專(zhuān)利名稱(chēng)：一種合成三聚氰胺完全抗原的方法及檢測(cè)三聚氰胺的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，尤其是提供了應(yīng)用單克隆抗 體術(shù)研制的檢測(cè)三聚氰胺的ELISA試劑盒，同時(shí)還公開(kāi)了其制備方法，屬于酶聯(lián)免疫 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(melamine)簡(jiǎn)稱(chēng)三胺，學(xué)名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺， 是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料。這種化學(xué)品常被用于生產(chǎn)塑料、膠水和阻燃劑。 三聚氰胺含氮量為66. 6%，折合成粗蛋白含量為416.27%，摻入少量就可以迅速提高蛋 白含量，使產(chǎn)品在常規(guī)檢査中顯得含有較高的蛋白質(zhì)，常被不法商販冒充成高蛋白物 質(zhì)加入，以提高檢測(cè)時(shí)食品中蛋白質(zhì)檢測(cè)數(shù)值，還能大幅度降低成本。由于三聚氰胺 不溶解在水里，抗氨氮測(cè)定，加上三聚氰胺為白色粉末，易被染色，很容易混入原料 中而不被發(fā)現(xiàn)。所以一般的分析化驗(yàn)部門(mén)很難分析出來(lái)。
國(guó)際化學(xué)品安全規(guī)劃署和歐洲聯(lián)盟委員會(huì)合編的《國(guó)際化學(xué)品安全手冊(cè)》(第三 巻)表明長(zhǎng)期或反復(fù)大量攝入三聚氰胺可能對(duì)腎與膀胱產(chǎn)生影響，導(dǎo)致產(chǎn)生結(jié)石， 因此三聚氰胺是一種禁止用于食品及動(dòng)物飼料的化學(xué)物質(zhì)。
目前，三聚氰胺檢測(cè)方法主要是氣相色譜法和高效液相色譜法。高效液相色譜法 雖操作簡(jiǎn)單，但檢出限較高，無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)三聚氰胺低殘留限量的要求；氣相色譜法靈 敏度較高，但樣品前處理過(guò)程復(fù)雜、分析速度慢，不適合在基層推廣使用；并且氣相 色譜法和高效液相色譜法需要昂貴的專(zhuān)門(mén)設(shè)備，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù) 要求較高。
基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立起來(lái)的ELISA檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)單、快速、處理樣 品量大、靈敏度較高、特異性強(qiáng)和價(jià)格低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，可以直接用于生產(chǎn)實(shí)踐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)一種人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，用于制備單克隆抗體或多克 隆抗體。
本發(fā)明還提供了應(yīng)用單克隆抗體檢測(cè)三聚氰胺的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，適合工廠化生產(chǎn)。
本發(fā)明公開(kāi)的人工合成三聚寧J安完全抗原是通過(guò)以下方法得到的 以三聚氰胺為半抗原，通過(guò)戊二醛法與多聚賴(lài)氨酸偶聯(lián)制備完全抗原。 本發(fā)明提供的ELISA檢測(cè)試劑盒的組成包括
三聚氰胺酶標(biāo)物、三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液、包被三聚氰胺單克隆抗體的酶標(biāo)板、底物顯 色液、洗滌液、終止液、酶標(biāo)物稀釋液及樣品稀釋液等。
所述單克隆抗體為以三聚氰胺為半抗原，通過(guò)與多聚賴(lài)氨酸偶聯(lián)制備完全抗原， 并通過(guò)小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選及克隆化培養(yǎng)制得；所述三聚氰胺酶標(biāo)物采用化學(xué) 方法偶聯(lián)得到，標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶，所述方法為過(guò)碘酸鈉法；所述樣品稀釋液 為含0.1 %吐溫-20的PBST緩沖液，pH值為7. 4;所述洗滌液為含0.05 %吐溫-20的PBST 緩沖液，pH值為7. 4;所述酶標(biāo)物稀釋液為含0.01 %吐溫-20的PBST緩沖液，pH值為 7.4;底物顯色液A液為O. lmol/LpH值為5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0.3% 過(guò)氧化氫儲(chǔ)備液，每lmL緩沖液加入14uL儲(chǔ)備液，制成使用液；B液為四甲基聯(lián)苯胺， 先用丙酮配成0. 2mg / mL溶液，用0. lmol / LpH值為5. 0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制 成O. 2mg/L溶液。
另一方面，本發(fā)明還提供檢測(cè)樣品中三聚氰胺含量的方法，歩驟如下
(1) 樣品前處理
(2) 用權(quán)利要求2所述的ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，向包被三聚氰胺單抗的酶標(biāo) 板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，加入三聚氰胺酶標(biāo)物，孵育30分鐘，洗滌液洗滌，加 入顯色液孵育20分鐘，終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。
(3) 分析檢測(cè)結(jié)果 本發(fā)明人工合成三聚氰胺完全抗原的原理為
戊二醛(GA)是一種同型雙功能交聯(lián)劑，它的兩個(gè)功能基可以與多聚賴(lài)氨酸和三聚 氰胺上的氨基結(jié)合，形成多聚賴(lài)氨酸-GA-三聚氰胺的結(jié)合物。用兩步法先將多聚賴(lài)氨 酸與過(guò)量的GA反應(yīng)，形成二者的結(jié)合物，然后再將該結(jié)合物與抗體蛋白質(zhì)分子的氨 基交聯(lián)，形成多聚賴(lài)氨酸-GA-三聚氰胺的結(jié)合物，制備成三聚氰胺的完全抗原，可用 于免疫動(dòng)物制備單克隆抗體或多克隆抗體。
本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理為
將抗三聚氰胺的單克隆抗體包被于固相載體上，加入樣本或三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液 并加入三聚氰胺酶標(biāo)物，待檢樣品中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)物競(jìng)爭(zhēng)包被于固相載體上的單克隆抗體，通過(guò)洗滌除去未結(jié)合的三聚氰胺酶標(biāo)物，加入顯色液顯色后終止 反應(yīng)，測(cè)定樣品吸光度值，改值與樣品中三聚氰胺的量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較即 可測(cè)定樣品中三聚氰胺的濃度。 本發(fā)明的積極效果在于
本發(fā)明首次公開(kāi)一種新的合成三聚氰胺完全抗原的方法，為制備單克隆抗體或多
克隆抗體奠定了基礎(chǔ)；并首次應(yīng)用單克隆抗體建立了一種檢測(cè)三聚氰胺的直接競(jìng)爭(zhēng)
ELISA試劑盒，可定性或定量分析樣品中的三聚氰胺，適和工廠化生產(chǎn)。本發(fā)明的試
劑盒縮短了檢測(cè)時(shí)間，對(duì)樣品的前處理要求低，處理過(guò)程簡(jiǎn)單，并配備了相關(guān)的樣品
處理試劑，能夠同時(shí)迅速檢測(cè)大批樣品。
本發(fā)明的試劑盒所有試劑均為己配制好的工作液，可以直接操作無(wú)需處理，減少
了操作步驟，可以快速，靈敏檢測(cè)液態(tài)牛奶、奶粉、固體樣品中的三聚氰胺，避免了
復(fù)雜的操作，對(duì)設(shè)備要求低，可以適應(yīng)多種檢測(cè)環(huán)境，以及多種檢測(cè)需要；并且本發(fā)
明的試劑盒樣本用量小，試劑保存時(shí)間長(zhǎng)，自動(dòng)化程度高，對(duì)操作者無(wú)毒性，對(duì)環(huán)境
無(wú)污染等；因此本發(fā)明應(yīng)用單克隆抗體建立的ELISA檢測(cè)試劑盒具有重大的社會(huì)意義
和廣闊的市場(chǎng)前景。


圖l.三聚氰胺抑制曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任 何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1
制備三聚氰胺完全抗原
通過(guò)戊二醛法使三聚氰胺與多聚賴(lài)氨酸偶聯(lián)制備完全抗原，具體步驟如下
1. 取100mg多聚賴(lài)氨酸溶于20 mL pH7. 2 PBS中，加入2 mL50y。戊二醛，4(TC作 用18h。
2. 用0. 15mol/LNaCl平衡過(guò)的S印hadex G-50凝膠柱洗脫，除去游離的戊二醛， 或用0.01mol/L， pH7.2PBS， 4。C透析過(guò)夜，期間更換透析液三次。
3. 用lmol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)洗脫液或透析液pH值至9. 0 9. 6，將100mg 三聚氰胺直接溶于洗脫液或透析液中，37'C作用18h。4. 裝入透析袋，以O(shè). 01mol/L、 pH7.2PBS， 4'C透析過(guò)夜。
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用此方法制備的完全抗原可直接免疫動(dòng)物，制備單克隆抗體或多克隆抗體。
實(shí)施例2
三聚氰胺特異性單克隆抗體的制備
用實(shí)施例1方法制備的完全抗原作為免疫原，選用健康8周齡雌性BALB/C小鼠作 為免疫動(dòng)物，免疫劑量lmg/只，采取腹腔注射，每次免疫間隔為2周，免疫5次。初 次免疫用免疫原與弗氏完全佐劑(體積比=1: 1)注射，二、三、四次免疫抗原與等量 弗氏不完全佐劑混合，最后一次不加佐劑用2倍量免疫，3天后取小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0 骨髓瘤細(xì)胞雜交融合，制備雜交瘤細(xì)胞。采取有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，篩選能夠 穩(wěn)定分泌三聚氰胺單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。單克隆抗體的生產(chǎn)與純化，小鼠腹腔 注射雜交瘤細(xì)胞，采集腹水，經(jīng)硫酸銨鹽析，SPA-S印harose CL-4B親和層析柱純化單 抗，加入0.01%疊氮鈉，經(jīng)真空冷凍干燥后置-2(TC保存。
實(shí)施例3
三聚氰胺酶標(biāo)物的制備
酶標(biāo)抗原中的酶可為辣根過(guò)氧化物酶(服P)或堿性磷酸酶(AP)，優(yōu)選為HRP,HRP-三聚氰胺標(biāo)記物采用過(guò)碘酸鈉法制備，具體如下
1. 稱(chēng)取10mgHRP溶解于lral蒸餾水中。
2. 于上液中加入0. 2mL新配的0. 1M NaI(V溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
3. 將上述溶液裝入透析袋中，lmM PH4.4的醋酸鈉緩沖液4。C透析過(guò)夜。
4. 加20uL0.2MPH9. 5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化服P的PH升高到9. 0 9. 5。
5. 0. 5mg半抗原溶于lmL0.01M碳酸鹽緩沖液中，分為兩份，加入到醛化的HRP 中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。
6. 加0. lml新配的4mg/mL NaBH4液，混勻，再置4。C2小時(shí)。
7. 將上述液裝入透析袋中，對(duì)0. 15M PH7. 4 PBS透析，4'C過(guò)夜。
8. 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4i:i小時(shí)。
9. 3000。m離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶 于少量0. 15M PH7. 4的PBS中。
10. 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0. 15M PH7. 4的PBS緩沖液透析，去除銨離子 后(用萘氏試劑檢測(cè))，10，000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，加入等量50%甘油，小量分裝，4'C或-20'C保存。
大鵬詞4
直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立
1. 單抗最佳包被濃度和三聚氰胺酶結(jié)合物最佳稀釋度的確定 以倍比稀釋的單抗包被酶標(biāo)板，包被過(guò)夜后，1% BSA 37X:封閉lh，洗滌后，按分
別檢測(cè)陰、陽(yáng)性樣品，比較陰、陽(yáng)性樣品的OD值，選擇陽(yáng)性O(shè)D值較高、陰性O(shè)D值較 低和P/N值較高的單抗工作濃度作為最佳包被濃度；經(jīng)測(cè)定最佳包被濃度為1. 41ug / mL。單抗用最佳包被濃度包被酶標(biāo)板，檢測(cè)酶結(jié)合物最佳稀釋度，經(jīng)測(cè)定三聚氰胺酶 結(jié)合物最佳稀釋度為8000 X 。
2. ELISA檢測(cè)單抗IC50值
以最佳包被濃度用單抗包被酶標(biāo)板，準(zhǔn)備Oug/L、 5ug/L、 10ug/L、 50ug/L、 100 ug / L和200 ug / L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，加入50uL標(biāo)準(zhǔn)品和50uL最佳稀釋度酶標(biāo)結(jié) 合物，室溫反應(yīng)30分鐘，洗滌后顯色20分鐘終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。檢 測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖l。由圖l可見(jiàn)三聚氰胺單克隆抗體IC50在10ug/L左右，表明本發(fā)明制 備的單克隆抗體有較好的特異性，能夠滿(mǎn)足檢測(cè)三聚氰胺ELISA試劑盒的要求。
實(shí)施例5
檢測(cè)三聚氰胺直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的組建 ELISA檢測(cè)試劑盒包括以下組分
1. 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為Oug/L、 5ug/L、 10ug/L、 50ug/L、 100 ug/L和200 ug/L,共六瓶。
2. 包被三聚氰胺單克隆抗體的96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板。
3. 三聚氰胺酶標(biāo)物HRP-三聚氰胺酶標(biāo)物濃度為lmg/L。
4. 底物顯色液A液為0. lmol / LpH值為5. 0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0. 3 %過(guò)氧化氫儲(chǔ)備液，每lmL緩沖液加入14uL儲(chǔ)備液，制成使用液；B液為四甲基聯(lián)苯 胺，先用丙酮配成0. 2rag / mL溶液，用0. lmol / LpH值為5. 0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液 配制成O. 2mg/L溶液。
5. 洗滌液含0.05%吐溫-20的PBST緩沖液，pH值為7. 4。
6. 酶標(biāo)物稀釋液含0.017。吐溫-20的PBST緩沖液，pH值為7.4.
7. 樣品稀釋液含0.1%吐溫-20的PBST緩沖液，pH值為7.4。
8. 終止液2raol/L硫酸。試劑盒的保存溫度為4'C保存。
八
頭鵬W 0
樣品中三聚氰胺殘留的檢測(cè)
1. 樣品前處理
液態(tài)奶用樣品稀釋液l: IO稀釋?zhuān)?br> 奶粉按樣品包裝說(shuō)明用樣品稀釋液代替水稀釋?zhuān)儆脴悠废♂屢簂: IO稀釋?zhuān)?固體樣品稱(chēng)取樣品加入5倍體積DMS0振蕩1小時(shí)，離心取上清，用樣品稀釋液 稀釋?zhuān)苽錁悠啡芤骸?br> 2. 試劑盒檢測(cè)
(1) 將向包被三聚氰胺單克隆抗體的酶標(biāo)板中加入50uL樣品或三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品
溶液，并加入50uL三聚氰胺酶標(biāo)物；
(2) 輕輕振蕩30秒，室溫反應(yīng)30分鐘；
(3) 洗滌傾去孔內(nèi)的液體，用洗滌液注滿(mǎn)各孔(約300ul)，然后倒掉洗滌液，
如此反復(fù)3次，最后一次在吸水紙上拍干；
(4) 加入50uL三聚氰胺酶標(biāo)物，37'C反應(yīng)20分鐘；
(5) 加50uL終止液終止反應(yīng)；
(6) 用酶標(biāo)儀讀出OD450nm值。
3. 結(jié)果分析
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中三聚氰胺的含量可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出，也可 以用回歸方程計(jì)算出樣本中三聚氰胺的含量。測(cè)得的吸光度與樣品中的三聚氰胺含量 成反比，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算三聚氰胺的含量。
實(shí)施例7
往無(wú)三聚氰胺的的鮮牛奶中添加50 ug/L的三聚氰胺作為實(shí)際樣品，用試劑盒進(jìn) 行檢測(cè)。
1. 樣品前處理
用樣品稀釋液l: IO稀釋?zhuān)苽錁悠啡芤骸?br> 2. 試劑盒檢測(cè)
(1) 將向包被三聚氰胺單克隆抗體的酶標(biāo)板中加入50uL樣品或三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品 溶液，并加入50uL三聚氰胺酶標(biāo)物；
(2) 輕輕振蕩30秒，室溫反應(yīng)30分鐘；(3) 洗滌傾去孔內(nèi)的液體，用洗漆液注滿(mǎn)各孔(約300lU)，然后倒掉洗滌液， 如此反復(fù)3次，最jS—次在吸7JC纟氏上拍干；
(4) 加入50uL三聚氰胺酶標(biāo)物，37。C反應(yīng)20分鐘；
(5) 加50uL終止液終止反應(yīng)；
(6) 用酶標(biāo)儀讀出OD450nm值，經(jīng)測(cè)定數(shù)值為1.012。 3.結(jié)果分析-
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較，求得樣品溶液三聚氰胺的含量為5ug/L,因?yàn)闃悠啡芤航?jīng)前 處理己經(jīng)稀釋10倍，所以測(cè)定樣品牛奶中三聚氰胺的含量為50 ug/L。
權(quán)利要求
1、一種人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，其特征在于以三聚氰胺為半抗原，通過(guò)戊二醛法與多聚賴(lài)氨酸偶聯(lián)制備完全抗原。
2、 一種應(yīng)用單克隆抗體檢測(cè)三聚氰胺的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，組成包括三聚氰胺酶標(biāo)物、三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液、包被三聚氰胺單克隆抗體的酶標(biāo)板、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標(biāo)物稀釋液及樣品稀釋液。
3、 權(quán)利要求2所試劑盒的制備方法，其特征在于以三聚氰胺為半抗原，通過(guò)與多聚賴(lài)氨酸偶聯(lián)制備完全抗原；通過(guò)完全抗原免疫小鼠、細(xì) 胞融合、篩選及克隆化培養(yǎng)過(guò)程制備單克隆抗體；將單克隆抗體包被于酶 標(biāo)板制備包被三聚氰胺單克隆抗體的酶標(biāo)板，再加入三聚氰胺酶標(biāo)物、三 聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標(biāo)物稀釋液及樣品稀釋 液，組成ELISA試劑盒。
4、 權(quán)利要求3所述ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于所述三 聚氰胺酶標(biāo)物所用酶為辣根過(guò)氧化物酶，通過(guò)過(guò)碘酸鈉法與三聚氰胺偶聯(lián) 制備三聚氰胺酶標(biāo)物。
5、 ELISA試劑盒檢測(cè)方法，包括以下步驟(1) 樣品前處理液態(tài)奶用樣品稀釋液l: IO稀釋?zhuān)荒谭郯礃悠钒b說(shuō)明用樣品稀釋液代替水稀釋?zhuān)儆脴悠废♂屢簂: IO稀釋?zhuān)还腆w樣品稱(chēng)取樣品加入5倍體積DMS0振蕩1小時(shí)，離心取上清，用 樣品稀釋液稀釋?zhuān)苽錁悠啡芤骸?2) 用權(quán)利要求2所述的ELISA試劑盒檢測(cè)，向包被三聚氰胺單抗的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，加入三聚氰胺酶標(biāo)物，孵育30分鐘，洗滌液洗滌，加入顯色液孵育20分鐘，終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。(3)分析檢測(cè)結(jié)果 測(cè)得的吸光度與樣品中的三聚氰胺含量成反比，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算 三聚氰胺的含量。
全文摘要
本發(fā)明建立了一種合成三聚氰胺完全抗原的方法和應(yīng)用單克隆抗體檢測(cè)三聚氰胺的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒。試劑盒的組成包括三聚氰胺酶標(biāo)物、三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液、包被三聚氰胺單克隆抗體的酶標(biāo)板、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標(biāo)物稀釋液及樣品稀釋液等。本發(fā)明建立了人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，以多聚賴(lài)氨酸為載體制備單克隆抗體；應(yīng)用單克隆抗體制備的ELISA試劑盒，具有簡(jiǎn)單、快速、處理樣品量大、靈敏度較高、特異性強(qiáng)和價(jià)格低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，適和工廠化生產(chǎn)，可對(duì)液態(tài)牛奶、奶粉、固體樣品中三聚氰胺進(jìn)行快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C08G69/00GK101407580SQ200810051488
公開(kāi)日2009年4月15日 申請(qǐng)日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者新 馮, 孫長(zhǎng)江, 杜崇濤, 雷連成, 韓文瑜 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)