專利名稱::膜分離制備竹葉多糖提取物的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及一種竹葉多糖的分離方法,特別涉及一種膜分離制備高純度竹葉多糖的方法。
背景技術(shù):
:隨著人們生活水平的提高,回歸自然,天然健康食品,綠色食品的概念越來越深入人們的生活理念,天然食品和藥品已經(jīng)成為國際食品和藥品發(fā)展的潮流和時尚。竹葉提取物作為一種天然的、具有多種生理功能的提取物正不斷被人們所認識。竹子是屬于禾本科竹亞科(Bambusadea)的一類植物,全球約有70屬,1225種。竹類植物分布于地球的北緯46°至南緯47°之間的熱帶,亞熱帶和暖溫帶地區(qū),主要集中分布于亞洲、非洲、南北美洲、大洋洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)及太平洋相應位置的島嶼,東南亞的熱帶、亞熱帶為其分布的中心地區(qū)。竹林面積以每年3%的速度增加,如何合理高效利用竹林資源,推動竹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,已成為世界林業(yè)生產(chǎn)中一個高度關(guān)注的問題。我國是竹子中心產(chǎn)區(qū)之一,占世界竹林總面積的25%。開發(fā)利用竹類森林資源意義十分重大。竹葉在我國具有悠久的食用和藥用歷史,竹葉性淡、微澀、寒,味甘、苦,主治煩熱口渴,小兒發(fā)熱,小兒疳積,熱病不眠,口舌生瘡,目赤腫痛,疥癬,瘡毒,咽喉炎,外傷出血等癥。竹葉中含有大量的黃酮類化合物和生物活性多糖等有效成分,竹葉活性多糖通過增強免疫功能、促進免疫因子的生成和激活來實現(xiàn)抗腫瘤作用,具有良好的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗感染、抗炎癥等多種功效。目前已受到國內(nèi)外市場的廣泛關(guān)注。日本人還從箬竹葉提取分離得一種活性多糖,經(jīng)試驗證明對S-180有很好的抑制和清除效果。目前國內(nèi)外對于制備高含量竹葉多糖的方法報道不多,尤其是多糖含量大于80%的竹葉多糖提取物。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的竹葉多糖提取物中竹葉多糖的含量較低的缺陷,本發(fā)明提供了一種膜分離制備竹葉多糖提取物的方法,可以制得多糖含量高于80%wt的竹葉多糖提取物。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種膜分離制備竹葉多糖提取物的方法,包括以下步驟第一步,先用親脂性溶劑對篩選出的竹葉多糖含量大于5.0%Wt的竹葉進行提取,其中親脂性溶劑與竹葉的質(zhì)量比例為(1—30):1,提取溫度為2(TC-100°C,提取時間為0.5h-72h;提取方式可選擇熱回流提取、微波提取、超聲波提取中的任意一種或者其組合。熱回流提取溫度80°C-100°C,時間為0.5-10小時;微波提取功率100-2000W,時間10-120分鐘,溫度50。C-7(TC;超聲波提取功率300W-3KW,時間10-120分鐘,溫度50。C-70。C。竹葉多糖含量大于5.0%wt的竹葉的篩選方法為以硫酸-蒽酮法,以葡萄糖為標準,建立葡萄糖標準曲線,然后以葡萄糖為標準品,610nm下對收集的竹葉進行比色測定竹葉多糖含量,篩選出竹葉多糖含量大于5.0。/。wt的竹葉。優(yōu)選南京的鵝毛竹、鋪地竹、毛竹、唐竹或金絲慈竹下部的竹葉,或者安徽池州毛竹的竹葉。親脂性溶劑為Cs-C7的脂肪烷烴或沸程6(TC-12(TC的石油醚。所述的C5-C7的脂肪垸烴為正戊烷、正已烷或正庚烷中的任意一種。第二步,再用C,-C:,的脂肪醇或丙酮為提取劑對第一步的竹葉殘渣進行提取,提取劑與竹葉的質(zhì)量比例為(1一20):1,提取溫度為20°C-100°C,提取時間為0.5h-72h;C,-C3的脂肪醇為甲醇、乙醇、正丙醇中的任意一種。第三步,用去離子水提取第二步的竹葉殘渣,去離子水與竹葉的質(zhì)量比例為(1—20):1,提取溫度為80°C-110°C,提取時間為0.5h-5h;第四步,離心沉降將第三步去離子水的提取液調(diào)節(jié)pH至8-9,用6000-20000r/min速度離心沉降,獲得離心清液和沉淀物;第五步,膜藕合分離將第四步得到的離心清液依次通過陶瓷膜、超濾膜及納濾膜處理最后得到濃縮液,其中,陶瓷膜平均孔徑為O.1—0.5ixm,超濾膜截留分子量為5000—200000道爾頓,納濾膜截留分子量200—1000道爾頓,物料通過超濾膜及納濾膜通量l-10m7m2'h'Mpa;第六步,脫色,將第五步得到的濃縮液通過脫色樹脂吸附,加入的樹脂的質(zhì)量與加入的濃縮液的體積的比例為1-50:100,攪拌時間為5-60min,溫度5°C-80°C;脫色樹脂,指D845、D941、D280、D392、D291、D730、D293、D296中任意一種。第七步,醇析,將第六步樹脂脫色后的竹葉多糖溶液抽真空濃縮至比重為1.03-1.14,如比重1.12,加入C「C3的脂肪醇攪拌,脂肪醇與多糖溶液體積比例為4-20:1,再用160目濾布過濾得到沉淀物;第八步,真空干燥,將第七步得到的沉淀物離心,用3000-10000r/min速度離心沉降,獲得離心固體部分用600-2000W微波真空干燥,溫度25'C-6(TC,真空度250-700mmHg,獲得竹葉多糖含量大于80%wt的竹葉多糖提取物。本發(fā)明獲得如下技術(shù)效果1.通過對不同產(chǎn)地不同部位的30種竹葉所含的竹葉多糖含量進行分析,篩選出高含量竹葉多糖的品種,有利于高含量竹葉多糖的制備。2.根據(jù)相似相溶原理,采用分極性溶劑依次提取,盡量除去脂溶物、色素、醇溶物等雜質(zhì),提高了去離子水提取物中竹葉多糖濃度,也有利于保護膜設備的使用。3.首次采用不同類型膜分離藕合技術(shù)和脫色吸附藕合技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的溶劑萃取法,不僅能使竹葉多糖提取物中竹葉多糖的含量大于80%wt,而且節(jié)省能源、清潔環(huán)保。4.首次采用pH沉降離心法純化,不僅能除去高分子蛋白、膠質(zhì)、葉綠素、高分子單寧等雜質(zhì),提高竹葉多糖提取物的純度,而且有利于藕合膜組件的保護和再生,延長其壽命。5.選擇脫色吸附樹脂代替溶劑萃取去蛋白,既省溶劑,又能有效的提高竹葉多糖的含量。圖1陶瓷膜流速曲線。圖2超濾膜流速曲線。具體實施方式竹葉多糖含量大于5.0%wt的竹葉的篩選方法如下(1)以硫酸-蒽酮法,以葡萄糖為標準,建立葡萄糖標準曲線,如表l表l葡萄糖標準曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>以葡萄糖含量C(mg)對吸光度A線性回歸,得回歸方程A=5.8137C-0.00473(R=0.9987)。表明葡萄糖在0.0ug/mL96.0wg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈較好的線性關(guān)系。2)樣品多糖重復測定試驗分別取4份相同綠竹葉多糖提取液,重復測定竹葉多糖的結(jié)果如表2。試驗結(jié)果表明,以葡萄糖為標準品,610nm下比色測定竹葉多糖的方法可行,有較好的重復性。表2多糖測定重復性試驗數(shù)據(jù)<table><table>3)樣品多糖加樣回收率測定各組中加入的竹葉多糖樣品量為0.06mg/mLXlOmL二O.6mg,加入的葡萄糖標準品分另U為0.12mg/mLX4mL=0.48mg,0.12mg/mLX5mL二0.6mg,0.12mg/mLX6mL=0.72mg?;厥章史謩e為101.92%、101.68%、99.89%,標準偏差為0.0110,符合要求,證明了該方法的可靠性。表3加樣回收率試驗數(shù)據(jù)<table><table>本專利通過建立竹葉多糖的分析方法,對30個品種竹葉中竹葉多糖活性組分的含量進行了測定。結(jié)果表明,以質(zhì)量百分比計竹葉多糖含量在1.94%7.69%之間,其中竹葉多糖含量在4%以上有南京地區(qū)小葉箬竹(4.59%),矮箬竹(4.82%),巴山木竹4.43%,鵝毛竹(7.69%),鋪地竹(5.69%),毛竹(5.36%),百夾竹(4.86%),唐竹(5.30%),金絲慈竹下部(5.73%),福建省尤溪綠竹(4.36%),毛竹(4.72%),安徽池州(5.90%),尤其是南京的鵝毛竹、鋪地竹、毛竹、唐竹和金絲慈竹下部,安徽池州毛竹分布廣、多糖含量高于5%,經(jīng)過本專利的篩選成為工業(yè)上提取竹葉多糖活性組分的最佳原料。同品種的竹葉上下部位竹葉多糖含量有所不同,且含量都是下部老葉高于上部嫩葉子。結(jié)果如表4。表4不同品種竹葉中多糖含量竹種產(chǎn)地采摘時間多糖含量y諷t箬竹/.7a"/bh'i/s南林大10月2.66小葉箬竹(LvictorialisKengf.)南林大10月4,59闊葉箬竹南林大10月2.33(I.latifolious(Keng)McClure)上闊葉箬竹南林大10月2.58(I,latifolious(Keng)McClure)下矮箬竹I.pedalis(Keng)Kengf.南林大10月4.82髯毛箬竹I.barbatusMcClure南林大10月3.38細葉箬竹南林大10月3.43苦竹(PI.amarus(Keng)Kengf.)上南林大10月2.81苦竹(PI.amaxus(Keng)Kengf.)下南林大10月3.21細葉苦竹南林大10月3.72長葉苦竹(Pl.chinaf.hisauchii)上南林大10月1.94長葉苦竹(Pl.chinaf.hisauchii)下南林大10月3.73巴山木竹(B.fargesiikengf.etYi)上南林大10月2.77巴山木竹(B.faxgesiikengf.etYi)下南林大10月4.43鵝毛竹(Sh.chinensisNakai)南林大10月7.69鋪地竹(Sasaaxgenteastriatus南林大10月5.69E.G.Camus)毛竹(Ph.edulis(Carr)A.etC.Riv)南林大10月5,36靚竹(Sasaellaglabraf.南林大10月3.77albo-striata)淡竹(Ph.glaucaMcClue)南林大10月2.54百夾竹(Ph.nidulariaMunro)南林大10月4.86孝順竹(B.multiplex(Lour.)Raeuschel南林大10月3.09exj.A.etj.Schult)唐竹南林大10月5.30(Sinob柳busatootsik(Sieb.)Makino)毛金竹(Ph-nigavar.henonisSt即fet南林大10月3.76Rendle)金絲慈竹(N.affinis(Rendle)Kengf)上南林大10月3.55部金絲慈竹(N.affinis(Rendle)Kengf)下南林大10月5.73部水竹(PhyllostachysHeteroclata林化所4月3.51Oliver)淡竹(Ph.glaucaMcClue)尤溪4月2.54綠竹(Dendrocauamopsisoldhami.尤溪4月4.36(munro)Kengf)毛竹(Ph.edulis(Carr)A.etC.Riv)尤溪4月4.72苦竹(PI.柳arus(Keng)Kengf.)尤溪4月3.35苦竹(PI.咖arus(Keng)Kengf.)08年3月3.25毛竹(Ph.edulis(Carr)A.etC.Riv)池州08年3月5.90由表4可知,竹葉多糖的含量范圍為,以質(zhì)量百分比計1.94%7.69%,即19.4mg/g76.9mg/g,按含多糖的高低,將其分為含量在4%以上、3%4%之間、2%3%之間、2%以下四類。4%wt以上有南京地區(qū)小葉箬竹(4.59%),矮箬竹(4.82%),巴山木竹4.43%,鵝毛竹(7.69%),鋪地竹(5.69%),毛竹(5.36°/。),百夾竹(4.86%),唐竹(5.30%),金絲慈竹下部(5.73%),福建省尤溪綠竹(4.36%),毛竹(4.72%),安徽池州(5.90%);3%4%之間南林大的髯毛箬竹,細葉箬竹,苦竹下,細葉苦竹,長葉苦竹下,靚竹,孝順竹,毛金竹,金絲慈竹上;林化所的水竹;福建尤溪苦竹;安徽池州的苦竹;2%3%之間南林大的箬竹,闊葉箬竹上、下,苦竹上,巴山木竹上,淡竹;福建尤溪的淡竹;2%以下南林大的長葉苦竹上。同品種的南京竹園中的毛竹、尤溪毛竹及池州毛竹多糖含量有所不同,分別為5.36%、4.72%,5.90%;三個地方的苦竹含量分別為南林大上2.81%,南林大下3.21%,尤溪3.35%,池州3.25%。因此,同品種的竹葉上下部位多糖含量有所不同,且含量都是下部老葉高于上部嫩葉子。因而,多糖更多富集在下部老葉片中。提取方式說明本發(fā)明中第一步中的提取方式可選擇熱回流、微波提取、超聲波提取中的一種。熱回流提取溫度80°C-100°C,時間為0.5-10小時;微波提取功率100-2000W,時間10-120分鐘,溫度50。C-70。C;超聲波提取功率300W-3KW,時間10-120分鐘,溫度50°C-70°C。在本發(fā)明方案中,用極性溶劑提取前,先用非極性溶劑,如石油醚、正已烷、乙醚等對篩選的竹葉進行提取,質(zhì)量比例為(1—30):1,提取溫度為2(TC-IO(TC,提取時間為0.5h-72h,目的是除去脂溶性雜質(zhì),包括葉綠素等色素。實驗多次的結(jié)果表明,可除去l_3%wt的雜質(zhì)。再用C「C3的脂肪醇,如甲醇、乙醇或丙酮對剩下的竹葉殘渣進行提取,目的除去醇溶性的多酚、單寧、黃酮、萜類、皂苷、生物堿等雜質(zhì),實驗多次的結(jié)果表明,可除去5-15%wt的雜質(zhì)。用反滲透膜制備去離子水,提取剩下的竹葉殘渣,去離子水與竹葉的質(zhì)量比例為(1一20):1,提取溫度為80°C-110°C,提取時間為0.5h-5h;多糖類活性成分溶于水,提取率大于95%。本發(fā)明中按U(34)正交表分別采用水提、超聲波浸提、微波浸提方法,對竹葉多糖提取工藝參數(shù)進行試驗,用硫酸一苯酚法測定多糖含量。表2水提取工藝因子設計實驗號<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3L9(34)水提正交實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>影響竹葉多糖提取率因素的主次關(guān)系為提取固液比對多糖提取率影響最大,其次為提取次數(shù),溫度和時間的影響相對較小.其最佳浸提參數(shù)為A2B3C3D3,即80。C下,浸提100min,固液比1:25,浸提3次.在最佳條件下,多糖得率為0.661%.表4超聲波提取工藝因子設計<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5L9(34)超聲波提取正交實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表試驗結(jié)果可知,提取次數(shù)對提取率的影響最大,其次為溫度,時間和固液比對提取率的影響較小.其最佳浸提參數(shù)為A^CA,即7(TC下,浸提20min,固液比1:20,浸提3次,多糖得率為0.695%??紤]到后續(xù)加工的成本問題,優(yōu)選1:15的固液比,浸提10min。表6微波輔助提取工藝因子設計<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表7L9(34)微波輔助提取正交實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從表試驗結(jié)果可知,微波功率和提取次數(shù)對提取效果的影響最大,其次為時間和固液比.其最佳浸提參數(shù)為A^CA,即在微波功率800W的條件下,按固液比1:15,提取10min,浸提3次,多糖得率為0.658%。結(jié)果表明微波浸提5-10min的多糖提取率與水提相當,超聲波浸提的提取率高于水提和微波浸提。本發(fā)明中將微波和超聲波浸提液,用0.5%-5%堿液調(diào)節(jié)pH為8-9,有大量的沉淀產(chǎn)生。選擇轉(zhuǎn)速3000-10000轉(zhuǎn)/分離心機離心沉降,沉淀物中加入去離子水,沉淀物和去離子水的質(zhì)量比例是1:1-10,優(yōu)選1:4,除去沉淀物,合并兩次的清液。采用本方法處理不僅除掉大量不溶性固體、膠質(zhì)、葉綠素、高分離蛋白質(zhì)等雜質(zhì),提高提取液中多糖的含量,而且保護膜組件和脫色樹脂,有利于提高生產(chǎn)效果。在本發(fā)明中,采用膜藕合分離技術(shù),將離心沉降的清液依次通過陶瓷膜、超濾膜和納濾膜藕合裝置,最后得到濃縮液。無機陶瓷膜材質(zhì)為三氧化二鋁,平均孔徑0.1-0.5nm,超濾膜選擇截留分子量為5000~200000道爾頓(Dalton)的聚砜膜(PS),優(yōu)選100000-15000Dalton,納濾膜截為留分子量20(Tl000Daltori聚酰亞胺膜,物料通過超濾膜及納濾膜通量l-10m7m2'h'Mpa。與傳統(tǒng)真空轉(zhuǎn)鼓過濾機、硅藻土過濾機相比,采用陶瓷膜過濾技術(shù),不僅可除去細小不溶固體、大量高分子單寧、蛋白質(zhì)、膠質(zhì)、纖維、細菌及葉綠素等雜質(zhì),而且大大降低了后續(xù)超濾膜、納濾膜及脫色樹脂的污染,在一定的壓力下,當物料濾液流過膜表面時,只允許水及比膜孔徑小的小分子物質(zhì)通過,達到溶液的凈化、分離、與濃縮的目的,從而提高濃縮液中多糖的含量。如表8所示。表8多糖含量和截留率Tab.6-2Thecontentandremovalofpolysaccharide<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>圖1為中試提取多糖液過陶瓷膜時測得的膜流速,操作條件提取液濃度為9.32g/L,溫度為3(TC4(TC,壓力小于0.2MPa??梢钥闯觯沾赡ぴ?0分鐘后流速已經(jīng)基本穩(wěn)定。圖2為中試提取多糖液過超濾膜時測得的膜流速,提取液濃度為7.08g/L,溫度為26.5'C,壓力為(X24MPa。可以看出,超濾膜在5分鐘后流速己經(jīng)基本穩(wěn)定。本發(fā)明中,經(jīng)過無機陶瓷膜、10Dalton超濾膜和200Dalton納濾膜處理,濃縮液中多糖的含量可達到38.24%,大大地改善了傳統(tǒng)的水提醇析方法得到的粗多糖提取物中多糖含量低,酒精用量大,能耗大的問題。本發(fā)明采用大孔類樹脂D845、D941、D280、D392、D291、D730、D293、D296等中一種或幾種介質(zhì)為填料對納濾膜的濃縮液進行選擇性吸附,樹脂與納濾膜的濃縮液體積比為l:5-20。優(yōu)選D845、隨、D280、、D392,它們對多糖提取物的脫色率大于85%,多糖的損失率小于10%。本發(fā)明將大孔樹脂脫色后的竹葉多糖溶液抽真空濃縮至比重為1.03-1.14,優(yōu)選比重1.10-1.12,加入85。/。以上d-C3的脂肪醇攪拌,如甲醇、乙醇等,脂肪醇與多糖溶液體積比例為4-20:1,優(yōu)選4-6:1,目的是將多糖沉淀,再用160目濾布過濾得到多糖沉淀物;再經(jīng)過3000-10000r/min速度離心沉降,優(yōu)選6000-10000r/min,獲得離心固體部分用600-2000W微波真空干燥,溫度25°C_60°C,優(yōu)選30。C-4(TC,真空度250-700腿Hg,獲得竹葉多糖含量大于80%wt的竹葉多糖提取物。實施例1高含量竹葉多糖的篩選方法(1)硫酸-恩酮溶液配制稱取蒽酮0.2g,濃硫酸定容于100mL容量瓶中,混勻即可,現(xiàn)配現(xiàn)用。(2)標準葡萄糖溶液的配制精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖配制成濃度為0.1200mg/mL的溶液,備用。(3)葡萄糖標準曲線繪制精確吸取0.0mL、O.lmL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL于lOmL具塞試管中,用蒸餾水補足l.OmL,以1.0mL蒸餾水做空白對照,然后各加入4mL硫酸-恩酮溶液,搖勻,放入冰水中冷卻,后置于沸水中煮沸10min,迅速冷卻至室溫,于620nm測定吸光度A。(4)樣品多糖重復測定試驗分別取4份相同質(zhì)量(2g)經(jīng)粉碎的南京的鵝毛竹、鋪地竹、毛竹、唐竹和金絲慈竹下部,安徽池州毛竹等30個樣品中的任意一種,竹葉粉置于回流燒瓶中,提取條件同為料液比1:30(g:mL),溫度80°C,提取3h,提取兩次,合并提取液濃縮,定容于25mL容量瓶中,分別取1.0mL于10mL具塞試管中,以1.0mL蒸餾水做空白對照,然后各加入4mL硫酸-恩酮溶液,搖勻,放入冰水中冷卻,后置于沸水中煮沸10min,迅速冷卻至室溫,于620nm測定吸光度A。(5)樣品多糖加樣回收率測定配備0.06mg/mL的南京的鵝毛竹竹葉多糖提取液,分別向10mL樣品液中加入4mL、5mL、6mL的0.1200mg/mL的葡萄糖標準溶液,定容于25mL容量瓶中,取lmL測定吸光值。每個試驗號做3個點,共9點。(5)按葡萄糖標準回歸方程A=5.8137C-0.00473計算30個品種中多糖的含量,經(jīng)分析篩選,多糖含量在1.94%7.69%之間,其中多糖含量在4%以上有南京地區(qū)小葉箬竹(4.59%),矮箬竹(4.82%),巴山木竹4.43%,鵝毛竹(7.69%),鋪地竹(5.69%),毛竹(5.36%),百夾竹(4.86%),唐竹(5.30%),金絲慈竹下部(5.73%),福建省尤溪綠竹(4.36%),毛竹(4.72%),安徽池州(5.90%),尤其是南京的鵝毛竹、鋪地竹、毛竹、唐竹和金絲慈竹下部,安徽池州毛竹分布廣、多糖含量高于5%,成為工業(yè)上提取竹葉多糖活性組分的最佳原料。實施例2一種膜分離制備高純度竹葉多糖的方法,,包括以下步驟第一步,先用親脂性溶劑對篩選的竹葉細粉進行提取,其中親脂性溶劑與干燥的竹葉細粉的質(zhì)量比例為(1—30):1,例如比例可以選取為1:1,4:1,7:1,8:1,10:1,14:1,17:1,20:1,22:1,24:1,27:1,28:1,29:1,29.5:1,30:1,提取溫度為20°C-100°C,例如可以選取為25°C,35°C,40°C,50°C,60°C,70°C,75°C,80°C,卯。C,98°C;提取時間為0.5h-72h,提取時間為0.5h,lh,3h,5h,6h,8h,9.5h,12h,14h,15h,16h,17h,18h,20h,30h,35h,40h,55h,60h,70h,71h。第二步,再用CrC3的脂肪醇或丙酮對剩下的竹葉殘渣進行提取,提取劑與竹葉的質(zhì)量比例為(1一20):1,例如比例可以選取為1:1,4:1,7:1,8:1,10:1,14:1,17:1,20:1,提取溫度為20°C-IO(TC,例如可以選取為25°C,35°C,40°C,50°C,60°C,70°C,75°C,80°C,90°C,98°C;提取時間為O.5h-72h;提取時間為0.5h,1h,3h,5h,6h,8h,9.5h,12h,14h,15h,16h,17h,18h,20h,30h,35h,40h,55h,60h,70h,71h。第三步,用反滲透膜純化自來水制備去離子水,再用去離子水提取剩下的竹葉殘渣,去離子水與竹葉的質(zhì)量比例為(1—20):1,,例如比例可以選取為1:1,4:1,7:1,8:1,10:1,14:1,17:1,20:1,提取溫度為80°C-1l(TC,例如可以選取為80°C,85°C,90°C,95°C,100°C,105°C,ll(TC;提取時間為0.5h-5h;例如可以選取為0.5h,1h,2h,3h,4h,5h。第四步,離心沉降將提取液調(diào)節(jié)PH至8-9,例如8,8.5,9,用高速離心沉降,離心機的轉(zhuǎn)速為6000_20000轉(zhuǎn)/分,可以選取為6000轉(zhuǎn)/分,7000轉(zhuǎn)/分,20000轉(zhuǎn)/分,獲得離心清液和沉淀物;本實施例中可直接將該清液進行膜耦合分離,也可再在沉淀物中加入去離子水離心沉降,除去沉淀物,合并兩次的離心清液,其中,沉淀物和去離子水的質(zhì)量比例是l:(1-10),可以選取為l:1.5,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8,1:9,第五步,膜藕合分離將離心清液依次通過陶瓷膜、超濾膜及納濾膜處理,最后得到通過納濾膜的濃縮液,其中,無機陶瓷膜材質(zhì)可以為三氧化二鋁,陶瓷膜平均孔徑O.1—0.5um,可以為,0.2微米,0.4微米,超濾膜截留分子量為5000—200000Dalton(道爾頓),如5000,20000,50000,80000,100000,150000,180000,200000,納濾膜截留分子量200—1000Dalton(道爾頓),物料膜通量l-10m7m2'h.MPa,可以選取為2tn3/m2'h'MPa,3m3/m2'h'MPa,5m3/m2'h.MPa,8m7m2.h-MPa,第六步,脫色,將納濾膜的濃縮液通過脫色樹脂吸附,樹脂加入質(zhì)量與納濾膜的濃縮液體積比例為l-50:100,例如1:100,5:100,8:100,25:100,30:100,40:100,45:100,50:100,攪拌時間為5-60min,例如可以選取為5min,10min,20min,35min,40minh,50min,55min,60min,溫度5。C-80。C;例如可以選取為10°C,15°C,25°C,35°C,50°C,55°C,60°C,75°C,80°C;第七步,醇析,將樹脂脫色后的多糖溶液真空濃縮至比重為1.03-1.14,如1.04,1.08,1.10,1.12,1.14;用d-C3的脂肪醇加入攪拌,如甲醇、乙醇中的任一種,脂肪醇與多糖溶液體積比例為4-20:1,例如可以選取為5:1,7:1,10:1,15:1,18:1,20:1;用160目濾布過濾得到多糖沉淀物,再經(jīng)過3000-10000r/min速度離心沉降,優(yōu)選6000-10000r/min,獲得離心多糖沉淀物;第八步,真空干燥,將上述多糖沉淀物用600-2000W微波真空干燥,如600W,800W,1200W,1500W,1800W,干燥溫度25。C-60°C,例如,25°C,35。C,50。C,55°C,60°C,真空度250-700ramHg,例如,250mmHg,300mmHg,350mmHg,450鵬Hg,550畫Hg,650mmHg,700咖Hg,獲得總多糖含量大于80%的竹葉多糖提取物。本實施例中,本技術(shù)方案中第一步中的親脂性溶劑為Cs-C7(碳原子數(shù)為5-7,可以為5,6,7)的脂肪烷烴或沸程6(TC-12(TC石油醚,優(yōu)選石油醚、正己烷。第二步和第七步中C「C3的脂肪醇指甲醇、乙醇、丙醇,優(yōu)選甲醇。脫色樹脂為D845、D941、D280、D392、D291、D730、D293、D296等,優(yōu)選D845、D280、D392。第一步中的篩選的竹葉,特指多糖含量大于4.0%南京地區(qū)鵝毛竹(7.69%)、小葉箬竹(4.59%)、矮箬竹(4.82%)、巴山木竹(4.43%)、鋪地竹(5.69%)、百夾竹(4.86%)、唐竹(5.30%)、金絲慈竹下部(5.73%)、毛竹(5.36%),尤其是南京的鵝毛竹、鋪地竹、毛竹、唐竹和金絲慈竹下部,安徽池州毛竹分布廣、多糖含量高于5%,成為工業(yè)上提取竹葉多糖活性組分的最佳原料。本技術(shù)方案中,以硫酸-蒽酮法,以葡萄糖為標準,建立竹葉中多糖的分析方法。無水葡萄糖配制成濃度為0.1200mg/mL的溶液,精確吸取0.OmL、0.lmL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL于10mL具塞試管中,用蒸餾水補足lmL,以l.OmL蒸餾水做空白對照,然后各加入4mL硫酸-恩酮溶液,搖勻,放入冰水中冷卻,后置于沸水中煮沸10min,迅速冷卻至室溫,于620rai測定吸光度A。回歸方程A3.8137C-0.00473(R=0.9987),葡萄糖在0.096.0"g/ml范圍內(nèi)與吸光度呈較好的線性關(guān)系。實施例3選擇福建尤溪4月份收集的6年生新鮮毛竹葉20kg,放通風陰涼處干燥,然后在烘箱中5(TC以下鼓風4hr,測含水率低于7.0%,多糖含量4.72%。取8kg干燥葉,破碎成細粉,加60kg石油醚(60°C-90°C),7(TC熱回流提取,時間4小時,第二次提取加40kg石油醚(6(TC-9(TC),重復以上操作。合并提取液,5(TC下減壓回收溶劑。用工業(yè)級甲醇約100L加入到石油醚提取后的殘葉中提取,設定溫度為5(TC,浸提過夜;第二次加入50L甲醇提取3hr,溫度7(TC,過濾,合并甲醇提取液。殘葉用直接蒸氣吹干后,加入100L去離子水,提取溫度10(TC,提取時間2hr,過濾,重復提取3次,合并提取液200L。用NaOH堿溶液調(diào)節(jié)PH8.5,自然冷卻至室溫,用轉(zhuǎn)速6000轉(zhuǎn)/離心機離心沉淀,得到離心清液195L。澄清液依次通過陶瓷膜、超濾膜及納濾膜藕合裝置處理,最后得到納濾膜的濃縮液10kg。無機陶瓷膜材質(zhì)為三氧化二鋁,平均孔徑O.lum,超濾膜截留分子量為100000Dalton(道爾頓),納濾膜截留分子量400Dalton(道爾頓),物料膜通量6m3/nfh'Mpa。再將納濾膜的濃縮液10kg,用10kgD845大孔樹脂吸附60min后,過濾清液,溫度80。C下真空濃縮至比重1.12,慢慢加入95%wt乙醇4L,攪拌沉淀,用轉(zhuǎn)速6000轉(zhuǎn)/離心機離心沉淀,得到將沉淀物,固體部分用微波真空干燥,溫度45'C,真空度700ramHg,,得到白色粉末224g,即富含高純度竹葉多糖提取物,其中多糖80.6^wt,干燥失重《5.0免wt,灰分《3.0%wt,重金屬《10mg/kg,砷《2mg/kg。實施例4選擇南京林業(yè)大學10月份收集的5年生新鮮鵝毛竹葉25kg,放通風陰涼處干燥,然后在烘箱中50。C以下鼓風3hr,測含水率低于7.0%,多糖含量7.69%。取10kg干燥葉,破碎成細粉,力tnOOkg正已烷,70'C熱回流提取,時間2小時,第二次提取加50kg正已烷,重復以上操作。合并提取液,5(TC下減壓回收溶劑。用工業(yè)級乙醇100L加入到正已垸提取后的殘葉中提取,設定溫度為70°C,時間2hu;第二次加入50L乙醇提取3hr,溫度70。C,過濾,合并乙醇提取液。殘葉用直接蒸氣吹干后,加入150L去離子水,提取溫度10(TC,提取時間3hr,過濾,重復提取3次,合并提取液250L。用NaOH堿溶液調(diào)節(jié)PH8.5,自然冷卻至室溫,用轉(zhuǎn)速6000轉(zhuǎn)/離心機離心沉淀,得到離心清液240L。澄清液依次通過陶瓷膜、超濾膜及納濾膜藕合裝置處理,最后得到納濾膜的濃縮液10kg。無機陶瓷膜材質(zhì)為三氧化二鋁,平均孔徑0.4um,超濾膜截留分子量為150000Dalton(道爾頓),納濾膜截留分子量300Dalton(道爾頓),物料膜通量6m7m2'h'Mpa。再將納濾膜的濃縮液10kg,用8kgD280大孔樹脂吸附40min后,過濾清液,溫度8CTC下真空濃縮至比重1.10,慢慢加入95%乙醇5L,攪拌沉淀,用轉(zhuǎn)速6000轉(zhuǎn)/離心機離心沉淀,得到將沉淀物,固體部分用微波真空干燥,溫度5(TC,真空度700ramHg,,得到白色粉末540g,即富含高純度竹葉多糖提取物,其中多糖88.7%wt。實施例5選擇南京林業(yè)大學10月份收集的8年生新鮮金絲慈竹下部葉25kg,放通風陰涼處干燥,然后在烘箱中5(TC以下鼓風3hr,測含水率低于7.0%wt,多糖含量5.73%。取10kg干燥葉,破碎成細粉,多糖的提取分離方法與實施例4相同,大孔脫色樹脂采用D392,得到白色粉末260g,即富含高純度竹葉多糖提取物,其中多糖82.l%wt。實施例6選擇安微池州3月份收集的15年生新鮮毛竹葉20kg,放通風陰涼處干燥,然后在烘箱中50°C以下鼓風5hr,測含水率低于7.0%,多糖含量5.90%。取10kg干燥葉,破碎成細粉,多糖的提取分離方法與實施例3相同,大孔脫色樹脂采用D293,得到白色粉末249g,即富含高純度竹葉多糖提取物,其中多糖81.4%。實施例7選擇南京林業(yè)大學10月份收集的8年生新鮮鋪地竹葉20kg,放通風陰涼處干燥,然后在烘箱中5(TC以下鼓風5hr,測含水率低于7.0%,多糖含量5.69%。取10kg干燥葉,破碎成細粉,多糖的提取分離方法與實施例4相同,大孔脫色樹脂采用D296,得到白色粉末220g,即富含高純度竹葉多糖提取物,其中多糖80.2%wt。實施例8選擇南京林業(yè)大學10月份收集的8年生新鮮箬竹葉20kg,放通風陰涼處干燥,然后在烘箱中5(TC以下鼓風5hr,測含水率低于7.0%,多糖含量2.66%。取10kg干燥葉,破碎成細粉,加入150L去離子水,提取溫度100。C,提取時間2hr,過濾,重復提取3次,合并提取液250L。澄清液依次通過陶瓷膜、超濾膜及納濾膜藕合裝置處理,最后得到納濾膜的濃縮液10kg。無機陶瓷膜材質(zhì)為三氧化二鋁,平均孔徑0.5um,超濾膜截留分子量為80000Dalton(道爾頓),納濾膜截留分子量500Dalton(道爾頓),物料膜通量6mVm、h'Mpa。再將納濾膜的濃縮液10kg,用8kgD280大孔樹脂吸附60min后,過濾清液,溫度80。C下真空濃縮至比重I.IO,慢慢加入95。/。乙醇5L,攪拌沉淀,用轉(zhuǎn)速6000轉(zhuǎn)/離心機離心沉淀,得到將沉淀物,固體部分用微波真空干燥,溫度6(TC,真空度700鵬Hg,,得到白色粉末345g,即富含高純度竹葉多糖提取物,其中多糖48.3^wt。權(quán)利要求1.一種膜分離制備竹葉多糖提取物的方法,其特征在于包括以下步驟第一步,先用親脂性溶劑對篩選出的竹葉多糖含量大于5.0%wt的竹葉進行提取,其中親脂性溶劑與竹葉的質(zhì)量比例為(1—30)1,提取溫度為20℃-100℃,提取時間為0.5h-72h;第二步,再用C1-C3的脂肪醇或丙酮為提取劑對第一步的竹葉殘渣進行提取,提取劑與竹葉的質(zhì)量比例為(1—20)1,提取溫度為20℃-100℃,提取時間為0.5h-72h;第三步,用去離子水提取第二步得到的竹葉殘渣,去離子水與竹葉的質(zhì)量比例為(1—20)1,提取溫度為80℃-110℃,提取時間為0.5h-5h;第四步,離心沉降將第三步得到的提取液調(diào)節(jié)pH至8-9,用6000-20000r/min速度離心沉降,獲得離心清液和沉淀物;第五步,膜藕合分離將第四步得到的離心清液依次通過陶瓷膜、超濾膜及納濾膜處理最后得到濃縮液,其中,陶瓷膜平均孔徑為0.1—0.5μm,超濾膜截留分子量為5000—200000道爾頓,納濾膜截留分子量200—1000道爾頓,物料通過超濾膜及納濾膜通量1-10m3/m2·h·Mpa;第六步,脫色,將第五步得到的濃縮液通過脫色樹脂吸附,加入的樹脂的質(zhì)量與加入的濃縮液的體積的比例為1-50100,攪拌時間為5-60min,溫度5℃-80℃;第七步,醇析,將第六步樹脂脫色后的竹葉多糖溶液抽真空濃縮至比重為1.03-1.14,加入C1-C3的脂肪醇攪拌,脂肪醇與多糖溶液體積比例為4-201,再用160目濾布過濾得到沉淀物;第八步,真空干燥,將第七步得到的沉淀物離心,固體部分用600-2000W微波真空干燥,溫度25℃-60℃,真空度250-700mmHg,獲得竹葉多糖含量大于80%wt的竹葉多糖提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜分離制備竹葉多糖提取物的方法,其特征在于第一步中的竹葉,特指南京的鵝毛竹、鋪地竹、毛竹、唐竹或金絲慈竹下部的竹葉,或者安徽池州毛竹的竹葉。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜分離制備竹葉多糖提取物的方法,其特征在于所述的C「C3的脂肪醇為甲醇、乙醇、正丙醇中的任意一種。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜分離制備竹葉多糖提取物的方法,其特征在于第一步中親脂性溶劑為Cs-C7的脂肪烷烴或沸程為60°C-12(TC的石油醚。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膜分離制備竹葉多糖的方法,其特征在于所述的C5-C7的脂肪垸烴為正戊烷、正已焼或正庚烷中的任意一種。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜分離制備竹葉多糖的方法,其特征在于第六步中脫色樹脂,指D845、D941、D280、D392、D291、D730、D293、D296中任意一種。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜分離制備竹葉多糖提取物的方法,其特征在于第一步中竹葉多糖含量大于5.0y。wt的竹葉的篩選方法為以硫酸-蒽酮法,以葡萄糖為標準,建立葡萄糖標準曲線,然后以葡萄糖為標準品,610nm下對收集的竹葉進行比色測定竹葉多糖含量,篩選出竹葉多糖含量大于5.0%wt的竹葉。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜分離制備竹葉多糖提取物的方法,其特征在于第一步中的提取方式可選擇熱回流提取、微波提取、超聲波提取中的任意一種或組合。全文摘要本發(fā)明公開了一種膜分離制備竹葉多糖提取物的方法,包括以下步驟先用親脂性溶劑對篩選的竹葉進行提取,再用C<sub>1</sub>-C<sub>3</sub>的脂肪醇或丙酮對剩下的竹葉殘渣進行提取,然后用反滲透膜純化的去離子水提取剩下的竹葉殘渣,再堿性離心沉降,獲得離心清液和沉淀物,將離心清液依次通過陶瓷膜、超濾膜及納濾膜處理,最后得到通過納濾膜的濃縮液。將納濾膜的濃縮液通過脫色樹脂吸附,多糖溶液真空濃縮至比重為1.03-1.14,再用C<sub>1</sub>-C<sub>3</sub>的脂肪醇沉淀多糖,沉淀物離心,真空微波干燥沉淀物,固體部分用微波真空干燥,獲得多糖高含量的竹葉多糖提取物。文檔編號C08B37/00GK101392032SQ20081019506公開日2009年3月25日申請日期2008年11月5日優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日發(fā)明者葉建中,昊周,王成章,鄭光耀,陳文英,陳虹霞申請人:中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所