專利名稱：：菱角多糖及其提取方法及其藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域。技術(shù)背景菱角(恥妙ca/的戶)被中華人民共和國藥典(2005年版一部)及中藥大辭典所收載，為菱科植物菱的果實，具有清熱、解渴、健脾、益氣明目之功效。前期的實驗表明菱角的水提物具有良好的抗腫瘤活性，對于菱角多糖部分的活性尚未見文獻報道。惡性腫瘤已經(jīng)成為人類生命的三大殺手之一，醫(yī)學界在尋求和使用抗癌藥物的同時，發(fā)現(xiàn)許多化學抗癌藥物在作用于耙細胞時往往累及正常細胞，但植物藥的遺傳毒性不太明顯，表明中草藥在抗癌抗突變方面有其獨特的優(yōu)勢和廣闊的應用前景。近些年來單味中藥及中藥復方防治腫瘤作用的研究已取得一定成績。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種菱角多糖及其提取方法及其藥物用途。本發(fā)明菱角多糖是由下列制備方法得到的一、稱取菱角皮置于提取器內(nèi)，以810倍體積的蒸餾水浸泡810天，加熱煮沸34小時，過濾后再以35倍體積的水重復提取12次，合并深色提取液，過濾，濃縮至相對密度1.15-1.20(50°C);二、加入23倍量95%乙醇沉淀，并不斷攪拌，過濾，將沉淀加水充分溶解，3000rpm離心15min，去除不溶性雜質(zhì)；三、用23倍量95%乙醇沉淀，4°C，靜置15-20小時，3000rpm離心15min;沉淀依次用95%乙醇、無水乙醇脫水，再用乙醚脫去乙醇后，置于盛有P20s及NaOH的真空干燥器內(nèi)真空干燥，得粗多糖；四、粗多糖純化a、將粗多糖溶解，配成5%的糖液，氯仿一正丁醇溶液體積比為1:0.2，按粗多糖溶液與氯仿一正丁醇溶液，體積比為(2-5):1,加入一具塞容器中，振蕩30min，離心15min，吸取上層水相保留，棄掉氯仿相與蛋白沉淀，按上述方法重復除蛋白3次，干燥；b、除色素，采用活性炭法脫色，將多糖配成5%的糖液，加3%的活性炭，7(TC水浴中加熱2小時，冷卻，抽濾除去活性炭。本發(fā)明菱角多糖在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明提供菱角多糖及其制備方法，菱角多糖具有抗腫瘤作用。藥效學實驗表明，菱角多糖對Hela、11251細胞有明顯的增殖抑制和誘導凋亡作用。本發(fā)明藥物用法用量，口服劑量以生藥量計算0.5克-3克/次，一日三次。圖l是24h后對照組Hela細胞。圖2是多糖處理24h后Hela細胞。圖3是24h后對照組U^細胞。圖4是多糖處理24h后Hda細胞。圖5菱角多糖對11251細胞的生長抑制曲線。圖6菱角多糖對Hela細胞的生長抑制曲線。具體實施方式下面通過具體藥效學實驗例來進一步證明其抗腫瘤作用。1.MTT法測定多糖對腫瘤細胞增殖的抑制作用取對數(shù)生長期的人宮頸癌細胞Hela，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251接種于96孔板中，每孔100pL，密度為8x104'mL"，置于37。C、5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后加入不同濃度的多糖，使其終濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.25，15.625、7.8125|ugmL—1，每個劑量設(shè)3個平行孔，對照孔以等體積的IMDM代之。將培養(yǎng)板置37°C、5。/。C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后，加入MTT，每孔20pL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸出培養(yǎng)液，加入DMSO150pL，震蕩10min后置酶標儀上于570nm波長測各孔吸光度值，各重復孔的吸光度值取平均值，計算菱角多糖各組分對Hda，11251細胞的抑制率。抑制率計算公式為抑制率=對照組=組，|組應><畫%2.結(jié)果與分析2.2菱角多糖對Hela和U251細胞的體外抑瘤作用2.2.1細胞形態(tài)的變化倒置顯微鏡下觀察對照組和各實驗組細胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨著菱角多糖濃度的增加Hela和11251細胞的增殖受到明顯抑制。主要表現(xiàn)在隨著藥物濃度的增加細胞數(shù)目逐漸減少，細胞的體積變小、變形，貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。Hda細胞24h對照組細胞與加藥細胞形態(tài)變化見圖1、圖2;11251細胞24小時對照組與加藥細胞形態(tài)變化見圖3、圖4。2.2.2菱角多糖對U251細胞和Hela細胞24小時生長抑制率采用MTT法檢測了菱角多糖對U251細胞和Hela細胞24小時生長抑制率，結(jié)果見表l，表2，圖5和圖6。實驗表明，菱角多糖作用24h對所實驗腫瘤細胞Hela和U251細胞具有較強的抑制增殖作用，最高抑制率均達70%以上，并且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。表l菱角多糖對11251細胞24小時生長抑制率G±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*P<0.05,**P<0.01目前普遍認為惡性腫瘤化學治療藥物引起腫瘤退縮的機理,在于促進腫瘤細胞死亡和阻止其增殖,而細胞死亡既可以通過壞死(necrosis)又可通過凋亡(apoptosis)的形式進行。與壞死不同,凋亡的細胞維持完整的細胞膜結(jié)構(gòu)和功能，細胞解體后形成凋亡小體，不引起周圍組織炎癥反應[。體外實驗MTT結(jié)果表明，菱角多糖具有抑制Hela和U251細胞增殖的作用，并且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，作用24小時的最高抑制率均在70%以上。菱角多糖對Hela細胞作用24h半數(shù)抑制率IC5。為48.18mL—1，對U251細胞作用24h半數(shù)抑制率ICs。為41.97|igmL"。在倒置顯微鏡下觀察菱角多糖對Hda和U251細胞的作用，隨著菱角多糖濃度的增加細胞數(shù)目逐漸減少，藥物誘導后的腫瘤細胞胞漿內(nèi)顆粒增多、增粗，細胞膜邊緣變粗糙?？傊?，菱角多糖對Hela、U251細胞有明顯的增殖抑制和誘導凋亡作用。實施例1:一、稱取菱角皮置于提取器內(nèi)，以8倍體積的蒸餾水浸泡8天，加熱煮沸3小時，過濾后再以3倍體積的水重復提取2次，合并深色提取液，過濾，濃縮至相對密度1.15-1.20(50°C);二、加入3倍量95%乙醇沉淀，并不斷攪拌，過濾，將沉淀加水充分溶解，3000rpm離心15min，去除不溶性雜質(zhì)；三、用3倍量95°/。乙醇沉淀，4°C，靜置15小時，3000rpm離心15min;沉淀依次用95%乙醇、無水乙醇脫水，再用乙醚脫去乙醇后，置于盛有P205及NaOH的真空干燥器內(nèi)真空干燥，得粗多糖；四、粗多糖純化a、將粗多糖溶解，配成5%的糖液，氯仿一正丁醇溶液體積比為1:0.2，按粗多糖溶液與氯仿一正丁醇溶液，體積比為2:1,加入一具塞容器中，振蕩30min，離心15min，吸取上層水相保留，棄掉氯仿相與蛋白沉淀，按上述方法重復除蛋白3次，干燥；b、除色素，采用活性炭法脫色，將多糖配成5%的糖液，加3%的活性炭，70。C水浴中加熱2小時，冷卻，抽濾除去活性炭。實施例2一、稱取菱角皮置于提取器內(nèi)，以9倍體積的蒸餾水浸泡9天，加熱煮沸3.5小時，過濾后再以4倍體積的水重復提取2次，合并深色提取液，過濾，濃縮至相對密度1.15-1.20(50°C);二、加入2倍量95%乙醇沉淀，并不斷攪拌，過濾，將沉淀加水充分溶解，3000rpm離心15min，去除不溶性雜質(zhì)；三、用2倍量95%乙醇沉淀，4°C，靜置18小時，3000rpm離心15min;沉淀依次用95%乙醇、無水乙醇脫水，再用乙醚脫去乙醇后，置于盛有P205及NaOH的真空干燥器內(nèi)真空干燥，得粗多糖；四、粗多糖純化a、將粗多糖溶解，配成5%的糖液，氯仿一正丁醇溶液體積比為1:0.2，按粗多糖溶液與氯仿一正丁醇溶液，體積比為3:1,加入一具塞容器中，振蕩30min，離心15min,吸取上層水相保留，棄掉氯仿相與蛋白沉淀，按上述方法重復除蛋白3次，干燥；b、除色素，采用活性炭法脫色，將多糖配成5%的糖液，加3%的活性炭，7(TC水浴中加熱2小時，冷卻，抽濾除去活性炭。實施例3一、稱取菱角皮置于提取器內(nèi)，以10倍體積的蒸餾水浸泡10天，加熱煮沸4小時，過濾后再以5倍體積的水重復提取1次，合并深色提取液，過濾，濃縮至相對密度1.15-1.20(5(TC);二、加入2.5倍量95。/。乙醇沉淀，并不斷攪拌，過濾，將沉淀加水充分溶解，3000rpm離心15min，去除不溶性雜質(zhì)；三、用2.5倍量95%乙醇沉淀，4°C，靜置20小時，3000rpm離心15min;沉淀依次用95%乙醇、無水乙醇脫水，再用乙醚脫去乙醇后，置于盛有P20s及NaOH的真空干燥器內(nèi)真空干燥，得粗多糖；四、粗多糖純化a、將粗多糖溶解，配成5%的糖液，氯仿一正丁醇溶液體積比為1:0.2，按粗多糖溶液與氯仿一正丁醇溶液，體積比為5:1,加入一具塞容器中，振蕩30min，離心15min，吸取上層水相保留，棄掉氯仿相與蛋白沉淀，按上述方法重復除蛋白3次，干燥；b、除色素，采用活性炭法脫色，將多糖配成5%的糖液，加3%的活性炭，7(TC水浴中加熱2小時，冷卻，抽濾除去活性炭。實施例4本發(fā)明片劑的制備取實施例1制得的菱角多糖500克，加入制備片劑的常規(guī)輔料500克，混勻，制成1000片。實施例5本發(fā)明膠囊劑的制備取實施例1制得的菱角多糖500克，加入淀粉500克，混勻，用乙醇制粒，干燥，裝膠囊，制成1000粒。權(quán)利要求1.一種菱角多糖，其特征在于它是由下列制備方法得到的一、稱取菱角皮置于提取器內(nèi)，以8～10倍體積的蒸餾水浸泡8～10天，加熱煮沸3～4小時，過濾后再以3～5倍體積的水重復提取1～2次，合并深色提取液，過濾，濃縮至相對密度1.15-1.20(50℃)；二、加入2～3倍量95％乙醇沉淀，并不斷攪拌，過濾，將沉淀加水充分溶解，3000rpm離心15min，去除不溶性雜質(zhì)；三、用2～3倍量95％乙醇沉淀，4℃，靜置15-20小時，3000rpm離心15min；沉淀依次用95％乙醇、無水乙醇脫水，再用乙醚脫去乙醇后，置于盛有P2O5及NaOH的真空干燥器內(nèi)真空干燥，得粗多糖；四、粗多糖純化a、將粗多糖溶解，配成5％的糖液，氯仿—正丁醇溶液體積比為1∶0.2，按粗多糖溶液與氯仿—正丁醇溶液，體積比為(2-5)∶1，加入一具塞容器中，振蕩30min，離心15min，吸取上層水相保留，棄掉氯仿相與蛋白沉淀，按上述方法重復除蛋白3次，干燥；b、除色素，采用活性炭法脫色，將多糖配成5％的糖液，加3％的活性炭，70℃水浴中加熱2小時，冷卻，抽濾除去活性炭。2、如權(quán)利要求l所述的菱角多糖的制備方法。3、如權(quán)利要求1所述的菱角多糖在制備抗腫瘤藥物中的應用。4、如權(quán)利要求3所述的菱角多糖在制備抗人宮頸癌藥物中的應用。5、如權(quán)利要求3所述的菱角多糖在制備抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種菱角多糖及其提取方法及其藥物用途，屬于中藥領(lǐng)域。菱角多糖，其特征在于它是由下列制備方法得到的包括制備粗多糖和粗多糖純化，將粗多糖溶解，配成5％的糖液，氯仿—正丁醇溶液體積比為1∶0.2，按粗多糖溶液與氯仿—正丁醇溶液，體積比為(2-5)∶1，加入一具塞容器中，振蕩30min，離心15min，吸取上層水相保留，棄掉氯仿相與蛋白沉淀，按上述方法重復除蛋白3次，干燥；采用活性炭法脫色。菱角多糖具有抗腫瘤作用。藥效學實驗表明，菱角多糖對Hela、U₂₅₁細胞有明顯的增殖抑制和誘導凋亡作用。文檔編號C08B37/00GK101264110SQ20081005066公開日2008年9月17日申請日期2008年4月29日優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日發(fā)明者牛鳳蘭申請人:吉林大學