專利名稱：：一種星型共聚物自組裝納米膠束的制備方法一種星型共聚物自組裝納米膠束的制備方法
背景技術(shù)：
：在過去的十年中，兩親共聚物不僅在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域，而且在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是在藥物運(yùn)載體系中，已經(jīng)吸引了人們眾多的關(guān)注。在選擇性溶劑中，兩親嵌段共聚物能夠自組裝形成多種形態(tài)的納米聚集體，尤其是由疏水性的內(nèi)核及親水性的外殼所組成的球形聚合物膠束，在藥物載體系統(tǒng)中有著重要的應(yīng)用。在用于藥物載體系統(tǒng)的核-殼型聚合物膠束中，疏水性的內(nèi)核可以作為一個納米容器用來裝載疏水性的藥物，而親水性的外殼則起到有效的空間保護(hù)防止膠束間的聚集，另外還可能對親水外殼進(jìn)行修飾增加靶向或其它功能基團(tuán)。與傳統(tǒng)的表面活性劑形成的膠束相比較，聚合物膠束具有高得多的熱力學(xué)穩(wěn)定性。聚合物膠束的低臨界膠束濃度(CMC)比傳統(tǒng)的表面活性劑膠(10—3-10—4mol/L)束低大約1000倍。同樣的，聚合物膠束還有許多的優(yōu)點(diǎn)如制備方法簡便易行；無須對裝載藥物進(jìn)行修飾即可獲得較高的包封率；在體內(nèi)慢性積累的風(fēng)險較小以及易于實(shí)現(xiàn)對藥物釋放行為的控制等。與粒子尺寸較大的其它藥物載體相比較，由于聚合物膠束在水溶液中的尺寸較小(〈200nm)，不但可以減小網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬系統(tǒng)(RES)對其的非特異性吸收，還可以利用非選擇性滯留效應(yīng)(EPReffect),從而實(shí)現(xiàn)對抗癌藥物的選擇性傳遞作用。如上所述，目前，聚合物膠束被認(rèn)為是極有前景的藥物傳遞系統(tǒng)(DDSs)之一。藥物載體的主要目的是為了能夠控制和調(diào)節(jié)藥物在體內(nèi)的分布。由于在不同組織或器官的許多病理區(qū)域(如發(fā)炎，腫瘤和外傷等)都會表現(xiàn)出區(qū)域的溫度升高(2-5°C)或者是pH下降(l-2.5個pH單位)，并且在實(shí)體腫瘤區(qū)域進(jìn)行定位加熱的技術(shù)己有應(yīng)用，刺激響應(yīng)(如溫度或環(huán)境pH等)激發(fā)的藥物載體的應(yīng)用將會是增強(qiáng)病理區(qū)域藥物活性的有效途徑。通過化學(xué)設(shè)計可以很容易地制備刺激敏感的聚合物膠束。通常，這一類聚合物是由溫度或pH敏感的鏈段所構(gòu)成，如聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸(PMAA)、聚甲基丙烯酸二甲基胺基乙酯(PDMAEMA)以及它們的共聚物等。在過去的幾年中，研究者都對基于PNIPAAm的溫度響應(yīng)聚合物膠束進(jìn)行了研究。Yokoyama等報道了由溫度響應(yīng)的Poly(NIPAAm-c^DMMm)鏈段作為親水嵌段，生物可降解的聚乳酸(poly(D，L-lactide))，聚己內(nèi)酯(poly(f-caprolactone))或者乳酸與己內(nèi)酯的共聚物(poly(D，L-lactide-f-caprolactone))作為疏水鏈段的共聚物膠束。這些共聚物膠束能夠裝載抗癌藥阿霉素(doxorubicin),并表現(xiàn)出了溫度響應(yīng)的藥物釋放行為。同樣的，基于PNIPAAm的兩親嵌段聚合物PSt-^PNIPAAm和PBMA-^PNIPAAm的合成也有文獻(xiàn)報道。這一類共聚物膠束在水溶液中，對應(yīng)于重復(fù)的溫度變化顯示出了可逆的分散/聚集行為。研究者希望這些共聚物膠束不但能夠利用EPR效應(yīng)在體內(nèi)顯示空間的選擇性，而且能夠通過定位加熱的方法增強(qiáng)聚合物膠束在靶向區(qū)域的保持能力。Yang等合成了不同組成的poly(NIPMm-^H)MAAm)-Zr"poly(D，L-lactide-c^glycolide)嵌段共聚物，并研究了共聚物膠束的溫度敏感性及其對阿霉素的釋放行為。Zhang等報道了數(shù)種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的基于PNIPAAm的自組裝聚合物膠束，包括一種星型的嵌段共聚物[27]和"Y"型的共聚物。由于它們具有獨(dú)特的膠束結(jié)構(gòu)，這些聚合物都顯示出了較高的藥物包封率以及獨(dú)特的溫度響應(yīng)藥物釋放行為。他們的研究也表明，通過選擇合適的共聚物結(jié)構(gòu)能夠有效的控制相應(yīng)的藥物運(yùn)載體系的藥物釋放動力學(xué)特性，如藥物的包封效率和藥物的釋放速率等。另一方面，基于PEG和甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸丙酯或者丙烯酸丁酯的pH敏感嵌段共聚物的聚合物膠束也已用于對藥物candesartancilexetil(CDN)的裝載和控制釋放。Leroux的小組報道了這些共聚物能夠自組裝形成膠束，并且顯示出對CDN的高載藥率和pH依賴型的藥物釋放模式。Yang的工作小組報道了基于兩嵌段共聚物poly(2-ethy1-2-oxazoline)-Z^poly(L-lactide)的共聚物膠束。他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在通常的生理?xiàng)l件下(pH7.4)聚合物膠束的結(jié)構(gòu)能夠保持疏水藥物D0X，當(dāng)聚合物膠束感受到類似于細(xì)胞內(nèi)的pH變化(內(nèi)涵體和溶酶體中約為pH45)時，能夠選擇性的釋放D0X。Bae的研究小組開發(fā)了一種pH敏感的腫瘤定位聚合物膠束，該膠束由共聚物poly(L-lacticacid)+poly(ethyleneglycol)+poly(X-histidine)自組裝形成。他們推斷該聚合物膠束在水溶液中能夠形成以PLA和polyHis鏈段為疏水內(nèi)核，以PEG鏈段為外殼的"花"狀(flower-like)膠束。聚合物膠束的pH敏感性來源于當(dāng)環(huán)境輕微酸化，polyHis鏈段發(fā)生離子化，所引起的膠束的疏水內(nèi)核的解離。這一機(jī)理就為聚合物膠束經(jīng)歷微小的pH變化(pH7.2-6.5)而觸發(fā)聚合物膠束釋放裝載藥物提供了可能性。近來，為了提高藥物載體的靶向定位能力和治療效率，人們制備了許多具有雙刺激響應(yīng)的藥物載體。人們合成了一種膽固醇接枝的共聚物poly(NIPAAm-c^DMAAm-ctHJA)，并且用于包封水溶性極差的抗癌藥物，紫杉醇(paclitaxel)?；谠撃懝檀冀又酆衔锏妮d藥膠束顯示出了一種極為有用的pH相關(guān)的溫度響應(yīng)特性，而且在pH5.0的環(huán)境下其藥物釋放速率顯著高于在pH7.4的環(huán)境下，有利于抗癌藥物在腫瘤區(qū)域的定位釋放。Zhang的研究小組開發(fā)了基于十一烯酸和NIPAAni的溫度、pH雙響應(yīng)共聚物poly(UA_/^NIPAAm)，并作為藥物載體對疏水藥物強(qiáng)的松(prednisoneacetate)進(jìn)行包封。該藥物載體系統(tǒng)表現(xiàn)出了顯著的溫度響應(yīng)的控制釋放行為和獨(dú)特的pH響應(yīng)藥物釋放行為。Jiang的研究小組報道了一種基于共聚物P(NIPMm-co-AA)-b-PCL的納米自組裝粒子。該粒子表現(xiàn)出了對溫度和pH敏感的雙響應(yīng)特性，并且其響應(yīng)溫度和pH變化的范圍非常適合應(yīng)用于靶向抗癌藥物的載體系統(tǒng)。然而，我們注意到，大多都是使用了含有羰基的單體(M，MAorUA)作為pH敏感基團(tuán)，通常都在pH低于7.4的環(huán)境中，表現(xiàn)出更高的藥物釋放速率，而應(yīng)用于腫瘤的靶向定位。為了能夠拓展雙響應(yīng)的藥物載體在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用范圍，開發(fā)能夠?qū)哂胁煌h(huán)境的其它病理區(qū)域進(jìn)行耙向定位的，新型的雙響應(yīng)藥物載體，也顯得十分重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的，在于提供一種星型共聚物自組裝納米膠束的制備方法，能在水溶液中能夠形成納米聚合物膠束。本發(fā)明一種星形共聚物自組裝納米膠束的制備方法，包括如下步驟a.制備端基為羧基的聚甲基丙烯酸甲酯以巰基丙酸為鏈轉(zhuǎn)移劑，將單體甲基丙烯酸甲酯用引發(fā)劑偶氮二異丁腈在有機(jī)溶劑中，一定溫度下，進(jìn)行自由基聚合反應(yīng)；b.制備三臂聚合物tri-armP(NIPAAm-co-DMAEMA):以鈰-醇組成的氧化還原體系為弓I發(fā)劑，將單體,異丙基丙烯酰胺和f二甲基胺乙基甲基丙烯酸甲酯進(jìn)行自由基共聚合；c.制備星形共聚物將以上制備的兩種聚合物在溶劑中加入f羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺，反應(yīng)一定時間，產(chǎn)物在乙醚中沉淀，過濾后真空干燥至恒重；d.將上述制得的星形兩親共聚物溶于透析袋中，置入蒸餾水中進(jìn)行透析，得到共聚物膠束。上述的星形共聚物自組裝納米膠束的制備方法，步驟a所述的溫度為50"C-80'C之間，反應(yīng)時間為5小時-48小時，所述有機(jī)溶劑是二氧六環(huán)，甲酰胺，二氯甲烷，苯，甲苯任一種。上述的星形共聚物自組裝納米膠束的制備方法，步驟b中，所述的引發(fā)體系是由三羥甲基甲胺和硝酸鈰組成，它們的質(zhì)量比為1:5-1:100之間，引發(fā)體系與聚合單體的質(zhì)量比控制在1:100-1:10000之間，反應(yīng)溫度為2-12小時，反應(yīng)溫度為5(TC-8(TC之間。上述的星形共聚物自組裝納米膠束的制備方法，步驟c中，所述有機(jī)溶劑是二氧六環(huán)、甲酰胺、二氯甲垸、三氯甲烷、苯、甲苯任一種，反應(yīng)時間為10-72小時，溫度控制在0°C-8(TC之間。本發(fā)明采用了一種簡便的合成方法，制備了一種新型的星形的兩親共聚物，并且在水溶液中能夠形成納米聚合物膠束。該星形共聚物由一根短的疏水聚甲基丙烯酸(PMAA)PMMA鏈段和三根親水的共聚物poly\\Poly(NIPAAm-ccH)MAE區(qū))鏈段構(gòu)成。在親水的鏈段中，NIPAAm和DMAEMA分別作為聚合物的溫度敏感和pH敏感基團(tuán)。如圖1所示，星形聚合物在水溶液中能夠自組裝形成膠束，并且能夠響應(yīng)溫度和pH的變化。在不同的pH條件下，聚合物的低臨界溶液溫度(LCST)和自組裝膠束的尺寸都發(fā)生變化。因而，溫度和pH都能夠?qū)酆衔锬z束的結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控。作為一種有效的刺激敏感型藥物傳遞系統(tǒng)，該聚合物納米粒子對疏水藥物甲蝶呤(MTX)表現(xiàn)出了溫度和pH響應(yīng)的藥物釋放行為。更為重要的是，加速的藥物釋放行為可以很容易的通過溫度或pH的調(diào)控來達(dá)到。因此，該星型聚合物膠束做為一種藥物載體，能夠通過利用外部的或體內(nèi)固有的環(huán)境的變化而達(dá)到在病理區(qū)域的藥物耙向釋放，提高藥物治療效率。本發(fā)明合成了由親水的三臂tri-armP(NIPAAm-ctH)區(qū)EMA)鏈段與疏水的P麗A鏈段所組成的新型兩親星形嵌段共聚物。在水溶液中，該星形共聚物能夠自組裝形成具有核殼結(jié)構(gòu)的納米膠束粒子。由于親水鏈段中PDMAEMA鏈段在不同pH條件下的離子化與去離子化作用，共聚物膠束在不同的pH條件下表現(xiàn)出不同的LCST。當(dāng)環(huán)境的pH分別為5，7.4和9時，共聚物膠束相應(yīng)的LCST分別為32°C，36.6°Cand39.5°C，而且共聚物膠束的粒徑也隨著pH的變化而發(fā)生微小變化。由于親水鏈段具有的溫度和pH雙響應(yīng)特性，載藥的自組裝共聚物膠束也顯示出了溫度和pH雙重響應(yīng)的藥物釋放行為。在體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)中，載藥共聚物膠束在pH7.4的條件下表現(xiàn)出溫度觸發(fā)的藥物釋放速率加速現(xiàn)象，并且在37r的條件下表現(xiàn)出pH除法的藥物釋放速率加速現(xiàn)象。因此，我們合成的新型共聚物納米膠束粒子是一種具有極大潛在應(yīng)用價值的智能藥物傳遞載體，它能夠通過環(huán)境溫度或pH的微小改變，實(shí)現(xiàn)在目標(biāo)病理區(qū)域的藥物釋放和積累，以提高藥物的治療效率，減小副作用。下面過一步對本發(fā)明共聚物膠束的形成作一描述，作為在水中溶解度很小的藥物的載體，疏水的內(nèi)核是其裝載藥物的必要條件。另外，載體具有親水的表面也是其具有長的血液循環(huán)時間的保證。因此，我們希望合成的聚合物膠束能夠在水溶液中具有疏水核/親水殼的結(jié)構(gòu)。對于我們合成的星形兩親嵌段共聚物，通過比較其分別在CDC13和D20溶劑，就可以確定是否能在水溶液中形成具有疏水核/親水殼結(jié)構(gòu)的聚合物膠束。圖3和圖4是共聚物分別在CDC13和D20溶劑中的1H麗R圖譜，以及共振峰的歸屬。我們發(fā)現(xiàn)，在CDC13溶劑的圖譜中如圖3，出現(xiàn)了共聚物中所有組成鏈段的共振峰，然而，在D20溶劑的圖譜如圖4中，只出現(xiàn)了PNIPAAm和PDMAEMA鏈段的共振峰，沒有檢測到PMMA鏈段的共振峰。這表明，在水溶液中，共聚物自己紅疏水的PMMA鏈段被親水的鏈段所包裹，形成了具有疏水核/親水殼結(jié)構(gòu)的共聚物膠束。本發(fā)明低臨界膠束濃度(CMC)的確定方法如下CMC是研究膠束形成，以及評價膠束穩(wěn)定性的重要參數(shù)之一。通常而言，在兩親共聚物中，疏水鏈段比例的增加會導(dǎo)致共聚物的CMC降低，也意味著熱力學(xué)穩(wěn)定性有所增加。因而，通常我們希望兩親聚合物能夠具有比較低的CMC。在本章中，我們選擇芘作為外源的熒光探針。共聚物的CMC由芘在水相中以及在膠束疏水核中分配的比例所引起的熒光發(fā)射或激發(fā)光譜變化來確定。圖3-4是在不同的pH環(huán)境中，共聚物濃度的對數(shù)(lgc)對聚合物溶液中芘發(fā)射光譜中的強(qiáng)度比值I391/I374所做的曲線圖。隨著聚合物濃度的增大，比值也在增大。這是由于由于聚合物形成了膠束，更多的芘分子進(jìn)入了疏水的內(nèi)核環(huán)境中。該曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)兩側(cè)的切線交叉點(diǎn)即確定為共聚物的CMC值。從圖5中我們可以看到在不同pH條件下熒光發(fā)射光譜中1391/1374對logC的曲線圖。入ex二342皿，[pyrene]=6X10-7M.共聚物在不同的pH環(huán)境中，CMC值有一定的變化。當(dāng)聚合物的溶液pH分別為5，7.4，和9時，所對應(yīng)的CMC分別為7.5mg/L，8.7mg/L和11.2mg/L。顯然，星形共聚物在不同的pH條件下的CMC值都比較小，表明在pH從5至9的范圍內(nèi)，其都能夠在水溶液中形成穩(wěn)定的自組裝聚合物膠束。由于具有比較低的CMC值，該共聚物膠束可望在極稀的水溶液中，如人體體液環(huán)境，作為藥物載體而應(yīng)用。同時，我們也注意到，該共聚物膠束的CMC值表現(xiàn)出了顯著的pH相關(guān)性。這是由于在不同的pH條件下，共聚物的親水鏈段中DMAEMA基團(tuán)發(fā)生了質(zhì)子化或去質(zhì)子化，改變了親水鏈段的親水-疏水性質(zhì)，從而影響了共聚物的CMC，表現(xiàn)出了CMC的pH相關(guān)特性。本發(fā)明溫度和pH敏感的共聚物膠束結(jié)構(gòu)變化如下PNIPAAm是一種人們熟知的具有低臨界溶液溫度(LCST)的聚合物，其相變溫度大約為32°C。低于此溫度，PNIPAAm是水溶性聚合物，聚合物分子鏈以伸展鏈的形態(tài)存在。高于此溫度，PNIPAAm經(jīng)歷一個可逆的相轉(zhuǎn)變，從水溶性聚合物轉(zhuǎn)變?yōu)樗蝗艿木奂w。另外，通過NIPAAm單體與不同比例的其它親水或疏水單體進(jìn)行共聚合，可以很容易地在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)PNIPAAm的LCST值。由于具有大量的叔胺基團(tuán)，PDMAEMA在水溶液中表現(xiàn)為一種pH敏感的聚合物。在不同的pH條件下，PDMAEMA可以表現(xiàn)出離子化或去離子化的狀態(tài)。因此，PDMAEMA的水溶性是與溶液的pH相關(guān)的。在酸性的環(huán)境中，PDMAEMA離子化，帶有正電荷，表現(xiàn)出極強(qiáng)的水溶性。在堿性環(huán)境中，PDMAEMA去離子化，電荷減小，成為水不溶聚合物。我們不僅關(guān)注共聚物膠束在不同溫度下結(jié)構(gòu)的變化，同時也關(guān)注不同pH環(huán)境中，溫度敏感特性的改變。如我們所預(yù)料，圖6給出了不同pH條件下共聚物的LCST值，圖6在不同pH條件下共聚物水溶液透過率隨溫度的變化曲線，表明隨著溫度的升高，共聚物膠束的親水鏈結(jié)構(gòu)由伸展的親水鏈轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s的疏水聚集體。隨著溫度的變化，親水外殼鏈結(jié)構(gòu)的改變也破壞了穩(wěn)定的聚合物膠束。更為重要的是，我們注意到聚合物膠束顯示出了pH相關(guān)的溫度響應(yīng)特性。對應(yīng)于pH5,pH7.4和pH9，測得的共聚物L(fēng)CST值分別為32°C，36.6°C和39.5°C。為了解釋所共聚物表現(xiàn)出的溫度、pH雙敏感特性，我們可以將星形共聚物中的PDMAEMA鏈段分為兩個部分一部分是由去離子化的DMAEMA單體所組成的疏水鏈段，而另一部分則是由離子化的DMAEMA單體所組成的親水鏈段。顯然，這兩部分的比例是可以通過pH的變化而進(jìn)行調(diào)節(jié)的。因此，在tri-armP(NIPMm-co-DMAEMA)鏈段中，親水/疏水鏈段的比例隨著pH的變化而變化，從而影響了共聚物的LCST值pH升高，疏水鏈段比例增加，LCST下降，反之亦然。作為藥物的載體，共聚物膠束的結(jié)構(gòu)響應(yīng)溫度、pH的變化而發(fā)生轉(zhuǎn)變，必然會引起其對藥物的釋放行為的變化，這將在以下部分予以討論。本發(fā)明納米膠束粒子的形態(tài)及其尺寸的PH相關(guān)性如下在選擇性的溶劑中，兩親嵌段共聚物能夠自組裝形成多種形態(tài)的聚集體，如球形，棒狀，囊泡，薄層狀，管狀等。眾所周知，直徑小于200nm的球形膠束粒子是抗腫瘤藥物藥物載體的最佳選擇]。這是由于其能夠充分利用選擇性滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))在腫瘤區(qū)域積聚，并且能夠避免網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬系統(tǒng)的去除作用。圖3-6是在pH7.4條件下，空的聚合物膠束(圖7)以及載藥聚合物膠束(圖7)的電鏡圖片。圖片顯示，無論是聚合物膠束還是載藥后的膠束，都能夠在水溶液中分散成為孤立的具有球形的納米膠束粒子。并且我們注意到，載藥后的膠束粒子(80-120nm)較空的膠束粒子(60-100nm)大一些，這表明共聚物膠束載藥后，膠束的尺寸略有增大。此外，粒子納米粒子尺寸的測定結(jié)果(圖8)表明，聚合物膠束的粒徑不僅是載藥后有微小的增加，而且隨著溶液pH的變化，膠束的粒徑也有微小的變化。在pH5的條件下，聚合物膠束粒子的直徑約為113nm，隨著pH升高至9,聚合物膠束的粒徑減小至約85nm，載藥后的聚合物膠束也具有相似的變化規(guī)律。這種聚合物膠束粒徑隨著pH變化而發(fā)生變化的也是由于在不同的pH環(huán)境中，PDMAEMA鏈段中的叔胺基(pKa-7.4)的離子化程度不同所造成的。在較低的pH條件下，PDMAEMA鏈段的離子化程度較高，帶有較多的正電荷，因此，聚合物膠束的親水殼顯示出了較強(qiáng)的靜電排斥作用，伸展了外殼的親水鏈段，導(dǎo)致了較大的共聚物膠束尺寸。然而，在較高的pH條件下，PDMAEMA鏈段去離子化，帶有的正電荷減小，親水外殼收縮，導(dǎo)致了共聚物膠束粒子的減小。本發(fā)明溫度和pH響應(yīng)的體外藥物釋放行為如下智能型的藥物載體在體內(nèi)穩(wěn)定循環(huán)時，盡可能不釋放所載藥物，而當(dāng)經(jīng)歷外界刺激，如溫度或pH的變化時，則能夠在病理區(qū)域加速藥物的釋放速率。從在實(shí)驗(yàn)部分可以看出，共聚物膠束的藥物包封率(encapsulationefficiency,EE)為31.5%，表明在使用的模型藥物MTX(8.0mg)中大約有31.5%(2.45mg)進(jìn)入了聚合物膠束的疏水核。較傳統(tǒng)的聚合物膠束而言，該共聚物膠束顯示出了更高的載藥能力，這可能是由于形成膠束的共聚物具有了特殊的星形結(jié)構(gòu)[39，40],增強(qiáng)了疏水內(nèi)核與藥物的相互作用能力。圖9是載藥共聚物膠束在pH7.4的環(huán)境中，分別在25'C，低于低臨界溶液溫度(LCST)和40°C(高于LCST)時的累積藥物釋放曲線圖。當(dāng)藥物釋放環(huán)境溫度低于共聚物的LCST(36.6°C，pH7.4)時，共聚物以穩(wěn)定的核殼型膠束的形式存在，藥物被包封在疏水的內(nèi)核中，因此藥物釋放速率較小。當(dāng)溫度高于共聚物的LCST時，聚合物膠束的外殼從伸展的親水鏈變?yōu)槭湛s的疏水鏈，共聚物膠束的穩(wěn)定核殼結(jié)構(gòu)被破壞，藥物釋放速率加快?；诖朔N在近似生理環(huán)境下的溫度觸發(fā)的藥物釋放行為，該共聚物納米膠束粒子將會是一種非常有前景的定位藥物載體。它可以利用區(qū)域加熱技術(shù)或病理區(qū)域固有的溫度升高來實(shí)現(xiàn)藥物釋放的觸發(fā)。從圖10中，我們可以觀察到，在給定的pH條件下，在25°C，MTX從共聚物膠束粒子中的釋放速率和累計釋放量(低于35%)都是比較低的。此外，我們還可以注意到，盡管在不同的pH條件下，總的累計藥物釋放量基本上相同，但是在藥物釋放的初始階段，當(dāng)pH為5時的藥物釋放速率要較pH為7.4和9時略高一些。在這個實(shí)驗(yàn)中，釋放溫度為25T:，低于給定pH條件下的共聚物L(fēng)CST值。因此，在整個藥物釋放過程中，共聚物膠束粒子都是保持著穩(wěn)定的核-殼結(jié)構(gòu)，在不同的pH條件下，沒有表現(xiàn)出pH響應(yīng)的特性。在不同的PH條件下，載藥共聚物膠束粒子的初始藥物釋放速率的不同，表明在較高的pH條件下，膠束粒子外殼親水鏈段的收縮也有可能會阻礙疏水核中的藥物向釋放介質(zhì)的擴(kuò)散，從而減小了藥物釋放速率，但是對總的藥物釋放量卻基本上沒有影響。釋放溫度保持37'C不變，不同的pH條件下載藥共聚物膠束表現(xiàn)出顯著不同的藥物釋放行為如圖11，表現(xiàn)出了顯著的pH響應(yīng)藥物釋放特性。當(dāng)pH=5時，藥物的釋放速率較小，且累計藥物釋放量小于35%。而當(dāng)pH=7.4或9時，藥物釋放速率顯著加大，釋放時間為40h時，累計藥物釋放量已經(jīng)達(dá)到70-80%。在不同pH條件下的不同藥物釋放行為可以由不同pH條件下，共聚物的LCST的差異來進(jìn)行解釋。在pH=5時，共聚物的LCST確定為約39.5°C，高于實(shí)驗(yàn)的釋放溫度，此時，載藥共聚物膠束是在低于共聚物的LCST的溫度下進(jìn)行釋放，共聚物膠束呈穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu)，因此釋放速率較小，累計釋放量也較低。當(dāng)pH改變?yōu)?.4和9時，共聚物的LCST分別為36.6°C和32°C，低于實(shí)驗(yàn)的釋放溫度，此時，載藥共聚物膠束是在高于共聚物的LCST的溫度下進(jìn)行釋放，共聚物的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被破壞，共聚物膠束轉(zhuǎn)變成為沉淀，包封藥物的能力下降，因此藥物進(jìn)入釋放介質(zhì)的速率較大，累計釋放量也較高?；谠摴簿畚锬z束在正常生理溫度條件下的PH響應(yīng)藥物釋放特性，該新型納米膠束粒子可望成為一種具有巨大潛在應(yīng)用價值的口服藥物載體。它將能夠在酸性的pH條件下(如在胃部環(huán)境中)保持所裝載的藥物，而在接近正常生理pH的條件下(如在腸內(nèi)環(huán)境中)加速釋放所裝載的藥物。此外，為了進(jìn)一步地確認(rèn)載藥共聚物膠束的溫度、pH雙響應(yīng)藥物釋放行為，我們考察了在藥物釋放過程中改變釋放介質(zhì)的溫度或pH時，藥物釋放行為的變化。圖12顯示了在pH7.4的條件下，溫度觸發(fā)的藥物加速釋放行為。這是由于溫度升高，載藥共聚物膠束由穩(wěn)定的核殼型膠束(25°C)轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗芫奂w(37°C)的緣故。與此相似，圖13顯示了在37"C的條件下，pH觸發(fā)的藥物加速釋放行為。結(jié)果表明，在接近人體生理環(huán)境的載藥共聚物膠束釋放藥物過程中，溫度或pH的改變都會引起藥物釋放行為的變化。因此，我們認(rèn)為這種具有溫度和pH雙重響應(yīng)的納米共聚物粒子能夠作為溫度和pH觸發(fā)的定位藥物載體，它將能夠通過目標(biāo)區(qū)域的溫度或PH的變化，增強(qiáng)藥物在靶向病理區(qū)域的積累從而提高藥物的治療效率。圖1為星型共聚物自組裝及其響應(yīng)溫度和pH的結(jié)構(gòu)變化的示意圖圖2為星型共聚物的合成路線圖3為(a)三臂P(NIPAAm-ccH)MAEMA)共聚物在CDC13中以及(b)星型共聚物在CDC13中的W麗R譜圖圖4為星型共聚物在D20中的^NMR譜圖圖5為在不同pH條件下熒光發(fā)射光譜中/391//374對logC的曲線圖。圖6為在不同pH條件下共聚物水溶液透過率隨溫度的變化曲線圖7為透射電鏡圖(a)空的納米膠束粒子(b)載藥后的納米膠束粒子圖8為在不同pH條件下，膠束粒子的粒徑變化圖圖9為在pH7.4的PBS緩沖溶液中溫度敏感的藥物釋放曲線圖10為在25"C下的pH敏感藥物釋放曲線圖ll為在37'C下pH敏感的藥物釋放曲線圖12為在pH7.4條件下的溫度觸發(fā)藥物加速釋放圖以及圖13為在37"C下pH觸發(fā)的藥物加速釋放曲線圖。具體實(shí)施例本發(fā)明具體實(shí)施例用的二甲基胺乙基甲基丙烯酸甲酯(DMAEMA，98%)購于Arcos公司，使用前經(jīng)減壓蒸餾提純。l異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)購于Arcos公司，使用前經(jīng)甲苯/正己烷重結(jié)晶提純。三羥甲基甲胺和硝酸鈰銨(IV)是上?；瘜W(xué)試劑廠產(chǎn)品，未經(jīng)處理直接使用。3-巰基丙酸(MPA)，f羥基琥珀酰亞胺(麗S)和dicylohexyl-carbodiimide(DCC)均為Acros公司產(chǎn)品，未經(jīng)處理直接使用。偶氮二異丁腈(AIBN)購于上海化學(xué)廠，使用前經(jīng)甲醇重結(jié)晶提純。二氧六環(huán)和二甲基甲酰胺為上?；瘜W(xué)試劑廠產(chǎn)品，使用前按照標(biāo)準(zhǔn)方法處理。溴化-3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四唑(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品。Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)由中國典型物保藏中心(CCTCC)提供。改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(MEM)和磷酸緩沖溶液(PBS)購于Gibco公司。其余試劑和溶液均為市售，未經(jīng)處理直接使用。本發(fā)明具體實(shí)施例由以下步驟完成1、半遙爪聚合物PMMA-COOH的制備通過以MPA為鏈轉(zhuǎn)移劑的自由基聚合制備了末端為羧基的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA-COOH)。將MMA(9X10_2mol)，MPA(2.2X10_3mol))以及AIBN(4.5X10—4mol)溶于40mLDMF中。溶液通入氮?dú)夤呐莩?0min(工藝參數(shù)請給一個數(shù)值區(qū)間，以擴(kuò)大專利保護(hù)范圍，后面涉及的也要這樣處理)。體系升溫至60°C，攪拌聚合8h。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液傾入水中，析出白色沉淀，水洗過濾。將得到的白色固體溶于DMF中，再在水中沉淀，反復(fù)三次，產(chǎn)品真空干燥至恒重。2、三臂聚合物tri-armP(NIPAAm-co-DMAEMA)的制備單體NIPAAm和DMAEMA的共聚合反應(yīng)，以鈰-醇組成的氧化還原體系為引發(fā)劑，在具有攪拌裝置、回流冷凝管和氮?dú)獗Ｗo(hù)裝置的三口燒瓶中進(jìn)行。將NIPAAm3.4g(3X10—2mol),DMAEMA0.94g(6X10—3mol)，以及三羥甲基甲胺O.18g(1.5X10—3mol)和70%硝酸溶液1mL溶解于70mL去離子水中，然后將混合溶液通入氮?dú)饬鞒?0miri。加熱至55°C，攪拌，保溫lh(要用規(guī)范的用詞，H改為小時)。用注射器加入溶有3.278g(6X10—3mol)硝酸鈰銨(IV)的0.5M硝酸溶液3mL引發(fā)聚合反應(yīng)。在氮?dú)饬鞯谋Ｗo(hù)下，保溫攪拌反應(yīng)8小時，然后冷卻至室溫。反應(yīng)液移入透析袋(截留分子量為8,000-10,000g/mol，上?；瘜W(xué)試劑公司)中，浸入蒸餾水中透析4天，以除去未反應(yīng)的單體，冷凍干燥得到產(chǎn)品。3、星形兩親共聚物的制備將以上制備的tri-armP(NIPAAm-co-DMAEMA)共聚物1.0g,PMMA-COOH0.5g，以及N-羥基琥珀酰亞胺(麗S)6.0X10—4mol溶于10mL二氧六環(huán)中。在氮?dú)獗Ｗo(hù)及攪拌下下，往上述溶液中逐滴加入含有DCC(6.OX10—4mol)的二氧六環(huán)5mL。滴加完畢后，室溫下攪拌反應(yīng)48h。產(chǎn)物在大量的乙醚中沉淀以除去未參加反應(yīng)的PMMA-C00H。產(chǎn)物在真空中干燥至恒重。4、星形兩親共聚物膠束的形成本章采用透析法制備共聚物膠束。具體方法如下將星形兩親共聚物2mg溶于透析袋(截留分子量8000-10,000g/mo1，上?；瘜W(xué)試劑公司)中，置入500mL蒸餾水中進(jìn)行透析48小時，冷凍干燥，得到共聚物膠束。上述本發(fā)明實(shí)施例聚合物分子量的測定所得聚合物分子量(數(shù)均分子量處及重均分子量必)的測定使用配備有Waters2690D分離模塊及Waters2410折光率檢測器的凝膠滲透色譜(GPC)進(jìn)行。DMF為洗脫液，流速0.3mL/min。以窄分子量分布的聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)，Watersmillenniummodule軟件用于計算分子量。本發(fā)明HNMR的測定H麗R譜圖用VarianVX-300Mercury(300MHz)核磁共振儀測定(內(nèi)標(biāo)為TMS，溶劑分別為CDCl3和D20)。上述實(shí)施例光學(xué)透過率測定不同pH條件下的星形共聚物濃度為4mg/mL的磷酸緩沖溶液(0.1M)的光學(xué)透過率測定使用配有循環(huán)水浴夾套的UV-8500紫外光譜儀(中國)測定。測定波長為500nm，升溫速率為0.5°C/min。聚合物溶液的LCST確定為光學(xué)透過率為50%所對應(yīng)的溫度。上述實(shí)施例透射電鏡的觀察為了觀察聚合物膠束在溶液中的尺寸和形態(tài)，試樣制備如下一滴共聚物的水溶液置于覆有聚乙烯醇縮甲醛膜的銅網(wǎng)上，在室溫(低于聚合物的LCST)下干燥。用JEM-IOOCXII透射電鏡(日本)進(jìn)行觀察，加速電壓80kV。上述實(shí)施例共聚物膠束粒子直徑的測定共聚物膠束粒子直徑的測定使用MalvernZetasizerZs90(英國，Malvern)進(jìn)行。測定時，溫度為25"C，低于共聚物的LCST值，溶液為含有0.01MNaCl的不同pH的磷酸緩沖溶液(0.1M)。本發(fā)明上述實(shí)施例共聚物水溶液熒光的測定同我們以前的工作所描述的一致，靜態(tài)熒光光譜用ShimadzuRF-5301PC熒光光譜儀(日本)測定。芘作為疏水熒光探針。lmL芘的丙酮溶液(6X10-6M)置入試管中，將丙酮在空氣中自然蒸發(fā)除去。一系列不同濃度的，10mL的聚合物水溶液分別加入上述含有殘存芘的試管中。所有的待測聚合物溶液試樣中具有相同的芘濃度(6X10—7M)。聚合物溶液在室溫下靜置24小時，以使芘在溶液中的溶解達(dá)到平衡。激發(fā)波長為340mn，發(fā)射光譜記錄350至600nm范圍。激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5nm。在芘的發(fā)射光譜中，第三發(fā)射帶(391nm，/3)與第一發(fā)射帶(374nm，的發(fā)射強(qiáng)度(發(fā)射峰高度)之比(A/ii)對聚合物的濃度作圖。該曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)兩側(cè)的切線交叉點(diǎn)即確定為聚合物的CMC值。本發(fā)明上述實(shí)施例藥物的裝載將8mg星形共聚物和8mg氨甲蝶呤(MTX)溶于4mL二甲酰胺中。溶液移入透析袋中(上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，截留分子量8000-10,000g/mo1)，在1000mL蒸餾水中透析24小時。為了測定聚合物的載藥量，將載藥聚合物溶液過濾，除去不溶物，然后冷凍干燥，得到載藥聚合物粉末。將一定重量的載藥聚合物粉末溶于二甲酰胺中，用紫外光譜標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測定藥物的量，吸收波長371nm。氨甲蝶呤/二甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線由實(shí)驗(yàn)獲得。實(shí)驗(yàn)測得，該共聚物的載藥率約為31.5wt.%。本發(fā)明上述實(shí)施例體外藥物釋放行為的測定通過透析裝載藥物后，將透析袋直接浸入400mL具有不同pH或溫度的釋放介質(zhì)中，攪拌。每隔一定時間，從蒸餾水中移取3mL溶液，測定藥物濃度。每次取完樣后，補(bǔ)加3mL的釋放介質(zhì)，以保持溶液體積恒定。從聚合物膠束中釋放出的藥物濃度用紫外吸收光譜法測定，吸收波長371nm。本發(fā)明上述實(shí)施例兩親星形共聚物的合成及結(jié)構(gòu)星形嵌段共聚物是由末端為羧基的P醒A鏈段與三臂的tri-armP(NIPAAm-c^DMAEMA)聚合物鏈段偶合而制備的。共聚物的合成路線如圖2所不。第一步是采用自由基聚合，以MPA為鏈轉(zhuǎn)移劑合成了以羧基封端的P畫A，作為目標(biāo)聚合物的疏水嵌段。第二步是合成多臂的親水鏈段tri-armP(NIPAAm-c^DMAEMA)。高價的鈰鹽與還原試劑，如醇、醛、酮等共同組成的引發(fā)體系，引發(fā)乙烯基單體的聚合反應(yīng)已有文獻(xiàn)報道。本章中，NIPAAm和DMAEMA的共聚合由硝酸鈰銨與三羥甲基甲胺組成的氧化還原體系引發(fā)。在三羥甲基甲胺分子中，與羥基相連的碳原子在鈰(IV)的作用下生成自由基，從而引發(fā)聚合單體的聚合。如式3-l所示，在Ce+4的氧化作用下，三羥甲基甲胺中的-CH20H基團(tuán)產(chǎn)生了自由基。在聚合中，形成的自由基從-CH20H基團(tuán)向NIPAAm和DMAEMA單體轉(zhuǎn)移，從而實(shí)現(xiàn)了聚合鏈的增長。由于在一個三羥甲基甲胺分子中有三個_CH20H基團(tuán)，能夠形成三個引發(fā)自由基，因此，得到了具有三臂的NIPAAm與DMAEMA的共聚物。最后，在NHS與DCC的作用下，末端為羧基的PMMA鏈段與親水的三臂tri-armP(NIPAAm-ccH)MAEMA)共聚物進(jìn)行偶合，得到了兩親的星形嵌段共聚物。各個步驟中得到的聚合物的及目標(biāo)聚合物的分子量及分子量分布結(jié)果如表3-l所示。聚合物的分子量結(jié)果表明，在第三步合成中，星形聚合物的分子量的增加與PMMA-COOH的分子量相當(dāng)，證明了兩個相應(yīng)鏈段之間的偶合。表1PMMA，tri-armsP(NIPPAm-co-DMAEMA)和星形共聚物的分子量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>此外，由D和星形嵌段共聚物在CCl3D中的'H麗R圖3可見，星形嵌段共聚物的^麗R不但顯示出了PNIPAAm、PDMAEMA的特征峰，還出現(xiàn)了明顯的PMMA的特征峰，而未參加反應(yīng)的PMMA-C00H已通過在乙醚中沉淀而除去，因而證實(shí)了該共聚物是由PMMA鏈段和NIPAAm、DMAEMA共聚鏈段偶合構(gòu)成。基于共聚物的麗R圖，tri-armP(NIPAAm-c^DMAE區(qū))的共聚物組成可以通過歸屬于NIPPAm的共振峰的強(qiáng)度(3.97)與歸屬于DMAEMA的共振峰(2.25)強(qiáng)度計算而得到。結(jié)果表明，共聚物中PNIPAAm與PDMAEMA的比例與投料比一致。這也就是說，我們成功的制備了一種新型的兩親星形嵌段共聚物。該共聚物由一個相對較短的疏水PMMA鏈段和一個具有溫度和pH響應(yīng)能力的三臂的親水鏈段所組成。權(quán)利要求1、一種星形共聚物自組裝納米膠束的制備方法，其特征在于，包括如下步驟e.制備端基為羧基的聚甲基丙烯酸甲酯以巰基丙酸為鏈轉(zhuǎn)移劑，將單體甲基丙烯酸甲酯用引發(fā)劑偶氮二異丁腈在有機(jī)溶劑中，一定溫度下，進(jìn)行自由基聚合反應(yīng)；f.制備三臂聚合物tri-armP(NIPAAm-co-DMAEMA)以鈰-醇組成的氧化還原體系為引發(fā)劑，將單體N-異丙基丙烯酰胺和N，N-二甲基胺乙基甲基丙烯酸甲酯進(jìn)行自由基共聚合；g.制備星形共聚物將以上制備的兩種聚合物在溶劑中加入N-羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺，反應(yīng)一定時間，產(chǎn)物在乙醚中沉淀，過濾后真空干燥至恒重；h.將上述制得的星形兩親共聚物溶于透析袋中，置入蒸餾水中進(jìn)行透析，得到共聚物膠束。2、如權(quán)利要求1所述的星形共聚物自組裝納米膠束的制備方法，其特征是，步驟a中，所述的溫度為5(TC-8(TC之間，反應(yīng)時間為5小時_48小時，所述有機(jī)溶劑是二氧六環(huán)，甲酰胺，二氯甲垸，苯，甲苯任一種。3、如權(quán)利要求1所述的星形共聚物自組裝納米膠束的制備方法，其特征是，步驟b中，所述的引發(fā)體系是由三羥甲基甲胺和硝酸鈰組成，它們的質(zhì)量比為1:5-1:100之間，引發(fā)體系與聚合單體的質(zhì)量比控制在1:100-1:10000之間，反應(yīng)溫度為2-12小時，反應(yīng)溫度為5(TC-8(TC之間。4、如權(quán)利要求1所述的星形共聚物自組裝納米膠束的制備方法，其特征是，步驟c中，所述有機(jī)溶劑是二氧六環(huán)、甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯任一種，反應(yīng)時間為10-72小時，溫度控制在0'C-80'C之間。全文摘要一種星形共聚物自組裝納米膠束的制備方法，包括如下步驟制備端基為羧基的聚甲基丙烯酸甲酯:制備三臂聚合物tri-armP(NIPAAm-co-DMAEMA):以鈰-醇組成的氧化還原體系為引發(fā)劑，將單體N-異丙基丙烯酰胺和N，N-二甲基胺乙基甲基丙烯酸甲酯進(jìn)行自由基共聚合；制備星形共聚物，將上述制得的星形兩親共聚物溶于透析袋中，置入蒸餾水中進(jìn)行透析，得到共聚物膠束。本發(fā)明星型聚合物膠束做為一種藥物載體，能夠通過利用外部的或體內(nèi)固有的環(huán)境的變化而達(dá)到在病理區(qū)域的藥物靶向釋放，提高藥物治療效率。文檔編號C08F4/40GK101348570SQ20081010705公開日2009年1月21日申請日期2008年9月3日優(yōu)先權(quán)日2008年9月3日發(fā)明者樂長高,劉云海,曹小紅,羅明標(biāo)申請人:東華理工大學(xué)