專利名稱：：用于純化高分子量透明質(zhì)酸的有效方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于生產(chǎn)和純化透明質(zhì)酸和它的鹽的技術(shù)。本發(fā)明也涉及具有生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的透明質(zhì)酸和它的鹽的生產(chǎn)和工藝最優(yōu)化和純化。
背景技術(shù)：
：透明質(zhì)酸(HA)是一種在細(xì)菌和包括人類在內(nèi)的高等動物中具有生物功能的天然存在的生物聚合物。天然存在的HA可以在高等動物組織中發(fā)現(xiàn)，尤其作為胞間隙填充物(Balazs,Viscosupplementation:anewconceptinthetreatmentofosteoarthritis.J.Rheumatol.Suppl.;39:3-9,(Aug.1993))。它在眼睛玻璃體液和關(guān)節(jié)滑液中的濃度最高(O'Regan,M.,Martini,I.,Crescenzi，F(xiàn).,DeLuca,C,和Lansing,M.,Molecularmechanismsandgeneticsofhyaluronanbiosynthesis.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules16:283-286(1994))。在革蘭氏陽性的鏈球菌(&/^tococc/)中，發(fā)現(xiàn)它是圍繞在細(xì)菌周圍的粘液樣莢膜。透明質(zhì)酸也稱作乙酰透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽，是一種在結(jié)締組織、上皮組織和神經(jīng)組織中廣泛分布的糖胺聚糖。它是胞外基質(zhì)的主要組分之一。它主要有助于細(xì)胞增殖和遷移，且也可以參與有些惡性腫瘤的進(jìn)展。乙酰透明質(zhì)酸天然地存在于許多身體組織中，例如皮膚、軟骨和玻璃體液。因此它非常適用于靶向這些組織的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。在二十世紀(jì)七十年代和八十年代開發(fā)了第一種乙酰透明質(zhì)酸生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品Healon,并批準(zhǔn)用于眼外科手術(shù)(即，角膜移植術(shù)、內(nèi)障外科、青光眼外科手術(shù)和修復(fù)視網(wǎng)膜剝離的外科手術(shù))。其它生物醫(yī)學(xué)公司也生產(chǎn)用于眼外科手術(shù)的乙酰透明質(zhì)酸品牌。5乙酰透明質(zhì)酸也用于治療膝蓋的骨關(guān)節(jié)炎。這樣的治療作為向膝關(guān)節(jié)中的注射過程來施用，且可以用于補充關(guān)節(jié)液的粘性，從而潤滑關(guān)節(jié)、緩沖關(guān)節(jié)和產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。乙酰透明質(zhì)酸也可以對軟骨細(xì)胞具有積極的生4b效應(yīng)。由于它的高生物相容性和它常存在于組織的胞外基質(zhì)中，乙酰透明質(zhì)酸在組織工程研究中作為生物材料支架日益得到普及。在有些癌癥中，乙酰透明質(zhì)酸水平與惡性肺瘤和預(yù)后差非常相關(guān)。乙酰透明質(zhì)酸可以用作前列腺癌和乳腺癌的腫瘤標(biāo)記。它也可以用于監(jiān)控這些疾病的進(jìn)展。乙酰透明質(zhì)酸也可以在手術(shù)后用于誘導(dǎo)組織愈合，特別在內(nèi)障外科后。現(xiàn)有的傷口愈合模型提出，更大的透明質(zhì)酸聚合物出現(xiàn)在愈合早期，以在物理上為介導(dǎo)免疫應(yīng)答的白細(xì)胞騰出空間。乙酰透明質(zhì)酸是皮膚護(hù)理產(chǎn)品中的常見成分。術(shù)語"透明質(zhì)酸鹽"是指透明質(zhì)酸(HA)的共軛堿。因為該分子通常以它的聚陰離子形式存在于體內(nèi)，所以它最常見地稱作"乙酰透明質(zhì)酸"。HA包含由通過卩1-3和卩l(xiāng)-4糖苷鍵交替連接的葡糖醛酸(GcUA)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)組成的線性的、不分支的、聚陰離子二糖單元，如圖1所示。HA是糖胺聚糖家族的成員，該家族包括硫酸軟骨素、硫酸皮膚素(dermatinsulphate)和碌u酸乙酰肝素。不同于該家族的其它成員，它不共價結(jié)合蛋白。在中性水溶液中，由于氬鍵形成，水分子和鄰近的羧基和N-乙酰基賦予聚合物構(gòu)象勁度，這限制了它的柔性。氫鍵形成導(dǎo)致聚合物的獨特的水結(jié)合和保留能力。因而也斷定，水結(jié)合能力與該分子的分子量直接相關(guān)。已知每克HA可以結(jié)合最高達(dá)6升水(Sutherland,Novelandestablishedapplicationsofmicrobialpolysaccharides.TrendsBiotechnol16:41-46，1998)。已經(jīng)廣泛研究了透明質(zhì)酸(HA)和它的書f生物在生物醫(yī)學(xué)實踐中的應(yīng)用。該聚合物的生物相容性特征已經(jīng)引起矯形外科的注意，因為它可以用于粘稠物質(zhì)手術(shù)，并允許外科醫(yī)生在組織之間安全地產(chǎn)生間隙。從HA構(gòu)建粘稠物質(zhì)手術(shù)植入物(Balazs,Aug1993,同前)。HA的粘彈性特征已經(jīng)用于補充關(guān)節(jié)中的潤滑。其也已經(jīng)用于作為微嚢的靶向藥物遞送。最后，因為它的高水保留能力，該EPS(胞外多糖)也在盈利的化妝6品市場上占有一席之地。在2003年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)乙酰透明質(zhì)酸注射劑用于填充^:組織缺陷，例如面部皺紋。Restylane是該產(chǎn)品的常見商品名稱。乙酰透明質(zhì)酸注射劑通過增加皮膚下容積來暫時平滑皺紋，效果通常持續(xù)6個月。另外，HA溶液的特征在于粘彈性和假塑性。甚至在該聚合物的非常稀的溶液(其中形成非常粘稠的凝膠)中，也發(fā)現(xiàn)了這些特征。通過HA的濃度和分子量，控制對于它作為生物材料的用途重要的HA溶液的粘彈性性質(zhì)。來自不同來源的HA的分子量相差很大，其范圍從104至107Da。隨著它的產(chǎn)生經(jīng)細(xì)胞膜擠出HA，這允許不受拘束的聚合物延伸，這可以導(dǎo)致產(chǎn)生非常高分子量的HA。分子量是最影響基于透明質(zhì)酸的醫(yī)學(xué)設(shè)備的物理性質(zhì)的參數(shù)。分子量影響透明質(zhì)酸溶液的粘度對濃度概況，且在它的其它粘彈性性質(zhì)中起重要作用。具體地，如果分子量增加，其治療功效需要給定粘度的溶液要求更低的透明質(zhì)酸濃度。已經(jīng)表明，這為眼和矯形外科應(yīng)用提供優(yōu)點。能產(chǎn)生具有大于750,000道爾頓的分子量的醫(yī)學(xué)級透明質(zhì)酸的方法因而具有顯著的商業(yè)潛力。在許多醫(yī)藥應(yīng)用中，不希望在制劑中具有低分子量透明質(zhì)酸，例如考慮到在美國專利號4,141,973中報道的低分子量HA的炎性作用。透明質(zhì)酸用于有些銷售得非常好的商業(yè)化產(chǎn)品，包括Synvisc(Genzyme)、Orthovisc(Anika)、Seprafilm(Genzyme)、Restylane(Q國Med)、Healon(Pharmacia)、Amvisc(Med-Chem)等。但是，由于它的高成本，它僅以非常低的濃度用于這些產(chǎn)品中。HA具有比其它微生物EPS更高的商業(yè)價值。估計它的世界市場價值是5億美元，每千克售價約10萬美元。已經(jīng)常規(guī)地從公雞冠和牛玻璃體液提取HA。但是，難以以工業(yè)上可行的速率從這些來源分離高分子量HA,因為它與在動物組織中存在的蛋白聚糖形成復(fù)合物(O'Regan等人，1994)。當(dāng)它在動物組織中合成時，控制生物聚合物的分子量目前是不實際的。此外，動物衍生的生化試劑用于人治療的用途已經(jīng)產(chǎn)生了倫理問題，且遇到與日俱增的阻力。除了倫理問題以外，存在與動物衍生的生化試劑用于人治療的用途有關(guān)的潛在傳染病危險。在可以從動物組織得到10MDa鏈的條件下，有相當(dāng)大的提高范圍。上面討論的缺點已經(jīng)迫使工業(yè)上采用細(xì)菌發(fā)酵方法，希望得到商業(yè)7上可行的生物聚合物。使用細(xì)菌發(fā)酵方法，HA被釋放進(jìn)生長培養(yǎng)基，它輔助控制聚合物特征，并導(dǎo)致提高的HA得率。通過上述途徑可以生產(chǎn)的生物聚合物的量在理論上是無限的。但是，細(xì)菌發(fā)酵的應(yīng)用確實具有缺點。最近的趨勢是使用Lancefidd氏A和C組鏈球菌，它天然地生產(chǎn)HA的粘液樣莢膜。HA莢膜是能使該革蘭氏陽性細(xì)菌避免宿主免疫防御的生物相容性因子，且是它的特征性高毒力水平的原因。使用細(xì)菌的提取和純化方法中的以前的后續(xù)提高已經(jīng)導(dǎo)致HA的固有的分子量降低。鏈球菌發(fā)酵已經(jīng)僅能生產(chǎn)范圍為l-4MDa的平均分子量的HA。如上面所討論的，高分子量是HA生物聚合物的希望的性質(zhì)。本發(fā)明提供了得到具有高分子量的HA的方法。鏈球菌是營養(yǎng)上難養(yǎng)的兼性厭氧菌，它生產(chǎn)乳酸作為葡萄糖分解代謝的副產(chǎn)物。因此通過這些細(xì)菌回收的能量比需氧細(xì)菌更低。使用以前已知的方法從細(xì)菌發(fā)酵得到的HA得率特征性地低(O.lg/g葡萄糖，0.15g/lh)。這樣的低得率滿足市場需求必然是費勁的。另外，發(fā)酵的嚴(yán)格營養(yǎng)需求通過禁止化學(xué)成分確知培養(yǎng)基用于生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵來影響經(jīng)濟，并限制可以采用的復(fù)雜培養(yǎng)基的選擇。幾個研究組已經(jīng)提供了建議的工藝參數(shù)最優(yōu)化，HA的工藝^t式的選擇，通過復(fù)雜培養(yǎng)基設(shè)計來最優(yōu)化得率，和基于HA的發(fā)酵控制的模型。Cooney,M丄，Goh,L.T.,Lee,P.L.，和Johns,R.R.,Structuremodel-basedanalysisandcontrolofthehyaluronicacidfermentationby5"/r，ococcz^zoo—d譜/cws:Physiologicalimplicationsofglucoseandcomplex-nitrogen-limitedgrowth,BiotechnologyProgress,15:898-910(1999);LarsM.Blank,RichardL.McLaughlin,LarsK.Nielsen,StableproductionofhyaluronicacidinS^一ococcwszooe/油脂'cwschemostatsoperatedathighdilutionrate,BiotechnologyandBioengineering,90(6):685-693(2005);Johns,M.R.,Goh,L,T.,和Oeggerli,A.，EffectofpH，agitationandaerationonhyaluronicacidproductionby5^，ococcz^zooe/油m/c肌BiotechnologyLetters16:507-512(1994);Kitchen,J.R.,禾口Cysyk,R.L.，SynthesisandreleaseofhyaluronicacidbySwiss3T3fibroblasts,BiochemicalJournal,309:649-656(1995》ArmstrongD,JohnsMR,Cultureconditionsaffectthemolecularweightpropertiesofhyaluronicacidproducedby/S/r，ococcwszoo印油mz'cws,Appl.Environ.Microbiol.,63:2759-2764(1997)。隨著時間的逝去，HA分子量已經(jīng)變成研究人員的主要研究領(lǐng)域。研究人員例如Armstrong和Johns已經(jīng)檢查了工藝參數(shù)的作用，以確定對HA的分子量的作用。Armstrong,D.C,和Johns,M.R.,EffectofCultureConditionsonMolecularWeightofHyaluronicAcidProducedby5Vr，ococcuyzooep/t/謹(jǐn)/ciM1,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,63:2759-2764(1997);Armstrong,D.C,和Johns,M.R.,Improvedmolecularweightanalysisofstreptococcalhyaluronicacidbysizeexclusionchromatography,BiotechnologyTechniques,9:491-496(1995》這些研究組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些發(fā)酵參數(shù)影響生產(chǎn)的HA的分子量。Armstrong等人(1997)報道，諸如溫度、通氣和葡萄糖濃度的條件影響HA的分子量，而pH和攪拌不會。發(fā)現(xiàn)低生長溫度(28。C)、培養(yǎng)通氣和高起始葡萄糖濃度(40g/l)導(dǎo)致獸瘟鏈球菌(S.zooe/,Aw,c^)生產(chǎn)更高分子量的HA。以前的研究組也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)pH和攪拌不影響HA發(fā)酵的分子量結(jié)果。具體地，Johns等人(1994)以前報道，pH和攪拌普遍地影響HA的生產(chǎn)，但是不影響分子量。已知的事實是，細(xì)菌的比生長速率和HA的分子量成反比。該效應(yīng)可以通過如圖2所示的HA合成的基于資源的代謝模型來解釋。以它的最簡單的形式，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生2個竟?fàn)庍^程，即細(xì)胞生長和HA的生物合成。這2個過程竟?fàn)幱邢薜馁Y源，例如碳、氮和能量。在低比生長速率，細(xì)胞指導(dǎo)更多的葡萄糖-衍生的活化的前體(即UDP-Glc和UDP-GlcNAc)進(jìn)行HA合成而不是細(xì)胞壁合成。來自需氧葡萄糖分解代謝的更高的ATP得率有利于UTP形成，后者是HA合成的兩種活化的前體(即UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc)的形成所必需的。通過厭氧生長下乳酸鹽的生產(chǎn)，也耗盡了可以用于合成HA的葡萄糖。以前也觀察到HA生產(chǎn)的比速率(gg"h")隨著比生長速率的降低而增加。在活化的HA合成酶的密度不太可能改變的事實的條件下，更高的生產(chǎn)速率可以歸因于通過每種合酶的更高的聚合速率。增加的合酶活性可以源自由低生長速率導(dǎo)致的更高的細(xì)胞內(nèi)底物濃度。通過合酶在它的壽命中可以聚合的前體的數(shù)目，確定生產(chǎn)的HA的分子量?；谠摾碚?，合酶的超表達(dá)導(dǎo)致合成的HA的分子量的降低。實際上，它可以降低平均分子量，因為存在更多的酶竟?fàn)幭嗤馁Y源。聚羥基丁酸鹽合酶的超表達(dá)報道了類似的效應(yīng)(Sim等人，PHAsynthaseactivitycontrolsthemolecularweightandpolydispersityofpolyhydroxybutyrateinvivo,"NatureBiotech.15:63-67，1997)。美國專利號4,897,349證實，通過控制生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物的代謝可利用的氧，可以得到提高的HA總得率。可利用的氧限于刺激希望的透明質(zhì)酸的不成比例的更大生產(chǎn)。沒有研究關(guān)于碳源的培養(yǎng)條件。但是，該過程需要修改溶解氧，其通常不導(dǎo)致生產(chǎn)的HA的一致得率。歐洲專利EP0694616采用2.5%濃度的從保藏中心得到的獸瘟鏈球菌培養(yǎng)物。發(fā)酵在37。C進(jìn)行約24小時，通過連續(xù)自動加入NaOH,將pH維持在7.00。在接種時加入33%的葡萄糖，且連續(xù)施用剩余的葡萄糖。通過HPLC分析測得的該方法的得率低至0.8g/1,估計的平均分子量是約500,000Da。曰本專利JP62215397證實，在攪拌下在培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)能生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物，由于向培養(yǎng)基中加入糖幾次，培養(yǎng)基中糖的濃度總是保持在0.1-3w/v%。收集在培養(yǎng)基中積累的透明質(zhì)酸。優(yōu)選的糖是葡萄糖或乳糖。通過分離多糖的常規(guī)方法，分離在培養(yǎng)混合物中積累的透明質(zhì)酸。在該專利中呈現(xiàn)的過程是補料分批過程，且不適用于連續(xù)分批過程。日本專利JP62257901公開了一種生產(chǎn)HA的方法，其可以通過在含有碳水化合物的培養(yǎng)基(例如，pH7.5，含有0.50%酵母提取物、0.75%蛋白胨、0.02%亞硫酸鈉和1-3%葡萄糖)中培養(yǎng)透明質(zhì)酸生產(chǎn)細(xì)菌來得到。日本專利JP62289198提出一種方法，其中將生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌林例如馬鏈球菌(Streptococcusequi)NK-850214接種進(jìn)含有濃度為0.01-1wto/o的精氨酸和/或谷氨酸以及蛋白胨、NaCl、痕量維生素等的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過程包含以將整個培養(yǎng)過程中碳水化合物濃度恒定保持在0.1-3w/v。/。的方式，在23份劑量中每1升培養(yǎng)基加入^20g碳水化合物，例如葡萄糖。在曰本專利JP05276972中，在含有表面活性劑的培養(yǎng)溶液中培養(yǎng)能生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物。在培養(yǎng)溶液中形成和積累透明質(zhì)酸，并收集。日本專利JP06038783提供了一種在工業(yè)規(guī)才莫生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，10其通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于鏈球菌屬(&^^OCOCCM)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株實現(xiàn)。培養(yǎng)基在特定條件下含有特定量的糖組分(作為主要碳源)，同時通過通氣攪拌培養(yǎng)基。將屬于鏈球菌屬且能生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌抹(例如，獸瘟鏈球菌)接種到含有^3%糖組分作為主要碳源的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，且在通氣攪拌下在pH7和33。C培養(yǎng)4天。通過該方法得到的產(chǎn)量是2.1g/L。曰本專利JP06319579提出了在含有葡萄糖和果糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中生產(chǎn)透明質(zhì)酸，以在培養(yǎng)混合物中積累高分子量的透明質(zhì)酸。美國專利號4,784,990證實了得到透明質(zhì)酸鈉的方法，其包含在適當(dāng)條件下在劇烈攪拌下在含有糖組分作為碳源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)鏈球菌屬的微生物。微生物生產(chǎn)大量高分子量透明質(zhì)酸，且該專利涉及選擇微生物的方法，所述微生物生產(chǎn)增加量的透明質(zhì)酸，且缺少溶血活性。獸痕鏈球菌HA-116ATCC39920是一種突變抹。然后如下回收透明質(zhì)酸鈉取出微生物和培養(yǎng)基中不溶的其它材料，從培養(yǎng)基沉淀透明質(zhì)酸鈉，例如使用有機溶劑，和回收沉淀。然后粉碎和干燥沉淀。通過這些方法，可以生產(chǎn)特征在于不存在致熱性和炎性活性的透明質(zhì)酸鈉組合物。培養(yǎng)基具有基本上恒定的約6.0至7.5的pH,且使用包含沉淀、再溶解和再沉淀透明質(zhì)酸鹽的方法，純化生物分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的透明質(zhì)酸鈉。通過向培養(yǎng)基中加入第一種有機溶劑，例如異丙醇，可以-使透明質(zhì)酸鈉從培養(yǎng)基或濾液中沉淀。將沉淀再溶解于3%含水乙酸鈉，然后用第二種有才幾溶劑例如乙醇再沉淀。將第二次沉淀再溶解于3%含水乙酸鈉，且加入活性炭，以形成懸浮液。過濾懸浮液，且加入第三種有才幾溶劑例如丙酮，以生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉沉淀。第一種、第二種和第三種有機溶劑各自可以是異丙醇、乙醇或丙酮。或者，可以在每個步驟中用相同的有機溶劑沉淀透明質(zhì)酸鹽。例如，在所有3個沉淀步驟中，使用異丙醇從培養(yǎng)基沉淀透明質(zhì)酸鈉。該專利中用于醫(yī)學(xué)級HA的方法包含使用去污劑例如十六烷基氯化吡啶镥，多溶劑沉淀步驟，硅酸鎂載體(florisi)處理等。美國專利號4,946,780提供了通過采用表面活性劑例如十六烷基氯化吡啶鏡，從發(fā)酵生產(chǎn)HA的方法。該方法也包含下述純化程序，所述純化程序包含使含有透明質(zhì)酸鈉的溶液接觸氧化鋁、活性炭或其混合物，然后接觸二氧化硅，以形成純化的透明質(zhì)酸鈉溶液。該方法然后將醇加入純化的透明質(zhì)酸鈉溶液，以沉淀純化的透明質(zhì)酸鈉，并干燥純化ii的透明質(zhì)酸鈉。表面活性劑難以從產(chǎn)物去除，且使得需要用無致熱原水多次洗滌的步驟。美國專利號5,563,051公開了一種方法，其中在發(fā)酵過程后，用特別合適的試劑殺死生物質(zhì)。用于殺死生物質(zhì)的試劑是甲醛，例如，以通常已知為福爾馬林的水溶液形式。用含有陰離子表面活性劑即十二烷基硫酸鈉的含水介質(zhì)提取HA。該專利另外公開了具有通常是10,000至25,000道爾頓、且優(yōu)選20,000道爾頓的適當(dāng)分子量截止的超濾膜的應(yīng)用。用8-20體積的純化水、優(yōu)選約IO體積的純化水滲濾包含溶解的HA的過濾的溶液，其中連續(xù)拋棄濾液。美國專利號6,489,467要求保護(hù)從生物源純化高分子量透明質(zhì)酸的方法，其包括將含有來自生物源的高分子量透明質(zhì)酸的水溶液的pH調(diào)節(jié)至1.7至3.3的pH范圍的步驟。該方法另外包含使用具有100,000道爾頓的標(biāo)稱分子截止至0.45口的孔徑的濾器，滲濾在相同pH的水溶液，并從含有來自生物源的高分子量透明質(zhì)酸的水溶液去除細(xì)胞。美國專利號7，002,007公開了一些方法，它們包含使含有透明質(zhì)酸鹽的來源接觸酸，以產(chǎn)生酸性的透明質(zhì)酸鹽懸浮液，在有酸性緩沖液存在下，使該懸浮液接觸陰離子交換介質(zhì)，且此后使所述介質(zhì)接觸具有更高鹽含量的酸性緩沖液，以從培養(yǎng)基解吸透明質(zhì)酸鹽。以前的生產(chǎn)HA的方法通常使用葡萄糖作為碳源。使用這些方法，得到的HA的分子量經(jīng)常是2至4xl()SDa,即相對低的分子量。此外，HA的固有粘度隨著它的分子量的增加而增加。該增加的粘度已經(jīng)在發(fā)酵過程以及HA純化中產(chǎn)生主要障礙。盡管高分子量HA可能太大而不能穿透皮膚和血流，但它具有許多有價值的用途。例如，在局部用制劑中，高分子量HA可以用于眼外科手術(shù)和化妝品。同樣，高分子量HA可以用于粘彈性薄膜，以保留皮膚水分和阻斷外來物質(zhì)。因此，提供一種生產(chǎn)高分子量HA的方法已經(jīng)成為一項挑戰(zhàn)和需要，所述高分子量HA包括滿足關(guān)于醫(yī)學(xué)應(yīng)用所述的規(guī)定的那些，例如，在英國藥典(BritishPharmaacoepia)2003版中所述的^見定。以前的純化HA的方法包含至少3個連續(xù)的溶劑沉淀步驟，由此導(dǎo)致增加數(shù)目的過程步驟和冷凍干燥機的過載。以前的沉淀發(fā)酵液(fermentationbroth)的方法也包含4吏用表面活性劑或去污劑，例如十六烷基氯化吡啶鏡/十六烷基三曱基溴化銨。剩余的去污劑或表面活性劑12的去除增加所需的處理步驟的數(shù)目，它已經(jīng)造成復(fù)雜性和成本。另外，以前已知的純化程序，例如用于實現(xiàn)高分子量HA的滲濾步驟，包含使用大體積的有機溶劑。這樣的溶劑的使用，造成按比例放大操作中的處理問題，并導(dǎo)致環(huán)境危險。本發(fā)明涉及生產(chǎn)和純化HA的方法的改進(jìn)，所述HA例如高分子量HA和它的鹽，包括具有英國藥典2003版所述的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的那些。本發(fā)明提出了用于HA的高得率生產(chǎn)的簡單且經(jīng)濟上可行的方法，其通過在合適的培養(yǎng)基中連續(xù)發(fā)酵細(xì)菌，例如獸瘟鏈球菌，以生產(chǎn)高得率的高分子量HA實現(xiàn)。本發(fā)明的方法優(yōu)于傳統(tǒng)的分批培養(yǎng)，在后者中，降解酶可以開始分解鏈球菌屬的細(xì)胞壁，并將細(xì)胞內(nèi)容物釋放進(jìn)發(fā)酵液(fomenterbroth)中，從而導(dǎo)致HA的純化困難。此外，本發(fā)明也提出了透明質(zhì)酸的純化方法，它包括與活性炭處理相組合的硅膠過濾和隨后的使用更少量溶劑的滲濾，由此產(chǎn)生具有生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的更好質(zhì)量的透明質(zhì)酸。同樣，本發(fā)明提供了具有工業(yè)應(yīng)用的透明質(zhì)酸和它的鹽的一種商業(yè)上可行的純化方法。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是，提供生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，所述透明質(zhì)酸滿足藥典中關(guān)于醫(yī)學(xué)應(yīng)用的規(guī)定。同樣，本發(fā)明的目的是，提供一種商業(yè)上可行的生產(chǎn)透明質(zhì)酸和它的鹽的方法。本發(fā)明的目的是，提供由獸瘟鏈球菌生產(chǎn)的醫(yī)學(xué)級高分子量透明質(zhì)酸。本發(fā)明的目的是，提供一種高分子量透明質(zhì)酸，在HA的生產(chǎn)過程中不使用表面活性劑或去污劑。本發(fā)明的目的是，最優(yōu)化各種條件對本發(fā)明下的HA的分子量的作用，例如碳源、金屬離子和培養(yǎng)基組成。本發(fā)明的目的是，提供透明質(zhì)酸的純化方法，產(chǎn)生具有生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的更好質(zhì)量的透明質(zhì)酸。本發(fā)明的目的是，提供通過采用硅膠純化和碳處理兩個步驟，從透明質(zhì)酸去除蛋白雜質(zhì)的有效方法。本發(fā)明的目的是，提供在透明質(zhì)酸的純化中使用更少量的溶劑的有-丈的滲濾方法。本發(fā)明的目的是，提供一種醫(yī)學(xué)級高分子量透明質(zhì)酸。本發(fā)明的目的是，提供一種不使用表面活性劑或去污劑的方法。本發(fā)明的目的是，提供用于純化透明質(zhì)酸的單個循環(huán)過程。本發(fā)明的目的是，提供一種方法，其包含最小量的溶劑。本發(fā)明的目的是，采用硅膠和活性炭處理，去除至少90%的蛋白雜質(zhì)。本發(fā)明的目的是，提供一種導(dǎo)致高分子量HA的用于恒定體積滲濾的方法。本發(fā)明的目的也是，提供按照英國藥典2003版的規(guī)定的HA。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了節(jié)省成本的生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸和它的鹽的方法。本發(fā)明會產(chǎn)生不含有表面活性劑或去污劑的具有生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的更好質(zhì)量的透明質(zhì)酸。本發(fā)明包含下述生產(chǎn)醫(yī)學(xué)級透明質(zhì)酸的步驟。a)通過發(fā)酵制備HA，b)去除蛋白雜質(zhì)，c)滲濾。在一個實施方案中，本發(fā)明使用發(fā)酵技術(shù)，來使用細(xì)菌生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸。在一個實施方案中，所述細(xì)菌是獸痘鏈球菌。在另一個實施方案中，本發(fā)明使用碳源、金屬離子和培養(yǎng)基組成，其最優(yōu)化高分子量HA的生產(chǎn)。在一個實施方案中，如下制備HA:在合適的培養(yǎng)基中起始培養(yǎng)微生物獸瘟鏈球菌，隨后在約300-500rpm攪拌和1-3vvm(體積/體積/分鐘(vol/vol/min》通氣下，通過將pH維持在中性范圍，在1-10升發(fā)酵罐中在約30-40。C將發(fā)酵液發(fā)酵約15-28小時。(通氣速率vvm二每分鐘每單位液體體積的氣流體積(體積/體積/分鐘))。溫育后，適當(dāng)?shù)赜盟♂尠l(fā)酵液，并澄清。用等體積的合適的溶劑(包括但不限于異丙醇)再沉淀在澄清的發(fā)酵液中存在的HA。然后將沉淀的高分子量HA轉(zhuǎn)化成它的鹽，其中它可以然后溶解，用于后續(xù)純化程序。在一個實施方案中，通過加入3%乙酸鈉和均化至完全溶解，將HA轉(zhuǎn)化成它的鈉鹽。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了最優(yōu)化HA的產(chǎn)量和分子量的培養(yǎng)條件。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HA的生產(chǎn)是生長相關(guān)的現(xiàn)象。通過控制培養(yǎng)條件，人們可以生產(chǎn)高分子量HA。例如，生產(chǎn)的HA的分子量隨著細(xì)菌生長而增加。在發(fā)酵過程開始時，更低的分子量群體(5000Da)是總HA的約60%。在發(fā)酵22小時結(jié)束時，約70%的總HA具有高分子量(>800KDa)(圖4)。另外，在HA的發(fā)酵過程中人們可以使用不同的金屬。已知金屬離子增強各種細(xì)菌的莢膜生產(chǎn)。測試了在發(fā)酵24小時結(jié)束時0.025%(終濃度)的CuS04、MnS04和ZnS04對HA的得率的作用。盡管在對照(沒有加入金屬)和用CuS04或MnS04處理的瓶之間沒有顯著差異，但發(fā)現(xiàn)在用ZnS04處理過的培養(yǎng)基中的總HA的相當(dāng)大部分(60%)是在更高的分子量區(qū)域(〉800KDa)(圖5)。同樣，可以改變培養(yǎng)基中的碳源即糖。測試了在含有各種類型的糖的培養(yǎng)基中的生長和HA生產(chǎn)。培養(yǎng)基中的不同糖影響生產(chǎn)過程中HA的分子量。盡管在大多數(shù)糖(2%終濃度)中的生長相當(dāng)恒定，但乳糖和蔗糖給出比葡萄糖更好的高分子量HA(〉800K)得率，所述葡萄糖產(chǎn)生更低分子量的HA(圖6)。與葡萄糖相比，使用蔗糖得到的HA的得率高至少lO-倍，且發(fā)現(xiàn)HA的分子量高得多。如圖6所示，通過本發(fā)明使用蔗糖得到的HA的分子量大于8x1(^Da(即，800kDa)，而在葡萄糖培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)分子量是2至4xl()5Da(即，200-400kDa)。檢查了培養(yǎng)基對高分子HA的生產(chǎn)的作用。在一個實驗中，改變培養(yǎng)基中的糖和酪蛋白水解物酶含量。在該實驗中，糖提供必需的能量，且酪蛋白酶水解物提供必需的氮源。圖7顯示了當(dāng)培養(yǎng)基中的糖濃度從2%增加至5%且當(dāng)酪蛋白水解物酶濃度從2.5%降低至1%時的結(jié)果。這些參數(shù)使HA產(chǎn)量增加了5-6g/L(圖7)。圖7中的"糖"是指蔗糖；"生物質(zhì)"是指細(xì)胞密度，它反映微生物的生長。當(dāng)糖濃度更低(2°/。)且酪蛋白酶水解物濃度更高(2.5%)時，或當(dāng)僅糖濃度升高至5%時(數(shù)據(jù)未顯示)時，產(chǎn)量更低。在一個實施方案中，如下制備HA:在合適的培養(yǎng)基中起始培養(yǎng)微生物獸瘋鏈球菌，隨后在約300-500rpm攪拌和1-3vvm通氣下，通過將pH維持在中性范圍，在1-10升發(fā)酵罐中在約30-4(TC將發(fā)酵液發(fā)酵約15-28小時。15在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種從透明質(zhì)酸去除蛋白雜質(zhì)的有效方法。本發(fā)明采用硅膠過濾和活性炭處理，用于有效地去除蛋白雜質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過滲濾純化透明質(zhì)酸的有效方法。本發(fā)明在該方法中采用更少量的溶劑。溫育后，適當(dāng)?shù)赜盟♂尠l(fā)酵液，并澄清。用等體積的合適的溶劑，包括但不限于異丙醇，再沉淀在澄清的發(fā)酵液中存在的HA。然后將沉淀的高分子量HA轉(zhuǎn)化成它的鹽，其中它可以然后溶解，用于后續(xù)純化程序。本發(fā)明通過加入3%乙酸鈉和均化至完全溶解，將HA轉(zhuǎn)化成它的鈉鹽。本發(fā)明也提供了一種從透明質(zhì)酸去除蛋白雜質(zhì)的有效純化方法。該方法采用硅膠過濾和活性炭處理，用于有效地去除蛋白雜質(zhì)。使用硅膠的初步處理會去除約68-70%的蛋白。離心去除硅膠后，用活性炭處理高分子量HA,這去除85-90%的蛋白。在一個實施方案中，該方法包含使二氧化硅處理過的樣品穿過浸漬在纖維素筒上的碳。在一個實施方案中，通過滲濾進(jìn)一步純化去除蛋白雜質(zhì)后得到的溶液。本發(fā)明在該方法中采用更少量的溶劑。例如，在一個實施方案中，所述滲濾步驟包含，用溶劑(即無致熱原水)稀釋HA溶液，且該稀釋僅進(jìn)行5次，不同于美國專利號6,489,467(Carlino等人(2002),Processforpurifyinghighmolecularweighthyaluronicacid)中所述的10次，從而顯著減小處理體積?？梢?吏用連續(xù)方式的滲濾，它包含用無菌的、無致熱原的水稀釋，例如5次。在一個實施方案中，該過程還包含，通過經(jīng)0.22iim孔過濾器的過濾，分離無菌的、純化的透明質(zhì)酸。在另一個實施方案中，通過無菌過濾，可以得到用于生物醫(yī)學(xué)目的的透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)物。任選地，可以用異丙醇再沉淀透明質(zhì)酸鈉，以產(chǎn)生純化的高分子量HA。可以凍干得到的HA,直到水分含量小于5%。總之，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的HA純化方法，其不采用酸性pH條件，且不使用任何去污劑和表面活性劑。蛋白雜質(zhì)的去除步驟不使用任何有害的化學(xué)試劑，例如福爾馬林。另外，所述純化方法釆用更少的溶劑稀釋，且因此減少了冷凍干燥機的負(fù)載。附圖簡述下述附圖構(gòu)成本說明書的部分，且包括進(jìn)來用于進(jìn)一步證實本發(fā)明公開內(nèi)容的某些方面。因而，參考這些附圖中的一幅或多幅以及本文所述實施方案的詳述，可以更好地理解本發(fā)明。圖1:顯示了包含GlcUA和GlcNAc的HA的二糖重復(fù)單元。圖2:顯示了鏈球菌中的HA生物合成途徑。圖3:說明了制備醫(yī)學(xué)級高分子量透明質(zhì)酸的方法的流程圖。圖4.在獸瘟鏈球菌生長過程中各種分子量的HA的分布。圖5.金屬離子對各種分子量的HA群體的作用。圖6.來自含有不同碳源的培養(yǎng)基的HA的HPLC概況。培養(yǎng)基補加了終濃度為2%的葡萄糖、蔗糖、乳糖或果糖。圖7.提高的HA產(chǎn)量的培養(yǎng)基最優(yōu)化。起始蔗糖含量是5%,且酪蛋白水解物的濃度是1.0%。"％"對應(yīng)著g/100ml培養(yǎng)基；"糖"是指蔗糖；且"生物質(zhì)"是反映微生物的生長的細(xì)胞密度。酪蛋白水解物酶用作細(xì)菌生長過程中的氮源。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了從細(xì)菌發(fā)酵液得到醫(yī)學(xué)級高分子量HA的高得率的方法。本發(fā)明也提供了一種節(jié)省成本的純化HA的方法。定義本文使用的術(shù)語"透明質(zhì)酸"或"HA"是指從任意生物來源得到的透明質(zhì)酸。本文使用的術(shù)語"透明質(zhì)酸鹽"是指HA的任意鹽形式，例如HA的鈉鹽。本文使用的術(shù)語"高分子量"是指具有至少1000KDa(lOO萬Da)分子量的HA或HA的鹽。術(shù)語"硅膠，，是指多孔的、顆粒狀的二氧化硅，其從具有不同孔隙率的硅酸鈉合成地生產(chǎn)，且保留可利用的最高容量吸附劑。一個實例是Ineos銷售的硅膠。術(shù)語"活性炭"是指具有特別高的表面積的材料。僅l丄活性炭就具有約5001112的表面積，通常通過氮氣吸附來測定,且包括大量微孔。一個實例由Millipore(Millistak+,ActivatedCarbonminicapsule17M40AC23HH3)銷售。術(shù)語"滲濾"是指一種交叉流過濾方法，其允許低分子量種類、水和/或溶劑穿過膜轉(zhuǎn)移，而不改變?nèi)芤后w積。該方法用于純化保留的大分子量種類、增加低分子量種類的回收、緩沖液更換和簡單改變給定溶液的'l"生質(zhì)。它可以通過例i口Sartoconslicecassettemod.No.3051465001E-SG,50kDaMWCO來實現(xiàn)。術(shù)語"中性pH"是指pH是7.0。在一個實施方案中，微生物源是能生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸的鏈球菌屬物種。例如，所述微生物源可以選自獸痕鏈球菌、馬鏈球菌和釀膿鏈球菌(5Vr，ococcws/^oge"es)。本文使用的術(shù)語"溶劑"是指任意有機或無機溶劑。在一個實施方案中，所述溶劑是異丙醇。如前面所指出的，HA的生產(chǎn)是生長有關(guān)的現(xiàn)象，且與生長負(fù)相關(guān)。在本發(fā)明的一個實施方案中，選擇平衡這2個過程的培養(yǎng)和發(fā)酵參數(shù)。HA的分子量隨著培養(yǎng)時間過去而增加，在生長期中早期檢測到更小的鏈，然后在生長的后面部分過程中檢測到高分子量HA。以前的研究，例如Armstrong和Johns的研究，已經(jīng)表明當(dāng)在細(xì)菌中生產(chǎn)HA時，溫度、pH和攪拌速率急劇影響HA的分子量。當(dāng)將結(jié)果與Armstrong等人(Armstrong和Johns,1997)進(jìn)行的研究和其它常規(guī)方法的結(jié)果相對比時，其它研究人員發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)pH和攪拌速率在生產(chǎn)過程中不急劇影響HA的分子量。在本發(fā)明中，使用更低的溫度和通氣，以及其它參數(shù)，可以提高HA生產(chǎn)的得率，并增加生產(chǎn)的HA的分子量。以前的研究發(fā)現(xiàn)，起始葡萄糖濃度對HA的分子量有深遠(yuǎn)影響。一個研究組Armstrong和Johns提供了一種解釋，即當(dāng)激活的糖單體UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc在高濃度存在時，HA鏈持續(xù)延伸。外部葡萄糖濃度可能已經(jīng)與這些單體的內(nèi)部濃度相關(guān)聯(lián)，因為它們源自葡萄糖，且它們的合成需要相當(dāng)大量能量消耗(Armstrong和Johns,1997)。但是，在本發(fā)明中，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就高分子量HA的生產(chǎn)而言，蔗糖和乳糖是比葡萄糖更好的碳源。因為蔗糖和乳糖是二糖，所以它們可以用作比葡萄糖更好的能量來源。本發(fā)明在一個實施方案中進(jìn)一步提供，在更高濃度的蔗糖或乳糖和在更低濃度的蛋白(例如酪蛋白水解物)18上生長，生成5-6g/L的高分子量HA。發(fā)現(xiàn)HA的分子量在3.5-4.0x106Da范圍內(nèi)。還已經(jīng)研究了各種金屬離子對生產(chǎn)的HA的分子量的作用。在培養(yǎng)基中存在的金屬離子是細(xì)菌的氧化應(yīng)激的原因，由此在該過程期間釋放出自由基，后者可以具有殺細(xì)菌作用。為了躲避，幾種細(xì)菌、特別有些假單胞菌屬(尸wwdo加o"w)物種生產(chǎn)EPSs(胞外多糖)，例如藻酸鹽等，其輔助細(xì)菌侵入宿主并從而存活。KeithLMW,BenderCL.AIgT(《22)ControlsAlginateProductionandTolerancetoEnvironmentalStressin尸ses;v7力gae,5a"en'o/,181:7176-7184(1999)。至少一個組已經(jīng)暗示，鏈球菌和哺乳動物透明質(zhì)酸鹽合酶比其它金屬離子更偏好鎂離子用于生產(chǎn)高分子量HA(Yamada和Kawasaki,Microbialsynthesisofhyaluronanandchitin:newapproaches.J.Biosci.Bioeng.99:521-528,2005)。YamadaT和Kawasaki,2005提供了用4美離子刺激的另一種新的生產(chǎn)HA的小球藻病毒系統(tǒng)，其生產(chǎn)約0.5-1g/L的HA。在本發(fā)明中，金屬離子例如Cu和Mn不誘導(dǎo)高分子量HA的生產(chǎn)，盡管含有Zn的培養(yǎng)基中的相當(dāng)大群體的HA是在高分子量范圍內(nèi)?？傊?，本發(fā)明已經(jīng)最優(yōu)化了培養(yǎng)條件，其已經(jīng)導(dǎo)致提高的高分子量HA產(chǎn)量，例如5-6gHA/L。在一個實施方案中，降^氐培養(yǎng)基中的酪蛋白水解物酶，且增加培養(yǎng)基中的糖濃度。這些條件導(dǎo)致更低的生長速率。因為HA的生產(chǎn)與生長成負(fù)比，所以獲得HA產(chǎn)量的增加。在一個實施方案中，發(fā)酵24小時后，通過本發(fā)明得到的HA的分子量是約3.5x106至3.9x106Da。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了生產(chǎn)具有至少100萬Da分子量的高分子量透明質(zhì)酸(HA)或它的鹽的方法，該方法包含(a)提供能生產(chǎn)HA的細(xì)菌；(b)提供包含二價金屬離子鹽(例如MgS04、CuS04、MnS04和ZnS04)、酪蛋白水解物和碳源(例如乳糖或蔗糖)的營養(yǎng)培養(yǎng)基；(c)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌；和(d)在需氧條件下發(fā)酵、例如連續(xù)發(fā)酵營養(yǎng)培養(yǎng)基。能生產(chǎn)HA的細(xì)菌包括選自獸瘟鏈球菌、馬鏈球菌和釀膿鏈球菌的那些。在另一個實施方案中，營養(yǎng)培養(yǎng)基包含1%酪蛋白水解物和/或5%乳糖或蔗糖。在另一個實施方案中，營養(yǎng)培養(yǎng)基包含鋅，例如以ZnS04形式，濃度為10g/L的酪蛋白水解物，和濃度為50g/L的選自乳糖和蔗糖的碳源。在另一個實施方案中，在30-40。C的溫度、300-500rpm的攪拌速率、l-3vvm的通氣和中性pH,進(jìn)行所述發(fā)酵步驟至少15個小時。在另一個實施方案中，該方法生產(chǎn)分子量在約3.5x106Da至4.0x106Da范圍內(nèi)的HA或它的鹽。在一個實施方案中，該方法產(chǎn)生至少5g高分子量HA/升營養(yǎng)培養(yǎng)基。在一個實施方案中，發(fā)酵24小時后，HA的分子量是至少3xl06Da。本發(fā)明也提供了從生產(chǎn)的HA去除蛋白雜質(zhì)的方法，其包含硅膠處理、然后活性炭處理兩步。后續(xù)的滲濾步驟也幫助確保高度純化的HA的鹽。然后可以無菌過濾這樣得到的產(chǎn)物，用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。以前已知的純化方法使用去污劑或表面活性劑(例如十六烷基氯化吡啶鏡/十六烷基三曱基溴化銨)沉淀HA。但是，這需要多個步驟來去除殘余的去污劑或表面活性劑。本發(fā)明提供了一種有效的HA純化方法，它不采用去污劑或表面活性劑。以前已知的使用滲濾技術(shù)純化HA的方法已經(jīng)包含用溶劑大量稀釋，例如稀釋10次。參見美國專利號6,489,467(Carlino，等人，Processforpurifyinghighmolecularweighthyaluronicacid(2002》。大體積、溶劑的應(yīng)用在更大規(guī)模的操作中產(chǎn)生問題，例如更大的處理容器和更長的時間來完成過程，和當(dāng)然更高的生產(chǎn)成本。本發(fā)明通過使用更少的稀釋，避免了這種問題。在一個實施方案中，從細(xì)菌發(fā)酵液純化透明質(zhì)酸(HA)或它的鹽的方法包含(a)稀釋和澄清發(fā)酵液；(b)用等體積的溶劑，例如異丙醇、乙醇或丙酮，沉淀在發(fā)酵液中存在的HA;(c)將沉淀的HA或它的鹽溶于溶液，例如3%乙酸鈉；(d)將石圭膠加入來自步驟(c)的HA溶液或HA鹽溶液，然后去除硅膠，例如通過離心；(e)用活性炭處理來自步驟(d)的HA溶液或HA鹽溶液；和(f)使用溶劑，例如約5體積的無菌無致熱原水，滲濾來自步驟(e)的HA溶液或HA鹽溶液；其中在沒有任何去污劑或表面活性劑或福爾馬林存在下和在中性pH進(jìn)行該過程。在另一個實施方案中，該方法另外包含將在步驟(b)中沉淀的HA轉(zhuǎn)化成它的鹽，然后在步驟(c)的溶液中均化HA鹽。在另一個實施方案中，在步驟(e)中將活性炭浸漬在纖維素筒上。在另一個實施方案中，該方法另外包含，通過無菌過濾器過濾，分離無菌的、純化的HA或它的鹽；和/或凍干HA或它的鹽，直到水分含量小于5%。20包括下面的實施例用于證實本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人實踐中較好發(fā)揮作用的技術(shù)，且因而可以視作構(gòu)成它的實踐的優(yōu)選模式。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容應(yīng)明白，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，在公開的特定實施方案中可以作出許多改變，且仍然得到相似或類似的結(jié)果。實施例1:細(xì)菌菌林和培養(yǎng)基。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心得到馬鏈球菌獸痘亞種ATCC39920。在腦心浸液瓊脂或胰胨豆胨培養(yǎng)液上維持細(xì)菌。實施例2:HA的估計用等體積的異丙醇沉淀并再溶解于3%乙酸鈉溶液后，通過呼唑測定(Bitter，T.,和Muir,M,Amodifieduronicacidcarbazolereaction.AnalBiochem4:330-334，1962)常規(guī)地估計發(fā)酵液中的HA。實施例3:培養(yǎng)基最優(yōu)化對于培養(yǎng)基最優(yōu)化實驗，在由2.5%酪蛋白水解物酶、1%酵母提取物、0.2%K2HP04、0.15%NaCl、0.04%MgS04.7H20和2%碳源(蔗糖)組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獸瘟鏈球菌。在37。C、在200rpm在錐形瓶中培養(yǎng)生物24小時。為了評價金屬離子對HA生產(chǎn)的作用，在0.025%的終濃度，將過濾除菌的CuS04、ZnS04和MnS04溶液加入培養(yǎng)基。參見圖5。實施例4:分子量測定使用串聯(lián)連接的ShodexOH-PakSB805-804HQ柱，通過大小排阻層析在HPLC上測定HA的分子量。使用的流動相是1MNaN03,流速為1ml/分鐘，且使用RI檢測器檢測峰。用不同分子量的支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)校正柱。實施例5:蛋白雜質(zhì)的去除硅膠處理用2%終濃度的用于吸附蛋白的硅膠，以分批模式處理部分均化的懸浮液100ml。該步驟去除68-70%的蛋白。通過在12,000rpm、在4°C離心20分鐘，從透明質(zhì)酸鈉溶液分離硅膠。活性炭處理用炭吸附的0.45p過濾器集合(Millipore,Millistak+,ActivatedCarbonminicapsuleM40AC23HH3),進(jìn)一步處理高分子量透明質(zhì)酸溶液。流速是14ml/分鐘。該步驟去除85-卯％的剩余蛋白。實施例6:純化連續(xù)模式滲濾使用連續(xù)模式滲濾方法，進(jìn)一步純化穿過碳過濾器的流通物(flowthrough)。將稀釋的HA溶液泵入(流速15ml-20ml/分鐘)配有50kDa截止聚醚砜盒(Sartoconslicecassettemod.No.3051465001E-SG)的交叉流過濾器架。在開始將水性發(fā)酵液供給過濾器時，關(guān)閉滲透閥，以再循環(huán)水性發(fā)酵液幾次，直到系統(tǒng)穩(wěn)定且在滲余物(retentate)中看不到氣泡。IO分鐘后打開滲透閥，且在進(jìn)料儲器中再循環(huán)水性發(fā)酵液另外IO分鐘，以確保沒有透過滲透閥的跨膜HA泄漏。15分鐘后，分別收集滲透物和滲余物。在含有HA溶液的儲器中，連續(xù)加入5個等價體積的無菌的、無致熱原的蒸餾水。以與濾液的流出速率相同的流速，向HA溶液加入水。交叉流過濾器架的入口壓力維持在約0.5-1.5巴(bar)。滲余物用于進(jìn)一步回收透明質(zhì)酸，且拋棄滲透物?；旧?，滲透物不含有HA。將滲余物濃縮至原始體積，并分析純度。滲濾步驟去除80-85%的剩余蛋白。無菌過濾最后對來自滲濾過程的濃縮的透明質(zhì)酸溶液進(jìn)行0.22無菌過濾(Milliporestericup:SCGPU02RE,PVDF過濾器材料)，這產(chǎn)生合才各用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的產(chǎn)物。凍干這樣形成的產(chǎn)物，以得到醫(yī)學(xué)級高分子量透明質(zhì)酸鈉。實施例7:最優(yōu)化的制備和純化HA的參數(shù)在由1%酵母提取物、1%酪蛋白水解物酶、0.2%K2HP04、0.15%22NaCl、0.04y。MgSCV7H20和5%蔗糖組成的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)獸瘟鏈球菌ATCC39920。在1wm通氣、400rpm、37°C，在1L培養(yǎng)基中培養(yǎng)生物24小時。通過連續(xù)加入NaOH水溶液，將培養(yǎng)基的pH維持在7.0。溫育后，用l體積的水稀釋發(fā)酵液，并通過在10,000rpm、4"C離心20分鐘進(jìn)行澄清。用等體積的異丙醇沉淀在澄清的發(fā)酵液中的HA。使用機械勻漿器(Kinematica-A.G.,polytronPT2100)在15000rpm,將通過在10,000rpm、4°C離心20分鐘分離的沉淀懸浮于1L3%乙酸鈉中10分鐘，重復(fù)3個循環(huán)。用2°/。終濃度的用于吸附蛋白的硅膠，處理均化的溶液。該步驟去除85%的蛋白。通過在12,000rpm、在4。C離心20分鐘，從透明質(zhì)酸鈉溶液分離硅膠。用碳吸附的0.45u過濾器集合(Millipore,Millistak+,ActivatedCarbonminicapsuleM40AC23HH3),進(jìn)一步處理高分子量透明質(zhì)酸溶液。流速是14ml/分鐘。該步驟去除60%的剩余蛋白。使用連續(xù)模式滲濾方法，進(jìn)一步純化來自碳過濾器的流通物。將稀釋的HA溶液泵入(流速15ml-20ml/分鐘)配有50kDa截止聚醚砜盒(Sartoconslicecassettemod.No.3051465001E-SG)的交叉流過濾器架。在開始將水性發(fā)酵液供給過濾器時，關(guān)閉滲透閥，以再循環(huán)水性發(fā)酵液幾次，直到系統(tǒng)穩(wěn)定且在滲余物中看不到氣泡。IO分鐘后打開滲透閥，且在進(jìn)料儲器中再循環(huán)水性發(fā)酵液另外10分鐘，以確保沒有透過滲透岡的跨膜HA泄漏。15分鐘后，分別收集滲透物和滲余物。在含有HA溶液的儲器中，連續(xù)加入5個等價體積的無菌的、無致熱原的蒸餾水。以與濾液的流出速率相同的流速，向HA溶液加入水。交叉流過濾器架的入口壓力維持在約0.5-1.5巴。滲余物用于進(jìn)一步回收透明質(zhì)酸，且拋棄滲透物?；旧希瑵B透物不含有HA。將滲余物濃縮至原始體積，并分析純度。滲濾步驟去除70%的剩余蛋白。最后對來自滲濾過程的濃縮的透明質(zhì)酸溶液進(jìn)行0.22|im無菌過濾(Milliporestericup:SCGPU02RE,PVDF過濾器材料)，這產(chǎn)生合格用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的產(chǎn)物。凍干這樣形成的產(chǎn)物，以得到醫(yī)學(xué)級高分子量透明質(zhì)酸鈉，剩余蛋白相對于HA的含量是0.031%,回收率是51%。實施例8將實施例1的方法按比例放大至10L?？梢栽佻F(xiàn)HA的回收率和純化概況。終產(chǎn)物導(dǎo)致相對于HA具有0.066%蛋白的產(chǎn)品，且HA的回收率是82%。實施例9:相對分析下表是指相對分析S.No用下述純化的/處理的HA體積mlHA產(chǎn)量mg/ml蛋白mg/ral總HAmg總蛋白mg%蛋白w.r.t.HA1IPA1003.3760.56337.65614,222硅膠卯3.220.15289.813.54.453欲卯3.1140,01872柳.261.680,64滲濾(5X)1281.7160.0014219.60.1790.07550.22fun過濾1281.960.0011250.880.140.056"IPA"是指異丙醇；"S.No"是指步驟編號。實施例10:產(chǎn)物規(guī)格測試終產(chǎn)物的蛋白、核酸、外觀、pH、葡糖醛酸含量、分子量、IR譜、氯化物含量和水分含量。生產(chǎn)具有300-350萬道爾頓的分子量的HA。上述試驗和材料規(guī)范如英國藥典2003版所述。下面列出了對比結(jié)果SR.NO試驗規(guī)格結(jié)果1溶液外^L溶液澄清；在600nm測得的溶液吸光度不大于0.01溶液澄清；在600nm測得的溶液吸光度是0.0042IR分光光度法試驗物質(zhì)的光語對應(yīng)透明質(zhì)酸鈉的參照謙符合3pH在5.0-8.5范圍內(nèi)6.654核酸在260nm的吸光度不超過0.50.0335蛋白不超過0.3%。如果要用于腸胃外制劑，不超過0.1%。0.056%6氯化物0.5%(最高)符合24<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>分子量測定通過HPLC,在ShodexOHPakSB804-805HQ柱上通過大小排阻層析測定HA的分子量。使用的流動相是0.1MNaN03，流速為1ml/分鐘，使用RI檢測器。在24小時時，分子量是3.9xl(^Da。根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容，可以制備和執(zhí)行本文公開和要求保護(hù)的所有組合物和方法，而無需過度試驗。盡管已經(jīng)按照優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，在不脫離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下，可以改變所述組合物和/或方法、和本文所述方法的步驟或步驟的次序。更具體地，應(yīng)當(dāng)明白，化學(xué)上或生理上有關(guān)的某些試劑可以替代本文所述的試劑，同時達(dá)到相同或類似的結(jié)果。認(rèn)為對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的所有這樣的類似的替換和修改都在本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。權(quán)利要求1.生產(chǎn)透明質(zhì)酸(HA)或它的鹽的方法，該方法包含(a)提供能生產(chǎn)HA的細(xì)菌；(b)提供營養(yǎng)培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)菌，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含二價金屬離子鹽、1％酪蛋白水解物和5％選自乳糖和蔗糖的碳源；(c)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌；和(d)在需氧條件下發(fā)酵營養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述透明質(zhì)酸具有至少100萬Da的分子量。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述發(fā)酵是連續(xù)的。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述二價金屬離子鹽選自MgS04、CuS04、MnS04*ZnS04。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述鹽是ZnS04。5.權(quán)利要求1的方法，其中在30-40。C的溫度、300-500rpm的攪拌速率、l-3vvm的通氣和中性pH，進(jìn)行所述發(fā)酵步驟至少15個小時。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述HA具有在約3.5x1(^Da至4.0x106Da范圍內(nèi)的分子量，且該方法生產(chǎn)產(chǎn)量為至少5g高分子量HA/升營養(yǎng)培養(yǎng)基。7.權(quán)利要求6的方法，其中發(fā)酵24小時后，HA的分子量是至少3x106Da。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述細(xì)菌選自獸瘟鏈球菌、馬鏈球菌和釀膿鏈J求菌。9.權(quán)利要求l的方法，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含1%的酪蛋白水解物和5%的糖。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述細(xì)菌是獸瘟鏈球菌。11.權(quán)利要求l的方法，其中在30-40。C的溫度、300-500rpm的攪拌速率、l-3vvm的通氣和中性pH,進(jìn)行所述發(fā)酵步驟至少15個小時。12.從細(xì)菌發(fā)酵液純化透明質(zhì)酸(HA)或它的鹽的方法，包含(a)稀釋和澄清發(fā)酵液；(b)用等體積的溶劑沉淀在發(fā)酵液中存在的HA;(c)將沉淀的HA或它的鹽溶于溶液；(d)將硅膠加入來自步驟(c)的HA溶液或HA鹽溶液，然后去除硅膠；(e)用活性炭處理來自步驟(d)的HA溶液或HA鹽溶液；和(f)使用約5體積的溶劑，滲濾來自步驟(e)的HA溶液或HA鹽溶液；其中在沒有任何去污劑或表面活性劑或福爾馬林存在下和在中性pH進(jìn)行該方法。13.權(quán)利要求13的方法，另外包含將在步驟(b)中沉淀的HA轉(zhuǎn)化成它的鹽，然后在步驟(c)的溶液中均化HA鹽。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中在步驟(b)中使用的溶劑選自異丙醇、乙醇和丙酮。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述溶劑是異丙醇。16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中在步驟(c)中的溶液是3。/。乙酸鈉。17.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中在步驟(d)中通過離心去除硅膠。18.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中在步驟(e)中將活性炭浸漬在纖維素筒上。19.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中在步驟(f)中的溶劑是無菌的無致熱原水。20.權(quán)利要求13的方法，另外包含(g)通過無菌過濾器過濾，分離無菌的、純化的HA或它的鹽；和(h)凍干HA或它的鹽，直到水分含量小于5%。21.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中步驟(b)的溶劑是異丙醇，且該方法另外包含(g)凍干HA或它的鹽，直到水分含量小于5%。22.生產(chǎn)透明質(zhì)酸(HA)或它的鹽的方法，該方法包含(a)提供能生產(chǎn)HA的細(xì)菌；(b)提供營養(yǎng)培養(yǎng)基來培養(yǎng)微生物源，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含二價金屬離子鹽、1%酪蛋白水解物和5%選自乳糖和蔗糖的碳源；(c)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌；(d)在需氧條件下發(fā)酵營養(yǎng)培養(yǎng)基，(e)稀釋和澄清營養(yǎng)培養(yǎng)基；(f)用溶劑沉淀在稀釋的培養(yǎng)基中存在的HA;(g)將沉淀的HA或它的鹽溶于溶液；(h)將硅膠加入來自步驟(g)的HA溶液或HA鹽溶液，然后去除硅膠；(i)用活性炭處理來自步驟(h)的HA溶液或HA鹽溶液；和(j)使用溶劑滲濾來自步驟(i)的HA溶液或HA鹽溶液；其中在沒有任何去污劑或表面活性劑或福爾馬林存在下和在中性pH進(jìn)行該方法；其中所述HA具有至少100萬Da的分子量。23.生產(chǎn)透明質(zhì)酸(HA)或它的鹽的方法，該方法包含(a)提供能生產(chǎn)HA的細(xì)菌；(b)提供營養(yǎng)培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)菌，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含鋅、濃度為10g/L的酪蛋白水解物和濃度為50g/L的選自乳糖和蔗糖的碳源；(c)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌；和(d)在需氧條件下發(fā)酵營養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述透明質(zhì)酸具有至少lOO萬Da的分子量。24.通過權(quán)利要求、7、13、14、24或25的方法生產(chǎn)的透明質(zhì)酸或它的鹽。25.本文主要在實施例和附圖中例示的上面要求保護(hù)的透明質(zhì)酸或它的鹽和它的制備方法。全文摘要本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)和純化高分子量透明質(zhì)酸(HA)的有效的且改進(jìn)的方法。一個實施方案涉及提供在獸瘟鏈球菌中生產(chǎn)高分子量HA的生長條件。例如，在包含更低的蛋白濃度(例如，1％酪蛋白水解物)和更高的糖濃度(例如，5％蔗糖)的培養(yǎng)基中生長，產(chǎn)生5-6g/L的高分子量HA，其范圍是3.5-4.0×10⁶Da。本發(fā)明也提供了純化HA的有效方法，其包含用硅膠處理、然后用活性炭處理，隨后用更小體積的溶劑滲濾。文檔編號C08B37/00GK101512006SQ200780033000公開日2009年8月19日申請日期2007年7月6日優(yōu)先權(quán)日2006年7月6日發(fā)明者A·卡帕特,H·維蘭卡,J·達(dá)門德拉,V·蘭加斯瓦米,V·桑托什,V·納塔拉申請人:利萊恩斯生命科學(xué)有限公司