因子活性比值隨時(shí)間的變化。誤差范圍是土SE(考慮附圖清晰度僅顯示上限)。UFH，普通肝素。圖16:犬深動(dòng)脈血栓模型中經(jīng)ACT(上圖)、aPTT(中圖)和PT(下圖)測(cè)定的凝結(jié)活性與時(shí)間關(guān)系的示意圖。圖中顯示的溶劑對(duì)照組隨后接受150IU/kg的M118-REH。誤差范圍是士SE。UFH，普通肝素。圖17:發(fā)生股動(dòng)脈閉塞的動(dòng)物占犬深動(dòng)脈血栓模型的百分?jǐn)?shù)。通過(guò)多普勒血流儀在試驗(yàn)開(kāi)始后180分鐘的時(shí)間段內(nèi)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。閉塞定義為流過(guò)損傷動(dòng)脈的血流量低于基線血流的2%。UFH，普通肝素。具體實(shí)施例方式優(yōu)化的LMWH在很多臨床條件下，因?yàn)長(zhǎng)MWH具有更可預(yù)知的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)并且可經(jīng)皮下給藥，所以商購(gòu)LMWH制劑優(yōu)于UFH制劑。然而，目前可用的LMWH制劑缺少UFH所具有的很多有用性質(zhì)，例如較高的抗IIa活性、使用硫酸魚(yú)精蛋白的可逆性(可中和性)和可監(jiān)測(cè)性。因此，在某些臨床條件下，LMWH不是最優(yōu)或?qū)嶋H的治療選擇。本發(fā)明公開(kāi)了經(jīng)設(shè)計(jì)其臨床性質(zhì)優(yōu)于其它商購(gòu)LMWH制劑和UFH制劑的LMWH制劑。所述臨床性質(zhì)包括，例如使用硫酸魚(yú)精蛋白的可逆性、可預(yù)知的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)、抗IIa活性、基本40恒定的抗Xa活性與抗IIa活性的比值、可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(例如，ACT或aPTT)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的活性水平、皮下生物利用度和降低的HIT發(fā)生率?？笽Ia活性本文公開(kāi)的LMWH制劑包含大量足夠長(zhǎng)的鏈(可表述為，例如制劑的平均鏈長(zhǎng)和/或制劑的重均分子量)以提供抗IIa活性，例如約50300IU/mg，約70280IU/mg，約卯250IU/mg，約100140IU/mg，約100140IU/mg，約150約200IU/mg，約130190IU/mg，約155195IU/mg的抗IIa活性。使用平行試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算每毫克的抗IIa活性(以國(guó)際單位計(jì))。使用以下原理測(cè)定本文所述的抗IIa活性水平。M118+ATIII—[M118'ATHI]IIaM118.ATIII—[M118'ATILWIa]+IIa(過(guò)量)IIa(過(guò)量)+底物—肽+pNA(經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定)通過(guò)樣品對(duì)抗凝血酶(ATIII)凝血酶抑制的增效作用來(lái)測(cè)定抗IIa因子的活性。可間接通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量過(guò)量的凝血酶?？墒褂肅hromogenix(S-2238底物，凝血酶(53nkat/瓶)和抗凝血酶)在DiagnosticaStago分析儀或ACLFuturaTM凝血系統(tǒng)上，或在任意等價(jià)系統(tǒng)上測(cè)定抗IIa因子活性。使用第二國(guó)際低分子量月干素標(biāo)7隹(2ndInternationalStandardforLowMolecular1WeightHeparin)校正分析儀的結(jié)果。鏈長(zhǎng)度/分子量例如，可通過(guò)測(cè)定LMWH制劑中鏈的平均鏈長(zhǎng)度和/或測(cè)定LMWH制劑中鏈的重均分子量確認(rèn)LMWH制劑是否包含足夠長(zhǎng)的鏈。測(cè)定平均鏈長(zhǎng)時(shí)，約520(例如718)的平均鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選約916或814個(gè)二糖重復(fù)，表明LMWH制劑中有大量足夠長(zhǎng)的鏈。本文所用"平均鏈長(zhǎng)度"是指鏈中出現(xiàn)的糖醛酸/己糖胺二糖重復(fù)的平均鏈長(zhǎng)。存在的非糖醛酸和/或非己糖胺二糖構(gòu)建單元(例如，相連的PEG部分)不包含在平均鏈長(zhǎng)的測(cè)定中。由數(shù)均分子量(Mn)除以二糖的數(shù)均分子量(500Da)來(lái)測(cè)定平均鏈長(zhǎng)度。下文描述了使用SECMALS測(cè)定數(shù)均分子量的方法。其中R是H或S03X;Ri是S03X或COCH3;和X是單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子(例如Na或Ca);并且平均n為916或815。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>R是H或S03X;Rj是S03X或COCH3;X是單并且平均n為916或815?；蚨r(jià)陽(yáng)離子(例如Na或Ca);其中，X是單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子(例如Na或Ca);R是H或S03X;R,是S03X或COCH3;并且n平均約為812或711;和其中，X是單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子(例如Na或Ca);R是H或S03X;R4是S03X或COCH3;n平均約為812或711，并且xo2cco2x測(cè)定制劑的重均分子量時(shí)，約50009000Da，約50008300Da，優(yōu)選約55008000Da，約57007900，或約58006800Da的重均分子量說(shuō)明LMWH組合物中有大量鏈具有足夠的鏈長(zhǎng)。本文所用"重均分子量"是指糖醛酸/己糖胺二糖重復(fù)鏈的平均重量(以道爾頓計(jì))。存在的非糖醛酸和/或非己糖胺的構(gòu)建單元不被包括在重均分子量的測(cè)定中。因此，制劑的一個(gè)或多個(gè)鏈中非糖醛酸和非己糖胺構(gòu)建單元的分子量不包含在對(duì)重均分子量的測(cè)定中。根據(jù)等式Mw=i;(cimi)/2:ci計(jì)算重均分子量(Mw)。變量Ci是片段i(slicei)聚合物的濃度，nii是片段i聚合物的分子量。對(duì)色譜峰求和，該色譜峰包含多個(gè)片段的數(shù)據(jù)。在色譜峰與時(shí)間的坐標(biāo)圖中，一個(gè)片段的數(shù)據(jù)可表示為一條垂直直線。因此，可以將洗脫峰分成多個(gè)片段。重均分子量的計(jì)算依據(jù)所有片段的濃度和分子量的總和進(jìn)行平均。例如，可使用WyattAstra軟件或任意適合的軟件計(jì)算重均摩爾質(zhì)量。使用串聯(lián)的兩個(gè)柱子(例如，TSKG3000SWXL和G2000SWXL)以及與之偶聯(lián)的多角度光散射(MALS)檢測(cè)器和折射檢測(cè)器通過(guò)高效液相色譜測(cè)定本文所述重均分子量。所用的洗脫液是0.2硫酸鈉，pH5.0，流速為0.5mL/分鐘。非還原末端結(jié)構(gòu)除了鏈長(zhǎng)度，制劑中約515摩爾％、714摩爾％或912摩爾％的鏈還可在距離鏈非還原末端的約2個(gè)、4個(gè)或6個(gè)單糖的位點(diǎn)處或之內(nèi)具有△UHNAe，6SGHNS,3S,6S?？捎糜诙看祟惤Y(jié)構(gòu)的方法包括例如，毛細(xì)管電泳(CE)和如反相高效液相色譜(RPHPLC)的高效液相色譜(HPLC)?？蓽y(cè)定MJH^，6sGH^，3s,6s的反應(yīng)因子(RF)以定量LMWM制劑中AUHwAc,6sGHws,3S6s的摩爾％。所述測(cè)定還可包括測(cè)定獲得的所有物質(zhì)的RF，例如使用CE或HPLC，例如本文所述的CE方法。為了通過(guò)CE(例如本文所述的CE方法)獲取一種或所有物質(zhì)的RF，可將一種或多種物質(zhì)的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物注射到CE中，并用以測(cè)定各物質(zhì)的RF。隨后，可使用RF確定摩爾M。如本文所述，樣品具有的結(jié)構(gòu)的實(shí)際水平可被表示為，例如以摩爾％的單位計(jì)，515摩爾％。所述實(shí)際水平也可由其它單位表示，例如重量％。不管用什么單位表示，所述實(shí)際水平都是相同的。本方法中摩爾％的說(shuō)法僅用來(lái)表明受試實(shí)體的實(shí)際存在量。只要以其它單位表示的參考值與以摩爾％(在此實(shí)例中為515摩爾％)表示的參考值對(duì)應(yīng)于相同的受試實(shí)體量，可使用其它單位測(cè)量受試實(shí)體的水平并且以其它單位表示參考值。因此，要求以515摩爾％表示所述結(jié)構(gòu)的存在水平的方法可通過(guò)用其它測(cè)量單位(例如，重量％、鏈的數(shù)量或y。AUC)表示該結(jié)構(gòu)存在于以該單位表示的一個(gè)范圍內(nèi)，其中，如關(guān)于其它測(cè)量單位的描述，所述范圍與以摩爾％(在此實(shí)例中為515摩爾％)給出的同一受試實(shí)體的量相同。本文所述LMWH制劑可在制劑中鏈的非還原末端具有AU和艾杜糖醛酸(I)/葡萄糖醛酸(G)的混合。術(shù)語(yǔ)"AU"是指由肝素酶、HSGAG裂解酶或具有類似底物特異性的其它酶的裂解活動(dòng)導(dǎo)致在4-5位點(diǎn)具有引入雙鍵的不飽和糖醛酸(艾杜糖醛酸(I)、葡萄糖醛酸(G)或半乳糖醛酸)。優(yōu)選地，制劑中鏈總量的約15%35%，2030%(例如，15%、20%、25%、30°/。、35%)在鏈的非還原末端具有AU?？墒褂美?D-NMR測(cè)定樣品中鏈非還原末端AU和/或I/G的數(shù)量。在此方法中，可使用在還原末端具有乙酰化己糖胺(HNAc)鏈的總數(shù)和/或還原末端開(kāi)環(huán)構(gòu)象數(shù)目來(lái)確定制劑中鏈的總數(shù)?？蓪⒅苿┲性?4非還原末端具有AU和減I/G的鏈的總百分?jǐn)?shù)與鏈的總數(shù)進(jìn)行比較。優(yōu)選地，如本文所述的制劑中，90%、95%、98%、99%的鏈在非還原末端均不具有硫酸酯化AU，優(yōu)選所述制劑中所有鏈在非還原末端均不具有硫酸酯化AU。還原末端結(jié)構(gòu)在一些實(shí)例中，本文提供的LMWH制劑基本不帶有經(jīng)修飾的還原末端。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，LMWH制劑中至少85%、90%、95%、98%、99%或所有的鏈均具有非修飾的還原末端結(jié)構(gòu)。所述"經(jīng)修飾的還原末端"是指由天然源分離或制備所述制劑時(shí)在制劑中鏈的還原末端形成的結(jié)構(gòu)。例如很多商購(gòu)LMWH制劑主要由普通肝素通過(guò)化學(xué)或酶促的多糖鏈解聚作用衍生而來(lái)。用于制備LMWH的過(guò)程可在來(lái)自天然源的起始原料的多糖鏈還原末端造成一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)修飾。例如，肝素的亞硝酸解聚作用導(dǎo)致還原末端2,5-脫水甘露糖的形成，該2,5-脫水甘露糖可被還原以形成醇，而通過(guò)糖醛酸上羧酸酯官能團(tuán)的酯化進(jìn)行解聚并隨后進(jìn)行P-消除可導(dǎo)致一些鏈的還原末端上形成1,6-脫水結(jié)構(gòu)(1,6-anhydro)。因此，2，5-脫水甘露糖和1,6-脫水結(jié)構(gòu)是發(fā)現(xiàn)于LMWH中一些鏈上的經(jīng)修飾還原末端結(jié)構(gòu)的實(shí)例。本文提供的LMWH制劑中的鏈可包括，例如至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%的鏈或所有的鏈均在還原末端具有乙酰化己糖胺。抗Xa活性LMWH制劑的抗Xa活性在LMWH制劑的生物活性中起作用。優(yōu)選地，本文提供的LMWH制劑具有約100400IU/mg，例如約120380IU/mg，例如約150350IU/mg，例如約170330IU/mg，例如約180300IU/mg，例如約150200IU/mg,200300IU/mg的抗Xa活性。使用平行試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算每毫克LMWH制劑的抗Xa活性(以國(guó)際單位計(jì))。使用以下原理測(cè)定本文所述LMWH制劑的抗Xa因子活性。Ml18+ATIII—[Ml18'ATIII]FXaM118'ATI11—[M118.ATIIIOCa]+FXa(過(guò)量)45FXa(過(guò)量)十底物—肽+pNA(經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定)通過(guò)樣品對(duì)抗凝血斷ATIII)活化Xa因子(FXa)抑制的增效作用來(lái)測(cè)定抗Xa因子活性?？砷g接通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量過(guò)量的Xa因子?？墒褂肧tachrom肝素測(cè)試試劑盒在DiagnosticaStago分析儀，或使用Chromogenix的Coatest肝素試劑盒在ACLFuturaTM凝血系統(tǒng)上，或在任意等價(jià)系統(tǒng)上測(cè)定抗Xa因子活性。使用低分子量肝素的NIBSC國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)校正分析儀的響應(yīng)?？筙a/IIa比值在一些方面，本文提供的LMWH制劑具有3:1或更小的抗Xa活性/抗IIa活性的比值，例如2:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1。上文已經(jīng)描述了用于測(cè)定抗Xa因子活性和抗IIa因子活性的方法。由抗Xa因子活性(折干計(jì)算)除以抗IIa因子活性(折干計(jì)算)來(lái)計(jì)算抗Xa活性/抗IIa活性的比值。肝素和LMWH制劑的抗Xa活性和抗IIa活性均與抗凝血酶III(ATIII)與制劑鏈中存在的表示為AUHNAe,6SGHNS,3S，6S的特異序列的結(jié)合相關(guān)。ATIII與此序列的結(jié)合介導(dǎo)了抗Xa活性。此外，凝血酶(IIa因子)也在接近于ATIII結(jié)合位點(diǎn)的位置與肝素結(jié)合。與抗Xa活性僅需要AT-m結(jié)合位點(diǎn)不同，抗IIa活性需要ATIII結(jié)合位點(diǎn)以及距離ATIII結(jié)合位點(diǎn)末端足夠長(zhǎng)的鏈。本文提供的LMWH制劑的抗II活性至少部分由于LMWH制劑中鏈非還原末端或非還原末端附近存在的AUHNA(:,6SGHNS,3S,6S以及制劑中存在的多數(shù)鏈的長(zhǎng)度。這個(gè)組合可產(chǎn)生制劑中對(duì)抗Xa活性和抗IIa活性均有貢獻(xiàn)的鏈。如果同一條或多條鏈可提供抗Xa活性和抗Ila活性，除去所述的一條或多條鏈可同時(shí)造成抗Xa活性和抗IIa活性的下降。因此，在施用療程期間，抗Xa活性和抗IIa活性可保持相對(duì)恒定。因此，在一些方面，本文提供的LMWH制劑可在施用LMWH的療程期間維持相對(duì)恒定的抗Xa活性與抗Ila活性的比值，例如在約30、60、120、180、240、300分鐘的時(shí)期內(nèi)抗Xa活性與抗Ila活性的比值的變化不超過(guò)約士1.5、±1、±0.5或±0.2。例如，如果初始抗Xa與抗IIa比值為2，則在初始施用后第二時(shí)間(例如，在約30、60、120、180、240、300分鐘)測(cè)量的比值優(yōu)選小于3，并優(yōu)選等于2或在2附近。中禾口本文提供的LMWH制劑可通過(guò)硫酸魚(yú)精蛋白中和。例如可通過(guò)施用魚(yú)精蛋白中和至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的抗IIa活性和/或抗Xa活性。硫酸魚(yú)精蛋白是商購(gòu)的，例如購(gòu)自EliLilly和公司。例如，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)凝結(jié)試驗(yàn)(例如本文進(jìn)一步描述的ACT和aPTT試驗(yàn))測(cè)定對(duì)抗Xa活性和抗IIa活性的中和。例如，每100IU血漿抗Xa活性的LMWH組合物施用約1、2、3mg劑量的硫酸魚(yú)精蛋白。優(yōu)選地，在施用硫酸魚(yú)精蛋白后的5、10、15、20、25或30分鐘之內(nèi)，發(fā)生魚(yú)精蛋白對(duì)抗Xa活性和/或抗IIa活性的中和。多分散性本文提供的LMWH制劑的多分散性為約1.6或更小，例如約1.6或1.51.1，以及之間的數(shù)值。術(shù)語(yǔ)"多分散"或"多分散性"是指組合物的重均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)。通過(guò)以下等式Mn=2>i/Q>i/mi)計(jì)算數(shù)均分子量(Mn)。變量Ci是片段i聚合物的濃度，mi是片段i聚合物的分子量。針對(duì)包含多個(gè)片段的數(shù)據(jù)的色譜峰求和。在色譜峰與時(shí)間的坐標(biāo)圖中，一個(gè)片段的數(shù)據(jù)可表示為一條垂直直線。因此，可以將洗脫峰分成多個(gè)片段。數(shù)均分子量的計(jì)算依賴于各個(gè)片段數(shù)據(jù)的濃度和分子量。上文描述了測(cè)定重均分子量的方法，所述方法也用于測(cè)定多分散性。對(duì)于本文所述的任意范圍，例如給定的結(jié)構(gòu)或活性的范圍，所述范圍可以是公開(kāi)的范圍以及其它范圍。例如，所述范圍可以由一個(gè)范圍(例如，給定的構(gòu)建單元或活性)下限構(gòu)建的范圍與由另一個(gè)范圍(例如，給定的構(gòu)建單元或活性)上限構(gòu)建的范圍組合給出。所述"分離"或"純化"LMWH制劑基本不包含細(xì)胞物質(zhì)或基本不包含來(lái)自衍生出LMWH的細(xì)胞或組織源的其它污染蛋白質(zhì)，或在化學(xué)合成的情況下，基本不包含化學(xué)前體或其它化學(xué)試劑。所述"基本不包含"是指LMWH制劑的純度至少為50%(wt/wt)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，LMWH制劑具有小于約30%、20%、10%和更優(yōu)選地5%(折干計(jì)算)的非肝素多糖、蛋白質(zhì)或化學(xué)前體或其它化學(xué)試劑，例如來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程的這些物質(zhì)。這些物質(zhì)在本文中也被稱為"污染物"?？沙霈F(xiàn)于本文提供的LMWH制劑中的污染物的實(shí)例包括但不限于鈣、鈉、肝素酶(具有類似底物特異性的其它酶)、甲醇、乙醇、氯化物、硫化物、硫酸皮膚素和硫酸軟骨素。監(jiān)測(cè)LMWH制劑活性的方法可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)抗凝試驗(yàn)監(jiān)測(cè)本文提供的LMWH制劑的活性。此類試驗(yàn)包括，例如ACT和aPTT，這兩種試驗(yàn)是醫(yī)院，特別是醫(yī)院手術(shù)室的常規(guī)項(xiàng)目。ACT是用來(lái)監(jiān)測(cè)肝素治療有效性的試驗(yàn)。ACT可在床邊進(jìn)行，例如用于患有肺栓塞、進(jìn)行體外膜肺氧合(ECMO)和血液透析的患者。ACT最常用于外科手術(shù)之前、期間和之后，例如心肺轉(zhuǎn)流(CPB)手術(shù)、PCI和支架置入。ACT的參考值可在70-180秒的范圍內(nèi)。然而，對(duì)于特定過(guò)程(例如CPB)，需要的范圍可超過(guò)400-500秒。ACT利用帶負(fù)電的顆粒測(cè)定凝塊形成的時(shí)間?？墒褂玫亩喾N顆粒的實(shí)例包括寅式鹽(具有約100170秒的ACT正常長(zhǎng)度)、高嶺土(具有約90150秒的ACT正常長(zhǎng)度)和玻璃微粒(具有約190300秒的ACT正常長(zhǎng)度)。測(cè)定ACT的適合機(jī)器包括，例如HemochronandMedtronicHemoTec。在aPTT(也被稱為"部分促凝血激酶原激酶時(shí)間"或"PTT")試驗(yàn)中，使用接觸活化劑通過(guò)提供高分子量激肽原、激肽釋放酶和XIIa因子發(fā)揮功能的表面來(lái)刺激XIIa因子的產(chǎn)生。容許此接觸活化進(jìn)行一段時(shí)間。隨后，加入鈣以引發(fā)進(jìn)一步反應(yīng)并測(cè)定凝塊形成所需的時(shí)間。需要磷脂以形成活化X因子和凝血素的復(fù)合物?？赏ㄟ^(guò)ILTestTMAPTT-SP(液體)測(cè)定APTT。aPTT的參考值為約2535秒。延長(zhǎng)的aPTT說(shuō)明由于例如肝素或LMWH處理，需要長(zhǎng)于預(yù)期的時(shí)間來(lái)形成凝結(jié)。制備LMWH制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明也設(shè)計(jì)了制備LMWH帝U劑，例如制備本文所述LMWH制劑的方法。例如，此類方法包括具有約816或916個(gè)二糖的平均鏈長(zhǎng)的LMWH制劑的制備方法。所述方法包括提供具有小于816或916個(gè)二糖鏈長(zhǎng)的LMWH制劑前體，和加工LMWH制劑前體以獲得具有約816或916個(gè)二糖的平均鏈長(zhǎng)的LMWH制劑。優(yōu)選地，所述前體具有約814(例如8-12)個(gè)二糖的平均鏈長(zhǎng)。例如，所述LMWH制劑前體可具有以下結(jié)構(gòu)xo7cco7xG:O或OHCH2ORco2xCH2OR其中，X是單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子(例如，Na或Ca)，R是H或S03X;R，是S03X或COCH3;n=245，例如，235;且所述組合物的n的平均值優(yōu)選為713(例如，711或812)?？赏ㄟ^(guò)包括鹽沉淀和隨后酶降解的方法獲得此方法使用的LMWH制劑前體。在獲得LMWH制劑前體的方法中可使用單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子的鹽?？墒褂玫膯蝺r(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子的實(shí)例包括，例如鈉、鉀、銣、銫、鋇、鈣、鎂、鍶及其組合。所述鹽是單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子的乙酸鹽。獲得LMWH前體的酶消化可包括使用切割未硫酸酯化糖醛酸中的糖苷鍵的一種或多種酶。示例性的酶包括肝素酶III、肝素酶III的突變體和來(lái)自多形擬桿菌的HSGAG裂解酶III。肝素酶m描述于，例如美國(guó)專利第5,681,733號(hào)和第5,919,693號(hào)。肝素酶III突變體描述于美國(guó)專利第5,896,789號(hào)。優(yōu)選的肝素酶III突變體是那些將組氨酸殘基His36、Hisl05、HisllO、Hisl39、Hisl52、His225、His234、His241、His424、His469和His539中的一個(gè)或多個(gè)取代為丙氨酸的肝素酶III突變體?？筛鶕?jù)大小進(jìn)行分離，例如體積排阻色譜、離子交換色譜或過(guò)濾來(lái)處理LMWH制劑前體?？稍诜蛛x之前或之后使用其它加工步驟以獲得藥物產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)"藥物產(chǎn)物"是指具有所需純度并被配制以藥用的LMWH制劑。術(shù)語(yǔ)"原料藥"是指具有用于藥物應(yīng)用但不一定是最終制劑形式的、具有多糖組分的LMWH制劑和/或包含一種或多種非產(chǎn)物污染物(例如，一種或多種無(wú)機(jī)產(chǎn)物(例如硫酸鹽、氯化物)、蛋白質(zhì)污染物、加工副產(chǎn)物(例如肝素酶、鈣、鈉))。生產(chǎn)本文提供的LMWH制劑的其它方法包括提供來(lái)自于包含葡胺聚糖(GAG)的樣品(例如UFH)的"快速移動(dòng)組分"?？砂匆韵路绞缴a(chǎn)所述快速移動(dòng)組分(1)對(duì)包含GAG的樣品(例如UFH)進(jìn)行第一次沉淀以獲得第一上清液例如，使用極性有機(jī)溶劑(例如，如乙醇的醇類)、極性非有機(jī)溶劑(例如水)和鹽(例如，優(yōu)選如乙酸鈉的鈉鹽)對(duì)包含GAG的樣品(例如UFH)進(jìn)行第一次沉淀以獲得第一上清液；(2)對(duì)所述第一上清液進(jìn)行第二次沉淀以獲得沉淀物例如，使用極性有機(jī)溶劑(例如，如乙醇的醇類)和極性非有機(jī)溶劑(例如水)對(duì)所述第一上清液進(jìn)行第二次沉淀以獲得沉淀物(此沉淀物包含快速移動(dòng)組分)；(3)并優(yōu)選地溶解所述沉淀物。也可將通過(guò)產(chǎn)生基本等價(jià)片段(例如具有916個(gè)二糖的平均鏈長(zhǎng)度的片段)的其它方法生產(chǎn)的包含(GAG)片段的樣品(例如，UFH)用作快速移動(dòng)組分。在一些實(shí)施方案中，所述快速移動(dòng)組分具有以下結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage50</formula>其中，X是Na或Ca;R是H或S03Na;R,是S03Na或COCH3;n=250，例如，240;且所述組合物的n的平均值優(yōu)選為916或815。此組合物可作為L(zhǎng)MWH生產(chǎn)過(guò)程中的中間產(chǎn)物產(chǎn)生，例如作為沉淀產(chǎn)物以提供快速移動(dòng)組分(如本文的討論)?？蓪⒖爝f移動(dòng)組分進(jìn)一步加工以提供本發(fā)明的LMWH。快速移動(dòng)組分的加工可包括使用切割未硫酸酯化糖醛酸中的一個(gè)或多個(gè)糖苷鍵(例如，與N-乙酰葡糖胺殘基臨近的未硫酸酯化糖醛酸的一個(gè)或多個(gè)糖苷鍵)的化學(xué)試劑或酶消化所述快速移動(dòng)組分，例如以獲得具有本文所述質(zhì)量和特征的制劑?？赏ㄟ^(guò)以下步驟評(píng)估酶對(duì)底物的特異性1)使用具有不同硫酸酯化密度的兩種HSGAG底物(例如，肝素和硫酸乙酰肝素)對(duì)酶活性進(jìn)行功能篩選，從而選出與肝素相比對(duì)硫酸乙酰肝素優(yōu)選的酶；2)對(duì)步驟1的切割后底物進(jìn)行片段作圖(fragmentmapping)以評(píng)估底物特異性；3)使用酶切割LMWH(例如M118-REH)步驟I中間產(chǎn)物或達(dá)肝素，隨后4)使用體外試驗(yàn)評(píng)估切割后底物的抗Xa活性和抗II活性；和5)使用凝膠滲透色譜法(GPC)和/或帶多角度光散射檢測(cè)的體積排阻色譜法(SEC-MALS)評(píng)估切割后底物的分子量分布(或平均鏈長(zhǎng))。步驟1評(píng)估了酶作為HSGAG裂解酶的能力以及其對(duì)低硫酸化底物(例如硫酸乙酰肝素)是否優(yōu)選，其中通過(guò)在切割產(chǎn)物的非還原末端產(chǎn)生非飽和C4-C5鍵的能力來(lái)鑒定其作為HSGAG裂解酶的能力?？赏ㄟ^(guò)監(jiān)測(cè)232nm處的UV吸收，通過(guò)分光光度法監(jiān)測(cè)酶活性。對(duì)此波長(zhǎng)的吸收表明了切割產(chǎn)物非還原末端不飽和糖醛酸的形成?？赏ㄟ^(guò)動(dòng)力學(xué)方式(產(chǎn)物形成的起始速率)和根據(jù)完全消化(約1215小時(shí))后總產(chǎn)物的形成來(lái)檢測(cè)酶活性。優(yōu)選的酶具有高于肝素約2倍的硫酸乙酰肝素(heparansulfate)優(yōu)選性，以及高于2倍以上(例如，35倍)的總活性差異。第二步評(píng)估酶的切割特異性。適合于制備本文所述LMWH組合物的酶優(yōu)選切割肝素或硫酸乙酰肝素的未硫酸酯化區(qū)域。如果使用的底物是UFH，此優(yōu)選性表現(xiàn)為對(duì)底物的明顯不完全降解(由較長(zhǎng)寡糖的存在表明)，以及產(chǎn)生具有低硫酸酯密度的二糖。相反，如果底物是硫酸乙酰肝素，降解產(chǎn)生較多數(shù)量的二糖，這說(shuō)明較高的切割頻率?？扇绫疚钠渌糠炙鲞M(jìn)行剩余的步驟35。酶的實(shí)例包括肝素酶III，肝素酶III的突變體和來(lái)自多形擬桿菌的HSGAG裂解酶。在一些實(shí)施方案中，使用將肝素酶III氨基酸序列中第225位殘基的組氨酸替換成丙氨酸的突變肝素酶來(lái)至少部分地加工(或處理)快速移動(dòng)組分。本文中，這個(gè)酶也被稱為"MOll"。經(jīng)降解的LMWH制劑可以是終產(chǎn)物，例如原料藥或藥物產(chǎn)物，或經(jīng)進(jìn)一歩加工獲得終產(chǎn)物，例如原料藥或藥產(chǎn)物。濃縮的LMWH制劑可經(jīng)進(jìn)一51步加工，例如通過(guò)一種或多種根據(jù)大小進(jìn)行的分離(例如，通過(guò)體積排阻色譜、離子交換色譜和過(guò)濾)和過(guò)濾進(jìn)行加工。優(yōu)選地，通過(guò)根據(jù)大小進(jìn)行的分離進(jìn)一步加工濃縮的LMWH制劑，且由此步驟獲得的LMWH制劑具有約916個(gè)二糖的平均鏈長(zhǎng)。評(píng)估或加工LMWH制劑的方法毛細(xì)管電泳使用CE對(duì)LMWH制劑(例如M118-REH制劑)進(jìn)行分析包括，例如使用一種或多種肝素降解酶進(jìn)行消化。例如，肝素降解酶可以是一種或多種肝素酶、肝素裂解酶、HSGAG裂解酶、也可以降解肝素的被稱作GAG裂解酶的裂解酶，和/或被稱作水解酶、硫酸酯酶/磺基氫化酶、或糖基水解酶/糖苷酶的多肽。例如，可以用以下的一種或多種酶消化LMWH審lj劑不飽和葡糖醛酸基水解酶(例如肝素黃桿菌(F/2e^^"Mm)A4,5葡糖醛酸酶、多形擬桿菌A4,5葡糖醛酸酶)、葡糖醛酸基水解酶(例如哺乳動(dòng)物(x-艾杜糖醛酸酶、卩-葡糖醛酸酶)、磺基氫化酶(例如肝素黃桿菌2-0-硫酸酯酶、6-0-硫酸酯酶、3-0-硫酸酯酶、多形擬桿菌6-0-硫酸酯酶、粘蛋白脫硫酶、哺乳動(dòng)物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶、哺乳動(dòng)物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)、N-磺酰胺酶(例如肝素黃桿菌N-磺酰胺酶、哺乳動(dòng)物乙酰肝素-N-硫酸酯酶)、芳基硫酸酯酶、氨基已糖苷酶、糖基水解酶(例如內(nèi)切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)、肝素酶(例如肝素黃桿菌肝素酶I、肝素黃桿菌肝素酶II、肝素黃桿菌肝素酶III、肝素黃桿菌肝素酶IV)、內(nèi)切葡糖醛酸酶(例如哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶)、肝素/乙酰肝素硫酸酯裂解酶(例如多形擬桿菌HSGAG裂解酶I、多形擬桿菌HSGAG裂解酶II、多形擬桿菌HSGAG裂解酶III、多形擬桿菌HSGAG裂解酶IV)和其功能性片段和變體。也可以包括來(lái)自于除肝素黃桿菌(又名，解肝磷脂土地桿菌P^fo^c/w/2印an'm/s)或多形擬桿菌之外的微生物的上述多肽(例如肝素酶或肝素/肝素硫酸鹽裂解酶)。例如，嗜鹽古菌(/fo/o"rcw/awa^附wtw/)、根癌農(nóng)桿菌(JgraZacfeWww2fww咖c/e/w)、月市炎,連球菌(5^e/tococcwsj9"ewmo"/"e)、月巿炎f連球菌(5^eptococcw/"ewwo"/ae)、化胺性,連球菌(5^e;tococci^pyogewasO、無(wú)乳鏈球菌5^re/tococcwsflga/ac^3e、中間l連球菌52浙e/tococcws/她77wWws、豬鏈球菌5!^/tococcw51s油、糞月湯球菌力eca/Zs、召澤纟工假單胞菌i/zc^o;wei^o附owaspa/"Mn's、纟隹氏石肖寸七申干菌煎ra6acterw/wograA一、漢堡石肖化桿菌(M加6ac/er/2麵6wrgms/力、慢生大旦根瘤菌C8ra(i,/z/zo6/wwj'apcw/cwm)、苜蓿根瘤菌(i/^o6/wmwe/o//")、百脈根根瘤菌CM&sw/2izo&wm/o")、*S//"g/zoZ)(3cten'Mm牛禾中布魯氏菌(Sn^ce〃aa6orwsZz'ovar)、羊禾中布魯氏菌(Brwce〃ame//fem7》、So/Aacto-、莢膜酸桿菌(/4c/cfoZ)a"m'謂ca/wwto簡(jiǎn))、Mfcra6w/6^r、綠月農(nóng)桿菌(&gwt/cwo"asaerw—osa)、洋蔥伯克霍爾德菌(5wrA:/7oWeWa，eM(io附owosce/ac/a)、G^o6ac妙膨to〃〖mii/cms1、普氏菌(/Vevote〃"禾占質(zhì)少雷氏菌(5ferra/aW7arcasce/ts)、棒^!犬木干菌(Cbr"j;6flcten'wws/.)、y4"aerawjaoZac^^fe/za/ogew^ms、i/zo<i，>e〃w/<3Za/"ca、海洋小梨形菌(PzVe〃w/aman.wa)禾口/或隱J求出芽菌((7emmatao^cw/g/oftMS)。優(yōu)選地，用于消化的至少一種酶是由于可在肝素中的特異連接處進(jìn)行切割而被選擇出來(lái)的。例如，所述酶可以是肝素酶I和/或HSGAG裂解酶I。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用肝素黃桿菌肝素酶I降解LMWH制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用多形擬桿菌HSGAG裂解酶I降解LMWH制劑。在降解中可選擇使用其它酶，這些酶可分解僅使用肝素酶I、II和III時(shí)不能分解的結(jié)構(gòu)。本文所述的任何酶均可替換成具有等價(jià)功能活性的酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)行完全消化或至少足以提供具有表10A中列出的全部產(chǎn)物的消化物的消化，并且優(yōu)選基本不含有未消化的物質(zhì)。在消化之前，可凍干樣品。例如，可在真空箱中干燥樣品，例如在約2(TC、25°C、30°C、35°C、40°C、43°C、46°C、49°C、52。C或55。C干燥約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24小時(shí)。例如，可在以下條件之一凍干和/或干燥樣品40。C下12小時(shí)；46。C下8小時(shí)；49'C下6小時(shí)；52"C下4小時(shí)?？梢约sl、2、5、10、20、50、100、200或500mg/mL的濃度將樣品懸浮在水或適合的緩沖液(例如，1mM乙酸鈣、25mM乙酸鈉，pH7.0和5%甘氨酸)中?？上驑悠分刑砑右环N或多種肝素降解酶。在一些實(shí)施方案中，可向樣品中添加肝素酶I或HSGAG裂解酶I(或這些酶的組合)、肝素酶II或HSGAG裂解酶II(或這些酶的組合)和肝素酶III或HSGAG裂解酶III(或這些酶的組合)。將所述樣品在約18°C、25°C、30°C、37。C或45。C的溫度下降53解約6、12、16、18、20或24小時(shí)，例如約25'C下24小時(shí)；30。C下約18小時(shí)；約37'C下12小時(shí)。消化之后，例如使用N產(chǎn)柱、體積排阻柱、透析、超濾等，從樣品混合物中除去所述一種或多種酶?？稍谙笸ㄟ^(guò)加熱(例如在65"C加熱20分鐘)對(duì)一種或多種酶進(jìn)行滅活。在分析前可將樣品在-85"C、-70°C、-20°C、4°C、18"C或25。C儲(chǔ)存一段時(shí)間?？赏ㄟ^(guò)多種方式檢測(cè)本文所述方法分離的物質(zhì)，例如通過(guò)紫外吸收(例如，在約232nm的波長(zhǎng)下的吸收)、蒸發(fā)光散射、熒光、脈沖安培檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)法。在一些實(shí)施方案中，可對(duì)同一樣品進(jìn)行兩種或多種方式的檢測(cè)，例如串聯(lián)或并聯(lián)的檢測(cè)?？墒褂闷渌赶▉?lái)消化樣品。例如，肝素酶I或HSGAG裂解酶I(或這些酶的組合)、肝素酶II或HSGAG裂解酶II(或這些酶的組合)、肝素酶III或HSGAG裂解酶III(或這些酶的組合)和2-0硫酸酯酶、A4，5葡萄糖醛酸酶的組合和/或肝素酶I或HSGAG裂解酶I(或這些酶的組合)、肝素酶II或HSGAG裂解酶II(或這些酶的組合)、肝素酶III或HSGAG裂解酶III(或這些酶的組合)的組合可用于消化，并且通過(guò)例如上述方法進(jìn)行檢測(cè)。使用Agilent3D毛細(xì)管電泳儀器分析消化產(chǎn)物。所述毛細(xì)管為延長(zhǎng)光路的裸露熔融硅毛細(xì)管，內(nèi)徑75pm，有效長(zhǎng)度72cm。使用pH2.5的Tris(50mM),10nM硫酸葡聚糖作為CE緩沖液。在30mbar壓力下注射樣品20秒。在負(fù)極性下進(jìn)行分離，并使用310nm作為參考波長(zhǎng)在232nm下監(jiān)測(cè)分析物。依次使用水、1N氫氧化鈉、水和分離緩沖液對(duì)新毛細(xì)管進(jìn)行預(yù)處理。每次樣品分析前，使用緩沖液將毛細(xì)管預(yù)處理5分鐘?？捎糜诒疚乃龇椒ǖ钠渌畔⒖稍谝韵挛墨I(xiàn)中找到，例如Linhardtetal.(1988)Biochem.J.,254:781-787;Chuangetal.(2001)J.Chromatogr.A,932:65-74;和Yatesetal.(2004)J.Med.Chem.,47:277-280，和Rhombergetal.(1988)ProcNatlAcadSciUSA.95(8):4176畫81.可使用CE(例如使用無(wú)涂層熔融硅毛細(xì)管)分析LMWH，例如本文所述的LMWH制劑。在低pH的條件下，分離幾乎完全由分析物的電泳遷移性控帝lj?？紤]到所有LMWH相關(guān)的糖類由于羧酸酯和硫酸酯部分而具有凈負(fù)電荷，分離在反極性條件下進(jìn)行。此外，在低pH(pH2.5)緩沖液中補(bǔ)充硫酸葡聚糖可防止肝素樣陰離子物質(zhì)的非特異性吸收，從而保證對(duì)稱的峰形和精確的定量?？墒褂靡幌盗械?種消化物(本文其它部分詳細(xì)討論)來(lái)分離LMWH制劑中的物質(zhì)；在向各消化物中添加萘單磺酸鹽內(nèi)標(biāo)后，進(jìn)行毛細(xì)管電泳。在CE中分離出14中的單組分(參見(jiàn)，例如本文表10)。按如下方式評(píng)估成分分析法中的質(zhì)量回收(massrecovery)。此分析發(fā)生于兩個(gè)水平(1)酶促消化后的質(zhì)量回收和(2)經(jīng)毛細(xì)管電泳分離后的質(zhì)量回收。層i可使用二維核磁共振譜(2DNMR)的方法部分地分辨并鑒定信號(hào)重疊最小的信號(hào)。整合2DNMR信號(hào)，隨后進(jìn)行簡(jiǎn)單計(jì)算可促進(jìn)多糖混合物單糖成分的定量分析，例如，對(duì)如本文提供的那些LMWH制劑的分析。此外，2DNMR可提供關(guān)于二糖組分(例如H-U二糖)連接環(huán)境的信息，從而對(duì)二糖連接提供分析(包括定性分析和定量分析)。在一些實(shí)施方案中，2DNMR分析可提供關(guān)于H-U連接的差向異構(gòu)狀態(tài)的信息，從而提供例如處于差向異構(gòu)狀態(tài)是艾杜糖醛酸殘基還是葡萄糖醛酸殘基(即I或U)的信息。在一些實(shí)施方案中，2D質(zhì)子-碳相關(guān)譜(HSQC)試驗(yàn)可對(duì)一種或多種葡胺聚糖提供定量成分分析。例如，在一些實(shí)施方案中，2DNMR分析可提供關(guān)于單糖還原末端最鄰近序列的信息。此信息可提供，例如多糖混合物(例如，如本文所述LMWH制劑的LMWH)中出現(xiàn)特定單糖的周圍序列。在一些實(shí)施方案中，2DNMR法可區(qū)分內(nèi)部殘基和還原末端殘基。特別地，對(duì)于本文所述的那些LMWH，可專門鑒定還原N-乙酰葡糖胺的可測(cè)定的量。在一些實(shí)施方案中，2DNMR分析可提供關(guān)于LMWH鏈非還原末端的信息，即由酶促消化產(chǎn)生的AUAp2-OH的量。在一些實(shí)施方案中，可使用2DNMR評(píng)估多糖混合物中一種或多種雜質(zhì)(例如，硫酸皮膚素)的存在。例如，質(zhì)子NMR中2.062.09ppm處信號(hào)的缺失可用于確認(rèn)硫酸皮膚素的存在水平不大于儀器的檢測(cè)水平(例如，大于約1%的水平)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用2DNMR評(píng)估糖的結(jié)構(gòu)，例如評(píng)估使用D20交換，冷凍干燥過(guò)夜，并重溶于D20中的多糖混合物樣品。隨后，將所述樣品放置在分析用NMR管中，并使用裝備有5-mmTXI探針的BrukerAvance600MHz分光計(jì)在303K進(jìn)行分析。在數(shù)據(jù)獲得(acquision)期間使用去碳偶合記錄梯度增強(qiáng)的HSQC譜。隨后，通過(guò)對(duì)間接13C維度中每256個(gè)增量進(jìn)行16次掃描獲得所述數(shù)據(jù)。將極化轉(zhuǎn)移延遲設(shè)定為2.941ms以獲得155HzIJCH耦合的最佳轉(zhuǎn)移。通常隨后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，例如在傅立葉轉(zhuǎn)化前應(yīng)用平方余弦函數(shù)將1Kx256大小的矩陣由0填充至2Kx1K。例如，使用MestreC4.5軟件對(duì)交叉峰進(jìn)行積分，并使用單正峰用于積分。使用N-硫酸酯化葡糖胺的H2/C2峰(3.26/60.5ppm)對(duì)積分進(jìn)行歸一化。通常使用公開(kāi)的化學(xué)轉(zhuǎn)換以及通過(guò)COSY和TOCSY實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)性歸屬來(lái)對(duì)峰進(jìn)行歸屬。使用異頭交叉峰面積計(jì)算成分百分?jǐn)?shù)，其中所有的糖醛酸殘基均具有類似的IJCH偶聯(lián)，所有的葡糖胺也是如此。對(duì)于由重疊而妨礙其精確定量的葡糖胺異頭峰，則對(duì)H2/C2信號(hào)進(jìn)行積分。每種單糖的量表示為占總葡糖胺或糖醛酸含量的百分比。由H6/C6信號(hào)的積分計(jì)算6-0硫酸酯與6-0脫硫酸酯的比值。表IIA提供了成分百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)?？捎糜诒疚姆椒ǖ钠渌畔⒖砂l(fā)現(xiàn)于，例如Guerrinietal.(2005)Anal.Biochem.,337:35-47。藥物組合物本發(fā)明提供了包含與藥學(xué)上可接受的載體一同配制的本文所述LMWH制劑的組合物，例如藥學(xué)上可接受的組合物。本文所用"藥學(xué)上可接受的載體"包括任意和所有的溶劑、分散介質(zhì)、等滲吸收延遲劑以及生理上相容的類似物。所述載體可適合用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸胃外、直腸、脊髓或表皮給藥(例如，通過(guò)注射或輸注)。本發(fā)明的組合物可以是多種形式。這些形式包括，例如液體、半固體和固體劑型，例如液體溶液(例如，可注射和可輸注的溶液)、分散液或懸浮液、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于預(yù)定的給藥方式和治療應(yīng)用。通常優(yōu)選組合物的形式是可注射和可輸注的溶液。優(yōu)選的給藥模式是腸胃外給藥(例如，靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)給藥)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈內(nèi)輸注或注射施用LMWH制劑。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)肌肉內(nèi)或皮下注射使用LMWH制劑。本文所用短語(yǔ)"胃腸外施用"和"胃腸外給藥"是指腸和局部給藥之外的給藥模式，該模式通常通過(guò)注射，并包括而不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、玻璃體內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜上和胸骨內(nèi)注射和輸注。治療性組合物通常應(yīng)為無(wú)菌，并在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定。可將所述組合物配制成溶液、微乳劑、分散液、脂質(zhì)體或適合于高濃度的其它有序結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^(guò)向具有上述一種成分或成分組合的合適溶劑中加入所需量的活性化合物(即LMWH)，隨后通過(guò)過(guò)濾殺菌制備無(wú)菌注射溶液。通常，通過(guò)向包含基本分散介質(zhì)和所需的上述其它成分的無(wú)菌溶劑中添加活性化合物來(lái)制備分散液。在用于制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥法和凍干法，該方法從其先前的過(guò)濾除菌溶液中獲得活性成分和任意其它所需成分的粉末。例如通過(guò)使用如卵磷脂的涂層；在分散液的情況下，通過(guò)保持所需的粒徑；以及通過(guò)使用表面活性劑，可保持溶液的適當(dāng)流動(dòng)性?？赏ㄟ^(guò)向組合物加入延緩吸收的試劑(例如，多種聚合物、單硬脂酸鹽和明膠)獲得可注射組合物的延長(zhǎng)吸收?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法施用LMWH制劑，盡管對(duì)于很多治療性應(yīng)用，優(yōu)選的給藥途徑/模式是靜脈注射或輸注。技術(shù)人員可理解，所述給藥途徑/模式可依照期望結(jié)果進(jìn)行改變。在特定實(shí)施方案中，可使用阻止活性化合物快速釋放的載體制備所述活性化合物，例如控釋制劑，包括植入劑、透皮貼和微膠囊化給藥系統(tǒng)。可使用生物可降解性、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原磷酯和聚乳酸。此類制劑的很多制備方法已取得專利或?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。參見(jiàn)，例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978。57注射制劑可存在于單位劑量形式(例如，安瓿)或多劑量容器中(例如，具有添加的防腐劑)。所述組合物可采用，例如油性或水性溶劑的懸浮液、溶液或乳液的形式，并可包含配制試劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。在特定實(shí)施方案中，可口服本文提供的LMWH制劑，例如與惰性稀釋劑或可同化的食用載體一起口服。也可將所述化合物(以及其它需要的成分)裝入硬或軟殼明膠膠囊，壓縮成片劑，或直接添加到受試者的飲食中。對(duì)于治療性口服，可將所述化合物加入到賦形劑中，并以吸收片劑、口含片、藥片、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、薄片劑和類似形式使用。為了通過(guò)腸胃外施用之外的途徑來(lái)施用本發(fā)明的化合物，有必要使用材料包被所述化合物，或與所述化合物共施用以阻止其失活。向糖丸核提供適合的糖衣。處于這個(gè)目的，可使用濃縮的糖溶液，該糖溶液可任選地包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯垸酮、Carb叩ol膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液(lacquersolution)以及合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。可向片劑或糖衣中添加染料或色素以鑒別或表征活性化合物劑量的不同組合?？捎糜诳诜乃幬锝M合物包括由明膠制造的推送式膠囊、以及由明膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)制造的密封軟膠囊。推送式膠囊可包含與填料(例如乳糖)、結(jié)合劑(例如淀粉)和/或潤(rùn)滑劑(例如滑石或硬脂酸鎂)以及任選地穩(wěn)定劑混合在一起的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮于適合的液體中，例如油脂、液態(tài)石蠟或液態(tài)聚乙二醇。此外，可添加穩(wěn)定劑。也可使用口服的微球制劑。本領(lǐng)域已對(duì)此類微球做出詳細(xì)定義。所有用于口服的制劑都應(yīng)該是適合此類施用的劑量。對(duì)于經(jīng)口腔施用，所述組合物可采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。對(duì)于吸入式施用，可使用適合的推進(jìn)劑(例如，二氯二氟甲垸、三氯氟甲烷、二氯四氟乙垸、二氧化碳或其它適合的氣體)由加壓包或噴霧器方便地遞送氣溶膠噴霧形式的LMWH制劑。在加壓氣溶膠的情況下，可通過(guò)提供閥門以遞送額定量的方式確定劑量單位。用于吸入器或吹藥器的明膠膠囊或藥包經(jīng)過(guò)配制可包含所述化合物以及適合的粉末基料(例如，乳糖或淀粉)的粉狀混合物。此外，用于吸入療法的干粉制劑也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。可按WO02/32406的公開(kāi)制備此類干粉制劑。58也可將所述組合物制備成經(jīng)直腸或陰道的組合物，例如栓劑或保留性灌腸劑，例如包含常規(guī)栓劑基料(例如可可脂或其它甘油酯)的栓劑或保留性灌腸劑。除上文所述組合物之外，也可將化合物制備成庫(kù)存式制劑。可使用適合的聚合或疏水材料(例如，可接受的油的乳液)或離子交換樹(shù)脂制備此類長(zhǎng)效制劑，或?qū)⑵渲苽涑晌⑷苄匝苌铮缥⑷苄喳}。所述藥物組合物也可包含適合的固體或凝膠相載體或賦形劑。此類載體或賦形劑的實(shí)例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和如聚乙二醇的聚合物?？捎糜诜悄c胃外給藥(例如，非侵入式給藥)的組合物的實(shí)例包括由吸入器向肺額定量給藥的組合物；具有處方劑量單位的口服片；透皮遞送單位劑量的透皮貼；以及經(jīng)直腸或陰道遞送所需單位劑量的栓劑。所述組合物可包含在容器、包裝或帶有施用說(shuō)明書的配藥器中。也可使用短期或長(zhǎng)期植入裝置施用所述LMWH制劑?？稍谄は轮踩胨鲋苿?qū)⑵渲踩氲浇M織或器官中(例如，冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、腎動(dòng)脈和其它外周動(dòng)脈、靜脈、腎、心臟、角膜、玻璃體、大腦等)，或?qū)⑵渲踩氲浇M織和器官附近的生理空間中(例如，腎囊、心包膜、胸腔或腹膜腔)?？墒褂盟鯨MWH制劑包被多種醫(yī)療器械。例如，可使用所述LMWH制劑包被支架或體外電路。LMWH制劑的此類制劑可包括使用，例如控釋微珠、凝膠或微球，以及多種聚合物(例如PLGA、纖維素、海藻酸鹽或其它多糖)?？烧{(diào)整給藥策略以產(chǎn)生最佳期望反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以單次濃注施用，可在一段時(shí)間內(nèi)使用多個(gè)分次劑量或根據(jù)治療狀況的要求按比例減少或增加劑量。制備單位劑型的腸胃外給藥組合物以利于施用和劑量的一致性，這一點(diǎn)特別有利。本文所用的單位劑型是指適合于向待治療受試者提供單位劑量的在物理上分散的單位，每個(gè)單位包含經(jīng)過(guò)計(jì)算可產(chǎn)生期望治療效果的預(yù)定量的活性化合物以及所需的藥學(xué)載體。本發(fā)明單位劑型的說(shuō)明受控于并直接依賴于(a)所述活性化合物的獨(dú)特特征以及希望達(dá)到的特別治療效果，和(b)組合此類活性化合物用于個(gè)體敏感性治療領(lǐng)域本身存在的局限性。59應(yīng)注意劑量值可隨著需緩解病癥的類型和嚴(yán)重性改變。應(yīng)進(jìn)一歩理解，對(duì)于任意特定受試者，應(yīng)根據(jù)個(gè)體需要以及施用所述組合物或監(jiān)測(cè)所述組合物施用的人員的專業(yè)判斷來(lái)隨時(shí)間調(diào)整特定的給藥策略。本發(fā)明的藥物組合物可包括"治療有效量"或"預(yù)防有效量"的LMWH制劑。"治療有效量"是指在必要時(shí)間后達(dá)到期望治療結(jié)果的有效劑量。LMWH制劑的治療有效量可根據(jù)多種因素改變，例如疾病狀態(tài)、年齡、性別、個(gè)體體重以及在個(gè)體中引發(fā)期望反應(yīng)的LMWH制劑。治療有效量也可以是其中LMWH制劑的任意毒性或有害作用超出治療有益作用的量。優(yōu)選與未處理的受試者相比，"治療有效量"抑制可測(cè)量的參數(shù)，例如通過(guò)ACT和aPTT測(cè)定至少約20%地抑制凝結(jié)或血栓參數(shù)，更優(yōu)選至少約40%，再優(yōu)選至少約60%，和更優(yōu)選至少約80%地抑制抑制凝結(jié)或血栓參數(shù)?？稍趧?dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)估所述化合物抑制可測(cè)參數(shù)(例如凝結(jié)或血栓參數(shù))的能力以預(yù)測(cè)其在人體中的效力?；蛘?，可通過(guò)檢測(cè)所述化合物在體外試驗(yàn)中的能力對(duì)其此類性質(zhì)做出評(píng)估。經(jīng)靜脈施用LMWH制劑的示范性劑量為約IU/kg200IU/kg，例如1IU/kg、2IU/kg、3IU/kg、4IU/kg、5IU/kg、6IU/kg、7IU/kg、8IU/kg、9IU/kg、10IU/kg、11IU/kg、12IU/kg、13IU/kg、14IU/kg、15IU/kg、16IU/kg、17IU/kg、18IU/kg、19IU/kg、20IU/kg、21IU/kg、22IU/kg、25IU/mg、30IU/kg、40IU/kg、50IU/kg、70IU/kg、100IU/kg、125IU/kg、150IU/kg、175IU/kg、200IU/kg。經(jīng)靜脈施用LMWH制劑的其它示范性劑量為約0.03mg/kg0.45mg/kg，例如0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.22mg/kg、0.25mg/kg、0.27mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.37mg/kg、0.4mg/kg、0.44mg/kg,優(yōu)選約0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.44mg/kg、0.47mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.60mg/kg、0.7mg/kg，優(yōu)選約0.300.50mg/kg，例如0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.42mg/kg、0.44mg/kg、0.47mg/kgor0.50mg/kg。"預(yù)防有效量"是指在必要時(shí)間后達(dá)到期望預(yù)防結(jié)果的有效劑量。通常，由于預(yù)防性劑量用于疾病早期或疾病發(fā)生之前的受試者，因此預(yù)防有效量可小于治療有效量。包含本文提供的LMWH制劑的試劑盒也包含在本文的范圍之內(nèi)。所述試劑盒可包含一種或多種其它元件使用說(shuō)明書、其它試劑，例如治療劑或硫酸魚(yú)精蛋白、用于制備施用的LMWH制劑的裝置或其它材料、藥學(xué)上可接受的載體，以及用于向受試者施用的裝置或其它材料。使用說(shuō)明書可包括利用凝結(jié)試驗(yàn)(例如ACT和aPTT)監(jiān)測(cè)抗Xa活性和/或抗IIa活性的說(shuō)明。所述說(shuō)明書可包括對(duì)治療性應(yīng)用的說(shuō)明，包括建議劑量和/或給藥模式，例如對(duì)于患有病變(例如本文所述病變)的患者的建議劑量和/或給藥模式。其它說(shuō)明書可包括對(duì)使用硫酸魚(yú)精蛋白中和抗Xa活性和/或抗IIa活性的說(shuō)明。所述試劑盒可進(jìn)一步包含經(jīng)適當(dāng)?shù)呐渲瓢谝粋€(gè)或多個(gè)合適的單獨(dú)藥物制劑中的的至少一種其它試劑，例如診斷或治療性試劑(例如本文所述的診斷或治療性試劑)。預(yù)防性和治療性應(yīng)用所述LMWH制劑可用來(lái)治療受試者。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"治療"(treat,treatment)定義為向受試者(例如患者)應(yīng)用或施用LMWH帝lj劑，或向來(lái)自受試者(例如患者)的分離組織或細(xì)胞應(yīng)用或施用LMWH制劑，隨后將所述分離組織或細(xì)胞返還到患者體內(nèi)。所述受試者可以使患有病變(例如本文所述病變)、病變癥狀的患者或具有易患病變體質(zhì)的患者。所述治療可以是痊愈、治愈、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、緩和、改進(jìn)或影響所述病變、病變癥狀或具有易患所述病變體質(zhì)。本文中所用"受試者"為脊椎動(dòng)物，例如人類，非人類的靈長(zhǎng)動(dòng)物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動(dòng)物。所述受試者可以是，例如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、獸醫(yī)用動(dòng)物或人類受試者。所述治療可以是治療性的，例如痊愈、治愈、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、緩和、改進(jìn)或影響所述病變或病變癥狀的治療，例如減少、減輕或改進(jìn)現(xiàn)有的不利病癥或其癥狀，或者所述治療是預(yù)防性的，例如延遲(例如阻止)不利病癥或其癥狀出現(xiàn)的治療。肝素和LMWH具有多種治療性應(yīng)用。本文提供的LMWH制劑可用于治療任何類型的可由肝素或LMWH療法有效治療的病癥。因此，所述制劑和方法可用于多種體外、體內(nèi)或轉(zhuǎn)體(exWw)方法。例如，已知肝素和LMWH可用于預(yù)防和治療癡呆(例如，阿茲海默癥)、與凝血相關(guān)的病變(例如DVT61和PE)、纖維化病變(例如主要器官纖維化、纖維增生性病變和外傷相關(guān)的疤痕)、血栓癥(例如ACS、穩(wěn)定型或不穩(wěn)定型心絞痛，MIC例如STEMI和NSTEMI))或心血管疾病(動(dòng)脈硬化癥)、血管病癥或心房纖顫、過(guò)敏性反應(yīng)或呼吸系統(tǒng)病變(例如哮喘、肺氣腫、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、囊腫性纖維化或肺再灌注損傷)、循環(huán)性休克和相關(guān)病癥、遺傳性病變、癌癥或轉(zhuǎn)移性病變、膿血癥、狹窄和再狹窄，以及骨質(zhì)疏松癥。本文提供的LMWH制劑也可用于患有骨折(例如髖部骨折)的受試者，或接受外科手術(shù)(例如器官移植、整形外科手術(shù)、髖關(guān)節(jié)替換、膝關(guān)節(jié)替換，PCI、支架置入、血管成形術(shù)和CABG)之前、期間或之后的受試者。這些病變均為本領(lǐng)域所熟知并描述于，例如Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine(McGrawHill,Inc.,NewYork),其并入本文作為參考。HLGAG組合物在多種治療方法中的應(yīng)用描述并總結(jié)于Huang,J.andShimamura,A.,CoagulationDisorders,12,1251-1281(1998)。因此，LMWH制劑可用于治療或預(yù)防與凝血相關(guān)的疾病。當(dāng)凝血途徑傾向于過(guò)量凝結(jié)的不平衡狀態(tài)時(shí)，其結(jié)果是血栓趨勢(shì)的形成，通常表現(xiàn)為心臟病發(fā)作、中風(fēng)、DVT、ACS、穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型心絞痛以及心肌梗死。本文所用"與凝血相關(guān)的疾病"是指可由組織血液供應(yīng)的中斷或減少導(dǎo)致的局部炎癥表征的病癥，所述血液供應(yīng)的中斷或減少可能是例如由于負(fù)責(zé)向組織供血的血管堵塞的結(jié)果(例如在心肌梗死、腦梗死或外周血管疾病中觀察到的血管堵塞)，或由與血栓形成相關(guān)的病癥(例如心房纖顫、DVT或PE)的結(jié)果。經(jīng)歷手術(shù)、感覺(jué)缺失和長(zhǎng)期臥床休息或其它靜止?fàn)顟B(tài)的人常易患上深靜脈血栓(DVT)疾病，這是下肢和/或骨盆中靜脈血的凝結(jié)。這種凝結(jié)發(fā)生的原因是由于下肢缺乏輸送靜脈血(停滯的)所需的肌肉運(yùn)動(dòng)、局部血管損傷或高凝狀態(tài)。如果血凝塊移動(dòng)到肺而造成"肺栓塞"或干擾心血管循環(huán)，這種癥狀可能危及生命。一種治療方法包括使用抗凝血?jiǎng)?。所述方法可用于治療血栓性疾病和心血管疾病。所述心血管疾病包括但不限于?dòng)脈硬化癥和心房纖顫。心房纖顫是心律失常的常見(jiàn)形式，通常作為情緒壓力的結(jié)果而產(chǎn)生或在手術(shù)、鍛煉或急性酒精中毒之后發(fā)生。心房纖顫的特征是紊亂動(dòng)脈活動(dòng)和ECG上離散P波消失。這種紊亂活動(dòng)可導(dǎo)致心房中的異常血流以及血栓的形成。這些血栓可發(fā)生栓塞，造成腦缺血和其它疾病。血栓性疾病包括但不限于ACS(例如MI)、穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型心絞痛。心肌梗死是一種疾病狀態(tài)，有時(shí)是在先前經(jīng)動(dòng)脈硬化癥而窄化的冠狀動(dòng)脈中發(fā)生血栓阻塞后，冠狀血流突然減少而造成的。例如吸煙、高血壓和脂質(zhì)累積的因素可產(chǎn)生或促進(jìn)此類損傷。心絞痛是由瞬時(shí)心肌缺血造成的。這種疾病通常與體重、壓迫感、壓力、窒息或胸腔下部憋悶感相關(guān)。所述病癥通常是由運(yùn)動(dòng)或感情引發(fā)，但也在休息時(shí)發(fā)生。STEMI也被稱為"Q波心肌梗死"，是指具有異常超聲波心動(dòng)圖的MI。NSTEMI，或"非Q波心肌梗死"與超聲波心動(dòng)圖異常無(wú)關(guān)。穩(wěn)定型心絞痛發(fā)生在特定量運(yùn)動(dòng)或活動(dòng)后，其發(fā)生次數(shù)可以預(yù)測(cè)。不穩(wěn)定型心絞痛可作為普通模式穩(wěn)定型心絞痛的變體發(fā)生。它可包括休息時(shí)或較少運(yùn)動(dòng)后發(fā)生的胸痛，可較為嚴(yán)重或持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，或?qū)ο趸视偷捻憫?yīng)較小。不穩(wěn)定型心絞痛意味著由于血管窄化加劇或由于冠狀動(dòng)脈中形成小血塊而潛在地使血流進(jìn)一步惡化。不穩(wěn)定型心絞痛是即將發(fā)生心肌梗死的預(yù)警前兆。在血栓性疾病和心血管疾病的治療中可單獨(dú)使用所述LMWH制劑，或?qū)⑵渑c降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)或治療心血管疾病的其它治療劑組合使用。例如，組合療法可包括一種或多種其它治療劑(例如，一種或多種本文所述的治療劑)與LMWH制劑的共配制和/或共施用。本文所用"組合"施用是指在患病受試者的療程期間，向所述受試者遞送兩種(或多種)不同的治療劑，例如在所述受試者被診斷患有疾病或被鑒定有患病風(fēng)險(xiǎn)之后和疾病被預(yù)防、治愈或消除之前，向所述受試者遞送兩種或多種治療劑。在一些實(shí)施方案中，在第二治療的遞送開(kāi)始時(shí)，第一治療的遞送仍在繼續(xù)，也就是存在重疊。本文中有時(shí)將其稱為"同時(shí)"或"同時(shí)遞送"。在其它實(shí)施方案中，第一治療的遞送在其它治療的遞送開(kāi)始之前結(jié)束。可進(jìn)行這樣的遞送，在遞送第二治療時(shí)仍可檢測(cè)到第一治療的遞送效果。其它治療劑包括但不限于抗炎劑、抗血栓形成劑、抗血小板劑、纖維蛋白溶解劑、溶解血栓劑、降脂劑、直接凝血酶抑制劑、抗Xa抑制劑、抗IIa抑制劑、糖蛋白11b/ina受體抑制劑和直接凝血酶抑制劑。可與本文提供的LMWH制劑組合使用的試劑實(shí)例包括比伐盧定、水蛭素、水蛭素原、Angiomax、agatroban、PPACK、？疑血酶適配子、阿斯匹林、GPIIb/IIIa抑制劑(例如，Integrelin)、P2Y12抑制劑、噻吩吡啶、噻氯匹定和氯吡格雷。63本文提供的LMWH制劑的通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)抗凝試驗(yàn)(例如ACT和aPTT)的可監(jiān)測(cè)性以及可逆性為患者治療提供了提高的適應(yīng)性，例如同意住院和接受心血管手術(shù)可能性評(píng)估的那些患者。通過(guò)以下設(shè)想可突出此類優(yōu)勢(shì)。患者去醫(yī)院稱其患有與多種血栓性疾病(例如，ACS)相關(guān)的癥狀，包括穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛和MI。本文提供的LMWH制劑的可檢測(cè)性和可逆性使此類制劑可在患者接受心血管手術(shù)可能性評(píng)估時(shí)使用。如果確認(rèn)患者將接受如PCI或支架防治的外科手術(shù)，則可在手術(shù)期間監(jiān)測(cè)LMWH制劑的可監(jiān)測(cè)性、LMWH制劑的抗Xa活性和抗IIa活性，并且如果需要，可在手術(shù)期間或之后施用額外劑量的LMWH制劑以維持這些活性。如果確認(rèn)患者將接受如CABG的外科手術(shù)，則可在手術(shù)之前使用硫酸魚(yú)精蛋白中和LMWH制劑的抗Xa活性和抗IIa活性。此外，可監(jiān)測(cè)患者的抗Xa活性和抗IIa活性以確保手術(shù)前活性得到充分降低。本文提供的LMWH制劑也可用于治療血管病癥。血管病癥包括但不限于例如DVT、外周脈管病、腦缺血的病變(包括中風(fēng)和PE)。腦缺血發(fā)作或腦缺血是腦供血受阻的缺血病癥的一種形式。腦供血的中斷或減少可能是多種因素的結(jié)果，包括內(nèi)在阻斷或血管自身閉塞、遠(yuǎn)起源的閉塞、灌注壓力下降或血液粘稠度升高引起的腦血流不足，或蛛網(wǎng)膜下腔或大腦內(nèi)組織中血管破裂。所述方法可用于治療腦缺血。腦缺血可造成瞬時(shí)或永久性缺陷，經(jīng)歷腦缺血的患者所受的神經(jīng)傷害取決于缺血事件的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。瞬時(shí)缺血發(fā)作是指腦血流僅被暫時(shí)地中斷并導(dǎo)致暫時(shí)的神經(jīng)傷害，通?？稍?4小時(shí)之內(nèi)消除。TIA的癥狀包括面部或四肢麻木或虛弱，無(wú)法清晰交談和/或理解他人的談話、視覺(jué)損失或視力模糊以及眩暈感。永久性腦缺血發(fā)作，也被稱為中風(fēng)，是因血栓或栓塞導(dǎo)致腦血流的較長(zhǎng)中斷或減少引發(fā)的。中風(fēng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損失，通常造成可得到改善但不能痊愈的神經(jīng)缺陷。血栓栓塞中風(fēng)是由血栓或栓塞閉塞顱外或顱內(nèi)血管造成的。因?yàn)橥ǔ：茈y辨別中風(fēng)是由血栓癥還是由栓塞癥引發(fā)的，術(shù)語(yǔ)"血栓栓塞"用以涵蓋由所述任一個(gè)機(jī)制引發(fā)的中風(fēng)。所述方法還涉及使用本文提供的LMWH制劑治療急性血栓栓塞中風(fēng)。急性中風(fēng)是由腦供血中斷或減少的缺血事件導(dǎo)致的涉及神經(jīng)損傷的內(nèi)科綜合癥。單獨(dú)使用LMWH制劑或?qū)⑵渑c治療中風(fēng)的其它治療劑組合使用的有效量是指足以減少中風(fēng)造成的體內(nèi)腦損傷的量。腦損傷的減少是指在對(duì)腦損傷的預(yù)防，所述腦損傷可發(fā)生在未經(jīng)本文所述的治療且經(jīng)歷過(guò)血栓栓塞中風(fēng)的患者中。可使用多種生理參數(shù)評(píng)定腦損傷的減少，包括較小的梗死面積、提高的區(qū)域性腦血流以及降低的顱內(nèi)壓，例如，與治療前患者、未經(jīng)治療的中風(fēng)患者，或單獨(dú)使用溶解血栓劑治療的中風(fēng)患者的參數(shù)進(jìn)行比較?？蓡为?dú)使用LMWH制劑或與治療凝血相關(guān)疾病的治療劑組合使用。用于治療凝血相關(guān)疾病的治療劑的實(shí)例包括抗凝劑、抗血小板劑和溶解血栓劑?？鼓齽┳柚寡撼煞帜Y(jié)并以此阻止凝塊形成?？鼓齽┌ǖ幌抻谌A法林、香豆素(Coumadin)、雙香豆素、苯丙香豆素、醋硝香豆素、雙香豆素乙酯和茚二酮衍生物。"直接凝血酶抑制劑"包括水蛭素、水蛭素原、Angiomax、agatroban、PPACK、凝血酶適配子?？寡“鍎┮种蒲“迥?，并常用于預(yù)防曾經(jīng)歷瞬時(shí)缺血發(fā)作或中風(fēng)患者發(fā)生血栓栓塞中風(fēng)。溶解血栓劑溶解可引發(fā)血栓栓塞中風(fēng)的凝塊。溶解血栓劑已用于治療急性靜脈血栓栓塞和肺栓塞，并為本領(lǐng)域所熟知(參見(jiàn)，例如Hennekensetal,JAmCollCardiol;v.25(7supp),p.18S-22S(1995);Holmes,etal,JAmCollCardiol;v.25(7suppl),p.10S畫17S(1995))。本文所用肺栓塞是指與血凝塊在肺動(dòng)脈腔的滯留相關(guān)的疾病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸官能障礙。肺栓塞常發(fā)生于下肢靜脈，在腿部深靜脈形成凝塊并隨后通過(guò)靜脈循環(huán)到達(dá)肺部。因此，肺栓塞通常作為下肢靜脈的深靜脈血栓并發(fā)癥而發(fā)生。肺栓塞的癥狀包括急性發(fā)作的呼吸短促、胸痛(呼吸時(shí)疼痛增加)以及心率和呼吸速率加快。一些個(gè)體可能發(fā)生咯血。所述制劑和方法也可用于治療或預(yù)防動(dòng)脈硬化癥。現(xiàn)已在多種試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭凶C明肝素有利于動(dòng)脈硬化癥的預(yù)防。動(dòng)脈硬化癥是動(dòng)脈硬化的一種形式，人們認(rèn)為動(dòng)脈硬化是大多數(shù)冠狀動(dòng)脈疾病、主動(dòng)脈瘤和下肢的心房疾病的病因，并對(duì)腦血管疾病的發(fā)生起到作用。也可在透析程序和手術(shù)之前、期間或之后使用LMWH制劑。手術(shù)患者，特別是年齡超過(guò)40歲的患者，其發(fā)生DVT的風(fēng)險(xiǎn)增大。因此，可以預(yù)期本文提供的LMWH制劑在預(yù)防手術(shù)程序相關(guān)血栓癥發(fā)生上的用途。除一般手術(shù)程序，例如經(jīng)皮介入治療(例如，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI))、PCTA、支架和其它類似方法、髖或膝替換、心肺轉(zhuǎn)流手術(shù)、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)、整形外科手術(shù)和假體置換手術(shù)之外，所述方法也可用于接受組織或器官移植程序或骨折(例如髖骨折)治療的受試者。此外，本文提供的LMWH制劑可用于治療呼吸系統(tǒng)疾病，例如囊腫性纖維化、哮喘、過(guò)敏性反應(yīng)、肺氣腫、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺再灌注損傷和肺的缺血再灌注損傷。囊腫性纖維化是影響呼吸系統(tǒng)的慢性進(jìn)行性疾病。囊腫性纖維化的一個(gè)嚴(yán)重后果是銅綠假單胞菌性肺感染，僅此一項(xiàng)即占到囊腫性纖維化發(fā)病和死亡的幾乎90%。用于治療囊腫性纖維化的治療劑包括治療病原感染的抗菌劑。哮喘是以炎癥、氣管狹窄和氣管對(duì)吸入劑反應(yīng)性增加為特征的呼吸系統(tǒng)病變。哮喘通常與遺傳性過(guò)敏或過(guò)敏癥狀相關(guān)，盡管并非唯一相關(guān)。哮喘也可包括運(yùn)動(dòng)引發(fā)的哮喘、對(duì)支氣管刺激劑的支氣管收縮反應(yīng)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、自身免疫性腦脊髓炎和相關(guān)疾病。哮喘通常由抗過(guò)敏原的IgE抗體的產(chǎn)生而引發(fā)。肺氣腫是帶有肺泡隔破壞的終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端氣道膨脹。肺氣腫由彈性蛋白酶引發(fā)的肺損傷引發(fā)。成人呼吸窘迫綜合征是涵蓋伴有多種形態(tài)嚴(yán)重心房低氧血癥的多種急性彌漫性肺損傷。膿血癥是ARDS的最常見(jiàn)病因之一。炎癥疾病包括但不限于自身免疫性疾病和遺傳性過(guò)敏癥?？墒褂帽疚奶峁┑腖MWH制劑治療的其它炎癥類型有難治性潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病(Crohn'sdisease)、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性疾病、非特異性漬瘍性結(jié)腸炎、膿血癥和間質(zhì)性膀胱炎。所述LMWH制劑也可用于治療纖維化疾病，例如主要器官纖維化、纖維增生性病變和外傷相關(guān)的疤痕。主要器官纖維化包括但不限于間質(zhì)性肺疾病(ILD)、肝硬化、腎病(例如，糖尿病腎病和未經(jīng)治療的高血壓腎病)、心臟病和眼部疾病(例如，黃斑變性、視網(wǎng)膜病或玻璃體視網(wǎng)膜病變)。纖維增殖性病變的實(shí)例包括系統(tǒng)性和局部硬皮病、瘢痕瘤和肥厚性疤痕、動(dòng)脈硬化癥、再狹窄、纖維肉瘤和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。外傷相關(guān)疤痕的實(shí)例包括手術(shù)疤痕、化療引發(fā)的纖維化、放射引發(fā)的纖維化、與損傷或燒傷相關(guān)的疤痕。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用LMWH制劑抑制血管形成。本文使用的血管形成是指不恰當(dāng)?shù)男卵苄纬伞?血管形成"常在腫瘤中發(fā)生，內(nèi)皮細(xì)胞分66泌一組內(nèi)皮促有絲分裂生長(zhǎng)因子造成內(nèi)皮細(xì)胞伸長(zhǎng)和增殖，從而導(dǎo)致新血管的產(chǎn)生。一些血管分裂原是與內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子相關(guān)的肝素結(jié)合肽。抑制血管生成可導(dǎo)致動(dòng)物模型中的腫瘤衰退，說(shuō)明其作為抗癌治療劑的用途。血管形成疾病包括但不限于眼部新生血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、牛皮癬、關(guān)節(jié)炎、癌癥和心血管疾病。所述LMWH制劑也可用于抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此，所述方法可用于治療和/或預(yù)防受試者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)移。所述癌癥可以是惡性或非惡性癌癥。癌癥或腫瘤包括但不限于膽道癌、腦癌、乳腺癌、宮頸癌、絨毛膜癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、上皮內(nèi)瘤變、白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如，小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、肉瘤、皮膚癌、睪丸癌、甲狀腺癌和腎癌，以及其它癌和肉瘤。需要癌癥治療的受試者可能是具有高癌癥發(fā)生可能性的受試者。這些受試者包括，例如具有遺傳性異常的受試者(現(xiàn)己證明遺傳性異常的出現(xiàn)與較高的癌癥發(fā)生可逆性相關(guān))以及暴露于致癌劑(例如煙草、石棉或其它化學(xué)毒素)的受試者，或曾接受癌癥治療并且在外觀上癌癥已經(jīng)消退的受試者。向接受癌癥治療的受試者施用時(shí)，所述LMWH制劑可在包含其它抗癌劑的混合物中施用。所述LMWH制劑也可在包含治療放療副作用的試劑(例如止吐藥、放療保護(hù)劑等)的混合物中施用。本文提供的治療可進(jìn)一步包含施用硫酸魚(yú)精蛋白以中和所述LMWH制劑的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如當(dāng)不再需要抗凝血或抗血栓形成活性時(shí)中和所述LMWH制劑的抗Xa活性和/或抗IIa活性。硫酸魚(yú)精蛋白可按照每100IU抗Xa活性約1、2、3mg硫酸魚(yú)精蛋白的劑量施用，例如通過(guò)靜脈施用?？墒褂美绫疚乃龅哪囼?yàn)測(cè)定抗Xa活性的IU。其它實(shí)施方案通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，的限制。本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、本文作為參考。所述實(shí)施例不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明專利和公開(kāi)專利申請(qǐng)的內(nèi)容均并入實(shí)施例生產(chǎn)M118-REH的方法生產(chǎn)過(guò)程圖1顯示了用于生產(chǎn)M118-REH的流程示意圖。簡(jiǎn)要而言，在流程中的第一步，使用乙酸鈣的乙醇水溶液對(duì)商購(gòu)的普通肝素USP(UFH)進(jìn)行系列逐步沉淀(乙酸鈣/UFH質(zhì)量比為3:1)，從而提取出低分子量UFH的部分(也被稱為基本是快速移動(dòng)組分的部分)。步驟1分離所得的產(chǎn)物被稱為中間產(chǎn)物1。步驟2包括在pH7.2和37。C下，在乙酸鈉水緩沖液中使用經(jīng)修飾的肝素酶m消化中間產(chǎn)物l，以產(chǎn)生中間產(chǎn)物2，其中經(jīng)修飾的肝素酶III具有組氨酸至丙氨酸的第225位氨基酸殘基取代(M011)。M011通過(guò)N-乙酰氨基葡萄糖殘基和低硫酸酯化糖醛酸間的(3-消除進(jìn)行切割以產(chǎn)生在非還原末端具有A4,5糖醛酸基團(tuán)，在還原末端具有N-乙酰葡糖胺的鏈。降解完成時(shí)，停止加熱并加入氯化鈉至約2%w/v的溶液終濃度。在步驟3中，使用體積排阻色譜(SEC)使中間產(chǎn)物2的高抗Xa因子活性和抗II因子活性組分與低活性組分分離。此步驟的產(chǎn)物稱為中間產(chǎn)物3。在步驟4中，將單個(gè)或組合的中間產(chǎn)物3物質(zhì)溶于純化水中，通過(guò)0.2pm濾器過(guò)濾，并凍干產(chǎn)生M118-REH原料藥。生產(chǎn)M118-REH的起始原料起始原料的詳述用于制備M118-REH的起始原料UFH鈉(USP)來(lái)自豬腸粘膜。除USP試驗(yàn)外，還使用了其它檢驗(yàn)。這些檢驗(yàn)列出于表l中表l:除DMF之外的UFH試驗(yàn)和規(guī)格試驗(yàn)規(guī)格效力分析證明NLT160U/mg(折干計(jì)算)瓊脂糖凝膠電泳報(bào)告快速移動(dòng)肝素和慢移動(dòng)肝素報(bào)告硫酸皮膚素和硫酸軟骨素68基于其電泳遷移性，瓊脂糖凝膠電泳半定量地分離基于肝素的多種組分，例如硫酸皮膚素和硫酸軟骨素。先后在pH5.8的乙酸鋇緩沖液和pH9的1,3-丙二胺乙酸酯緩沖液中進(jìn)行0.5%瓊脂糖凝膠的水平分離。在所使用的專用電泳槽中，用不溶于水的低密度有機(jī)溶劑(例如石油醚或庚垸)覆蓋包含液體緩沖劑的電極室。這一設(shè)計(jì)可在瓊脂糖凝膠板和填充有冰的金屬冷卻盤之間提供有效的熱傳遞。低分子量肝素通常由USP級(jí)UFH制備。為了獲得較高效力的低分子量肝素原料藥，將用于M118-REH過(guò)程的UFH起始原料限定為效力高于160IU/mg的那些原料。為了控制硫酸皮膚素和硫酸軟骨素的水平，在UFH起始原料中測(cè)定所述水平并在M118-REH生產(chǎn)過(guò)程的第一步進(jìn)行控制。中間產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析上文簡(jiǎn)要說(shuō)明了M118-REH生產(chǎn)過(guò)程的步驟(如圖1所示)。用于糖結(jié)構(gòu)研究的表征技術(shù)提供了對(duì)此過(guò)程各個(gè)步驟中UFH發(fā)生變化的結(jié)構(gòu)屬性的理解。此類信息有利于所述過(guò)程的控制和再現(xiàn)性，包括對(duì)起始原料的選擇。使用2D-NMR(HSQC)分析和毛細(xì)管電泳對(duì)步驟2的不同原料(或中間產(chǎn)物1樣品)和制備步驟2原料的起始原料UFH進(jìn)行分析。鑒定組成起始原料和中間產(chǎn)物的構(gòu)建單元，并進(jìn)行定量。試驗(yàn)中，所研究的步驟2的一些物質(zhì)并非下一步驟(酶消化)的理想底物，鑒定其屬性以找出優(yōu)選的步驟2物質(zhì)。表2和表3顯示的2DNMR分析數(shù)據(jù)說(shuō)明起始UFH和步驟2的物質(zhì)之間的差別。此分析可確定M118-REH生產(chǎn)過(guò)程的第一步中結(jié)構(gòu)屬性方面的所有差異?；诓町惙治霁@得的所有數(shù)據(jù)，得出了關(guān)于起始原料、中間產(chǎn)物和生產(chǎn)過(guò)程的某些結(jié)論。表2:對(duì)UFH和由UFH獲得的步驟2的物質(zhì)的2DNMR分析。這些物質(zhì)代表優(yōu)選的步驟2物質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>與起始原料相比，步驟2的物質(zhì)具有相對(duì)較低的l2S含量，這一點(diǎn)也通過(guò)表中顯示的H^-(l2s)結(jié)構(gòu)的減少得到反映。和預(yù)期的一樣，這還伴隨著HNS-(I)和H兩-(G)的增加。有趣的是，6-0-硫酸酯化己糖胺(H6s)的量也有相對(duì)增力口。表3:對(duì)UFH和由UFH獲得的步驟2的物質(zhì)的2DNMR分析。這些物質(zhì)代表優(yōu)選的步驟2物質(zhì)。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>"優(yōu)選"的步驟2物質(zhì)是在所述過(guò)程中可作為下一步(即MOU的酶消化)的優(yōu)良底物的物質(zhì)，而"較不優(yōu)選"的步驟2物質(zhì)是較差的底物。在對(duì)HNAc,)的相對(duì)含量進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)步驟1之后實(shí)際H旨含量在"優(yōu)選"的步驟2物質(zhì)中增加，而在"較不優(yōu)選"的步驟2物質(zhì)中減少(參見(jiàn)表2和表3)。另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是，與"優(yōu)選"的步驟2物質(zhì)相比，"較不優(yōu)選"的步驟2物質(zhì)中G-(HwAe)單位相對(duì)量的減少程度大很多。這些發(fā)現(xiàn)得到了MOll底物特異性的證明，其中MOll優(yōu)選作用于與未硫酸酯化葡糖酸相鄰的連接(即HNAe-G)。通過(guò)這些分析，鑒定出在生產(chǎn)過(guò)程的歩驟1(沉淀)中從普通肝素到歩驟2物質(zhì)發(fā)生的結(jié)構(gòu)屬性變化。由于步驟2物質(zhì)中的N-乙?；克坪鯇?duì)隨后的酶消化步驟非常重要，人們期望使用具有高N-乙?；康钠鹗糢FH，從而可更好地在沉淀后生產(chǎn)步驟2物質(zhì)。因此，基于此分析確定的起始UFH的預(yù)先標(biāo)準(zhǔn)可更好地控制和評(píng)估M118-REH生產(chǎn)過(guò)程。表4顯示了對(duì)過(guò)程中間產(chǎn)物的其它試驗(yàn)和規(guī)格，并在下文進(jìn)行詳述。表4:中間產(chǎn)物的試驗(yàn)和規(guī)格<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>瓊脂糖凝膠電泳過(guò)程已在上文進(jìn)行描述。如本文所述測(cè)定抗Xa因子活性。可使用Stachron^肝素測(cè)試試劑盒在DiagnosticaStago分析儀，或使用Chromogenix的(3(^1681@肝素試劑盒在ACLFuturaTM凝血系統(tǒng)上，或在任意等價(jià)系統(tǒng)上測(cè)定抗Xa因子活性。使用低分子量肝素沐t次01/608或現(xiàn)有批次)的NIBSC國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)校正分析儀的反應(yīng)。使用平行試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算每毫克M118-REH原料藥的效力(以國(guó)際單位計(jì)的抗Xa活性)。使用以下原則，根據(jù)本文所述測(cè)定抗IIa因子活性?？墒褂肅hromogenix的試劑(S-2238底物，凝血酶(53nkat/瓶)和抗凝血酶)在DiagnosticaStago分析儀或ACLFuturaTM凝血系統(tǒng)上，或在任意等價(jià)系統(tǒng)上測(cè)定抗IIa因子活性。使用低分子量肝素(批次01/608或等價(jià)物)的第二國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)校正分析儀的反應(yīng)。使用平行試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算每毫克的M118-REH原料藥的效力(以國(guó)際單位計(jì)的抗IIa活性)。使用連接有WyattminiDAWN多角度光散射(MALS)檢測(cè)器或任意其它適合的MALS檢測(cè)器的體積排阻色譜(SEC)系統(tǒng)，以及OptilabrEX干涉折射計(jì)(RID)或依照USP的其它適合RID<621>(當(dāng)前版本)測(cè)定M118-REH中間產(chǎn)物的重均摩爾質(zhì)量、多分散性和摩爾質(zhì)量分布。SEC柱由使用高分辨率L20作為填料的一些柱子組成，例如TosohSWXL保護(hù)柱與串聯(lián)偶聯(lián)的TosohTSKgelG3000SWXL和TosohTSKgelG2000SWXL。使用0.2M硫酸鈉流動(dòng)相(使用硫酸將pH調(diào)整至5.0)以0.5mL/min平衡所述系統(tǒng)。在流動(dòng)相中添加0.05%的疊氮化鈉。在注射M118-REH中間產(chǎn)物前將其溶于所述流動(dòng)相從而獲得10mg/mL的溶液。使用WyattAstra軟件或任意適合的軟件測(cè)定重均摩爾質(zhì)量、多分散性和分布參數(shù)。分布利用以下參數(shù)表征摩爾質(zhì)量小于5,500Da(Ms，)的鏈的百分比和摩爾質(zhì)量大于8,000Da(M,e)的鏈的百分比或摩爾質(zhì)量小于5,500Da(Ms50())的鏈的百分比和摩爾質(zhì)量大于7,500Da(M8ooo)的鏈的百分比。在M118-REH過(guò)程的第二步中，使用MOll酶消化中間產(chǎn)物l。隨著中間產(chǎn)物1底物的酶降解而產(chǎn)生的包含A4,5糖醛酸殘基的中間產(chǎn)物2具有UV232吸收的特征。為了監(jiān)測(cè)消化的進(jìn)展，定期對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行取樣，并測(cè)定232nm的吸收。232nm的吸收在1小時(shí)內(nèi)的改變不超過(guò)2AU時(shí)，可認(rèn)為完成步驟2的消化。表5顯示多種M118-REH制劑的重均分子量和M118-REh各種制劑的分子量分布。表6顯示M118-REH、LMWH和UFH產(chǎn)物的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>M118-REH為獨(dú)特的混合物。使用一系列分析技術(shù)完成對(duì)普通肝素(UFH)和LMWH產(chǎn)物的表征，使用所述分析技術(shù)已鑒定出給定LMWH的獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)，在多個(gè)不同LMWH中以不同量出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，以及負(fù)責(zé)肝素生物性質(zhì)的結(jié)構(gòu)。對(duì)如M118-REH的復(fù)合LMWH混合物的分析不僅需要說(shuō)明由肝素生物合成產(chǎn)生的內(nèi)在結(jié)構(gòu)可變性，還要說(shuō)明在酶切和生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)。這可以通過(guò)對(duì)混合物中存在的天然和經(jīng)修飾(如果存在)的還原和非還原末端特點(diǎn)進(jìn)行分辨而得到解決。此時(shí)，還需要確認(rèn)由親本UFH分子確定的二糖單位相對(duì)"順序"沒(méi)有受到生產(chǎn)過(guò)程的影響。因此，有必要提供在M118-REH鏈中這些經(jīng)修飾或天然構(gòu)建單元存在的序列。為了說(shuō)明這些因素，現(xiàn)已研發(fā)出表征M118-REH的方法，該方法包括使用來(lái)自于可提供獨(dú)特的互補(bǔ)數(shù)據(jù)群的多種不同分析技術(shù)的數(shù)據(jù)。使用CE進(jìn)行成分分析以鑒定M118-REH鏈中包含的單個(gè)構(gòu)建單元，并對(duì)其進(jìn)行定量。這些方法還能鑒定負(fù)責(zé)抗Xa活性的構(gòu)建單元結(jié)構(gòu)，稱為"抗Xa構(gòu)建單元"。構(gòu)建單元分析/成分分析通過(guò)毛細(xì)管電泳(CE)進(jìn)行的成分分析簡(jiǎn)要而言，此方法包括將M118-REH酶促消化成其成分構(gòu)建單元，隨后使用CE進(jìn)行分離(圖2A和圖2B)。CE是一種高分辨率的分離技術(shù)，并且已經(jīng)廣泛用于UFH和其它葡胺聚糖的分析。本文的方法使用無(wú)涂層熔融硅毛細(xì)管內(nèi)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳。利用毛細(xì)管電泳，硫酸酯化程度最高的物質(zhì)在毛細(xì)管中移動(dòng)最快，并首先被檢測(cè)到。代表性數(shù)據(jù)圖2顯示通過(guò)CE觀察到M118-REH的酶消化圖譜。特別地，在M118-REH中沒(méi)有觀察到除已存在于UFH中的修飾構(gòu)建單元之外的修飾構(gòu)建單元(通過(guò)對(duì)依諾肝素l,6-結(jié)構(gòu)的觀察表明)。另一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是與依諾肝素相比，M118-REH中3-0-硫酸酯化物質(zhì)的量幾乎增加了一倍(通過(guò)AT-intetra峰表明)。這與此混合物中觀察到的較高抗Xa活性良好地相關(guān)，并且與M118-REH的生產(chǎn)方法一致?；诖思夹g(shù)顯示M118-REH的硫酸酯化總程度也略高于依諾肝素。此技術(shù)也用于測(cè)定M118-REH中每個(gè)糖構(gòu)建單元成分的存在和數(shù)量(表〗2)。表7:在M118-REH的CE分析中觀察到的糖構(gòu)建單元峰結(jié)構(gòu)1△U2sHNS,6s2MJ2sHNS3AUHNS,6S4MJ2sHnAc,6S羅ns6AU2sHNAc7AUHnAc,6S8AUHnac9△UHnac,6sGHns,3S10△UHNAc,6SGHNS,3s,6s11AU2sHns,6sI2S12△U2sHNS,6sGHNS,3s，6s13AUgaiHNS,6S14△UgaiHNs定性分析上，沒(méi)有在M118-REH圖譜中觀察到1,6-脫水構(gòu)建單元(在依諾肝素中觀察到)或2,5-脫水結(jié)構(gòu)(在達(dá)肝素中發(fā)現(xiàn))。一些有趣的發(fā)現(xiàn)來(lái)自于對(duì)這些結(jié)構(gòu)的定量分析。在對(duì)依諾肝素和M118-REH中峰10(AUHwAe,6sGH^,3s,6s)的相對(duì)摩爾n/。進(jìn)行比較時(shí)，M118-REH中存在的峰值較高，證明M118-REH生產(chǎn)過(guò)程富集了肝素中的活性抗凝序列。與依諾肝素相76比，M118-REH中的三糖(AU2sH怖,6sl2s)含量相對(duì)較低。這是對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的反映。用于制備依諾肝素的化學(xué)過(guò)程導(dǎo)致寡糖還原末端的"剝離"，從而增加了奇數(shù)鏈的數(shù)量。對(duì)于M118-REH則不是這種情況，因此三糖水平仍是在起始UFH觀察到的直接結(jié)果。這一分析表明CE法的靈敏度足以獲得對(duì)LMWH生產(chǎn)中使用的不同過(guò)程的指示性變化，因此可具有高分辨率。表8:M118-REH和依諾肝素中選定結(jié)構(gòu)的定量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>通過(guò)2DNMR進(jìn)行的成分分析現(xiàn)已成功地將NMR譜用于檢測(cè)和定量與多糖中主要和次要結(jié)構(gòu)特征相關(guān)的信號(hào)。NMR譜也是能夠有效測(cè)定混合物中艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸的適合技術(shù)之一?，F(xiàn)已將二維(2D)NMR譜用作為拆分和鑒定對(duì)應(yīng)于特定單糖殘基群的特征信號(hào)的手段。這一方法不僅能夠定量混合物中的基本單糖成分，而且能夠以定量的方式評(píng)估其連接環(huán)境。二維NMR為通過(guò)CE的M118-REH成分分析提供了互補(bǔ)技術(shù)。2DNMR提供關(guān)于H-U連接的二糖的信息，從而提供了二糖連接的互補(bǔ)分析。近期使用2D質(zhì)子-碳相關(guān)譜(HSQC)試驗(yàn)的方法已經(jīng)證明其獲得葡胺聚糖的此類定量成分分析的能力。圖4顯示使用2D質(zhì)子-碳相關(guān)譜(HSQC)測(cè)定的M118-REH中異頭區(qū)域的圖譜。圖中顯示了異頭區(qū)域的交叉峰。對(duì)M118-REH中異頭區(qū)域的分析提供了一些關(guān)于使M118-REH具有不同于其它LMWH的獨(dú)特性的非常有趣的信息。第一，與其它如依諾肝素的LMWH相比，M118-REH的異頭區(qū)域要簡(jiǎn)單很多。第二，在分析鏈的還原末端殘基時(shí)，發(fā)現(xiàn)大部分鏈的末端為W-乙酰葡糖胺，僅有少量鏈的末端為iV-磺基葡糖胺。這是用來(lái)制備M118-REH的酶的特異性的結(jié)果。第三，NMR數(shù)據(jù)表明約30%的鏈在非還原末端具有AU殘基，這也是酶特異性的結(jié)果。第四，在M118-REH中沒(méi)有觀察到G-H^e二糖。最后，在NMR譜中沒(méi)有觀察到連接區(qū)域的糖類。表7列出了M118-REH中單糖成分的百分?jǐn)?shù)及其連接環(huán)境。NMR還能夠確定M118-REH的艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸比值。表9:M-118中葡糖胺和糖醛酸殘基成分的百分?jǐn)?shù)(兩個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果)M118-REH葡糖胺HnS-G2S)57.6/57.0Hns-(I)9.8/12.0Hns-(G)11.0/11.1H區(qū)c(內(nèi)在)6.1/3.1HnS,3S7.3〃.2HNSred1.6/1.5HNAcaredox4.6/5.1H^AcPredox2.0/3.0H6S90.4/90.5L.R.0/<0.1糖醛酸AU1.9/2.4I2S68.7〃0.20I-(HnS/Ac，6S)9.9/9.5I-(Hns/ac)1.4/0.9G-(Hns)8.7〃.7G-(H即s)5.9/4.8G畫(Hnac)0/0GalA2.7環(huán)氧化物0.8結(jié)論M118-REH的結(jié)構(gòu)屬性鑒定如下基于相對(duì)摩爾％，與現(xiàn)有LMWH和UFH起始原料相比，M118-REH富含具有3-0-硫酸酯的糖鏈(AT-ni結(jié)合四糖)；產(chǎn)生突出的還原末端結(jié)構(gòu)(HwAc);唯一發(fā)現(xiàn)的經(jīng)修飾的非還原末端結(jié)構(gòu)為AU;保持了UFH的天然二糖骨架結(jié)構(gòu)，并有限地引入了在其它LMWH觀察到的與加工相關(guān)的變化；從混合物中除去抗Xa或抗IIa(凝血酶)結(jié)合不需要的UFH成分，從而產(chǎn)生特征更加明確的肝素；M118-REH解聚過(guò)程的特異性保留了所需的鏈長(zhǎng)度以及最接近于結(jié)合位點(diǎn)的分離，從而保持抗IIa活性。如圖5所示，LMWH產(chǎn)物的關(guān)鍵屬性是通過(guò)多種解聚方法將較長(zhǎng)的多糖鏈切割成較小的片段。此切割事件可由化學(xué)或酶反應(yīng)引發(fā)，并在分子的還原和非還原末端產(chǎn)生特征性標(biāo)記。下文描述了M118-REH中存在的特征性末端基團(tuán)。非還原末端結(jié)構(gòu)導(dǎo)致新的非還原末端(縮寫為AU)形成的酶切特異性提供了在多糖鏈中設(shè)置AT-III結(jié)合1立點(diǎn)的方》去。還原末端結(jié)構(gòu)M118-REH鏈上新還原末端的葡糖胺結(jié)構(gòu)是對(duì)所述過(guò)程中使用的酶的特異性的反映。因此，M118-REH中的大部分還原末端結(jié)構(gòu)為N-乙酰化己糖胺(H^)殘基。M118-REH和普通肝素之間的結(jié)構(gòu)差別1)與普通肝素(UFH)原料相比，M118-REH具有更高摩爾％的抗凝血酶結(jié)合糖序列。2)與UFH原料相比，M118-REH具有的連結(jié)區(qū)域的量可以忽略不計(jì)。3)M118-REH在鏈的非還原末端具有特定比例的A4，5-葡萄糖醛酸，而UFH在非還原末端不含這種修飾殘基。79總之，M118-REH是一種具有獨(dú)特物理和功能屬性的肝素產(chǎn)物。以上討論的大多數(shù)結(jié)構(gòu)屬性都是用于制備M118-REH的酶的性質(zhì)的直接結(jié)果。這些包括顯著的還原末端結(jié)構(gòu)(Hw^)、唯一的經(jīng)修飾非還原末端結(jié)構(gòu)(AU)以及連結(jié)區(qū)域的除去。此外，由于酶優(yōu)選切割肝素混合物中的低級(jí)或非硫酸酯化域而并不影響AT-III結(jié)合序列，因此可使其在M118-REH中富集。使用上述表征方案分析了4個(gè)批次的M118-REH。此分析確認(rèn)了所述M118-REH生產(chǎn)的一致性表10:多個(gè)批次M118-REH的CE分析峰結(jié)構(gòu)#1#2#3#41△U2sHNS,6S57.159.557.057.42△U2sHNS6.05.65.46.1△UHNS，6S13.212.312.212.74AU2sHNAc,6s1.81.61.71.85羅NS0.60.70.60.76AU2sH區(qū)c0.50.50.40.47△UHNAc,6S4.53.73.74.38AUHNAc1.81.31.51.89AUH區(qū)c,6sGHns,3S1.31.01.21.210AUH區(qū)c,6sGHns,3S，6S10.49.48.98.611△U2sHNS,6sI2s0.30.30.70.612AU2sHns,6sGHns,3S，6S0.50.71,00.913AUgaiHNS,6S1.72.94.43.014△Uga]HNS020.50.90.480表10A:峰的優(yōu)選范圍峰結(jié)構(gòu)A1AU2sHNS,6S58±52△U2sHNs6±2.5△UHNS，6s13±34△U2sHNAc,6S1.5±1.55△UHNS0.6+1.06AU2sHNAc0.5+1.07△UHNAc，6S4+28MJHnac1.5+2.09AUHNAc，6SGHns,3s1.2±1.510AUHNAc,6sGHns,3S,6S9.5±411△U2sHNS，6sl2S0.5±1.012△U2sHNS,6SGHns,3S,6S0.7±2.013AUgaiHNs，6S3.0±3.014△UgaiHNS0.6士1.581表ll:M118-REH葡糖胺和糖醛酸殘基成分的百分比______________________單糖1234葡糖胺Hns-(工2S)54.357.061.857.6HNS-(I)12.512.011.09.8HNS-(G)10.811.19.511.0Hnac(內(nèi)在)3.43.14.26.1Hns，3S8.77.27.07.3HNSred0.81.50.41.6HNAcar6dox6.05.14.14.6HNAc卩redox3.63.02.02.0H6S90.090.591,390.4連接區(qū)域<0.1<0.1<0.1<0.1糖醛酸AU2.72.42.11.9I2S69.870.270.668.7I畫(Hns/Ac,6S)11.89.59.29.9I-(H麗Ac)1.40.91.21.4G-(HNS)8.97.78.48.7G-(H即s)5.44.84.15.9G畫(Hnac)0000半乳糖醛酸02.12.42.7環(huán)氧化物02.42.00.8表11A:優(yōu)選的結(jié)構(gòu)范圍單糖A葡糖胺HnS-(!2S)57.7土7HNS-(I)11.3±5HNS-(G)10.6±5HnAc(內(nèi)在)4.2士5Hns,3S7.6±5HNSred1.1±5HNAcaredox5.0±52.7±5H6S90.6±6連接區(qū)域<0.1-0.0糖醛酸AU2.3±5I2S69.8±6I-(Hns/Ac,6S)10.1±6I-(Hns/ac)1.2±5G-(HNS)8.4±5G-(HNS,3S)5.1±5G-(HNAc)0+2半乳糖醛酸1.8±5環(huán)氧化物1.3±5藥物產(chǎn)物M118-REH注射劑的規(guī)格和成分藥物產(chǎn)物M118-REH注射劑為I型玻璃瓶裝3mL單次使用的澄清無(wú)色至微黃溶液，由氯化丁基橡膠塞密封并使用鋁質(zhì)鉗口蓋進(jìn)行外封。每瓶標(biāo)定包含2mL5000IU抗Xa因子活性。表11給出了M118-REH注射劑的定量成分。所給出的是標(biāo)簽為2mL體積中的成分。瓶中的填充量為2.15mL，與USP推薦的過(guò)量體積一致。表12:M118-REH注射劑成分成分每單位(瓶)的量功能質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)M118-REH原料藥5000IU抗X活性1活性藥物成分N/A氯化鈉過(guò)程滲透度調(diào)節(jié)2滲透調(diào)節(jié)劑USP注射用水定容至2mL溶劑USP1根據(jù)抗Xa因子活性(折干計(jì)算)和干燥損失來(lái)計(jì)算M118-REH原料藥的量。假定對(duì)于200IU/mg的抗Xa因子活性，M118-REH原料藥的量為每瓶25mg。2達(dá)到280-330mOsm/L滲透壓所需要的氯化鈉的量為約8mg/mL，或每瓶16mg。M118-REH注射劑中不需要使用稀釋劑。M118-REH注射劑的成分通過(guò)將M118-REH原料藥溶于注射用水來(lái)生產(chǎn)M118-REH注射劑。M118-REH原料藥極易溶于水溶液，因此原料藥的粒徑分布對(duì)藥物產(chǎn)物的性質(zhì)沒(méi)有影響。氯化鈉(USP)是M118-REH注射劑中唯一使用的賦形劑(濃度為約8bg/mL)。使用氯化鈉作為滲透度調(diào)節(jié)劑以避免施用時(shí)注射位點(diǎn)的不適和紅血球溶解。M118-REH注射劑生產(chǎn)過(guò)程M118-REH注射劑的生產(chǎn)過(guò)程由將M118-REH原料藥溶于注射用水(USP)，和使用氯化鈉(USP)調(diào)節(jié)滲透度組成。將配制的溶液通過(guò)兩個(gè)串聯(lián)的0.2pm濾器進(jìn)行過(guò)濾，并在無(wú)菌條件下裝瓶。肝素鈉產(chǎn)物在極高溫度下會(huì)發(fā)生降解，因此不能進(jìn)行最終滅菌。圖6顯示了M118-REH注射劑的加工流程圖(見(jiàn)下文;)。圖6顯示了M118-REH注射劑的加工流程圖。根據(jù)以下等式，由試驗(yàn)(抗Xa因子活性)和化驗(yàn)證書的干燥損失計(jì)算各批次中應(yīng)添加的M118-REH原料2500IU/mL/試驗(yàn)(IU/mg)X100/(100-干燥損失％)X批次體積(mL)+1000mg/g=應(yīng)添的加原料藥的量84向配制容器中添加約等于批次最終重量75%的注射用水，并開(kāi)始攪拌。向所述容器中緩慢添加計(jì)算量的M118-REH原料藥，并混合直至所有固體溶解。加入初始量的氯化鈉(USP)，并將溶液混合直至所有固體溶解。加入注射用水直至最終批次體積，并將溶液繼續(xù)混合515分鐘。測(cè)定滲透度，并根據(jù)需要添加額外的氯化鈉(USP)以達(dá)到280-330mOsm/L的滲透度。使用經(jīng)預(yù)先滅菌的兩個(gè)串聯(lián)的Millipak20PVDF(聚偏氟乙烯)0.22pm濾器對(duì)大批M118-REH藥物產(chǎn)物進(jìn)行滅菌。將產(chǎn)物過(guò)濾至灌裝容器中，并在過(guò)濾結(jié)束時(shí)檢測(cè)濾器的完整性。M118-REH的生物和藥理學(xué)性質(zhì)M118-REH是產(chǎn)生解聚化低分子量肝素的酶促消化的產(chǎn)物。解聚化混合物富含活性抗凝劑和抗血栓形成片段，這可能是特異性葡胺聚糖裂解酶的位點(diǎn)特異性酶切的結(jié)果。所述特異性位點(diǎn)和通過(guò)這種酶進(jìn)行的定位解聚能夠使M118-REH成為一種高效的動(dòng)脈損傷保護(hù)分子。此外，M118-REH還具有可逆且容易地通過(guò)床邊凝結(jié)試驗(yàn)檢測(cè)的屬性?，F(xiàn)已完成關(guān)于M118-REH藥理和生物學(xué)性質(zhì)的研究，此研究過(guò)程揭示了M118-REH的體外和體內(nèi)作用模式。已經(jīng)對(duì)抗凝和抗血栓形成功能的機(jī)制進(jìn)行了研究。這些研究還提出了初步的構(gòu)效關(guān)系(SAR)。下文描述的這些研究及其結(jié)果是對(duì)產(chǎn)生的M118-REH生物藥理活性圖譜的初步分析。凝血活性的體外分析根據(jù)第二國(guó)際低分子量肝素標(biāo)準(zhǔn)，M118-REH的體外抗Xa活性的范圍是180300IU/mg。M118-REH制劑較高的體外抗Xa/IIa活性與其包含3-0-硫酸酯化部分的AUHNAe,6SGHNS,3S,6S片段成比例。根據(jù)第二國(guó)際低分子量肝素標(biāo)準(zhǔn)，M118-REH的體外抗IIa活性范圍是100250IU/mg。2.4pg/mL的M118-REH可將體外aPTT由40秒延長(zhǎng)至80秒，并且aPTT的變化與抗Xa和抗IIa活性成比例。硫酸魚(yú)精蛋白體外中和抗Xa活性的測(cè)定魚(yú)精蛋白能夠以lmg:100IU人血漿抗Xa活性的比例完全逆轉(zhuǎn)M118-REH的抗Xa活性?？蓪⑦@一點(diǎn)與其它LMWH制劑進(jìn)行比較。例如，以3mg:100IU人血漿抗Xa活性的比例，魚(yú)精蛋白僅能中和伊諾肝素60%的抗Xa活性。這些結(jié)果顯示于圖7中。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEO釋放組織因子途徑抑制物OTPI):在不含ECGS的2%FBSF12K改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)得自于ATCC的HUVEC。在相同的培養(yǎng)基中以0.01mg/ml和0.005mg/ml的終濃度配制M118-REH、Lovenox和UFH。將每組各3孔的細(xì)胞在37°C、5%(302和95%02的條件下溫育24和48小時(shí)。取上清液，使用來(lái)自ADI的ELISA試劑盒進(jìn)行TFPI釋放試驗(yàn)。如圖8所示，24和48小時(shí)后，0.005mg/ml和0.01mg/ml的M118-REH顯著增加了HUVEC的TFPI釋放。與普通肝素相比，M118-REH導(dǎo)致HUVEC更多地向細(xì)胞培養(yǎng)基中釋放TFPI。與對(duì)照相比，Lovenox沒(méi)有導(dǎo)致TFPI釋放的顯著增加。M118-REH的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)在嚙齒動(dòng)物模型(例如Sprague-Dawley大鼠和B16B16小鼠模型)中，M118-REH在靜脈注射后具有比UFH長(zhǎng)的消除半衰期，且與依諾肝素的消除半衰期相當(dāng)。M118-REH在皮下注射后被快速吸收，其Tmax的范圍是13小時(shí)。在如新西蘭白兔的兔模型中，皮下注射M118-REH獲得高于UFH的生物利用度(以抗Xa和抗II活性計(jì))，其生物利用度為靜脈注射的50%100%。M118-REH的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)與依諾肝素相當(dāng)，其消除半衰期范圍是35小時(shí)，且主要消除機(jī)制是通過(guò)腎排泄。86表13:M118-REH、依諾肝素和UFH在經(jīng)靜脈注射到兔和大鼠模型后的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。M118國(guó)REH依諾肝素UFHTl/2(小時(shí))兔靜脈注射1.5mg/kg抗Xa活性0.87±0.251.93±0.450.54±0.03抗IIa活性0.85±0.051.78±0.630.89±0.05Tl/2(小時(shí))大鼠靜脈注射抗Xa1mg/kg0.39±0.060.41±0.070.35±0.060.5mg/kg0.29±0.12N/A0.19±0.04在非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物(NHP，例如獼猴)中，M118-REH的消除半衰期范圍是20分鐘至50分鐘。靜脈注射后的抗Xa/IIa比值在0.52的藥物代謝動(dòng)力(PK)過(guò)程中保持一致，并且根據(jù)對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的分析，M118-REH分布于循環(huán)系統(tǒng)中并通過(guò)腎途徑消除。表14顯示了M118-REH在NHP模型中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。表14:M118-REH在NHP模型中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)測(cè)試材料組劑量(IU/kg)Rsqt1/2(小時(shí))Cmax(IU/mL)AUCINFobs(hr*IU/Ml)Vz—obs(mL/kg)CI—obs(mL/hr/kg)Anti-Xa1平均150.0980.504.074.0727.2637.24SD0.90.020.040.150.545.574.65Anti-IIa2平均1501.00.682.7333.4543.1743.92SD0.00.010.050.380.453.665.38M118-REH的藥物代謝動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為一級(jí)消除。施用M118-REH后，可在24小時(shí)期間維持高水平的體內(nèi)TFPI濃度。ACT和aPTT均與抗Xa活性良好相關(guān)。M118-REH的體內(nèi)藥效動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)在如Spmgue-Dawley大鼠的嚙齒動(dòng)物模型中，通過(guò)頸靜脈靜脈注射1mg/kg或2mg/kg的M118-REH和UFH，而依諾肝素的劑量為0.5mg/kg或1mg/kg。使用HemochronJr測(cè)定ACT(活化凝血時(shí)間)。在此模型中，活化部分凝血活酶時(shí)間(aPTT)和活化凝血時(shí)間表現(xiàn)出對(duì)M118-REH劑量增加的劑量響應(yīng)。以0.5mg/kg靜脈注射M118-REH給藥后ACT增加了1.53倍，而以1mg/kg給藥后ACT則增加了24倍。在抗Xa/IIa測(cè)定中，藥效動(dòng)力學(xué)圖譜與藥物代謝動(dòng)力學(xué)圖譜類似，消除半衰期范圍是0.150.5小時(shí)。在如新西蘭白兔的兔模型中，在靜脈遞送M118-REH后測(cè)定aPTT和ACT。aPTT和ACT的增加與M118-REH的劑量成比例。以1.5mg/kg經(jīng)靜脈和皮下施用后，抗Xa/IIa比值保持穩(wěn)定。與M118-REH相反，在觀察期間，靜脈施用后依諾肝素和UFH的抗Xa/IIa比值發(fā)生顯著波動(dòng)。如圖9所示，在如獼猴的NHP模型中，結(jié)果顯示以150IU抗Xa活性/kg靜脈注射M118-REH后，aPTT和ACT顯著增加了24倍和1.53倍。M118-REH的靜脈濃注使釋放到血流中的TFPI增加220倍，并且此效果維持超過(guò)24小時(shí)。此外，還在通過(guò)嚴(yán)重電解損傷誘導(dǎo)的犬深靜脈血栓模型中研究了M118-REH的靜脈濃注后連續(xù)輸注的效果。下文標(biāo)題為"電解誘導(dǎo)的比格犬股動(dòng)脈損傷模型"的實(shí)施例提供了關(guān)于此試驗(yàn)的更多細(xì)節(jié)。在臨床前期模型中的M118-REH功效試驗(yàn)翥眾錄遂導(dǎo)游^^^"銜侈M118-REH和依諾肝素的對(duì)比試驗(yàn)獲得對(duì)閉塞性血栓的劑量依賴性抑制。與鹽水相比，劑量為0.5mg/kg的M118-REH可顯著(p〈0.05)延長(zhǎng)形成閉塞的時(shí)間(TTO)(分別為28.5±7.1分鐘和11.1±0.9分鐘)。在完整的60分鐘觀察期內(nèi)，25%(2/8)的接受0.5mg/kgM118-REH注射的受損頸動(dòng)脈保持通暢。相反，在完整的60分鐘觀察期內(nèi)，全部(9/9)的接受鹽水注射的受損頸動(dòng)脈發(fā)生閉塞。施用1mg/kg的Ml18-REH可進(jìn)一步延長(zhǎng)TTO(55.3±3.6分鐘)，在60分鐘觀察期的末，83%(10/12)的血管保持通暢。與用鹽水注射的動(dòng)物相比，施用2mg/kg、3mg/kg或4mg/kg依諾肝素的所有大鼠均具有顯著延長(zhǎng)的TTO(分別為19.1±1.4分鐘，36.0±5.6分鐘和40.2±6.3分鐘)。在60分鐘觀察期之內(nèi)，施用2mg/kg劑量依諾肝素的大鼠全部(7/7)發(fā)生頸動(dòng)脈閉塞，而施用3mg/kg和4mg/kg依諾肝素的大鼠中分別有62%(7/13)和55%88(6/11)發(fā)生頸動(dòng)脈閉塞。盡管抗Xa活性低于3mg/kg和4mg/kg劑量的依諾肝素，但M118-REH(1mg/kg)產(chǎn)生最大程度的抗血栓保護(hù)作用。所述結(jié)果顯示于圖10和表15中。表15:功效數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(學(xué)生t檢驗(yàn))對(duì)照M118-REH0.5mg/kgM118-REHlmg/kg依諾肝素鈉2mg/kg依諾肝素鈉3mg/kg依諾肝素鈉4mg/kg平均11.329.2**55.3#**23.2**36.0"41.8**(分鐘)St.Dev.2.316.812.68.320.320.6*與對(duì)照組相比pO.05;"與對(duì)照組相比pO.01;#與3mg/kg依諾肝素鈉相比p0.01電解誘導(dǎo)的比格犬股動(dòng)脈損傷模型(Lncchesi模型)在嚴(yán)重電解損傷誘導(dǎo)的比格犬深動(dòng)脈血栓模型進(jìn)行Ml18-REH抗血栓形成和抗凝血作用的試驗(yàn)。財(cái)游在使用丙泊酚(48mg/kg)靜脈注射進(jìn)行麻醉前至少1015分鐘，通過(guò)肌肉注射硫酸阿托品(0.02mg/kg)和乙酰丙嗪(0.2mg/kg，每只<3mg)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理。插管并通過(guò)體積調(diào)節(jié)式呼吸機(jī)吸入異氟垸來(lái)維持動(dòng)物麻醉。在頸的內(nèi)側(cè)表面制造縱向切口以接近頸動(dòng)脈上的組織。通過(guò)鈍器解剖法先后剝離出約2cm的一條頸動(dòng)脈和兩條頸靜脈(其中一條用作備份)，并通過(guò)近端和遠(yuǎn)端結(jié)扎進(jìn)行支撐。制造另外兩條起始于腹部并沿恥骨肌延伸覆蓋每條腿骨長(zhǎng)度66%-75%的切口。在各切口處打開(kāi)筋膜，并將其下的股動(dòng)脈剝離出約23cm。動(dòng)激汰器麥備6aw'附a//ra^訓(xùn)e"她'o"J穿過(guò)左右股動(dòng)脈壁將血管內(nèi)電極放置于直接接觸內(nèi)膜的位置，從而對(duì)24只麻醉比格犬進(jìn)行儀器裝備。各電極均與恒流電源連接，陰極放置于遠(yuǎn)端皮下位點(diǎn)。立即將狹窄裝置(stenoticdevice)放置在電極遠(yuǎn)端，將血管外周多普89勒血流探針?lè)胖迷陔姌O近端，并將導(dǎo)管插入頸動(dòng)脈，所有以上裝置均連接到GouldPonemah生理平臺(tái)(LintonInstrumentation,Norfolk,UK)上以連續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓、血流和心率。將第二導(dǎo)管插入頸靜脈以收集血液樣品。最后，將靜脈導(dǎo)管插入外周靜脈中用于輸注治療研究，并放置肢體導(dǎo)聯(lián)以進(jìn)行心電圖(通過(guò)導(dǎo)聯(lián)II測(cè)定)。,動(dòng)胸潔微微儀器裝備完畢后，使各動(dòng)物接受90分鐘的連續(xù)靜脈溶媒(0.9%生理鹽水)輸注。輸注開(kāi)始后15分鐘，通過(guò)血管內(nèi)電極向右股動(dòng)脈(對(duì)照)施加電流(300^A)，并連續(xù)施加直至完整血栓形成(定義為多普勒血流減少至基線值的<2%),或者，如果血管保持暢通，則連續(xù)施加所述電流直至開(kāi)始電解損傷后180分鐘的觀察期結(jié)束。此后，在電解損傷位點(diǎn)近端和遠(yuǎn)端進(jìn)行結(jié)扎，獲取該片段，并對(duì)存在的任何血栓進(jìn)行稱重。在此模型中，富含血小板的血管內(nèi)血栓在近端造成末梢動(dòng)脈狹窄。因此，調(diào)節(jié)狹窄裝置以將缺氧誘導(dǎo)的反應(yīng)性充血限制到物理閉塞反應(yīng)基線的<80%(在進(jìn)行溶媒輸注或活性劑處理輸注前在各股動(dòng)脈處測(cè)定反應(yīng)性充血基線)。為了保證損傷位點(diǎn)的血液動(dòng)力學(xué)性質(zhì)接近于通過(guò)股動(dòng)脈的正常血流，通過(guò)異氟烷麻醉分別將平均動(dòng)脈壓和心率標(biāo)定在約70mmHg和每分鐘100次。在各動(dòng)物右股動(dòng)脈完成上述評(píng)估血栓形成基線參數(shù)試驗(yàn)后，在存在M118-REH或UFH輸注的左股動(dòng)脈(活性劑處理)進(jìn)行相同的處理過(guò)程。將動(dòng)物分成4個(gè)處理組(11=6)。3個(gè)處理組分別接受37.5IU抗Xa活性/kg、75IU抗Xa活性/kg和150IU抗Xa活性/kgMl18-REH的靜脈濃注，隨后以1.0RJ抗Xa活性/kg/分鐘連續(xù)輸注M118-REH90分鐘。第四組接受75U/kgUFH的靜脈濃注，隨后以1.0U/kg/分鐘連續(xù)輸注UFH90分鐘。在濃注處理15分鐘后開(kāi)始進(jìn)行連續(xù)電損傷，隨后進(jìn)行與溶液對(duì)照組相同的分析。在方案指定的時(shí)間點(diǎn)(見(jiàn)下)進(jìn)行皮膚出血時(shí)間(CBT)測(cè)試和血液收集。在試驗(yàn)全程受到監(jiān)控的生理參數(shù)包括脈搏率、呼吸率、直接血壓、直腸溫度、潮氣量、潮氣末二氧化碳水平和02飽和度。虛,對(duì)〃凝*#定在第15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165和180分鐘收集全血樣品(約100pL)，測(cè)定ACT以進(jìn)行血液學(xué)和凝血測(cè)定。根據(jù)廠商說(shuō)明，使用HEMOCHRONJr.Signature+微量凝血系統(tǒng)(ITC,Edison,NJ,USA)測(cè)定ACT。在第15分鐘、第60分鐘和第180分鐘或發(fā)生閉塞時(shí)(如果可以)收集兩份全血試樣(每份約1.3mL)用于血液學(xué)和進(jìn)一步的凝血試驗(yàn)。根據(jù)廠商說(shuō)明，使用Advia120血液學(xué)系統(tǒng)(BayerDiagnosticsNorden，Lyngby,Denmark)測(cè)定血液學(xué)參數(shù)(WBC、RBC、HGB、CHT、MCV、MCH、MCHC、PLT、RTC、ARTC和WBC分類)。根據(jù)廠商說(shuō)明，使用MLAElectra1400C凝血分析儀(BeckmanCoulter,Fullerton,CA,USA)進(jìn)行凝血試驗(yàn)(凝血酶原時(shí)間[PT]、活化部分凝血活酶時(shí)間[aPTT]和纖維蛋白原水平[FIB])。將處理開(kāi)始后0、15和60分鐘收集的檸檬酸化全血液樣品在冷凍離心機(jī)中以3000g離心約10分鐘以測(cè)定抗Xa因子和抗IIa因子水平。收集血漿，在-20'C下速凍，并在-80'C下冷藏直至用于顯色試驗(yàn)。使用Stachrome肝素抗Xa活性試劑盒(DiagnosticaStago,AsnieressurSeine,法國(guó))以及由底物S2238、牛凝血酶和人抗凝血酶III(Chromogenix,意大利米蘭)組成的試劑組進(jìn)行抗Xa因子和抗IIa因子試驗(yàn)。在STA-R分析儀(DiagnosticaStago)中對(duì)所有顯色試驗(yàn)進(jìn)行定量，隨后通過(guò)MomentaPharmaceuticals,Inc.標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)進(jìn)行抗Xa因子和抗IIa因子活性測(cè)試。在第15分鐘、第60分鐘和第180分鐘或發(fā)生閉塞時(shí)(如果可以)測(cè)定CBT。使用試驗(yàn)工具的SOP通過(guò)Midke法在前肢進(jìn)行CBT評(píng)估。鋭藩除非另有說(shuō)明，所列出的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。假定不同處理組的方差相等，使用學(xué)生t試驗(yàn)比較不同處理組的平均值。通過(guò)計(jì)算相對(duì)于對(duì)照的比數(shù)比并使用z檢驗(yàn)產(chǎn)生P值來(lái)比較處理組間閉塞的發(fā)生頻率。所有檢驗(yàn)的顯著性水平定為0.05。if拔x"厲f貧絲浙拔//像f茲絲將多種劑量的M118-REH與標(biāo)準(zhǔn)劑量的UFH(75U/kg)進(jìn)行比較。M118-REH顯示出對(duì)Xa因子和IIa因子的劑量依賴性抑制，最大劑量的M118-REH(150IU/kg)顯示出與UFH類似的抗Xa因子活性(圖13和表16)。對(duì)于M118-REH和UFH，抗II因子活性均隨抗Xa因子活性成比例增加，雖然M118-REH的相關(guān)系數(shù)(r、0.890)要大于UFH(r、0.465)(圖14)。最后，在時(shí)間上，M118-REH的血漿抗Xa因子活性與抗IIa因子活性的比值通常比UFH穩(wěn)定，這一點(diǎn)與已知的多分散性UFH大分子的可變代謝性相一致。表16:選定的血液測(cè)試終點(diǎn)的總結(jié)處理對(duì)照M118-REH(37.5IU/kg)卞M118畫REH(75IU/kg)1"M118-REH(150IU/kg)卞UFH(75U/kg)卞ACT(秒)*69±6101±7^應(yīng)±13J141±28§抗Xa因子活性抗IIa因子活性(IU±SD)*(IU±SD)*0.0±0.01.20±0.161.66±0.372.31±0.132.89±1.310.0±0.00.64±0.120.71±0.201.06±0.090.95±0.19163±55"ACT:活化凝血時(shí)間；IU:國(guó)際單位；SD:標(biāo)準(zhǔn)偏差；UFH:普通肝素*測(cè)試物輸注起始后60分鐘記錄；？濃注劑量；M118-REH與UFHPO.05;§M118-REH與對(duì)照相比PO.01;11UFH與對(duì)照相比PO.01。微然后比較M118-REH與標(biāo)準(zhǔn)劑量UFH的抗凝血活性。在所有凝血試驗(yàn)中，M118-REH的劑量依賴性凝血抑制可在所有凝血試驗(yàn)的15分鐘內(nèi)觀察到，并在60分鐘的觀察期內(nèi)得到保持(圖16)。60分鐘時(shí)，在ACT試驗(yàn)的UFH處理組中觀察到的凝血時(shí)間顯著大于37.5IU抗Xa活性/kg或75IU抗Xa活性/kgM118-REH組(表16)。ACT試驗(yàn)中，施用150IU抗Xa活性/kgM118-REH時(shí)，UFH與M118-REH間的差別不顯著(表16)。對(duì)照試驗(yàn)說(shuō)明，凝血試驗(yàn)中處理組間的差別不是由于纖維蛋白原底物的濃度變化造成的(數(shù)據(jù)未顯示)。拔戯形成柳由于發(fā)現(xiàn)150IU抗Xa活性/kgMl18-REH具有與75U/kg標(biāo)準(zhǔn)劑量的肝素類似的抗凝血性質(zhì)，因此在犬深動(dòng)脈血栓模型中，對(duì)150IU抗Xa活性/kg92以及較低劑量M118-REH的抗血栓形成效力與UFH進(jìn)行比較。在溶媒輸注期間，所有(24/24)動(dòng)物的對(duì)照動(dòng)脈均在180分鐘的觀察期內(nèi)發(fā)生完全閉塞(圖17)。在UFH處理組中，5/6(83.3%)的動(dòng)物發(fā)生模型所定義(modeldefined)的多普勒血流減少。比較起來(lái)，接受37.5IU抗Xa活性/kg、75IU抗Xa活性/kg和150IU抗Xa活性/kg的M118-REH濃注動(dòng)物中，分別有3/6(50%)、2/6(33.3%)和1/6(16.7%)的動(dòng)物發(fā)生完全閉塞，這符合劑量依賴關(guān)系。M118-REH組和溶媒處理組的動(dòng)脈閉塞率差別在所有M118-REH濃注中均具有統(tǒng)計(jì)顯著性(P〈0.05)。150IU抗Xa活性/kg濃注的M118-REH與UFH間的差異也具有顯著性(P<0.05)。因此，150IU抗Xa活性/kgM118-REH具有優(yōu)于75U/kgUFH的效力，盡管在此劑量上M118-REH和UFH的抗凝血活性相當(dāng)。測(cè)試中具有較低凝血活性的較低劑量(37.5IU抗Xa活性/kg、75IU抗Xa活性/kg)M118-REH顯示了與UFH基本相似的抗血栓形成作用。在用溶媒、UFH、M118-REH(37.5IU抗Xa活性/kg)、M118-REH(75IU抗Xa活性/kg)和M118-REH(150IU抗Xa活性/kg)處理的動(dòng)物中，發(fā)生閉塞所需時(shí)間分別為59士25分鐘、132士42分鐘、165士23分鐘、161±41分鐘和165士36分鐘。應(yīng)當(dāng)注意，與實(shí)際數(shù)值相比，試驗(yàn)低估了活性劑處理動(dòng)脈的平均閉塞時(shí)間，因?yàn)楹芏鄤?dòng)脈(特別是在M118-REH處理組中的動(dòng)脈)，在預(yù)定180分鐘的終點(diǎn)時(shí)也沒(méi)有發(fā)生完全閉塞(分析時(shí)任意地將這些動(dòng)脈的閉塞時(shí)間定為180分鐘)。在經(jīng)溶媒、UFH、M118-REH(37.5IU抗Xa活性/kg)、M118-REH(75IU抗Xa活性/kg)和M118-REH(150IU抗Xa活性/kg)處理的動(dòng)脈中，平均血栓重量分別為24.0±9.15mg、19.4±9.47mg、24.5±12.17mg、19.8±6.24mg和12.8±5.99mg。處理組之間平均閉塞時(shí)間和平均血栓重量的差別不具有統(tǒng)計(jì)顯著性。在方案指定的時(shí)間點(diǎn)，所有組在施用溶媒期間的CBT都在80±15.5秒至160±52.5秒之間變化(表17)。UFH和M118-REH處理使CBT稍有增加，并且此影響具有很高的變化性。在所有的時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)UFH處理后組平均值在135±90.5秒至275±306.8秒之間；施用M118-REH后組平均值在110±36.3秒至1卯±86.3秒之間。93表17:皮膚出血時(shí)間CBT(秒±SD)處理基線CBT(秒±SD)股動(dòng)脈15分鐘60分鐘180分鐘UFH(75U/kg)100±31.0對(duì)照處理125±29.5135±90.5138士45.5145±35.1畫±36.3275±306.8M118-REH(37.5IU/kg)95±35.1對(duì)照處理80±15.5145±64.1130±36.3125±48.1115土58.2110±36.3M118-REH(75謹(jǐn)g)140±24.5對(duì)照處理130±36.3160±45.2130±17.3190±86.3160±52.5160±31.0M118誦REH(150IU/kg)110±41.0對(duì)照處理115±51.7150±50,2110±36.3125±64.1115士48.1135±94.4UFH:普通肝素；SD:標(biāo)準(zhǔn)偏差；IU:國(guó)際單位；U:單位。i,動(dòng)力學(xué)參教在試驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有觀察到心血管參數(shù)或臨床化學(xué)發(fā)生具有臨床意義的變化。在試驗(yàn)的全部動(dòng)物群中，溶媒和活性劑處理動(dòng)脈在狹窄后充血反應(yīng)之間的差別S13mL/分鐘。除了兩條動(dòng)脈之外均實(shí)現(xiàn)了將缺氧誘導(dǎo)的充血反應(yīng)限制到對(duì)物理閉塞的反應(yīng)基線的^0%的目標(biāo)其中一條的反應(yīng)為81%(M118-REH[75IU抗Xa活性/kg];對(duì)照動(dòng)脈)，另一條的反應(yīng)為88%(M118-REH[75IU抗Xa活性/kg];活性劑處理動(dòng)脈)。所有處理組試驗(yàn)期間的平均動(dòng)脈壓和心率分別為68-78mmHg和96-111bpm，接近于方案預(yù)定的70mmHg和100bpm的目標(biāo)。對(duì)于任意給定動(dòng)物，溶媒處理動(dòng)脈和活性劑處理動(dòng)脈之間平均動(dòng)脈壓和心率的最大差別分別為6mmHg和每分鐘5次(差異P值沒(méi)有顯著性)。,忌錄150IU抗Xa活性/kgMl18-REH顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)劑量UFH(75U/kg)的抗血栓形成效力，盡管在ACT、aPTT和PT試驗(yàn)中，所述濃度的M118-REH和UFH顯示出的活性相當(dāng)。因此，M118-REH處理動(dòng)物中血栓誘94導(dǎo)的頸動(dòng)脈完全閉塞的發(fā)生頻率顯著低于UFH處理動(dòng)物(分別為1/6[16.7%]和5/6[83.3%];P<0.05)。在M118-REH處理中觀察到抗血栓形成作用，且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有并發(fā)癥的證據(jù)。沒(méi)有自發(fā)出血的事件，而且在M118-REH的所有濃度和試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)上僅觀察到CBT的微小增加。此外，沒(méi)有發(fā)生意外死亡或觀察到心血管參數(shù)或臨床化學(xué)發(fā)生具有臨床意義的變化。此試驗(yàn)中，有兩個(gè)值得注意的凝血數(shù)據(jù)特征。第一，通過(guò)即時(shí)ACT試驗(yàn)可檢測(cè)到M118-REH具有劑量依賴性。與UFH相比，其ACT反應(yīng)與抗Xa因子活性良好相關(guān)。這一特征可簡(jiǎn)化介入性治療和手術(shù)治療中的LMWH施用。第二，M118-REH不僅具有體外抗Xa因子活性，還具有顯著的抗IIa因子活性，這一特征使M118-REH進(jìn)一步區(qū)別于現(xiàn)有的LMWH(J.Hirshetal."Heparinandlow-molecular-weightheparin:mechanismsofaction,pharmacokinetics,dosing,monitoring,efficacy,andsafety,"Chest.2001;119:64S-94S)。例如，依諾肝素的特征為17.2的抗Xa因子活性/抗IIa因子活性比值；與之相比，UFH的類似比值為3.3(U.CornelliandJ.Fareed."Humanpharmacokineticsoflowmolecularweightheparins,"SeminThrombHemost.1999;25Suppl3:57-61)。在此試驗(yàn)中，M118-REH具有約2-2.5的抗Xa因子活性/抗IIa因子活性比值(圖15)，這證明相對(duì)于其它LMWH，M118-REH具有的抗IIa因子活性較高。正如對(duì)多分散性UFH大分子的已知可變代謝性的預(yù)測(cè)，所述比值隨時(shí)間的變化通常比UFH穩(wěn)定。95表18:血栓形成和選定的血液測(cè)試終點(diǎn)的總結(jié)表<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>TTO=發(fā)生閉塞所需時(shí)間；ACT=活化凝血時(shí)間；RFA=右股動(dòng)脈；UFH=普通肝素;Grp=組0aTTO>180分鐘則設(shè)為180分鐘。b在測(cè)試物輸注開(kāi)始后60分鐘記錄的值。e與對(duì)照相比P〈0.05。d與UFH相比P0.05。e與對(duì)照相比PO.Ol。體內(nèi)中和使用Sprague-Dawley大鼠和新西蘭兔進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。在t=0時(shí)，經(jīng)靜脈施用不同劑量的M118-REH、依諾肝素或兩種普通肝素(UFH)。t0后5分鐘以0.5mg和1mg硫酸魚(yú)精蛋白100IU抗Xa活性(或在UFH的情況下，為100USP單位或lmg)的比例通過(guò)尾靜脈注射硫酸魚(yú)精蛋白，從而評(píng)估對(duì)各處理藥理作用的中和。在基線(魚(yú)精蛋白注射前)和施用硫酸魚(yú)精蛋白5、30和60分鐘后收集血樣并檢測(cè)抗Xa活性和抗IIa活性。以0.5mg硫酸魚(yú)精蛋白100IU抗Xa活性(在大鼠中>98%)和1mg硫酸魚(yú)精蛋白100IU抗Xa活性(在大鼠中〉99。/。，在兔中為95%)的比例經(jīng)靜脈遞送硫酸魚(yú)精蛋白5分鐘后，可實(shí)現(xiàn)硫酸魚(yú)精蛋白對(duì)M118-REH抗Xa活性的完全而快速的體內(nèi)中和。在施用硫酸魚(yú)精蛋白1小時(shí)之內(nèi)沒(méi)有觀察到抗Xa活性的"反彈"。以0.5mg和1mg硫酸魚(yú)精蛋白100IU抗Xa活性(或100USP或1mgUFH)的比例時(shí)，M118-REH和UFH對(duì)抗Xa活性的中和程度相當(dāng)。以0.5mg和1mg硫酸魚(yú)精蛋白100IU抗Xa活性向施用依諾肝素的大鼠注射硫酸魚(yú)精蛋白5分鐘后，分別保留了40%以上和20M以上的抗Xa活性。以1mg:100IU抗Xa活性向施用依諾肝素的兔注射硫酸魚(yú)精蛋白IO分鐘后，約保留了38%的抗Xa活性。比例為0.5mg和1mg硫酸魚(yú)精蛋白100IU抗Xa活性時(shí)，每種肝素的抗Xa活性被中和超過(guò)9015/。。在三個(gè)處理(gPM118-REH、依諾肝素或UFH)中，硫酸魚(yú)精蛋白逆轉(zhuǎn)抗IIa活性的數(shù)量級(jí)相當(dāng)。所述結(jié)果顯示在圖11中。在獼猴中，硫酸魚(yú)精蛋白(PS)以劑量依賴方式將M118-REH的抗Xa和抗IIa活性逆轉(zhuǎn)了相似程度。經(jīng)靜脈向清醒獼猴施用M118-REH，在一些情況下，隨后施用PS。收集血液樣品，并通過(guò)抗Xa活性、抗IIa活性和凝血特征測(cè)定M118-REH的濃度。對(duì)血液學(xué)、皮膚出血時(shí)間和臨床毒性癥狀進(jìn)行24小時(shí)監(jiān)測(cè)。在以150IU抗Xa活性/kg的劑量經(jīng)靜脈施用M118-REH后即可檢測(cè)其活性。試驗(yàn)觀察到M118-REH的一級(jí)消除動(dòng)力學(xué)參數(shù)，t1/2為0.50±0.04小時(shí)(抗Xa活性)和0.68±0.05小時(shí)(抗IIa活性)。此外，PS以劑量依賴的方式迅速逆轉(zhuǎn)了M118-REH的抗Xa活性和抗IIa活性。PS在試驗(yàn)中的較高劑量(每100IU抗Xa活性1.5mgPS的比例)可快速中和大部分抗Xa(93.6±1.2%)和抗IIa(90.14±1.2%)活性。ACT和aPTT測(cè)定與抗Xa活性緊密相關(guān)(分別為r2=0.95和r2=0.99)。M118-REH使ACT延長(zhǎng)2-3倍，并在靜脈施用PS后5分鐘之內(nèi)被逆轉(zhuǎn)至基線值。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)臨床毒性或不良出血的癥狀。施用M118-REH可引發(fā)快速和持續(xù)的抗凝血反應(yīng)，而此抗凝血反應(yīng)可通過(guò)PS注射迅速逆轉(zhuǎn)?？赏ㄟ^(guò)ACT和aPPT簡(jiǎn)單地測(cè)定并監(jiān)測(cè)M118-REH的抗凝血作用。與其它商購(gòu)LMWH相比，M118-REH具有獨(dú)特的可逆性和可監(jiān)測(cè)性。以下表1921顯示了NHP模型中M118-REH中和試驗(yàn)的結(jié)果。表19:NHP模型中的M118-REH中和——給藥后大多數(shù)aPTT和ACT回復(fù)至正常水平UFHAAlmg:100IUM118-REHAlmg:100IU抗Xa活性M118-REHA1.5mg:脂IU抗Xa活性M118-REHAA2mg:訓(xùn)IU抗Xa活性基線99.5±9.285.3±4.293.0±5.197.0±4.2ACT施用M118-REH后168.5±14.9174.3±12.3193.0±9.7139.0±21.2施用魚(yú)精蛋白97.5±103.0±4.499.2±7.589.5±0.7后5分鐘14.9(NS)(NS)(NS)基線31.95±0.123.4±2.720.4士0.926.1±0.8aPTT施用M118-REH后46.9±31.9卞177.9士59.0*162.6±85.5*48.1±1.8施用魚(yú)精蛋白后5分鐘24.2±0.432.5±4.429.6±6.0(NS)25.9±1.6(NS)NS:與UFH相比無(wú)顯著差異*一些樣品中aPTT>212秒；卞UFH給藥后低于基線1/2A以150IU/kg經(jīng)靜脈施用M118-REH;^以75IU/kg經(jīng)靜脈施用M118-REH，以75IU/kg施用UFH98表20:NHP模型中的M118-REH中和——保留顯著的抗Xa/IIa活性抗Xa抗IIa施用M118-REH后施用魚(yú)精蛋白后5分鐘施用M118-REH后施用魚(yú)精蛋白后5分鐘UFHlmg:100IUM118-REHM118-REHlmg:1001.5mg:100IUIU抗Xa活性抗Xa活性M118畫REH2mg:畫IU抗Xa活性0.3±0.42.0±0.30.1±0.10.4±0.41.9±0.40.0±0.03.6±0.40.5±0.00.0±0.12.1±0.30.1±0.103±0.10.0±0.06.1±0.80.4±0.10.0±0.03.0±1.20.3±0.1n/a1.2±0.10.2±0.1n/a1.6土0.00.4±0.2表21:NHP模型中的M118-REH中和——施用魚(yú)精蛋白后不同參數(shù)的減少百分比UFHlmg:100IUM118-REHlmg:lOOIU抗Xa活性M118-REH1.5mg:幽IU抗Xa活性M118-REH2mg:100IU抗Xa活性ACT41.5±14.040.8±2.247.7±1.234.9±9.4aPPT32.4±46.980.6±5.474.8±16.246.0±16.9抗Xa活性97.3±3.885.2±2.093.6±1.284.0±9.1*抗IIa活性97.2±3.983.4±4.290.1±1.275.1±10.1*卞等式(施用M118-REH后-施用魚(yú)精蛋白后;riOO/施用M118-REH后*試驗(yàn)不穩(wěn)定臨床前模型的體內(nèi)床邊檢測(cè)試驗(yàn)以不同的劑量經(jīng)靜脈向大鼠或兔施用Ml18-REH、依諾肝素和普通肝素。收集血液樣品用于ACT測(cè)定和抗Xa測(cè)試。在ACT測(cè)定中使用HemachronJunior和ACTplus管，并使用Coag-A-MateMTXII測(cè)定抗Xa活性。比較這三種肝素抗Xa和ACT之間的相關(guān)性。在新西蘭白兔中，通過(guò)耳緣靜脈注射1mg/kgM118-REH和UFH。在遞送肝素后5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)收集血液樣品。在Sprague-Dawley大鼠中，M118-REH和UFH以0.5mg/kg和1mg/kg給藥，而依諾肝素以1mg/kg和2mg/kg給藥。這些劑量在大鼠和兔中均使抗Xa活性顯著增加并顯著延長(zhǎng)ACT。對(duì)于M118-REH，其抗Xa活性與ACT的相關(guān)因子(—)在兔和大鼠中分別為0.79和0.85。對(duì)于UFH，其抗Xa活性與ACT的相關(guān)因子(—)在兔和大鼠中分別為0.31和0.79，而對(duì)于依諾肝素，該相關(guān)因子在大鼠中僅為0.66。所述結(jié)果顯示于圖12中。在NHP模型中，靜脈注射后，M118-REH表現(xiàn)出一級(jí)消除，通過(guò)抗Xa和抗IIa測(cè)定，其半衰期分別為0.50±0.04小時(shí)或0.68±0.05小時(shí)。分布容積(distributionvolme，Vd)分別為32.01±2.21(抗Xa活性)或48.58±0.95mL/kg(抗IIa活性)。清除率(C1)為37.24±4.65mL/hr/kg(抗Xa活性)和43.92±5.38mL/hr/kg(抗IIa活性)。其ACT和aPTT結(jié)果與抗Xa活性密切相關(guān)(相關(guān)比分別是r=0.95和r-0.99)。體內(nèi)出血試驗(yàn)使用不同的化學(xué)或酶促方法解聚普通肝素從而產(chǎn)生低分子量肝素。在新抗血栓形成劑研發(fā)過(guò)程中常采用出血時(shí)間測(cè)定作為出血風(fēng)險(xiǎn)性的指示。此試驗(yàn)的目的是通過(guò)對(duì)M118-REH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)出血時(shí)間測(cè)試研究出血風(fēng)險(xiǎn)性，并將其風(fēng)險(xiǎn)性與使用依諾肝素和普通肝素進(jìn)行類似處理后的出血風(fēng)險(xiǎn)性進(jìn)行比較。以0.5mg/kg的單次濃注通過(guò)耳緣靜脈向兔施用M118-REH、依諾肝素和普通肝素。在基線以及施用測(cè)試物5、15、30、60、120和180分鐘后在耳部進(jìn)行出血時(shí)間(BT)測(cè)定。與施用后60分鐘相比，在第5分鐘時(shí)M118-REH使BT延長(zhǎng)了3-4倍(p0.05)。在使用依諾肝素和UFH處理時(shí)觀察到類似的BT反應(yīng)。在第120分鐘，出血時(shí)間回復(fù)到正常范圍之內(nèi)，并在剩余的時(shí)間點(diǎn)保持在基線值附近。在所測(cè)試的劑量下沒(méi)有在任何處理組中觀察到其它不良臨床發(fā)現(xiàn)。如表22所示，在NHP模型中，M118-REH在靜脈注射后導(dǎo)致Curtis出血時(shí)間(CBT)延長(zhǎng)，與基線之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)顯著性(p0.05)。22:以150IU抗Xa活性/kg向NHP模型靜脈注射M118-REH后的CBT時(shí)間點(diǎn)(小時(shí))00.2511.5出血時(shí)間(分13±0.62.5±0.72.5±1.02.5±1.3鐘)7VSTVS在比格犬中，UFH在濃注和連續(xù)輸注后產(chǎn)生的CBT比M118-REH長(zhǎng),體內(nèi)凝血系統(tǒng)射叛彼條在NHP模型中，在靜脈濃注施用M118-REH后沒(méi)有觀察到對(duì)ADP引發(fā)的血小板凝集的影響。辦婆翻鄉(xiāng)磁徑游f涉..在NHP模型中，如下表18所示，在靜脈濃注施用M118-REH后，纖維蛋白原水平保持恒定，并且與基線之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)顯著性。表23:以150IU抗Xa活性/kg向NHP模型靜脈注射M118-REH后的纖維蛋白原和凝血酶原時(shí)間(PT)_纖維蛋白原(mg/dL)凝血酶原時(shí)間(秒)基線174.3±35.011.4±0.55分鐘168.3±28.016.0±0.9**30分鐘166.0±30.513.8±0.9*60分鐘172.0±29.714.1±1.1*90分鐘170.0±27.912.8±2.2360分鐘163.7±29.511.4±0.9360分鐘164.3±27.010.8±0.31440分鐘176.0±2.010.7±0.3101多級(jí)遞增劑量試驗(yàn)在大鼠的重復(fù)IV給藥試驗(yàn)中的第O和第13天，顯示M118接觸量的增加與劑量的增加成比例。在雄性大鼠中，在第0-13天，以總抗Xa活性計(jì)算的M118接觸量增加，而以總抗IIa活性計(jì)算的M118接觸量則保持相似的水平。在雌性大鼠中，在第0-13天M118接觸量減少。在第O天，雌性大鼠顯示高于雄性大鼠的M118接觸量，但在第13天，M118接觸量在性別間類似。在對(duì)犬的重復(fù)IV給藥試驗(yàn)中，M118的全身接觸量隨劑量的增加(5-50mg/kg/天的劑量范圍)而增加。然而，M118接觸量沒(méi)有隨M118的增加而成比例增加。在14天的周期內(nèi)沒(méi)有積累的證據(jù)。犬血漿中抗Xa和抗IIa活性的半衰期范圍是1.0-3.2小時(shí)，沒(méi)有與劑量或性別相關(guān)的特別趨勢(shì)。在第13天的半衰期常短于第0天。M118劑量與抗Xa和抗IIa活性的表觀全身清除率或表觀分布容積之間沒(méi)有協(xié)同化趨勢(shì)。權(quán)利要求1.一種LMWH組合物，其具有約5000～9000Da重均分子量并且具有約70～280的抗IIa活性。2.如權(quán)利要求1所述的LMWH組合物，其具有約100250IU/mg的抗IIa活性。3.—種LMWH組合物，其具有約50009000Da重均分子量，并且經(jīng)ACT或aPTT測(cè)定，所具有的至少70%的抗IIa活性可被魚(yú)精蛋白中和。4.如權(quán)利要求3所述的LMWH組合物，其中在施用魚(yú)精蛋白后約30分鐘內(nèi)，至少70%的抗IIa活性被中和。5.—種LMWH組合物，其具有約50009000Da重均分子量，并且具有占該組合物515%的AUHNAe,6SGHNS，3S,6s。6.—種LMWH組合物，其平均鏈長(zhǎng)度為約916個(gè)二糖，并且具有占該組合物515%的MJHnac,6sGHns,3s,6s。7.如權(quán)利要求l、3和5中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其中所述重均分子量為約55008500Da。8.如權(quán)利要求1、3、5和6中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其進(jìn)一步具有約100400IU/mg的抗Xa活性。9.如權(quán)利要求8所述的LMWH組合物，其具有約150300IU/mg的抗Xa活性。10.如權(quán)利要求8所述的LMWH組合物，其中經(jīng)ACT或aPTT測(cè)定，至少70%的抗Xa活性可被中和。11.如權(quán)利要求10所述的LMWH組合物，其中在施用魚(yú)精蛋白后30分鐘內(nèi)，至少70%的抗Xa活性可被中和。12.如權(quán)利要求11所述的LMWH組合物，其中在以每100IU血漿抗Xa活性的所述LMWH組合物施用約12mg魚(yú)精蛋白后30分鐘內(nèi)，至少70%的抗Xa活性可被中和。13.—種LMWH組合物，其具有約5000卯00Da重均分子量，并且具有2:1或更低的抗Xa/抗IIa比值。14.如權(quán)利要求13所述的LMWH組合物，其中所述重均分子量為約55008500Da。15.如權(quán)利要求l、3、5、6和12中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其中所述組合物的活性可通過(guò)aPTT和ACT監(jiān)測(cè)。16.如權(quán)利要求l、3、5、6和12中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其中所述組合物在鏈的非還原末端包含AU和I/G結(jié)構(gòu)的混合。17.如權(quán)利要求l、3、5、6和12中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其中所述組合物中鏈總數(shù)的約15%至35%在非還原末端具有AU。18.如權(quán)利要求17所述的LMWH組合物，其中所述組合物中鏈總數(shù)的約80%或以上在非還原末端具有未硫酸酯化的AU。19.如權(quán)利要求l、3、5、6和12中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其中所述組合物中鏈總數(shù)中小于5%具有經(jīng)修飾的還原末端結(jié)構(gòu)。20.如權(quán)利要求l、3、5、6和12中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其中所述組合物中鏈總數(shù)的至少60%或以上在還原末端具有HNAc。21.如權(quán)利要求l、3、5、6和12中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其具有以下特征中的一個(gè)或多個(gè)小于3%的鈣含量；低于30%的鈉含量；少于1000ng/mg的肝素酶；少于1.0。/。W/W的甲醇；少于1.0Q/()W/W的乙醇；少于2.0°/。的氯化物；少于10重量％的水；少于2000ppm的游離硫酸酯。22.如權(quán)利要求l、3、5、6和12中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其中與依諾肝素相比，所述組合物提供的TFPI釋放至少增加2倍。23.如權(quán)利要求l、3、5、6和12中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其具有約30分鐘至3小時(shí)的靜脈內(nèi)半衰期。24.如權(quán)利要求l、3、5、6和12中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物，其具有約1.52.5小時(shí)的皮下半衰期。25.—種LMWH組合物，其具有下述結(jié)構(gòu)R是H或S03Na;R4是S03Na或COCH3;n二250;并且所述組合物優(yōu)選的n的平均值為916或815'26.LMWH組合物，其具有下述結(jié)構(gòu)」n麗R!其中:X是Na或Ca，R是H或S03Na;R'是S03Na或COCH3;n=245;并且26.所述組合物優(yōu)選的n的平均值為713或812。27.LMWH組合物，其具有下述結(jié)構(gòu)其中，X是Na或Ca;R是H或S03Na;R^是S03Na或COCH3;n=250;并且所述組合物優(yōu)選的n的平均值為916或815。28.—種LMWH組合物，其具有以下一個(gè)或多個(gè)特征所述組合物基本不具有經(jīng)修飾的還原末端結(jié)構(gòu)；所述組合物中至少60%的鏈在還原末端具有HNAe;所述組合物中小于90%的鏈在非還原末端具有硫酸酯化的AU;所述組合物中基本不存在連接區(qū)域；所述組合物中帶有3-0硫酸酯的鏈多于依諾肝素或達(dá)肝素；所述組合物中AUHNAe,6SGHNS,3S,6S與AU2SHNS,6SIHNAe，6SGHNS,3S,6S的比值是約4:1或以下。29.如權(quán)利要求28所述的LMWH組合物，其中所述組合物具有所有的所述特征。30.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求l、3、5、6、12或25中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物以及藥學(xué)上可接受的載體。31.治療患血栓性疾病或具有患血栓性疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，其包括向所述受試者使用如權(quán)利要求l、3、5、6、12或25中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物從而治療所述疾病。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述疾病是急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)。33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述疾病是心肌梗塞。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述疾病是ST段抬高心肌梗死或非ST段抬高心肌梗死。35.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述疾病與外科手術(shù)的介入相關(guān)。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述外科手術(shù)的介入選自于由血管成形術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)、支架置入組成的組。37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述受試者可在進(jìn)行外科手術(shù)、具有接受外科手術(shù)的可能，或正從外科手術(shù)中恢復(fù)。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述受試者具有接受冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)(CABG)的可能。39.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述疾病是穩(wěn)定型或不穩(wěn)定型心絞痛。40.如權(quán)利要求31所述的方法，其進(jìn)一步包括使用凝血試驗(yàn)監(jiān)測(cè)所述LMWH組合物的活性。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述凝血試驗(yàn)是活化凝血時(shí)間(ACT)或活化部分凝血活酶時(shí)間(aPTT)。42.如權(quán)利要求31所述的方法，其進(jìn)一步包含在施用所述LMWH組合物之后施用硫酸魚(yú)精蛋白以中和所述LMWH組合物的部分或全部抗Xa活性或抗IIa活性。43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中在CABG之前中和所述LMWH組合物。44.維持目標(biāo)ACT值的方法，其通過(guò)向需要維持目標(biāo)ACT值的受試者以多個(gè)濃注給予權(quán)利要求l、3、5、6或25中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物。45.治療患者血栓性疾病的方法，其包括向所述患者施用如權(quán)利要求l、3、5、6或25中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物；將所述患者分成不需要外科手術(shù)介入和在出院前為外科手術(shù)介入候選人的類別；和任選地，如果患者被分到外科手術(shù)介入候選人的類別，則監(jiān)測(cè)所述LMWH組合物和/或中和所述LMWH組合物。46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述患者被分到外科手術(shù)介入候選人的類別，并且所述方法進(jìn)一步包括在手術(shù)之前、期間或之后中的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間，監(jiān)測(cè)所述LMWH組合物的活性。47.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述患者被分到CABG候選人的類別，并且所述方法進(jìn)一歩包括在CABG之前監(jiān)測(cè)所述LMWH組合物的活性和/或中和部分或全部的抗Xa活性、抗IIa活性或以上兩種活性。48.監(jiān)測(cè)使用權(quán)利要求l、3、5、6或25中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物進(jìn)行治療的受試者的方法，所述方法包含評(píng)估施用過(guò)權(quán)利要求l、3、5、6或25中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物的受試者的活化凝血時(shí)間(ACT)或部分凝血活酶時(shí)間(aPTT)。49.治療方法，其用于治療施用過(guò)權(quán)利要求l、3、5、6或25中任一項(xiàng)所述的LMWH組合物的受試者，所述方法包括向所述受試者施用硫酸魚(yú)精蛋白以中和受試者體內(nèi)所述LMWH組合物的部分或全部抗Xa活性、抗IIa活性或以上兩種活性。50.制備LMWH組合物的方法，其包括(1)使用極性有機(jī)溶劑、極性非有機(jī)溶劑和鹽對(duì)普通肝素(UFH)樣品進(jìn)行第一次沉淀以獲得第一上清液；(2)使用極性有機(jī)溶劑和極性非有機(jī)溶劑對(duì)所述第一上清液進(jìn)行第二次沉淀以獲得沉淀物；(3)將所述沉淀物溶解，并使用在未硫酸酯化糖醛酸連接位點(diǎn)切割的酶來(lái)切割溶解的沉淀物；(4)使用鹽和極性有機(jī)溶劑沉淀所述經(jīng)切割的制劑以形成平均鏈長(zhǎng)為814個(gè)二糖的固體；(5)將來(lái)自所述固體的物質(zhì)進(jìn)行大小篩選以提供平均鏈長(zhǎng)為916個(gè)二糖的制劑，從而制備所述LMWH組合物。51.制備平均鏈長(zhǎng)為約916個(gè)二糖的LMWH組合物的方法，其包括提供平均鏈長(zhǎng)為約814個(gè)二糖的LMWH組合物前體；和加工所述LMWH組合物前體以獲得平均鏈長(zhǎng)為約916個(gè)二糖的LMWH組合物。52.制備LMWH組合物的方法，其包括(1)使用極性有機(jī)溶劑、極性非有機(jī)溶劑和鈉鹽對(duì)普通肝素(UFH)樣品進(jìn)行第一次沉淀以獲得第一上清液；和(2)使用極性有機(jī)溶劑和極性非有機(jī)溶劑對(duì)所述第一上清液進(jìn)行第二次沉淀以獲得沉淀物；從而制備LMWH組合物。53.評(píng)估或加工普通肝素(UFH)制劑的方法，其用以測(cè)定所述UFH制劑是否適合加工成LMWH組合物，所述方法包括測(cè)定所述UFH制劑中N-乙?；铜h(huán)氧化物中一種或多種的存在量；將測(cè)定的存在量與預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，并根據(jù)是否滿足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所述UFH制劑做出判定，從而評(píng)估或加工所述UFH制劑。54.評(píng)估或加工中間體LMWH制劑的方法，其用以測(cè)定所述中間體制劑是否適合加工成LMWH組合物，所述方法包括將中間體LMWH制劑中的硫酸酯化艾杜糖醛酸、與糖醛酸連接的N-硫酸酯化己糖胺、環(huán)氧化物和6-0硫酸酯化己糖胺之中的一種或多種的量與普通肝素起始原料中同一結(jié)構(gòu)的量進(jìn)行比較，和根據(jù)是否滿足起始原料和中間體LMWH制劑之間的預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中間體LMWH制劑做出判定，從而評(píng)估或加工所述中間體LMWH制劑。55.評(píng)估或加工LMWH制劑的方法，其包括提供LMWH組合物；和測(cè)定表10A中的結(jié)構(gòu)是否位于表10A提供的范圍之內(nèi)，從而評(píng)估LMWH制劑。56.評(píng)估或加工LMWH制劑的方法，所述方法包括提供LMWH組合物；和測(cè)定表11A中的結(jié)構(gòu)是否位于表11A提供的范圍之內(nèi)，從而評(píng)估LMWH制劑。57.評(píng)估LMWH制劑的方法，其包括通過(guò)2DNMR分析所述LMWH組合物；和測(cè)定表11A中列出的一個(gè)或多個(gè)峰是否位于表IIA所述的范圍之內(nèi)，從而評(píng)估所述LMWH制劑。全文摘要本發(fā)明提供了具有改進(jìn)性質(zhì)(例如提供臨床優(yōu)勢(shì)的性質(zhì))的低分子量肝素(LMWH)制劑。本發(fā)明還提供了制備和使用此類制劑的方法，以及在此類LMWH制劑的生產(chǎn)過(guò)程中，分析起始原料、加工、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的方法。文檔編號(hào)C08B37/10GK101495517SQ200780028096公開(kāi)日2009年7月29日申請(qǐng)日期2007年5月24日優(yōu)先權(quán)日2006年5月25日發(fā)明者伊尚·卡皮拉,伊恩·菲爾,劉翠華,加內(nèi)什·文卡塔拉曼,努爾·西貝爾·居那伊,姚一鳴,帕特麗夏·奧利弗,扎伊納布·西拉布?！ゑR穆瓦拉,扎卡里·施賴弗,穎李,科琳娜·鮑爾,達(dá)妮埃拉·貝卡蒂,馬利克·孫達(dá)拉姆,齊意偉申請(qǐng)人:莫曼塔醫(yī)藥品有限公司