專利名稱：：膠原分子片段接枝脂肪族聚酯二元或三元共聚物及制法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及膠原分子片段接枝脂肪族聚酯二元或三元共聚物及制法和應(yīng)用。技術(shù)背景天然生物高分子一膠原作為生物醫(yī)用材料，具有低抗原性、低毒性，體內(nèi)可降解吸收，且降解產(chǎn)物無毒(參考文獻(xiàn)[1,2])。膠原與細(xì)胞相容性好，對細(xì)胞有較高的誘導(dǎo)性，可以為細(xì)胞的粘附生長提供結(jié)合位點(diǎn)。因此，膠原廣泛的應(yīng)用在組織工程和藥物控制釋放領(lǐng)域中(參考文獻(xiàn)[3,4])。脂肪族聚酯是近來常用的合成生物醫(yī)用材料，可生物降解并且降解產(chǎn)物容易吸收或代謝，這一特點(diǎn)使得其在組織工程和藥物控制釋放領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景(參考文獻(xiàn)[5])。但是，脂肪族聚酯類材料和膠原相比，其細(xì)胞粘附和誘導(dǎo)性能差，組織相容性差，不能夠提供細(xì)胞進(jìn)行生長、分化的結(jié)合位點(diǎn)。因此，關(guān)于膠原對合成類脂肪族聚酯材料的改性研究越來越多。但是膠原分子量過大，對合成材料進(jìn)行改性只能采取表面處理或者共混(參考文獻(xiàn)[6-8])。為了使脂肪族聚酯能充分和膠原結(jié)合，同時(shí)不喪失脂肪族聚酯和膠原的優(yōu)點(diǎn)，將膠原降解獲得膠原分子片段，采用化學(xué)方法將兩者接枝共聚，這樣獲得的新材料在不影響脂肪族聚酯各項(xiàng)優(yōu)越性能的同時(shí)，改善其生物相容性，擴(kuò)大材料在組織工程和藥物控制釋放領(lǐng)域中的應(yīng)用。聚乙二醇具有顯著的生物相容性，抗凝血性，無毒和低免疫性，因此被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域(參考文獻(xiàn)[9，10])。用聚乙二醇對脂肪族聚酯進(jìn)行改性，可增加脂肪族聚酯的溶解性，改善其作為藥物載體的穩(wěn)定性。脂肪族聚酯能在生物體內(nèi)被酶降解，具有很好的可生物降解性和生物相容性，廣泛用于組織工程和藥物釋放。同時(shí)具有細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的膠原分子片段能在組織工程和藥物釋放體系中引進(jìn)功能基團(tuán)，兩者的結(jié)合具有重大的應(yīng)用價(jià)值。目前合成脂肪族聚酯通常由羥基引發(fā)乙交酯、丙交酯以及己內(nèi)酯等單體開環(huán)聚合得到(參考文獻(xiàn)[11-14])。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所合成的脂肪族聚酯一膠原分子片段共聚物和聚乙二醇一脂肪族聚酯一膠原分子片段，綜合利用了脂肪族聚酯和膠原分子片段的性質(zhì)。調(diào)節(jié)二嵌段或三嵌段膠原分子片段的比例，當(dāng)膠原分子片段上面氨基的摩爾數(shù)和聚酯分子的摩爾數(shù)比例小于等于1的時(shí)候，可以得到梳型結(jié)構(gòu)分子；當(dāng)膠原片段的摩爾數(shù)和聚酯分子的摩爾數(shù)比例大于等于1的時(shí)候，可以得到線性結(jié)構(gòu)分子。共聚物的親水/親油性，生物相容性，生物降解性等性能也可以通過調(diào)節(jié)各嵌段間的比例獲得。同時(shí)本發(fā)明所采用接枝共聚的方法，可應(yīng)用在一端具有可反應(yīng)功能基團(tuán)為羧基的脂肪族聚酯分子和任何一個(gè)具有氨基基團(tuán)的兩性聚電解質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、聚氨基酸和多肽的接枝共聚。脂肪族聚酯與膠原分子片段成功的結(jié)合后，材料的生物相容性得到提高，用作組織工程材料時(shí)可以提高材料與組織間的相容性，有利于誘導(dǎo)細(xì)胞在材料支架上面的粘附、生長和增殖。這種材料可以綜合利用脂肪族聚酯和膠原的優(yōu)良性能，在生理?xiàng)l件下可自行降解、崩潰和代謝，進(jìn)而被生物體吸收或排出體外，對人體無毒副作用。當(dāng)被用作藥物載體時(shí)，可以通過控制合成材料各部分的比例來控制降解速率，進(jìn)而來調(diào)節(jié)藥物釋放速率。因此，本發(fā)明所合成的高分子材料在醫(yī)學(xué)上有很高的使用價(jià)值，有廣泛的應(yīng)用前景。1)本發(fā)明的目之一是提供膠原分子片段接枝脂肪族聚酯二元或三元共聚物，所述的膠原分子片段接枝脂肪族聚酯二元共聚物，膠原分子片段的分子量為1007000，脂肪族聚酯分子量為500080000;所述的膠原分子片段接枝脂肪族聚酯三元共聚物，是甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯-膠原分子片段的共聚物；其中，甲氧基聚乙二醇的分子量為7505000，膠原分子片段的分子量為1007000，脂肪族聚酯分子量為500080000。2)本發(fā)明的另一目的是給出脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物(簡寫為Polyester-DCol)的制備方法，其步驟如下(1)膠原分子片段的制備方法取膠原凍干海綿溶解在濃度為0.52M的檸檬酸水溶液中，反應(yīng)溫度為80~100°C，磁力攪拌，進(jìn)行膠原的降解，膠原和0.52M的檸檬酸水溶液的質(zhì)量比為0.02-0.2;經(jīng)過1236h后，降解液用分子量100的透析袋進(jìn)行透析，除掉分子量小于IOO的膠原分子片段后，再用分子量7000的透析袋繼續(xù)透析，取透析出來的透析液冷凍干燥，得到分子量1007000膠原分子片段；(2)脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物(Polyester-DCol)的制備本發(fā)明采用異丙醇(IPA)引發(fā)乙交酯(GA)、L-丙交酯(L-LA)或者s-己內(nèi)酯(s-CL)開環(huán)聚合成一端帶有羥基的聚酯，實(shí)驗(yàn)條件參照參考文獻(xiàn)[11,14和15]。按脂肪族聚酯異丙醇質(zhì)量比為1:1100:1投料，先把異丙醇溶于甲苯中得到重量百分?jǐn)?shù)濃度為5%的甲苯溶液，在無水無，條件下加入L-LA、GA或者s-CL單體，再加入占單體摩爾數(shù)1%。的催化劑辛酸亞錫，甲苯的質(zhì)量是反應(yīng)物質(zhì)量的23倍，反應(yīng)溫度為120士2(TC，反應(yīng)48±10h后，反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉過量的甲苯，之后倒入102(TC的乙醚中，不斷攪拌，沉降，得到產(chǎn)物，得到的產(chǎn)物用乙醚再沉降三次，最后真空干燥，得到純凈的一端帶有羥基的脂肪族聚酯；然后將聚酯的羥基用琥珀酸酐進(jìn)行羧化，得到一端帶有羧基的聚酯，條件參照參考文獻(xiàn)[16,17]。首先將聚酯與琥珀酸酐按1:1.1的摩爾比投料，同時(shí)分別加入與聚酯等摩爾的吡啶和三乙胺，用1，4—二氧六環(huán)做溶劑，溶劑的量為聚酯質(zhì)量的67倍，室溫反應(yīng)24士5h，磁力攪拌，產(chǎn)物用乙醚沉降，抽干，得到端基為羧基的脂肪族聚酯；子然后將端基為羧基的脂肪族聚酯的端羧基活化，活化的過程參照參考文獻(xiàn)[1S]，先將帶有端羧基的聚酯和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解在二氯甲烷(DCM)中攪拌，冰浴中加入N,N，-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)進(jìn)行活化，0。C攪拌lh后，室溫反應(yīng)24h;反應(yīng)過程中有沉淀1,3-二環(huán)己基脲DCU)析出，說明活化成功；反應(yīng)結(jié)束后過濾除去DCU沉淀后，端羧基活化后的聚酯用乙醚沉降；將等摩爾量的端羧基活化后的聚酯和膠原分子片段在153(TC分別溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，端羧基活化后的聚酯和膠原分子片段溶液濃度相等，均為0.010.04mmol/mL，溶解后，把端羧基活化后的聚酯溶液逐滴加入到膠原分子片段溶液中，3040。C油浴中反應(yīng)312h接枝，反應(yīng)結(jié)束后，用二甲基亞砜和水作為透析液對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行逐級透析，然后用蒸餾水透析48~72h后，凍干得脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物。3)本發(fā)明的第三個(gè)目的是給出甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯一膠原分子片段三元共聚物的制備方法，其步驟如下首先制備甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯(mPEG-Polyester)共聚物，聚合物的合成遵循經(jīng)典的脂肪族聚酯的合成方法，實(shí)驗(yàn)過程按照參考文獻(xiàn)[12和19]的方法進(jìn)行，首先是將mPEG加入到甲苯中，在14(TC的條件下共沸,除去mPEG中殘留的水分，使剩余的甲苯的體積是溶液中溶質(zhì)質(zhì)量的23倍，之后降低溫度至120°C，加入L-LA、GA或者s-CL單體，再加入單體摩爾數(shù)1%。的辛酸亞錫作為催化劑，反應(yīng)24h;反應(yīng)的后處理如下將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉過量的甲苯，之后倒入102(TC乙醚中，不斷攪拌沉降，得到的產(chǎn)物用乙醚再沉降三次，最后真空干燥，得到純凈的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯二元共聚物；然后將甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯的端羥基用琥珀酸酐進(jìn)行羧化條件參照參考文獻(xiàn)[16,17]。首先將甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯與琥珀酸酐按h1.1的摩爾比投料，同時(shí)分別加入與甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯等摩爾的吡啶和三乙胺，用1，4一二氧六環(huán)做溶劑，溶劑的量為甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯質(zhì)量的67倍，室溫反應(yīng)24i5h，磁力攪拌，產(chǎn)物用乙醚沉降，抽干，得到端基為羧基的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯；然后將端基為羧基的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯的端羧基活化，活化的過程參照參考文獻(xiàn)[18]，先將帶有端羧基的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解在二氯甲烷(DCM)中攪拌，冰浴中加入N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)進(jìn)行活化，0。C攪拌lh后，室溫反應(yīng)24h;反應(yīng)過程中有沉淀1,3-二環(huán)己基脲(dicyclohexylurea,DCU)析出，說明活化成功；反應(yīng)結(jié)束后過濾除去DCU沉淀后，端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯用乙醚沉降；將等摩爾量的端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯和膠原分子片段在1530。C分別溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯和膠原分子片段溶液濃度相等，均為0.010.04mmol/mL，溶解后，把端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯溶液逐滴加入到膠原分子片段溶液中，304(TC油浴中反應(yīng)312h接枝，反應(yīng)結(jié)束后，用二甲基亞砜和水作為透析液對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行逐級透析，然后用蒸餾水透析4872h后，凍干得甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯一膠原分子片段三元共聚物。本發(fā)明的第四目的是脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物的用途，將其用于制備組織工程支架。一種制法是用電紡絲制備支架將脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物溶解在氯仿和二甲基亞酰胺的體積比9:1的混合溶液里面，溶液里面加入質(zhì)量為脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物質(zhì)量兩倍的分子量為100k的聚乳酸，最終溶液濃度為10wt%;為了增加電紡射流表面的電荷密度，防止珠狀物的形成，相對于聚合物質(zhì)量的35wt。/。的芐基三乙基溴化銨鹽加入到上述溶液中成均一的紡絲溶液，將得到的紡絲溶液在高壓電場下面進(jìn)行紡絲，可得到電紡纖維氈。第二種制法是熱塑成型將脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物溶在二甲基亞砜(DMSO)中，溶液里面加入質(zhì)量為脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物質(zhì)量兩倍的分子量為80000~200000的聚乳酸，混溶，溶解均勻后，用乙醚沉降，真空干燥后用熱壓的方法成型。本發(fā)明的第五個(gè)目的是甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯一膠原分子片段三元共聚物的用途，將其用于制備膠束作為藥物控制釋放載體。制法是在錐形瓶中，將甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯一膠原分子片段三元共聚物溶解于DMSO中，濃度為l~10mg/ml。然后逐滴勻速加入和DMSO等體積的二次蒸餾水，可形成膠束。膠束形成后，用分子量7000的透析袋對膠束水溶液進(jìn)行透析，除去DMSO，定容后可得到聚合物膠束的母液，-根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對母液進(jìn)行稀釋。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所進(jìn)行的合成脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物，以及合成甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯一膠原分子片段三元共聚物，脂肪族聚酯的分子量為500080000，膠原分子片段的分子量為1007500，甲氧基聚乙二醇單分支的分子量為750~5000。共聚物的分子結(jié)構(gòu)根據(jù)膠原分子片段上面氨基的數(shù)量從線形到梳型過渡。和表面固定和共混膠原的脂肪族聚酯相比，分子鏈上的膠原分子片斷可以保證材料在生物體內(nèi)不斷降解的過程中保持良好生物相容性；同時(shí)，具有梳型結(jié)構(gòu)的共聚物中心鏈上有大量的羧基，使這種材料具備了pH敏感的特性，在藥物緩釋領(lǐng)域的應(yīng)用具有優(yōu)勢。圖1是聚乙丙交酯(IPA-PLGA)端羥基羧化活化產(chǎn)物核磁圖，a峰的出現(xiàn)說明IPA-PLGA端羥基己經(jīng)被羧化，b峰的出現(xiàn)說明羧基被NHS活化。圖2是IPA-PLGA、DCol禾卩IPA-PLGA-DCol共聚物紅外譜圖，和IPA-PLGA譜圖相比，IPA-PLGA-DCol譜圖上1549cm"和1662cm"附近新增了兩個(gè)峰，3336cm"附近的峰有了明顯的遷移和增強(qiáng)。分別對應(yīng)的是DCol中酰胺II帶CN伸縮、NH彎曲振動，酰胺I帶C-O伸縮振動，和NH伸縮與酰胺II第一倍頻共振吸收，說明DCol和IPA-PLGA成功進(jìn)行了接枝共聚反應(yīng)。(坐標(biāo)用中文！)圖3是經(jīng)過lh培養(yǎng)后Hela細(xì)胞在聚合物表面粘附及生長形態(tài)。圖3的(a)是IPA-PLGA;圖3的(b)是IPA-PLGA-DCol。'圖4是經(jīng)過6h培養(yǎng)后Hela細(xì)胞在聚合物表面粘附及生長形態(tài)。圖4的(a)是IPA陽PLGA;圖4的(b)是IPA-PLGA-DCol。圖5是經(jīng)過12h培養(yǎng)后Hela細(xì)胞在聚合物表面粘附及生長形態(tài)。圖5的(a)是IPA-PLGA;圖5的(b)是IPA-PLGA-DCol。圖6是經(jīng)過24h培養(yǎng)后Hela細(xì)胞在聚合物表面粘附及生長形態(tài)。圖6的(a)是IPA-PLGA;圖6的(b)是IPA陽PLGA-DCol。圖7的(a)和(b)是IPA-PLGA-DCol的電紡絲掃描電鏡照片。具體實(shí)施方式實(shí)施例1用檸檬酸降解，可以選擇不同分子量范圍的透析袋透析來制備分子量為5007000的膠原分子片段。取lg膠原凍干海綿溶解在裝有20mL1M檸檬酸水溶液的支管反應(yīng)器中，油浴加熱使反應(yīng)溫度升高到IO(TC，磁力攪拌，使膠原發(fā)生降解反應(yīng)。24h后，降解液用分子量3500的透析袋進(jìn)行透析，除掉分子量小于3500的膠原分子片斷和檸檬酸后，用分子量7000的透析袋繼續(xù)透析。取透析出來的透析液冷凍干燥，得到分子量3500~7000的膠原分子片斷(DCol)。DCol的收率為10%。制備操作相同的條件下，用分子量3500和1000的透析袋，得到分子量1000~3500的膠原分子片段，收率為5%。用分子量500和1000的透析袋，得到分子量5001000的收率為5%。設(shè)定分子量為35007000的DCol的凝膠色譜測試結(jié)果見表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>用異丙醇(IPA)引發(fā)丙交酯(LA)開環(huán)聚合成不同分子量的聚乳酸(PLA)，PLA分子量的大小與引發(fā)劑IPA的用量直接相關(guān)。首先，根據(jù)要合成PLA的分子量計(jì)算所需丙交酯和引發(fā)劑的比例，然后將重結(jié)晶過的丙交酯裝入200mL安瓶中，氬氣保護(hù)下加入引發(fā)劑，催化劑辛酸亞錫(SnOct)和蒸餾提純的甲苯，SnOct占LA摩爾數(shù)的千分之一。實(shí)驗(yàn)中使用的是SnOct甲苯溶液，濃度根據(jù)配備的時(shí)候SnOct和甲苯的用量進(jìn)行計(jì)算。反應(yīng)物與催化劑加好后，將安瓶放入12(TC油浴中并磁力攪拌，氬氣保護(hù)下反應(yīng)48h。產(chǎn)物用乙醚沉降3次，抽真空干燥。產(chǎn)物的分子量用核磁進(jìn)行計(jì)算若要合成20gPLA,設(shè)計(jì)分子量分別為5000，10000，15000，那么所需甲苯40mL，IPA、LA用量及產(chǎn)物分子量列于表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例3用IPA引發(fā)LA和GA開環(huán)聚合成乙丙交酯共聚物(PLGA)，PLGA分子量的大小與引發(fā)劑異丙醇的用量直接相關(guān)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，用作生物材料的PLGA，LA:GA的比例為8:2材料性能最佳，因此，選擇此比例進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)操作。試驗(yàn)裝置和操作步驟同實(shí)施例2相同。首先，根據(jù)要合成PLGA的分子量計(jì)算所需LA、GA和引發(fā)劑的比例，然后將重結(jié)晶過的LA和GA裝入200mL安瓶中，氬氣保護(hù)下加入引發(fā)劑，催化劑辛酸亞錫(SnOct)和蒸餾提純的甲苯，SnOct占LA和GA總摩爾數(shù)的千分之一。安瓶放入12(TC油浴中并磁力攪拌，氬氣保護(hù)下反應(yīng)48h。產(chǎn)物用乙醚沉降3次，抽真空干燥。產(chǎn)物的分子量用核磁進(jìn)行計(jì)算若要合成20gPLGA，設(shè)計(jì)分子量分別為5000，10000，15000，那么實(shí)驗(yàn)所需甲苯40mL、LA、GA的用量及產(chǎn)物分子量列于表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例4用甲氧基聚乙二醇(mPEG)引發(fā)丙交酯開環(huán)聚合成不同分子量的mPEG-PLA兩嵌段共聚物，mPEG-PLA分子量的大小與引發(fā)劑的分子量和用量直接相關(guān)。首先，根據(jù)要合成PLA的分子量計(jì)算所需丙交酯(LA)和引發(fā)劑mPEG的比例，然后將mPEG裝入安瓶中，與甲苯共沸除水(140°C)5個(gè)小時(shí)后，將重結(jié)晶過的丙交酯裝入安瓶中，氬氣保護(hù)下加入催化劑SnOct，補(bǔ)加蒸餾提純的甲苯，SnOct占LA摩爾數(shù)的千分之一。反應(yīng)物與催化劑加好后，將反應(yīng)溫度降低到12(TC并磁力攪拌，氬氣保護(hù)下反應(yīng)48h。產(chǎn)物用乙醚沉降3次，抽真空干燥。產(chǎn)物的分子量用核磁進(jìn)行計(jì)算若要合成20gmPEG-PLA，mPEG的分子量為2000，設(shè)計(jì)分子量分別為5000，10000，20000，80000，那么實(shí)驗(yàn)所需甲苯40mL。mPEG、LA用量及產(chǎn)物分子量列于表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>用甲氧基聚乙二醇(mPEG)引發(fā)乙丙交酯開環(huán)聚合成不同分子量的mPEG-PLGA兩嵌段共聚物，mPEG-PLGA分子量的大小與mPEG的分子量和用量直接相關(guān)。首先，根據(jù)要合成PLGA的分子量計(jì)算所需LA和引發(fā)劑mPEG的比例，然后將mPEG裝入安瓶中，與甲苯共沸除水(140°C)5個(gè)小時(shí)后，將重結(jié)晶過的LA和GA裝入安瓶中，氬氣保護(hù)下加入催化劑SnOct，補(bǔ)加蒸餾提純的甲苯，SnOct占LA和GA總摩爾數(shù)的千分之一。反應(yīng)物與催化劑加好后，將反應(yīng)溫度降低到12(TC并磁力攪拌，氬氣保護(hù)下反應(yīng)48h。產(chǎn)物用乙醚沉降3次，抽真空干燥。產(chǎn)物的分子量用核磁進(jìn)行計(jì)算若要合成20gmPEG-PLGA,mPEG的分子量為分別為750，2000，5000，設(shè)計(jì)分子量分別為10000，那么實(shí)驗(yàn)所需甲苯40mL。mPEG、LA和GA用量及產(chǎn)物分子量列于表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例6實(shí)驗(yàn)所涉及到的聚酯類材料的端羥基必須羧化后才能與DCol的氨基偶聯(lián)。首先通過核磁計(jì)算出脂肪族聚酯的分子量。選擇琥珀酸酐在接枝到聚酯的羥基端，步驟是首先將聚酯與琥珀酸酐按1:1.1的摩爾比投料，同時(shí)加入等摩爾的4，4-二甲氨基吡啶(DMAP)和三乙胺，用1，4一二氧六環(huán)做溶劑，溶劑的量大約脂肪族聚酯質(zhì)量的7倍。實(shí)驗(yàn)過程中保持無水無氧，室溫反應(yīng)24小時(shí)后，產(chǎn)物用乙醇沉降三次，洗凈未反應(yīng)的琥珀酸酐，真空干燥3天，用核磁和紅外表征接枝反應(yīng)進(jìn)行的情況。設(shè)計(jì)合成分子量為10k的幾種聚酯的羧化過程中所用聚酯、琥珀酸酐、DMAP和三乙胺的用量列于表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例7由于DCol分子鏈上不但有氨基，而且有羧基，如果直接加入偶聯(lián)劑對端羥基羧化的聚酯與DCol進(jìn)行偶聯(lián)的話，在聚酯的端羧基與DCol接枝的同時(shí)，-DCol分子間也會發(fā)生反應(yīng)，而使大量的氨基喪失，有可能導(dǎo)致接枝反應(yīng)失敗。因此，在進(jìn)行偶聯(lián)以前，必須先使聚酯的端羧基活化?；罨倪^程是先將聚合物和偶聯(lián)劑N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解在二氯甲烷(DCM)中攪拌，冰浴中加入N,N，-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，0。C攪拌lh后，室溫反應(yīng)24h;DCC和NHS等量加入，為聚酯摩爾量的5倍。反應(yīng)過程中有沉淀1,3-二環(huán)己基脲(dicyclohexylurea，DCU)析出，說明接枝成功；反應(yīng)結(jié)束后過濾除去DCU沉淀后，產(chǎn)物用乙醚沉降。設(shè)計(jì)合成分子量為10k的幾種聚酯的端羧基活化過程中所用聚酯、NHS、DCC和DCM的用量列于表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>脂肪族聚酯的端羥基經(jīng)過羧化活化后可以直接與DCol偶聯(lián)。首先，計(jì)算DCol上面氨基的平均數(shù)量，然后按照一個(gè)氨基和一個(gè)羧基發(fā)生縮聚反應(yīng)，計(jì)算聚合物和DCol的摩爾比，在室溫分別溶解在DMSO中，溶解后，聚合物的溶液逐滴加入到DCol溶液中，40。C油裕中反應(yīng)3h接枝。反應(yīng)結(jié)束后，首先用DMSO透析24小時(shí)后，用DMSO和水的混合溶液作為透析液對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行逐級透析72小時(shí)，中間更換透析液，直至然后用蒸餾水透析48h后，凍干得PLGA/D-Co1。設(shè)計(jì)合成分子量為10k的幾種聚酯和分子量分布為35007000的DCol縮聚過程中所用聚酯、DCol和DMSO的用量見表8。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例9將異丙醇引發(fā)聚合的聚酯系列接枝膠原分子片段后，用作組織工程支架材料。由于膠原分子片段的接枝使得材料在有機(jī)溶劑中的溶解性能變差，但是材料對細(xì)胞的相容性得到了顯著的提高。因此可以將此系列材料與高分子量的PLA或者PCL混溶后，重新沉降，獲得的材料用熱塑成型，來制備組織工程用材料。細(xì)胞在分子量為10k的IPA-PLGA和IPA-PLGA-DCol膜表面生長的結(jié)果見圖3，統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表9。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例10將0.5g分子量為10k的IPA-PLGA-DCol溶解在2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，材料溶解完全后加氯仿(CHC13)18mL，得到IPA-PLGA-DCol的CHC13和DMF混合溶液。稱取0.25g分子量為100k的PLA，加入5mL上述的混合溶液溶解后，進(jìn)行電紡絲。電紡過程中所涉及到的操作參數(shù)如下噴絲口的直徑為0.4mm，所施加的靜電場的強(qiáng)度為1.46kV/cm，噴絲口和收集屏之間的距離為24cm，溶液流速為2-2.5ml/h。最終在收集屏上得到了干燥IPA-PLGA-DColPLA的電紡纖維氈。IPA-PLGA-DColPLA電紡絲的電鏡照片見附圖7。實(shí)施例11將mPEG引發(fā)聚合的系列材料(包括接和未接膠原分子片段的系列材料)制備成2.5mg/mL的DMSO溶液，然后緩慢逐滴滴加和DMSO等量的水，制備膠束溶液。透析除去DMSO，過程中觀察材料成膠束的情況。通過實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，材料成膠束的能力和mPEG的長度有直接的關(guān)系，膠原分子片段的接枝在一定程度上可以影響材料的成膠束能力，但是不是決定因素。不同材料能膠束能力的情況列于表11。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>mPEG750-PLGA10k-DCol半透明實(shí)施例12將10mgmPEG5k-PLGA5k和10mgmPEG750-PLGA10k-DCol分別溶解在4mLDMS0中，攪拌使材料充分溶解。然后在磁力攪拌過程中逐滴緩慢加水至8mL，對水進(jìn)行透析3天左后，去除DMSO。兩種材料均可成膠束mPEG750-PLGA10k-Dco1。膠束的熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定當(dāng)聚合物濃度增大到一定值的時(shí)候，芘的最大激發(fā)波長會由333nm增大到335.2nm，最大激發(fā)波長發(fā)生了2.2nm的紅移，說明mPEG750-PLGA10k-DCol可以形成膠束。mPEG5k-PLGA5k膠束的熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果是芘的最大激發(fā)波長由333nm增大到335nm，最大激發(fā)波長發(fā)生了2nm的紅移，也可形成膠束。通過熒光實(shí)驗(yàn)得到mPEG750-PLGA10k-DCo1和mPEG5k-PLGA5k膠束的臨界膠束濃度(CMC)，可知mPEG750-PLGA10k-DCo1在較低的濃度下就可以形成膠束。測試結(jié)果見表12。其中mPEG750-PLGA10k-DCo1膠束由于在D-Col分子上有大量的羧基存在，因此mPEG750-PLGA10k-DCo1膠束具備pH敏感性。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>參考文獻(xiàn)[I].StenzelKH,MiyataT,RubinALCollagenasaBiomaterial.AnnualReviewsinBiophysicsandBioengineering1974;3(1):231-253.[2].NimniME,CheungD,StratesB,KodamaM,SheikhK.Chemicallymodifiedcollagen:anaturalbiomaterialfortissuereplacement.JBiomedMaterRes1987;21(6):741-771.[3]FriessW.Collagen—biomaterialfordrugdelivery.EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics1998;45(2):113-136.[4].OttaniV,RaspantiM,RuggeriA.Collagenstructureandfunctionalimplications.Micron2001;32(3):251-260.[5].WebbAR,YangJ,AmeerGA.Biodegradablepolyesterelastomersintissueengineering,ebt2004;4(6):謝-812.[6].MutterD,RodeheaverGT,DiemunschP,T旨inM,MoodyDL,RaffaeliM.Anewcompositemesh(collagen-polyester)forintra-abdominallaparoscopicherniarepair.SurgEndosc1998;12:595.[7].GoSau-Brissonni￡reOA,FabreD,Leflon-GuiboutV,DiCentaI,Nicolas-ChanoineMH,CoggiaM.Comparisonoftheresistancetoinfectionofrifampin-bondedgelatin-sealedandsilver/collagen-coatedpolyesterprostheses.JournalofVascularSurgery2002;35(6):1260-1263.[8].HsuS，KuoCC，YenHJ，WhuSW,TsaiCL.TheEffectofTwoDifferentBioreactorsontheNeocartilageFormationinTypeIICollagenModifiedPolyesterScaffoldsSeededWithChondrocytes.ArtificialOrgans2005;29(6):467-474.[9].ArmaniDK,LiuC.Microfabricationtechnologyforpolycaprolactone,abiodegradablepolymer.J.Micromech.Microeng2000;10:80-84.[10].KenworthyAK,SimonSA,McintoshTJ.Structureandphasebehavioroflipidsuspensionscontainingphospholipidswithcovalentlyattachedpoly(ethyleneglycol).BiophysicalJournal1995;68(5):1903-1920.[II].Barr&eM,LandfesterK.Polyestersynthesisinaqueousminiemulsion.Polymer2003;44(10):2833-2841.[12].DengXM,XiongCD,ChengLM,XuRRSynthesisandcharacterizationofblockcopolymersfromD，L-lactideandpoly(ethyleneglycol)withstannouschloride.JournalofPolymerSciencePartCPolymerLetters1990;28(13):411-416.[13].HyonSH,JamshidiK,IkadaY.Synthesisofpolylactideswithdifferentmolecularweights.Biomaterials1997;18(22):1503陽1508.[14]丄iliLIU,YeWU,WeiCAI.SynthesisandCharacterizationofPoly(L-lactide-co-glycolide).JOURNALOFWUHANUNIVERSITYOF[15].TokiwaY,JareratA,Biodegradationofpoly(1-lactide).BiotechnologyLetters2004;26(10):771-777.[16].WangCH,HsiueGH.Polymer-DNAhybridnanoparticlesbasedonfolate-polyethylenimine-block-poly(L-lactide).BioconjugateChem2005;16(2):391-396.[17].HansM,ShimoniK，DaninoDS，SjL.A.(2005).SynthesisandCaracterizationofmPEG-PLAProdrugMicelles.Biomacromolecules;6:2708-2717.[18].ShuaiX,MerdanT，UngerF,WittmarM,KisselT.Novelbiodegradableternarycopolymershy-PEI-g-PCL-b-PEG:synthesis,characterization,andpotentialasefficientnonviralgenedeliveryvectors.Macromolecules2003;36(15):5751-5759.[19].GarciaJT，F(xiàn)arinaJB,MunguiaO，LlabresM.Comparativedegradationstudyofbiodegradablemicrospheresofpoly(DL-lactide-co-glycolide)withpoly(ethyleneglycol)derivates.JournalofMicroencapsulation1999;16(l):83-94.權(quán)利要求1、膠原分子片段接枝脂肪族聚酯二元共聚物，其特征在于，該二元共聚物中膠原分子片段的分子量為100～7000，脂肪族聚酯分子量為5000～80000。2、膠原分子片段接枝脂肪族聚酯三元共聚物，其特征在于，該三元共聚物是甲氧基聚乙二醇-脂肪族聚酯-膠原分子片段的共聚物；其中，甲氧基聚乙二醇的分子量為7505000，膠原分子片段的分子量為1007000脂肪族聚酯分子量為500080000。3、如權(quán)利要求1所述的脂肪族聚酯—膠原分子片段二元共聚物的制備方法，其特征在于步驟和條件如下(1)膠原分子片段的制備方法取膠原凍干海綿溶解在濃度為0.52M的檸檬酸水溶液中，反應(yīng)溫度為S010(TC，磁力攪拌，進(jìn)行膠原的降解，膠原和0.5~2M的檸檬酸水溶液的質(zhì)量比為0.02~0.2;經(jīng)過1236h后，降解液用分子量100的透析袋進(jìn)行透析，除掉分子量小于100的膠原分子片段后，再用分子量7000的透析袋繼續(xù)透析，取透析出來的透析液冷凍干燥，得到分子量1007000膠原分子片段；'(2)脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物的制備本發(fā)明采用異丙醇引發(fā)乙交酯、L-丙交酯或者s-己內(nèi)酯開環(huán)聚合成一端帶有羥基的聚酯，按脂肪族聚酯異丙醇質(zhì)量比為1:1100:1投料，先把異丙醇溶于甲苯中得到重量百分?jǐn)?shù)濃度為5%的甲苯溶液，在無水無氧條件下加入L-丙交酯、乙交酯或者s-己內(nèi)酯單體，再加入占單體摩爾數(shù)1%。的催化劑辛酸亞錫，甲苯的質(zhì)量是反應(yīng)物質(zhì)量的23倍，反應(yīng)溫度為120±20°C，反應(yīng)48il0h后，反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉過量的甲苯，之后倒入102(TC的乙醚中，不斷攪拌，沉降，得到產(chǎn)物，得到的產(chǎn)物用乙醚再沉降三次，最后真空干燥，得到純凈的一端帶有羥基的脂肪族聚酯；然后將一端帶有羥基的脂肪族聚酯的羥基用琥珀酸酐進(jìn)行羧化，首先將聚酯與琥珀酸酐按l:1.1的摩爾比投料，同時(shí)分別加入與聚酯等摩爾的吡啶和三乙胺，用1，4一二氧六環(huán)做溶劑，溶劑的量為聚酯質(zhì)量的67倍，室溫反應(yīng)24士5h，磁力攪拌，產(chǎn)物用乙醚沉降，抽干，得到端基為羧基的脂肪族聚酯；子然后將端基為羧基的脂肪族聚酯的端羧基活化，先將帶有端羧基的聚酯和N-羥基琥珀酰亞胺溶解在二氯甲烷中攪拌，冰浴中加入N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行活化，0'C攪拌lh后，室溫反應(yīng)24h;反應(yīng)結(jié)束后過濾除去1，3-二環(huán)己基脲沉淀后，端羧基活化后的聚酯用乙醚沉降；將等摩爾量的端羧基活化后的聚酯和膠原分子片段在153(TC分別溶解在二甲基亞砜中，端羧基活化后的聚酯和膠原分子片段溶液濃度均為0.01~0.04mmol/mL，溶解后，把端羧基活化后的聚酯溶液逐滴加入到膠原分子片段溶液中，304(TC油浴中反應(yīng)312h接枝，反應(yīng)結(jié)束后，用二甲基亞砜和水作為透析液對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行逐級透析，然后用蒸餾水透析4872h后，凍干，得到脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物。4、如權(quán)利要求1所述的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯一膠原分子片段三元共聚物的制備方法，其特征在于步驟和條件如下首先制備甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯共聚物，首先是將甲氧基聚乙二醇加入到甲苯中，在14(TC的條件下共沸，除去甲氧基聚乙二醇中殘留的水分，使剩余的甲苯的體積是溶液中溶質(zhì)質(zhì)量的2~3倍，之后降低溫度至120°C，加入乙交酯、L-丙交酯或者s-己內(nèi)酯單體，再加入單體摩爾數(shù)1%0的辛酸亞錫作為催化劑，反應(yīng)24h;反應(yīng)的后處理如下將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉過量的甲苯，之后倒入102(TC乙醚中，不斷攪拌沉降，得到的產(chǎn)物用乙醚再沉降三次，最后真空干燥，得到純凈的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯二元共聚物；然后將甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯的端羥基用琥珀酸酐進(jìn)行羧化，首先將甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯與琥珀酸酐按1:1.1的摩爾比投料，同時(shí)分別加入與甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯等摩爾的吡啶和三乙胺，用1，4一二氧六環(huán)做溶劑，溶劑的量為甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯質(zhì)量的67倍，室溫反應(yīng)24土5h，磁力攪拌，產(chǎn)物用乙醚沉降，抽干，得到端基為羧基的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯-,然后將端基為羧基的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯的端羧基活化，先將帶有端羧基的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯和N-羥基琥珀酰亞胺溶解在二氯甲烷中攪拌，冰浴中加入N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行活化，0。C攪拌lh后，室溫反應(yīng)24h;反應(yīng)結(jié)束后過濾除去1，3-二環(huán)己基脲沉淀后，端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯用乙醚沉降；將等摩爾量的端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯和膠原分子片段在153(TC分別溶解在二甲基亞砜中，端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯和膠原分子片段溶液濃度均為0.010.04mmol/mL，溶解后，把端羧基活化后的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯溶液逐滴加入到膠原分子片段溶液中，304(TC油浴中反應(yīng)312h接枝，反應(yīng)結(jié)束后，用二甲基亞砜和水作為透析液對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行逐級透析，然后用蒸餾水透析48~72h后，凍干得甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯一膠原分子片段三元共聚物。5、如權(quán)利要求1所述的脂肪族聚酯一膠原分子片段二元共聚物的應(yīng)用，其特征在于，其用于制備組織工程支架。6、如權(quán)利要求2所述的甲氧基聚乙二醇一脂肪族聚酯一膠原分子片段三元共聚物的用途，其特征在于，其用于制備膠束作為藥物控制釋放載體。全文摘要本發(fā)明涉及膠原分子片段接枝脂肪族聚酯二元或三元共聚物及制法和應(yīng)用。該二元共聚物中膠原分子片段的分子量為100～7000，脂肪族聚酯分子量為5000～80000。該三元共聚物是聚乙二醇-脂肪族聚酯-膠原分子片段的共聚物；其中，聚乙二醇的分子量為750～5000，膠原分子片段、脂肪族聚酯分子量與二元共聚物同。共聚物的分子結(jié)構(gòu)根據(jù)膠原分子片段上面氨基的數(shù)量從線形到梳型過渡。分子鏈上的膠原分子片斷可以保證材料在生物體內(nèi)不斷降解的過程中保持良好生物相容性；同時(shí)，具有梳型結(jié)構(gòu)的共聚物中心鏈上有大量的羧基，使材料具備pH敏感的特性，在藥物緩釋領(lǐng)域用于制備組織工程支架或用于制備膠束作為藥物控制釋放載體。文檔編號C08G63/91GK101397367SQ200810051340公開日2009年4月1日申請日期2008年10月27日優(yōu)先權(quán)日2008年10月27日發(fā)明者莊秀麗,景遐斌,李艷輝,田華雨,陳學(xué)思申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所