專利名稱：：由乳液得到的顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由乳液得到的顆粒(emulsion-derivedparticle)。其還涉及制造該顆粒的方法。
背景技術(shù)：
：除了別的應(yīng)用以外，包含固定化酶的顆粒通常用于生物催化作用和用于診斷學(xué)。然而，申請(qǐng)人注意到這種顆粒具有如其表面積不足以使酶充分固定的缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供至少減輕這個(gè)缺點(diǎn)的顆粒和制造這種顆粒的方法，該顆粒對(duì)蛋白質(zhì)具有高結(jié)合量并且能夠固定蛋白質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種由乳液得到的顆粒，該顆粒包括通過交聯(lián)劑交聯(lián)的聚合鏈(polymericstrand)的格狀結(jié)構(gòu)、靠近和圍繞所述鏈的填隙孔以及在所述格狀結(jié)構(gòu)上的官能團(tuán)，并且蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)能夠與所述官能團(tuán)反應(yīng)從而使蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)結(jié)合到所述格狀結(jié)構(gòu)上并因此被固定?！扇橐旱玫健傅氖且咽褂萌橐杭夹g(shù)制造或形成顆粒，所述乳液技術(shù)例如但不限于，本發(fā)明的第二和第三方面的基于乳液的方法?！案男缘牡鞍踪|(zhì)”指的是用化學(xué)手段(例如加入二醛)改性的蛋白質(zhì)或在基因水平(例如通過組氨酸標(biāo)簽(his-tag))改性的蛋白質(zhì)。因此，所述顆粒包括在聚合鏈或纖維上和/或者在交聯(lián)劑上的官能團(tuán)，該官能團(tuán)可以與蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)反應(yīng)。更具體而言，所述官能團(tuán)可以存在于所述鏈或纖維的聚合物上，并且可被選擇以使可以通過改性聚合物上的官能團(tuán)，從而通過共價(jià)結(jié)合、離子結(jié)合、疏水結(jié)合和親合結(jié)合中的一種或多種將蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)結(jié)合到聚合物上。因此，所述顆?？梢园ㄖ辽僖环N通過官能團(tuán)結(jié)合或鍵合到聚合物上的蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)，從而被固定。所述蛋白質(zhì)可為酶或酶混合物；抗體或抗體混合物；或者，抗原或抗原混合物或者任何具有功能或結(jié)構(gòu)特性的其它蛋白質(zhì)。因此，如需要，可以在顆粒內(nèi)固定多種不同的蛋白質(zhì)和/或多種不同的改性的蛋白質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是酶時(shí)，通過在顆粒中固定酶，所述顆粒提供了可以將酶的最適的PH轉(zhuǎn)變?yōu)樗峄驂A區(qū)的手段。當(dāng)將蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合到聚合物上時(shí)，例如，其可以通過環(huán)氧化物或醛與蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)的胺基相互作用實(shí)現(xiàn)。當(dāng)將蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)離子結(jié)合到聚合物上時(shí)，其可以通過聚合物上帶正電荷或負(fù)電荷的官能團(tuán)與蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)上帶相反電荷的氨基酸殘基的離子結(jié)合實(shí)現(xiàn)。當(dāng)將蛋白質(zhì)疏水結(jié)合到聚合物上時(shí)，其可以通過聚合物上的芳族或長(zhǎng)鏈烷疏水基與蛋白質(zhì)上的疏水性氨基酸的結(jié)合實(shí)現(xiàn)。當(dāng)將蛋白質(zhì)親合結(jié)合到聚合物上時(shí)，其可以通過親合標(biāo)記物(例如二價(jià)金屬和/或抗生物素蛋白)結(jié)合組氨酸或生物素化蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)。如需要，為了更加有效地結(jié)合蛋白質(zhì)，所述顆粒自然可以包含超過一種的上述類型或范疇的官能團(tuán)。所述鏈或纖維的聚合物可為均聚物，并且可為聚乙烯亞胺。所述交聯(lián)劑可為戊二醛或另外的醛；環(huán)氧化物；或者，具有兩個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的任何其它合適的化合物。所述顆?？梢园ㄏ萑胩钕犊谆蚋駹罱Y(jié)構(gòu)的空間的添加物。所述添加物可選自輔助因子、改性的輔助因子、或化學(xué)介體、磁石和/或磁性物質(zhì)中。通過在顆粒中包含適合的酶和/或作為添加物的物質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)用于反應(yīng)中的輔助因子的連續(xù)再生，從而使反應(yīng)達(dá)到平衡或完成。通過包含作為添加物的磁石或磁性物質(zhì)，使用磁性分離，可以容易地實(shí)現(xiàn)顆粒從形成的液體介質(zhì)中的回收。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種制造顆粒的方法，該方法包括提供分散在第二液相中的第一液相的液滴的乳液，一種液相為水相而另一種液相為油相，并且水相包含溶于其中的聚合物以及溶于其中的交聯(lián)劑；使交聯(lián)劑交聯(lián)聚合物的鏈，從而形成顆粒，各顆粒包含通過交聯(lián)劑交聯(lián)的聚合物鏈的格狀結(jié)構(gòu)、靠近和圍繞所述鏈的填隙孔以及在所述格狀結(jié)構(gòu)上的官能團(tuán)，并且蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)能夠與所述官能團(tuán)反應(yīng)從而使蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)結(jié)合到所述格狀結(jié)構(gòu)上并因此被固定。所述第一液相可為水相，所述第二液相因此為油相，從而所述乳液為油(O)包水(w)乳液，即w/o乳液。然而，在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，所述乳液可為水包油(0/V)乳液、水包油包水(w/o/w)乳液或油包水包油(o/w/o)乳液。通過將包含分散在油相中的水滴(含有溶于其中的聚合物)的第一乳液與包含分散在油相中的水滴(含有溶于其中的交聯(lián)劑)的第二乳液混合可以形成所述乳液。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種制造顆粒的方法，該方法包括提供分散在第二液相中的第一液相的液滴的第一乳液，一種液相為水相而另一種液相為油相，并且水相包含溶于其中的聚合物；將分散在第二液相中的第一液相的液滴的第二乳液與第一乳液混合，一種液相為水相而另一種液相為油相，并且水相包含溶于其中的交聯(lián)劑；使交聯(lián)劑交聯(lián)聚合物的鏈，從而形成顆粒，各顆粒包含通過交聯(lián)劑交聯(lián)的聚合物鏈的格狀結(jié)構(gòu)、靠近和圍繞所述鏈的填隙孔以及在所述格狀結(jié)構(gòu)上的官能團(tuán)，并且蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)能夠與所述官能團(tuán)反應(yīng)從而使蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)結(jié)合到所述格狀結(jié)構(gòu)上并因此被固定。至少一相可包含洗滌劑或表面活性劑。表面活性劑可以選自兩性離子表面活性齊U、中性表面活性劑、帶電荷表面活性劑和/或聚合物表面活性劑中。陰離子表面活性劑包括烷基硫酸鹽(如十二烷基硫酸鈉或月桂醇聚醚硫酸酯鈉(sodiumlaurethsulphate))和烷基醚硫酸鹽。陽離子表面活性劑包括西曲氯銨(centrimoniumchloride)。非離子表面活性劑包括乙氧基化烷基酚，如聚氧化乙烯(10)異辛基環(huán)己基醚(TritonX100)或聚氧化乙烯(9)壬基苯基醚(壬苯醇醚_9)。兩性離子或兩親型表面活性劑包括癸基甜菜堿。聚合物表面活性劑包括山梨糖醇_(環(huán)氧乙烷)80，環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷三嵌段共聚物，還稱為泊洛沙姆，例如購(gòu)自BASF商品名稱為普盧蘭尼克(Pluronic)的，以及環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷三嵌段共聚物，還稱為美羅沙波(meroxapol)。至少原則上，油相的油可為任何適合的水不混溶的有機(jī)溶劑，植物油，礦物油，煤油或原油得到的油性成分，或合成油；然而，其優(yōu)選選自礦物油、石蠟和如異辛烷的溶劑中。如上所述，所述聚合物可為聚乙烯亞胺(PEI)，同時(shí)所述交聯(lián)劑可為雙官能或多官能醛，例如戊二醛、琥珀醛、葡聚糖醛、己二異氰酸酯和乙二醛。其它的適合的交聯(lián)劑可以用于PEI或衍生PEI，或者其它的聚合物，例如異氰酸酯(包括己二異氰酸酯或二異氰酸甲苯酯，或異硫氰酸酯)；環(huán)氧化物(例如2-氯甲基環(huán)氧乙烷)；酐；環(huán)氧氯丙烷，1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亞胺；氯乙酸乙酯等等。由于未反應(yīng)的官能團(tuán)用于固定蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)，交聯(lián)劑也可認(rèn)為是用于聚合物改性或后交聯(lián)改性的衍生劑(derivitisationagent)?？梢允褂闷渌木酆衔锖凸簿畚?，例如聚乙烯醇、尼龍、藻酸鹽、其它的蛋白質(zhì)(例如白蛋白、膠原等等)等，改性的或沒有改性的。所述方法可以包括將蛋白質(zhì)(例如酶、抗體或抗原)和/或改性的蛋白質(zhì)引入到顆粒中或顆粒上，以使蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)與如上所述的在聚合鏈或纖維上和/或在交聯(lián)劑上的官能團(tuán)反應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)被結(jié)合到鏈或纖維的聚合物上和/或結(jié)合到交聯(lián)劑上，并因此被固定。所述方法可包括將添加物加入到其中一個(gè)相中，以使該添加物被陷入到顆粒的格狀結(jié)構(gòu)內(nèi)?？梢栽趯⒌鞍踪|(zhì)連到格狀結(jié)構(gòu)之前或之后進(jìn)一步加入添加物。如上所述，所述添加物可以選自輔助因子、改性的輔助因子、化學(xué)介體、磁石和/或磁性物質(zhì)中。所述方法可包括從油相中回收所述顆粒。特別是，可以用物理分離手段(如離心或過濾)進(jìn)行顆粒的回收。所述方法可以包括干燥回收的顆粒。顆粒的干燥可以包括丙酮脫水、空氣干燥、噴霧干燥或優(yōu)選地冷凍干燥或真空干燥。如上所述，所述方法可以包括在顆粒干燥之前將添加物加入到回收的顆粒中，以使添加物被陷入顆粒的格狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。為了實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)和顆粒的增強(qiáng)的穩(wěn)定作用，和/或?yàn)榱藢?shí)現(xiàn)添加劑(天然或改性的輔助因子)的陷入，可以在蛋白質(zhì)固定之前或之后進(jìn)行干燥回收的顆粒。通過多點(diǎn)附著，干燥還可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)或改性的蛋白質(zhì)的交聯(lián)增強(qiáng)。這反過來可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)(例如酶)的穩(wěn)定性。設(shè)想本發(fā)明的顆粒能夠具有不同的用途或應(yīng)用，例如用于生物催化、基于酶的生物治療、診斷學(xué)，以及用于結(jié)合到固體載體(如膜反應(yīng)器或蛋白質(zhì)固定基質(zhì))的表面，以增大其表面積?，F(xiàn)將參照下列實(shí)施例和附圖更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。附圖中，圖1為根據(jù)實(shí)施例1戊二醛交聯(lián)的PEI的聚合物顆粒的顯微鏡照片，其顯示PEI載體的聚合鏈/纖維的格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造骨架；圖2為顯示根據(jù)實(shí)施例2漆酶結(jié)合到纖維格狀結(jié)構(gòu)所獲得的結(jié)果，用pH分布改變校正的結(jié)合效率；圖3顯示使用多種油相制造的顆粒的粒度分布(平均尺寸)分析，其中，顆粒未被干燥(濕的)、已被干燥(使用冷凍干燥)，內(nèi)嵌超聲處理(in-lineultrasonication)(US)或在用超聲處理預(yù)處理后測(cè)量；圖4顯示使用多種表面活性劑制造的顆粒的粒度分布分析；其用光散射測(cè)定，或在超聲處理后(us后)分析；圖5顯示使用單乳液(singleemulsion)制造的濕的顆粒和干的顆粒的粒度分布；結(jié)果顯示重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差；其用光散射測(cè)定，伴隨在線超聲處理(伴隨US)，或在樣品預(yù)超聲處理后(US后)分析；圖6顯示在20ml體積礦物油和200ml體積礦物油制造的濕的顆粒和干的顆粒的粒度分布；圖7顯示在含有或不含有作為潛在保護(hù)物的底物的情況下結(jié)合到顆粒的多種酶的活性維持；圖8顯示在PEIpH為8(圖8A)和11(圖8B)制造的游離漆酶以及濕的和干的漆酶結(jié)合顆粒的最適溫度；圖9顯示在PEIpH為8和11制造的游離漆酶以及濕的和干的漆酶結(jié)合顆粒的pH穩(wěn)定性(6小時(shí))；圖10A顯示根據(jù)實(shí)施例14的在未經(jīng)后處理的纖維格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造上的固定化酶和游離酶的漆酶pH分布，說明了聚乙烯亞胺(‘PEI’)濃度變化對(duì)pH分布改變的影響；圖10B顯示根據(jù)實(shí)施例14在未經(jīng)后處理的纖維格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造上的固定化酶和游離酶的漆酶PH分布，說明了戊二醛濃度變化對(duì)pH分布改變的影響；圖11A顯示根據(jù)實(shí)施例14在戊二醛后處理的纖維格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造上的固定化酶和游離酶的漆酶PH分布，說明了PEI濃度變化對(duì)pH分布改變的影響；圖11B顯示根據(jù)實(shí)施例14在戊二醛后處理的纖維格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造上的固定化酶和游離酶的漆酶PH分布，說明了戊二醛濃度變化對(duì)pH分布改變的影響；圖12顯示了用于實(shí)驗(yàn)AF的顆粒的過氧化物酶活性獲得的結(jié)果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備由聚合鏈/纖維的網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)組成的顆粒該方法包括油包水乳液的形成，在該油包水乳液中，使含有聚胺聚合物(聚乙烯亞胺)的乳液與另一種伯胺交聯(lián)劑(戊二醛)混合。使兩種試劑反應(yīng)形成以微觀顆?；蛑榱Ｐ问降木酆衔铩；瘜W(xué)藥品戊二酸(25%水溶液)得自AcrosOrganics(GeelWestZone2，JanssenPharmaceutica1aan3a，2440Geel，比利時(shí))。聚乙烯亞胺(PEI)(50%水溶液，Cat-No.P_3143，Mw750，000和Mn60，000)得自Sigma-Aldrich(StLouis，Missouri63178)。礦物油(藥用白油，48031)購(gòu)自Castrol(8JunctionAvenue,Parktown,2193Johannesburg,南非)。制造顆粒的方法乳液A組成IOml礦物油(油相)0.05ml壬苯醇醚_4(nonoxyol-4)(表面活性劑)0.5ml聚乙烯亞胺(聚胺)，(10%m/v水溶液)，pH11使用磁力攪拌器以700rpm攪拌30min。乳液B組成IOml礦物油(油相)0.05ml壬苯醇醚_4(nonoxyol-4)(表面活性劑)0.5ml戊二醛，(25%m/v，等級(jí)II)使用磁力攪拌器以700rpm攪拌30min。將兩種乳液(A和B)混合以使聚合物進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)并且使用磁力攪拌器棒以700rpm攪拌30分鐘到1小時(shí)以確保其保持乳液狀態(tài)。然后，在3000rpm下使該乳液離心(在配備有JA20.1轉(zhuǎn)子的Beckman-CoulterJ2-21ME中，10分鐘)從而回收形成的顆粒。將顆粒狀物再懸浮于去離子水中，稀釋至1040ml，而后再次離心。這種沖洗處理重復(fù)兩次以上。最終的上清液是澄清的。將最終的顆粒狀物懸浮于IOmlTris-Cl緩沖液(0.05M,pH8.0)中。結(jié)果通過離心回收來自全部乳液制品的材料并通過光學(xué)顯微鏡觀察。格狀結(jié)構(gòu)形成結(jié)果示于圖1，說明形成了大致球形的顆粒。PEI戊二醛濃度比對(duì)顆粒形成的影響研究PEI與戊二醛的比例對(duì)顆粒形成的影響。按照表1制備樣品。通過纖維骨架格狀結(jié)構(gòu)或載體的冷凍干燥并稱量來進(jìn)行干重測(cè)定。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于表1中，并且說明寬范圍的反應(yīng)物組合形成了顆粒。表1用于纖維聚合骨架制造的PEI和戊二醛的數(shù)量的評(píng)價(jià)實(shí)施例2漆酶與PEI載體的聚合鏈/纖維的格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造骨架的結(jié)合酶DeniLite，一種漆酶，得自Novozymes(NovozymesA/S,Krogshoejvej36,2880Bagsvaerd,j5}-^)°酶的洗滌通過在IOOml重蒸餾的H2O中溶解5gDeniLiteIIBase，同時(shí)在4°C以200rpm攪拌1小時(shí)，從DeniLite中部分純化漆酶。通過使用Beckman-CoulterJ2-21ME離心機(jī)中的JA14轉(zhuǎn)子在4°C在IOOOOrpm下離心1小時(shí)移除懸浮固體。移出上清液并使用具有IOkDa截留的SnakeSkin(Pierce)透析管在4°C透析，并換水(51)三次。前兩次在持續(xù)2小時(shí)后更換，而最后的透析持續(xù)12小時(shí)。使酶在液氮中冷凍并凍干。使用前在4°C下儲(chǔ)存這種漆酶。漆酶測(cè)定在將漆酶結(jié)合到載體并且使漆酶固定在載體上后對(duì)離心的上清液進(jìn)行漆酶測(cè)定以測(cè)定結(jié)合時(shí)的活性維持情況。漆酶試劑包含在IOOmM琥珀酸鹽-乳酸鹽緩沖液(pH4.5)中的ImM的愈創(chuàng)木酚作為底物(JordaanJ,PletschkeB,LeukesW.2004Purificationandpartialcharacterizationofathermostablelaccasefromanunidentifiedbasidiomycete.Enz.Microb.Technol.34:635_641)。以消光系數(shù)為5200M"1.cnT1在450nm重復(fù)三次進(jìn)行測(cè)定。使用PowerWaveHTMicrotitre酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。酶的一個(gè)單位定義為每分鐘氧化1μmol底物所需酶的數(shù)量。蛋白質(zhì)測(cè)定在通過用漆酶作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在280nm的吸光度測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)濃度之后進(jìn)行蛋白質(zhì)負(fù)載。結(jié)合的蛋白質(zhì)定義為總蛋白質(zhì)減去溶液中的剩余蛋白質(zhì)。酶的固定化通過在室溫下溫和攪拌30分鐘使酶(漆酶(Iml的IOmg.πιΓ1溶液))結(jié)合到載體上。酶被結(jié)合到干重示于表2中的骨架上。通過在700xg離心5分鐘回收結(jié)合有漆酶的顆粒。用50ml水洗滌固定化酶5次并通過上述離心回收。將蛋白質(zhì)(此時(shí)為酶(漆酶))以緩沖溶液的形式加入到PEI-戊二醛顆粒(衍生的或非衍生的)中。按照實(shí)施例1中描述的方法制備顆粒。使顆粒與蛋白質(zhì)反應(yīng)從而使蛋白質(zhì)固定到上述聚合物上。在通過離心回收之后和在使用之前顆粒未被干燥。將蛋白質(zhì)結(jié)合到各種制成的蛋白質(zhì)載體上的結(jié)果列于下表2中，而漆酶活性結(jié)果示于圖2中。結(jié)果按照表1制備另一實(shí)驗(yàn)組；然而，在該實(shí)驗(yàn)中，將顆粒用戊二醛后處理并指定為編號(hào)二(即A2-J2)。隨后，根據(jù)上述方法，使漆酶結(jié)合到顆粒。通過以700xg離心5分鐘回收結(jié)合有漆酶的顆粒。負(fù)載到聚合物載體上的酶活性結(jié)果示于圖2中。該研究表明，纖維格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造可用作具有高蛋白質(zhì)結(jié)合量同時(shí)保持蛋白質(zhì)的功能活性的蛋白質(zhì)固定載體。實(shí)施例3使用各種油制造PEI載體的聚合鏈/纖維格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造骨架研究乳液的油相變化的影響。通過最初制備2種單獨(dú)的乳液A和B制造顆粒。乳液A組成IOml礦物油、石蠟油或異辛烷(油相)0.Iml壬苯醇醚-4(nonoxyol-4)(表面活性劑)0.5ml聚乙烯亞胺(聚胺)，(10%m/v水溶液)，pH11使用磁力攪拌器以500rpm在25°C攪拌30min。乳液B組成IOml油相(同上)0.Iml壬苯醇醚-4(nonoxyol-4)(表面活性劑)0.5ml戊二醛，(25%m/v，等級(jí)II)，使用磁力攪拌器以500rpm在25°C攪拌30min。其后，將乳液A迅速加入到乳液B中并另外攪拌一小時(shí)(700rpm)。通過離心(3000xg，Sorvall臺(tái)式離心機(jī))10分鐘接著用IOml體積的去離子水洗滌重復(fù)6次來從乳液中回收顆粒。洗滌后，用去離子水將最終的顆粒重懸浮到20ml，一半通過冷凍干燥被干燥。同時(shí)將濕的顆粒和干燥的顆粒進(jìn)行粒度分布分析(MalvernMastersizer2000)。為了研究附聚作用的存在，在內(nèi)嵌聲處理(in-linesonication)之前、之中和之后，測(cè)定粒度。還測(cè)定冷凍干燥后的回收的質(zhì)量。結(jié)果測(cè)定用不同油相(總體積各為20ml)制造的顆粒的回收的質(zhì)量，用礦物油、石蠟油和異辛烷回收的顆粒的質(zhì)量分別為lllmg、90mg和79mg。比較在各種油相中制造的未經(jīng)聲處理的濕的顆粒與干的顆粒，顯示對(duì)于礦物油和石蠟油樣品，干燥后，平均粒度增加(圖3)。盡管進(jìn)行干燥步驟，在異辛烷中制造的顆粒保持相對(duì)不變。內(nèi)嵌聲處理和預(yù)聲處理顯示了在礦物油和石蠟油中制造的干燥顆粒的粒度分布的大幅度降低，說明干燥后顆粒附聚(圖3)，但可通過聲處理分離。在礦物油和石蠟油中制成的濕的顆粒的粒度分析還顯示，用聲處理對(duì)顆粒進(jìn)行處理其平均粒度降低，盡管比用干燥顆粒的程度小(圖3)。在異辛烷中制造的顆粒不論干燥或聲處理保持相對(duì)不變。總之，可以使用各種油相來制造顆粒?？梢允褂貌煌挠拖?據(jù)推測(cè)其影響乳液液滴大小)以及各種后處理技術(shù)(如干燥或聲處理)來巧妙地控制它們的大小。實(shí)施例4使用多種表面活性劑制造PEI載體的聚合鏈/纖維格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造骨架在顆粒的合成中，表面活性劑的種類可能具有影響。對(duì)其進(jìn)行了研究。除了僅將礦物油用作油相并變化表面活性劑的類型之外，根據(jù)實(shí)施例3制備顆粒。結(jié)果測(cè)定在礦物油(總體積為20ml)中用多種表面活性劑(壬苯醇醚_4、CHAPS和TritonX-10)制造的顆粒的回收質(zhì)量0分別為11111^、7211^和9211^。在使用0^5和1^^011X-100時(shí)，用不同的表面活性劑制造的顆粒干燥后顯示沒有實(shí)際意義上的尺寸差異(圖4)。用壬苯醇醚-4作為表面活性劑制造的顆粒干燥后粒度增加了大約50%(圖4)。此外，聲處理后的尺寸分析顯示，用全部測(cè)試的表面活性劑制造的顆粒的粒度持續(xù)減小。在已將顆粒進(jìn)行聲處理后，在干燥之前或之后顆粒的粒度分析是相似的。總之，可以使用多種表面活性劑制造顆粒。而且，可用多種表面活性劑和后處理巧妙地控制粒度。實(shí)施例5用多種多醛作為聚合物交聯(lián)劑的顆粒的合成在顆粒的合成中使用的交聯(lián)劑醛可以是多種多樣的。因此，比較作為交聯(lián)劑的戊二醛、葡聚糖醛和己二異氰酸。除了以下情況一種情況用葡聚糖醛(Iml的15mg/ml)代替戊二醛；另一種情況用0.5ml己二異氰酸酯(25%ν/ν)代替戊二醛，按照實(shí)施例3的方法制造顆粒。向5ml顆粒懸浮液中加入6ml的5mg.πιΓ1在Tris-Cl緩沖液(0.05M，pH8.0)中的純化的Candidaantarctica脂肪酶B(CALB)，將其在25°C輕輕攪拌1小時(shí)。然后，在4°C將懸浮液離心并用IOml緩沖液洗滌兩次。然后將懸浮液離心并且將顆粒狀物再懸浮于IOmlTris-Cl緩沖液中。使用丁酸對(duì)硝基苯酯測(cè)定懸浮液(10μ1)。為了比較，使用基于丁酸對(duì)硝基苯酯的水解的測(cè)定和其隨后的分光光度測(cè)定法分析，還測(cè)定10μ1的0.5mg.πιΓ1的在Tris-Cl緩沖液(0.05M,pH8.0)中的純化的Candidaantarctica脂肪酶B(表3)。脂肪酶活性測(cè)定脂肪酶的活性影響對(duì)硝基苯基酯(丁酸對(duì)硝基苯酯(PNPB))至對(duì)硝基酚和丁酸的水解。對(duì)硝基酚的釋放產(chǎn)生黃色(用UV/Vis分光光度計(jì)在410nm測(cè)量)。重復(fù)三次測(cè)定活性。溶液的制備如下溶液A包含溶于8ml丙-2-醇中的酶底物；而溶液B包含267mg溶于50mMTris緩沖液(pH8.0)中的去氧膽酸鈉，接著溶解66.7mg阿拉伯膠。使用PowerWavemicrotitre酶標(biāo)儀(BioTekInstruments)，用240μ1的上述溶液的110(ΑB)混合物和10μ1的固定化脂肪酶懸浮液溶液或游離酶，在25°C進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果用多種醛交聯(lián)劑制成的顆粒的比較-CALB的活性。盡管沒有使該方法最優(yōu)化，但是其顯示，使用一定范圍的多醛化合物可以產(chǎn)生顆粒。這種物質(zhì)可以在0.45μm過濾器(Sartorius)上被回收并再使用，因?yàn)樵谥貜?fù)利用5次以上時(shí)，戊二醛顆粒具有7.05U.πιΓ1的平均值，或者具有最初活性的81%。使用來自熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens(PFL))的脂肪酶進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)。酶活性的測(cè)定使用丁酸的對(duì)硝基苯基酯(PNPB)和棕櫚酸的對(duì)硝基苯基酯(PNPP)作為底物。ΜΛ用多種醛交聯(lián)劑制成的顆粒的比較-PFL的活性因此，可以使用多種醛來同時(shí)提供用于形成顆粒的有效交聯(lián)和將蛋白質(zhì)交聯(lián)到顆粒上的官能團(tuán)。交聯(lián)劑的選擇可以通過酶變性的程度或顆粒與底物和產(chǎn)物的可及性的程度影響酶的活性?；诿负头磻?yīng)底物可以選擇最佳試劑。實(shí)施例6使用雙官能環(huán)氧化物交聯(lián)劑制造顆粒可以用其它的如雙環(huán)氧化物(例如1，4_丁二醇二環(huán)氧甘油醚)的其它交聯(lián)劑代替顆粒合成中使用的交聯(lián)劑醛。將其以0.5ml純度為50%、25%或12.5%ν/ν溶液加入(替代戊二醛)到交聯(lián)劑乳液(B)中并且在40°C反應(yīng)(按照實(shí)施例3)2小時(shí)。通過離心(3000xg,SorvallRT7臺(tái)式離心機(jī))10分鐘接著用IOml體積去離子水洗滌重復(fù)6次從乳液中回收顆粒。洗滌后，將最終的顆粒再懸浮到20ml的去離子水中。用12.5%或25%ν/ν環(huán)氧化物溶液如上制備的那些外形上幾乎全部一致，而使用純度為50%環(huán)氧化物形成的顆粒大且彌散。使用CALB(按照前面的實(shí)施例)研究蛋白質(zhì)的結(jié)合，使其透析過夜并在輕輕攪拌下與基于環(huán)氧化物的顆粒(用12.5%ν/ν環(huán)氧化物溶液如上制備)反應(yīng)一小時(shí)。在如實(shí)施例5中所述將脂肪酶結(jié)合顆?；厥障礈旌螅治雒富钚?。用PNPB作為底物進(jìn)行全部分析。結(jié)果使用丁二醇二環(huán)氧甘油醚作為交聯(lián)劑導(dǎo)致形成直徑大約為0.Imm的白色顆粒。然而，該顆粒外形上有點(diǎn)不規(guī)則，說明在交聯(lián)或隨后的清潔步驟的顆粒存在附聚。在酶的存在下，將用12.5%ν/ν環(huán)氧化物溶液制造的顆粒溫育過夜。這些顆粒產(chǎn)生的活性為0.28U.HiF10這說明，使用環(huán)氧化物交聯(lián)劑可以制造顆粒。實(shí)施例7在單乳液中制造的PEI載體的聚合鏈/纖維格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造骨架可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)用于顆粒形成的方法。例如，可以通過應(yīng)用單乳液形成顆粒。然后可以通過雙注射裝置注射進(jìn)入混合室，在水相中同時(shí)混合聚合物和交聯(lián)劑。最簡(jiǎn)單形式的這種裝置可由在同一點(diǎn)注射到共用管的兩個(gè)注射器組成。其可被直接注射到油相。例如，使用20ml礦物油(其中溶解0.2ml壬苯醇醚_4大約5分鐘)和以500rpm使用磁力攪拌，評(píng)價(jià)這種設(shè)備。一個(gè)注射器包含0.5mlPEI(10%)而另一個(gè)包含0.5ml戊二醛(20%，等級(jí)II)。直接向礦物油中同時(shí)壓注射器。將生成的乳液攪拌1小時(shí)而后按照實(shí)施例3回收顆粒。重復(fù)三次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將顆粒分成2等份，一份冷凍干燥(Virtis)并再懸浮至最初體積，接著用于粒度分布(MalvernMastersizer2000)分析。，樣品用于回收質(zhì)量分析。結(jié)果計(jì)算使用單乳液制造的顆粒的回收質(zhì)量為152士12mg，比使用2乳液策略(指實(shí)施例3)獲得的高大約1.4倍。使用單乳液形成顆粒是可能的并且使用當(dāng)前的制造技術(shù)使可復(fù)現(xiàn)的(圖5)。發(fā)現(xiàn)顆粒的粒度分布比使用雙乳液形成的那些大(圖5)。顯示單乳液獲得的濕的和干的顆粒的尺寸分布比雙乳液實(shí)驗(yàn)獲得的那些尺寸大5070%(圖3)。實(shí)施例8=PEI載體的網(wǎng)狀構(gòu)造或聚合鏈/纖維的格狀結(jié)構(gòu)的大規(guī)模制造目標(biāo)是10倍線性擴(kuò)大顆粒制造規(guī)模并評(píng)價(jià)粒度。除了第二批包含10倍數(shù)量的所需各個(gè)組分，根據(jù)實(shí)施例3中所述的標(biāo)準(zhǔn)制造方法制備分開的兩批顆粒。根據(jù)比例按照實(shí)施例3對(duì)兩批進(jìn)行處理以回收顆粒。結(jié)果計(jì)算在20ml和200ml體積的礦物油中制造的顆粒的回收質(zhì)量分別為0.Illg和1.llg，準(zhǔn)確地差10倍。可以在20和200ml體積的礦物油制造顆粒，較大規(guī)模制造的顆粒的粒度比在20ml規(guī)模獲得的那些的粒度始終僅小一點(diǎn)(圖6)。有趣的是，與在較小規(guī)模的干燥顆粒相比，在較大規(guī)模制造的未經(jīng)聲處理的干燥顆粒的尺寸小大約50%(圖6)?；诨厥召|(zhì)量和粒度分析，在標(biāo)準(zhǔn)條件下的顆粒的制造可放大至少10倍。實(shí)=PEI載體的網(wǎng)狀構(gòu)造或聚合鏈/纖維的格狀結(jié)構(gòu)在固定一定范圍的酶類方面的應(yīng)用目的是使不同的酶結(jié)合到顆粒骨架，并計(jì)算其結(jié)合百分比以及保持的酶活性。使用根據(jù)實(shí)施例3制造的顆粒。研究的酶為漆酶(Novozymes51009，Myceliopthorathermophilia)、葡萄糖氧化酶(SeravacPtyLtd,Aspergillusniger)禾口月旨肪酶(CALB，NovozymesCandidaantarctica)。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，將5mg的各酶(0.5ml，IOmg.ml-1)結(jié)合到14mg的顆粒(0.5ml,28mg.ml-1)上，伴隨輕輕搖動(dòng)進(jìn)行2小時(shí)(25°C)。使用AllegraX22R離心機(jī)(2000xg)將每種樣品離心10分鐘。將顆粒連續(xù)洗滌6次，每次用2ml去離子水。混合的上清液部分用于總蛋白質(zhì)分析。在含有和不含有特定底物(作為潛在保護(hù)物)的情況下各自進(jìn)行各酶結(jié)合的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于漆酶，市售介體DenilliteIIAssist(Novozymes)為潛在保護(hù)物(50μ1的IOOmg.ιΓ1,ρΗ調(diào)節(jié)至6.8)，對(duì)于葡萄糖氧化酶，潛在保護(hù)物為葡萄糖(50μ1的10%m/v葡萄糖一水合物)，以及對(duì)于CALB，使用2-異丙基-5-甲基環(huán)己醇(薄荷醇)的8非對(duì)映異構(gòu)混合物(50μ1)。將顆粒再懸浮到2ml的去離子水中。測(cè)定顆粒的各酶活性。全部測(cè)定重復(fù)三次進(jìn)行?？偟鞍踪|(zhì)使用Bio-Rad總蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Cat.No.=500-0006)進(jìn)行總蛋白質(zhì)測(cè)定，各自使用各酶作為標(biāo)準(zhǔn)。使用在IOOmM琥珀酸鹽-乳酸鹽緩沖液ρΗ4.5中的ImM2，2，-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)作為底物測(cè)定漆酶活性。在420nm測(cè)量溶液的光密度。通過將20μ1的樣品加入到180μ1的ABTS試劑中進(jìn)行這些測(cè)定。活性測(cè)定如下在25°C溫育下使用PowerWaveHT(BiotekInstruments)在420nm分光光度計(jì)測(cè)量。葡萄糖氧化酶使用辣根過氧化物酶(HRP)間接氧化鄰聯(lián)二茴香胺測(cè)量葡萄糖氧化酶(GOX)活性。根據(jù)Bergmeyer等人，1988提出的方法進(jìn)行測(cè)定。制備下列試劑試劑A，0.IM磷酸鉀緩沖液，PH7，包含鄰聯(lián)二茴香胺·2HC1(0.006%)；試劑B，D-葡萄糖的10%水溶液(使用前進(jìn)行變旋作用Ih)；試劑CjOUmr1HRP水溶液。在測(cè)定葡萄糖氧化酶前立即分別以2451的比例混合試劑A、B和C。該反應(yīng)包含0.3ml的反應(yīng)試劑并且通過加入10μ1的樣品開始測(cè)定。在25°C在436nm(PowerWaveHTMicrotitre酶標(biāo)儀)動(dòng)態(tài)測(cè)量反應(yīng)。葡萄糖氧化酶活性的一個(gè)單位定義為在25°C和ρΗ7下每分鐘使1微摩爾β-D-葡萄糖催化轉(zhuǎn)變成葡萄糖酸內(nèi)酯和H2O2的酶的量。脂肪酶脂肪酶的活性影響將將對(duì)硝基苯基酯水解成對(duì)硝基酚和脂肪族羧酸。對(duì)硝基酚的釋放產(chǎn)生黃色，其用UV/Vis分光光度計(jì)在410nm測(cè)量。使用兩種對(duì)硝基酚酯，對(duì)硝基苯基乙酸酯(PNPA)和對(duì)硝基苯基丁酸酯(PNPB)，并且重復(fù)三次測(cè)量活性。制備溶液如下溶液A包含溶于8ml丙-2-醇中的酶底物(11.6mgPNPA或24mgPNPP)；而溶液B包含溶于50mMTris-緩沖液(ρΗ8.0)中的267mg去氧膽酸鈉接著66.7mg阿拉伯膠。使用Powerffavemicrotitre酶標(biāo)儀(BioTek)°C，用240μ1的上述溶液的混合物和10μ1的球酶(spherezyme)或游離脂肪酶溶液在25°C進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果所有的用于結(jié)合到顆粒上的測(cè)試的酶的蛋白質(zhì)負(fù)載為30%到36%(表5)。各種酶與顆粒骨架載體的結(jié)合效率在酶的固定化期間加入底物以保護(hù)活性位點(diǎn)(參照上述方法)。與，包含薄荷醇底物有利地保持CALB對(duì)PNPA的活性比無底物的大約高30%的活性(83%)(圖7)。漆酶、葡萄糖氧化酶和CALB都成功地結(jié)合到顆粒上并保持活性，說明一定范圍的蛋白質(zhì)可以以高蛋白質(zhì)負(fù)載下有效地結(jié)合到顆粒上。此外，其它的酶(如辣根過氧化物酶、蛋白酶和脫氫酶)也顯示了結(jié)合到顆粒上(見下列實(shí)施例)。實(shí)施例10=PEI載體的聚合鏈/纖維的網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)；結(jié)合有多種酶的顆粒設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以表明對(duì)于兩種酶，超過1種酶可結(jié)合到顆粒骨架上并保持活性。選擇葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶體系。根據(jù)實(shí)施例3制造顆粒。研究的酶為葡萄糖氧化酶(SeravacPtyLtd,Aspergillusniger)禾口辣根過氧化物醇(SerevacPtyLtd)。例如，將5mg(0.5ml，IOmg.ml—1)葡萄糖氧化酶和IOmg的辣根過氧化物酶(lml,IOmg.mF1)結(jié)合到28mg(lml，28mg.πιΓ1)的顆粒骨架上，伴隨輕輕搖動(dòng)2小時(shí)(25°C)。使用AllegraX22離心機(jī)(200xg)將各樣品離心10分鐘。將顆粒連續(xù)洗滌6次，每次用2ml去離子水?；旌系纳锨逡翰糠钟糜诳偟鞍踪|(zhì)分析。根據(jù)實(shí)施例9中的葡萄糖氧化酶的測(cè)定方法測(cè)定顆粒的活性，但是在測(cè)定試劑中不包含辣根過氧化物酶。結(jié)果葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶被成功地結(jié)合到顆粒骨架上并且能夠以3μmol.miiT1的速率轉(zhuǎn)化葡萄糖(表6)。如測(cè)定檢測(cè)的活性，這說明葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶都被結(jié)合并且有活性。因此，可以使用顆粒結(jié)合超過一種酶并且其中兩種酶都保持活性。葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶雙酶顆粒的結(jié)合效率和活性(mg)(mg)(mg.g"1)(%m/m)(pmol.min·1)葡萄糖氧化酶和“TZTTT1“辣根過氧化物酶286·7240·724Λ3實(shí)施例11使用多種干燥方法制造的PEI載體的聚合鏈/纖維的網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)目的是制造顆粒并隨后使用不同的方法(如冷凍干燥、真空和丙酮干燥)使它們干燥。如在實(shí)施例1中所述的標(biāo)準(zhǔn)條件下制造顆粒。一旦洗滌完成，通過冷凍干燥(VirtisGenesis冷凍干燥器)、使用使用真空濃縮器(配備有SavantRVTlOO冷阱SavantSpeedVacSC110)的真空干燥、或通過用丙酮脫水接著在25°C空氣中干燥12小時(shí)干燥顆粒。由于附聚作用，丙酮干燥的顆粒不能在水性介質(zhì)中被再懸浮，并因此不進(jìn)一步考慮。然而，真空干燥和冷凍干燥都是干燥顆粒的成功技術(shù)并且能夠隨后用于一系列的酶和蛋白質(zhì)的附著(表7)。向5ml的顆粒懸浮液中加入在Tris-Cl緩沖液(0.05M，pH8.0)中的6ml的5mg.mirT1純化的酶，在25°C輕輕攪拌1小時(shí)。然后在4°C下將懸浮液離心并用IOml緩沖液洗滌兩次。然后，將懸浮液離心并在IOmlTris-Cl緩沖液(0·05Μ，ρΗ8.0)中再懸浮顆粒狀物。使用MalvernMastersizer測(cè)定粒度。結(jié)果表7多種干燥處理后的平均粒度。顆權(quán)-條職聲處理2249818.948顆粒-Alcalase蛋白冷凍干燥未處理30.73732.884Sl(Novozymes)聲處理20.29722.698該實(shí)施例顯示，用干燥，尤其用冷凍干燥，不會(huì)有很大程度的附聚作用。實(shí)施例12在多種pH下由PEI制備的聚合鏈/纖維的載體的網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)與漆酶結(jié)合特性測(cè)定結(jié)合后干燥對(duì)漆酶性質(zhì)的作用或結(jié)合的顆粒對(duì)酶特性的作用。根據(jù)實(shí)施例3中所述的標(biāo)準(zhǔn)制造方法制造顆粒，除了pH為IlPEI(10%)制品以夕卜，還評(píng)價(jià)了調(diào)節(jié)到PH為8的制品。其后，除了使Iml的漆酶(Novozyme51004，50mg.ml—1)與6.25ml顆粒(16mg.πιΓ1)反應(yīng)之外，按照實(shí)施例9所述的方法將漆酶固定到骨架上，從而每IOOmg的顆粒結(jié)合50mg的漆酶。用12.5ml去離子水洗滌漆酶結(jié)合顆粒并將其再懸浮到20ml的去離子水中。將顆粒分成兩等份(每份10ml)，將其樣品冷凍干燥用于回收質(zhì)量測(cè)定，并用于研究濕的和干的漆酶結(jié)合顆粒的特性。將干燥樣品再懸浮到最初體積的去離子水中。所有測(cè)定重復(fù)三次。用漆酶作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，使用Bio-Rad總蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Cat.No.=500-0006)測(cè)定漆酶上清液樣品的總蛋白質(zhì)。根據(jù)實(shí)施例9測(cè)定漆酶活性。結(jié)果通過冷凍干燥干燥漆酶結(jié)合顆粒顯示，在pH為11下用PEI制造顆粒時(shí)達(dá)到了較高的回收質(zhì)量(表8)，盡管在pH為8下使用PEI制造的顆粒結(jié)合更多的漆酶蛋白質(zhì)。使用pH為8PEI(16%)制造的未經(jīng)冷凍干燥的顆粒達(dá)到了對(duì)ABTS的最佳活性維持，但是冷凍干燥后相同樣品僅保持了3%的漆酶活性。注意到，使用pH為8PEI制造的顆粒在干燥后難以再懸浮，因此可能附聚，從而使表面積體積比(surfacetoarearatio)減小，因此由于在底物和產(chǎn)物上的擴(kuò)散限制而使活性降低。對(duì)于在PH為11使用PEI產(chǎn)生的顆粒未觀察到對(duì)活性的相同影響(表8)。在使用和不使用冷凍干燥的情況下在多種PEIpH值下制造的漆酶結(jié)合顆粒的結(jié)合效率和活性維持。該實(shí)驗(yàn)表明，用在不同的pH下PEI可以制備顆粒，以及這樣改變了顆粒與酶的結(jié)合性質(zhì)。實(shí)施例13在pH為8或11下制造PEI載體的聚合鏈/纖維的網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)并冷凍干燥，漆酶與其結(jié)合的穩(wěn)定性。測(cè)定漆酶結(jié)合到在pH為8和11制造并冷凍干燥的PEI載體的聚合鏈/纖維的網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性(如實(shí)施例12所述制造的漆酶結(jié)合顆粒)。最適溫度使用在IOOmM琥珀酸鹽-乳酸鹽緩沖液(pH4.5)中ImMABTS作為底物進(jìn)行游離漆酶和漆酶結(jié)合顆粒(在等值的蛋白質(zhì)負(fù)載)的最適溫度分布。將樣品(ΙΟΟμΙ)加入到1.9ml的預(yù)平衡過的底物中以在水浴中校正溫度。使用配備有Peltier溫度控制器的DU800分光光度計(jì)(Beckman-COulter，420nm)進(jìn)行測(cè)定。將分光光度計(jì)設(shè)定為目標(biāo)溫度并在加入在水浴中平衡過的試劑之前使比色杯平衡5分鐘。pH穩(wěn)定性使用IOOmM琥珀酸鹽-乳酸鹽緩沖液(pH4.5)中的ABTS(ImM)進(jìn)行游離漆酶和漆酶結(jié)合顆粒的PH穩(wěn)定性(在等值的蛋白質(zhì)負(fù)載)。在pH2.5、3和6下在Britton-Robinson通用緩沖液中溫育各種漆酶樣品。周期性地取出樣品(20μ1)并在25°C溫育的情況下使用PowerffaveHT(BiotekInstruments)在420nm分析(230μ1測(cè)定試劑)。用于該實(shí)驗(yàn)的6小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)示于下圖9中。結(jié)果結(jié)果示于圖8Α、8Β和9中。在70V游離(未固定)漆酶和結(jié)合到顆粒的漆酶活性最佳。然而，在90°C下與制備用于分析的樣品的時(shí)間內(nèi)的游離漆酶(0%活性)相比，漆酶結(jié)合顆粒顯示了提高的熱穩(wěn)定性(55-65%活性)。在使用干燥顆粒時(shí)還有較小提高，說明采用干燥是有利的。這可能是由于移除水時(shí)形成了更多的蛋白質(zhì)-顆粒連接。這反過來會(huì)增加蛋白質(zhì)或酶的多點(diǎn)共價(jià)結(jié)合，已知其提供了更大的穩(wěn)定性，例如提高的熱穩(wěn)定性[Improvementofenzymeactivity,stabilityandselectivityviaimmobilizationtechniques.Mateo,C.,Palomo,J.Μ.,Fernandez-Lorente,G.,Guisan,J.Μ.,Fernandez-Lafuente,R.2007EnzymeandMicrobialTechnology40(6),pp.1451—1463]。還測(cè)定了在pH為2.5、3和6下的漆酶結(jié)合顆粒和游離酶的pH穩(wěn)定性。在pH為2.5和pH為3下，所有漆酶結(jié)合顆粒樣品保持了80-110%活性，而游離酶分別已失去了大約70和40%活性(圖9)。因此固定提供了提高的pH穩(wěn)定性。6小時(shí)后在pH為6下包括游離酶的所有樣品都是穩(wěn)定的。因此在PEI載體的聚合鏈/纖維的網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)的顆粒上固定酶在極限pH下可提供額外的穩(wěn)定性。實(shí)施例14固定到PEI載體的聚合鏈/纖維的網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)的酶的最適pH改變。酶具有對(duì)于活性的最適pH。在一些情況下，酶的最適pH與反應(yīng)的其它方面的最適PH不同。例如，酶底物/反應(yīng)物可在另一pH下最佳溶解。另一個(gè)例子是在多步一鍋法反應(yīng)中使用超過一種酶，而其最適PH可能不同。因此，如果在固定期間酶的最適pH改變，這將具有商業(yè)和技術(shù)優(yōu)勢(shì)。因此，在固定和沒有固定到顆粒上的情況下測(cè)定漆酶的最適pH。酶測(cè)定漆酶試劑包含調(diào)節(jié)到目標(biāo)pH值的在50mMBritton-Robinson通用緩沖液中的ImM愈創(chuàng)木酚(DaviesTJ,BanksCE，NuthakkiB,RuslingJF,FranceRR,WadhawanaJD,ComptonRG.2002.Surfactant-freeemulsionelectrosynthesisviapowerultrasound:electrocatalyticformationofcarbon-carbonbonds.GreenChem.4570-577)。通用緩沖液用于確保存在相同的緩沖系統(tǒng)并且能夠在寬的pH范圍內(nèi)有效的緩沖。用SZOO^.cnT1的消光系數(shù)在450nm重復(fù)三次進(jìn)行測(cè)定。通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定固定到載體網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)的顆粒的漆酶以及游離酶的圖譜。使用PowerWaveHTMicrotitre酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。酶的一個(gè)單位定義為每分鐘使ιμmol底物氧化所需的酶的數(shù)量。pH分布改變因?yàn)橐呀?jīng)知道在固定期間pH分布發(fā)生改變，所以對(duì)結(jié)合到纖維格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造骨架載體的漆酶進(jìn)行PH分布測(cè)定。按照實(shí)施例3制造顆粒。由于戊二醛后處理的作用，還研究了戊二醛和PEI濃度的改變對(duì)最適pH改變的影響(實(shí)施例2，A2-J2)。結(jié)果結(jié)果示于圖10A、10B、11A和IlB中。對(duì)于pH分布改變通常的趨勢(shì)是向著中性到弱堿性pH。該實(shí)施例顯示，通過固定到顆粒上可以改變酶的pH分布。實(shí)施例15=PEI聚合鏈/纖維的網(wǎng)狀構(gòu)造或載體格狀結(jié)構(gòu)的多種官能性。顆粒骨架的官能性可被改變從而顯示蛋白質(zhì)的基于疏水、離子和親合結(jié)合。通過使包含0.Iml壬苯醇醚-4和0.5ml聚乙烯亞胺溶液的IOml礦物油的乳液(pH為11)和包含0.Iml壬苯醇醚-4和0.5ml戊二醛(Sigma等級(jí)II)的IOml礦物油的乳液混合制造顆粒。在混合前，以500rpm攪動(dòng)兩種乳液30分鐘。以500rpm攪動(dòng)該混合的乳液30分鐘。這樣提供了未改性的如前所述通過離心回收的顆粒。離子結(jié)合通過用戊二醛(200μ1的25%水溶液)官能化(用3x20ml的去離子水洗滌)接著通過用乙二胺(lml，0.33M)處理以與游離醛殘基反應(yīng)而在以上未改性顆粒上產(chǎn)生離子基團(tuán)(在室溫下周期性反轉(zhuǎn)1小時(shí))。將顆粒用過量的去離子水重復(fù)洗滌并通過在2000xg下離心10分鐘回收。在4°C將漆酶(2.5mg)與5mg的改性顆粒溫育30分鐘，用周期性反轉(zhuǎn)以確保適當(dāng)混合。為了測(cè)定離子結(jié)合，將1.OMNaCl(作為抗衡離子)加入到漆酶結(jié)合顆粒中并通過反轉(zhuǎn)混合5分鐘。通過離心回收顆粒(如上所述)并測(cè)定活性。疏水結(jié)合通過將未改性顆粒(5mg)與環(huán)氧辛烷(0.Iml)在25V溫育4小時(shí)而將疏水基團(tuán)加入到顆粒上。然后將其用過量的水反復(fù)洗滌并且通過離心回收(如上所述)。如通過在280nm測(cè)量蛋白質(zhì)吸光度所測(cè)定的，疏水結(jié)合的蛋白質(zhì)(熒光假單胞菌脂肪酶，5mg)可通過加入表面活性劑(1%脫氧膽酸鹽)而被移除。親合結(jié)合蛋白質(zhì)的親合結(jié)合示于實(shí)施例17中。結(jié)果離子結(jié)合45%的加入的漆酶被結(jié)合到改性顆粒上(通過Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定染料試劑方法500-0006所測(cè)定的，按照制造規(guī)程)。對(duì)于該45%的漆酶，通過加入作為抗衡離子的鹽(1.0MNaCl)可以移除76.9%的漆酶。與未改性的顆粒相比，其僅結(jié)合了14%的漆酶，而通過鹽溶液僅可移除其52.6%。疏水結(jié)合將蛋白質(zhì)結(jié)合到改性顆粒上。通過加入脫氧膽酸鹽移除大約28%的改性顆粒結(jié)合的蛋白質(zhì)，其為結(jié)合的酶的疏水結(jié)合部分。該實(shí)驗(yàn)顯示，顆?；|(zhì)的官能性可被改性以實(shí)施蛋白質(zhì)結(jié)合到顆粒基質(zhì)的可選機(jī)制。實(shí)施例16介體和輔助因子的共陷入包含的輔助因子(或改性的輔助因子或介體)使交聯(lián)后輔助因子與酶供陷入。通過選擇方法條件可以設(shè)置顆粒的多孔性以保持輔助因子，同時(shí)使如反應(yīng)物的小分子(例如酶底物、協(xié)同底物和聯(lián)產(chǎn)品)進(jìn)出。氨基酸脫氫酶(AADH)、甲酸脫氫酶(冷凍干燥)購(gòu)自Biocatalytics(USA)。PEG20000-NADH得自JulichFineChemicals(德國(guó))。礦物油得自Castrol(德國(guó))。壬苯醇醚-4得自ICI(英國(guó))。戊二醛(Glut)(25%水溶液)得自AcrosOrganics(比利時(shí))。甲酸得自Merck(德國(guó))。乙烯二胺(EDA)、乙烯亞胺(PEI)、3_甲基-2-氧代丁酸(2-酮纈氨酸)、DL-纈氨酸、NADH和NAD+得自Sigma-Aldrich。通過用戊二醛交聯(lián)聚乙烯亞胺(PEI)制造聚合顆粒。通過在含有200μ1的預(yù)溶解的壬苯醇醚_4(在IOOml燒杯中用20mm磁力攪拌器以500rpm磁力攪拌20分鐘)的40ml礦物油中乳化800μ1的10%PEI制備聚乙烯亞胺的一種油包水乳液。相似地，使用20%戊二醛溶液制備另一種油包水乳液。通過將戊二醛乳液加入到快速攪拌的聚乙烯亞胺乳液(700rpm)中混合兩種乳液。在連續(xù)攪拌下使其反應(yīng)30分鐘。通過在2000xg離心10分鐘(Sorval1，RT7)回收聚合顆粒。將聚合物顆粒用45ml去離子水洗滌四次。按照前面的實(shí)施例通過離心進(jìn)行洗滌過程中的回收。將產(chǎn)物再懸浮到IOml體積。將該溶液(Iml)等分到印pendorf管中并用于隨后的實(shí)驗(yàn)。制備含有IOmg.πιΓ1的各種蛋白質(zhì)的溶液(甲酸脫氫酶和纈氨酸脫氫酶)。隨后混合這兩種溶液(每種溶液200μ1)并與聚合材料溫育。將該溶液通過反轉(zhuǎn)混合并使其在輕輕攪動(dòng)下反應(yīng)30分鐘。使用下述方法對(duì)含有固定酶的顆粒進(jìn)行活性測(cè)定分析。將顆粒用去離子水洗滌，并如上所述回收。將顆粒與100μ1PEG20000-NADH(得自obtainedfromJulichFineChemiclsofJillich，德國(guó))混合并在室溫下輕輕攪動(dòng)溫育2小時(shí)。隨后將該溶液冷凍干燥。將冷凍干燥產(chǎn)物用2ml的水洗滌兩次并通過離心回收。使顆粒再懸浮在Iml的IOOmMpH為8.0的Tris-Cl緩沖液(其含有IOOmg賴氨酸)中從而使顆粒上的過量醛官能性淬滅，并在室溫下溫育1小時(shí)。將顆粒用2ml的Tris-Cl緩沖液(20mM，pH8.0)洗滌五次。然后使用Iml的再循環(huán)試劑對(duì)將該樣品進(jìn)行循環(huán)能力測(cè)試。在每個(gè)循環(huán)之間將樣品用2ml體積的水洗滌三次。通過如下所述的TLC和HPLC分析樣品的纈氨酸生成。使這些顆粒反應(yīng)并再循環(huán)到用于隨后反應(yīng)的新鮮反應(yīng)介質(zhì)中。再循環(huán)試劑用于生成纈氨酸的PEG-20000-NADH再循環(huán)試劑由50mM甲酸鹽(來自pH為8.0的IM甲酸鈉原液)、50mMpH為8.0的Tris-Cl緩沖液、50mM酒石酸銨和IOmM的2-酮纈氨酸組成。配制該試劑組合物以確保只有在PEGNADH被再循環(huán)的情況下產(chǎn)生纈氨酸。分析方法在F254硅凝膠板(Merck)上進(jìn)行氨基酸TLC。使用的流動(dòng)相為乙醇和冰醋酸(91)。使用在丙酮中的2%的水合茚三酮溶液使氨基酸(纈氨酸)染色。在120°C加熱該板直到纈氨酸(Rf0.49)和氨(Rf0.31)的適合的溶解為清楚可見的。使用用于測(cè)定氨基酸的OPA衍化方法(鄰苯二醛試劑)進(jìn)行HPLC。樣品在線衍生。包含纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果反應(yīng)和再循環(huán)根據(jù)TLC數(shù)據(jù)是成功的，形成了全部連續(xù)顆粒催化反應(yīng)的纈氨酸點(diǎn)。使用HPLCOPA方法證實(shí)并定量了陽性TLC結(jié)果，在六個(gè)連續(xù)16小時(shí)反應(yīng)循環(huán)中顆粒分別將48、35、59、43、33和29%的IOmM酮纈氨酸轉(zhuǎn)變成纈氨酸。該實(shí)施例顯示，在酶-顆?；|(zhì)中陷入輔助因子使采用輔助因子的酶保持官能性并使陷入的輔助因子再循環(huán)。實(shí)施例17用PEI載體的聚合鏈/纖維的網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)對(duì)抗體的結(jié)合。該實(shí)施例顯示了抗體和/或抗原在顆粒上的結(jié)合?？贵w和抗原的結(jié)合顯示了通過固定抗體或抗原使顆粒親合結(jié)合蛋白質(zhì)的適合性。此外，顯示了顆粒對(duì)診斷應(yīng)用(如ELISA)的可能性。聚乙烯亞胺(P3143；50%水溶液)、戊二醛等級(jí)II(G6257；25%水溶液)、礦物油(M8410)、抗原小鼠白細(xì)胞介素2(I0523-20UG；SL06092)和來自Sti^ptomycesavidinii的標(biāo)記酶鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶(S5512-250UG;SL05181)來自Sigma-Aldrich。一抗(大鼠的抗小鼠白細(xì)胞介素2(IL-2)MAB(I7663-27K1；L6080801))和二抗(大鼠的抗小鼠白細(xì)胞介素2(IL-2)生物素MAB(I7663-27M5;L6080803))來自USBiologicals。氯化鈉(S7653)、二代磷酸鈉(S0876)、一代磷酸鈉(S0757)、過氧化氫(21676-3)、吐溫20(P9416)和氫氯酸(H1758)來自Sigma-Aldrich02,2’-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(10102946001)來自Roche。顆粒制備根據(jù)實(shí)施例2制備交聯(lián)的聚乙烯亞胺顆粒，樣品G。試劑的調(diào)節(jié)僅為在稀釋到10%之前用HCl將聚乙烯亞胺溶液調(diào)節(jié)至pH9。直接用標(biāo)度因子4實(shí)驗(yàn)，從而需要20ml礦物油(其含有用800μ1的各種乳化反應(yīng)物溶解的200μ1的ΝΡ4)。將生成的交聯(lián)聚乙烯亞胺顆粒用6x50ml的去離子水洗滌并在各洗滌步驟之間通過在5000xg下離心5分鐘從礦物油中回收。隨后將顆粒狀物顆粒用去離子水再懸浮到IOml體積并將500μ1等份用于實(shí)驗(yàn)AF。蛋白質(zhì)的固定根據(jù)下表9用字母對(duì)實(shí)驗(yàn)編號(hào)。按實(shí)驗(yàn)下欄中所示的順序進(jìn)行各種蛋白質(zhì)的加入(表9)。在4°C在去離子水中進(jìn)行用于各實(shí)驗(yàn)的第一蛋白質(zhì)成分的固定1小時(shí)(順序加入步驟1，表9)，每10分鐘反轉(zhuǎn)樣品以確保充分混合。將顆粒用3xIml的去離子水洗滌并如上所述進(jìn)行回收。在含有150mM氯化鈉的IOmM磷酸鹽緩沖液pH6.8(結(jié)合緩沖液)中進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)結(jié)合，蛋白質(zhì)處理(表9，行25)。在37°C進(jìn)行結(jié)合30分鐘，每5分鐘反轉(zhuǎn)以確保充分混合。在結(jié)合各種蛋白質(zhì)后，使用溫和攪動(dòng)(IKAVortexGenius，設(shè)置2)10分鐘，將樣品用2xIml的含有0.05%吐溫20的結(jié)合緩沖液洗滌以限制非特異性蛋白質(zhì)的相互作用。通過在5000xg離心5分鐘實(shí)現(xiàn)各連續(xù)步驟間的顆粒回收。對(duì)各種蛋白質(zhì)處理步驟加入的蛋白質(zhì)的數(shù)量(表9)如下白蛋白-5mg;大鼠的抗小鼠白細(xì)胞介素2MAB(A-IL2-MA)-SOyg;大鼠的抗小鼠IL2MAB生物素(B-A-IL2-MA)-25l·!g；白細(xì)胞介素2(IL-2)-2l·!g；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(str印-perox)10μg。將這些數(shù)量的蛋白質(zhì)在Iml的結(jié)合緩沖液中制備。實(shí)驗(yàn)AF的蛋白質(zhì)結(jié)合的順序。測(cè)定過氧化物酶測(cè)定試劑包含pH為6.8的IOmM磷酸鹽緩沖液中(具有150mM氯化鈉)的2mMABTS和2mM過氧化氫。在30°C在420nm測(cè)量分析重復(fù)三次進(jìn)行，每孔有200μ1的試劑和50μ1的顆粒懸浮液。結(jié)果在實(shí)驗(yàn)B中評(píng)價(jià)抗體與抗原的結(jié)合(圖12)。該實(shí)驗(yàn)顯示陽性反應(yīng)，其表明一抗(A-IL2-MA)與顆粒表面成功結(jié)合，抗原(IL-2)、二抗(B-A-IL2-MA)和鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶與顆粒繼續(xù)結(jié)合。這類似于在如酶標(biāo)儀的孔的表面上進(jìn)行的夾心酶聯(lián)免疫分析(sandwichELISA)。實(shí)驗(yàn)C顯示，抗原可結(jié)合到顆粒表面并隨后用作抗體結(jié)合的識(shí)別元件。在與各種對(duì)照相比觀察時(shí)，這些實(shí)驗(yàn)顯示顆?？捎糜诮Y(jié)合抗體或抗原。實(shí)驗(yàn)A是顯示二抗(B-A-IL2-MA)或鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶與固定有一抗的顆粒的非特異性結(jié)合的對(duì)照。與B相比，較低的應(yīng)答說明抗原(IL-2)增強(qiáng)二抗與顆粒的結(jié)合。實(shí)驗(yàn)D和E是顯示在使白蛋白猝滅后一抗(A-IL2-MA)或二抗(B_A_IL2_MA)與顆粒的非特異性結(jié)合的對(duì)照。實(shí)驗(yàn)F包含未處理的交聯(lián)聚乙烯亞胺顆粒并用作測(cè)定對(duì)照。該實(shí)施例說明所述顆粒是抗原或抗體適合的固定載體。通過親合相互作用，我們進(jìn)一步證明了抗體與抗原的固定，反之亦然。該實(shí)施例由此說明了所述載體用于親合色譜和診斷學(xué)(如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)應(yīng)用的可行性。實(shí)施例18=向PEI載體的聚合鏈/纖維的網(wǎng)狀構(gòu)造或格狀結(jié)構(gòu)的顆粒中引入磁石。已證明了在顆粒中包含介體和輔助因子。在該實(shí)施例中證明了顆粒中包含磁性顆粒。顆粒制備根據(jù)以上實(shí)施例17制備顆粒，各乳液線性放大到25ml礦物油。乳化前將磁石(250mg)引入到10%聚乙烯亞胺液體溶液(pH為9.0)中。將交聯(lián)的聚乙烯亞胺顆粒用6個(gè)體積的50ml去離子水洗滌并在各洗滌步驟之間在5000xg下通過離心5分鐘使其從礦物油中回收。將顆粒狀物顆粒隨后再懸浮到IOml體積的去離子水中，并通過與500μ1的乙烯二胺反應(yīng)30分鐘而進(jìn)行陰離子交換官能化。將球狀物隨后用3Χ50ml等分的去離子水洗滌并如上所述通過離心回收。將最終的顆粒狀物在去離子水中再懸浮到IOml并用于以下白蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)Iml等分的IOml顆粒懸浮液冷凍干燥和稱量重復(fù)三次測(cè)定顆粒的干重。蛋白質(zhì)結(jié)合和定量通過在磁架(磁性分離架-Promega；Z5332)上磁性分離回收以上等分中的顆粒并移除液體。用Tris-Cl緩沖液(pH7.4)(50mM)2x2ml洗滌使顆粒平衡。將牛血清白蛋白(BSA)加入到顆粒中至終濃度為ZOmg.mr1。使用持續(xù)滾動(dòng)(end-over-end)混合在室溫下進(jìn)行離子蛋白質(zhì)結(jié)合30min。將該混合物置于磁架中以使樹脂在反應(yīng)管的側(cè)壁上保持磁化并從樣品中移除液體。將樹脂用Iml50mMTris-Cl(pH為7.4)洗滌5次并通過上述磁固定物回收。通過加入2個(gè)體積的500μ1的IMNaCl(于50mMTris-Cl(pH7.4)中)從樹脂中洗脫離子結(jié)合的BSA。蛋白質(zhì)定量按照制造商的說明，使用Quant-iT測(cè)定，在Qubit熒光計(jì)(Invitrogen)上進(jìn)行定量洗脫部分的蛋白質(zhì)(表10)。結(jié)果白蛋白與包含磁石的顆粒的結(jié)合(三次重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值)。結(jié)果顯示，磁石可被引入到顆粒中并且顆粒的磁性可用于其從液體懸浮液中有效分離。此外，這些結(jié)果顯示，所述載體可用作有效的離子交換樹脂。在實(shí)施例中，如果用帶正電荷的分子(如胺(乙烯二胺))使顆?；|(zhì)改性，則所述顆?？捎米麝庪x子交換樹脂。使用帶負(fù)電荷的分子(含有羧基的分子)會(huì)使其用作陽離子交換樹脂。該實(shí)施例進(jìn)一步提供了通過使磁性顆粒包含在格狀結(jié)構(gòu)中的另一回收方法的實(shí)例，這會(huì)使它們通過應(yīng)用磁場(chǎng)而被附著。本發(fā)明的顆粒因此包括通過交聯(lián)劑交聯(lián)的聚合鏈或纖維的格狀結(jié)構(gòu)，以及靠近和圍繞所述鏈的填隙孔。換句話說，本發(fā)明提供了一種纖維互相貫通的網(wǎng)狀構(gòu)造顆粒，優(yōu)選地，由戊二醛交聯(lián)的聚乙烯亞胺構(gòu)成或制成。該顆粒可用作酶的固定化基質(zhì)。所述顆粒優(yōu)選使用乳液型技術(shù)和本發(fā)明的第二和第三方面的技術(shù)制成。使用乳液型技術(shù)有利于尺寸控制(例如，顆粒表面積體積比和限定尺寸分布)，還有利地允許顆粒的單步合成。該顆粒為固定提供了大的表面積并可適用于，但不限于，大底物和小底物的生物催化。這種酶的固定化基質(zhì)顯示出高固定效率并在固定后具有高的酶活性維持。樹枝狀顆粒的纖維性質(zhì)為酶結(jié)合提供了大的內(nèi)部表面積。同樣，當(dāng)與骨架載體材料(例如PEI本身)相比時(shí)，每個(gè)酶亞單位的大量可使用的附著點(diǎn)為顯著提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性提供了機(jī)會(huì)。這種與松散的格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造組合，由于大的暴露的表面積用于固定并限制了對(duì)小底物和大底物的擴(kuò)散限制，而在加入生物催化劑后具有高活性與重量比。此夕卜，如果其成為固定基質(zhì)的阻礙，粒度的控制使底物的擴(kuò)散限制的減小增強(qiáng)。顆粒的制備方法包括在相同相中在含有或不含有交聯(lián)劑的情況下使骨架載體或格狀結(jié)構(gòu)乳化。優(yōu)選地，如上所述，使用雙乳液體系來制造。在第一乳液中不包含交聯(lián)劑的情況下，其可溶解在油相中，或者通過混合含有所述交聯(lián)劑的第二乳液而被加入。優(yōu)選的制造方法是使一種乳液中的骨架聚合物(聚乙烯亞胺)和另一種乳液中的至少雙官能化學(xué)藥品(戊二醛)分別乳化。聚合物和交聯(lián)劑間的自發(fā)反應(yīng)導(dǎo)致纖維格狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀構(gòu)造，在這種情況下包含的過量的醛官能團(tuán)，其隨后用于通過胺-醛交叉反應(yīng)性自發(fā)地共價(jià)連接蛋白與格狀結(jié)構(gòu)或載體。這種醛官能性可進(jìn)一步被外推連接其它化合物，或者具有其它性質(zhì)，如疏水性，從而使其應(yīng)用擴(kuò)大大結(jié)合更寬范圍的蛋白質(zhì)，如疏水蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)固定到基質(zhì)提高了酶的溶劑穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。通過在將蛋白質(zhì)固定到樹枝狀載體后干燥該載體可以進(jìn)一步提高這種穩(wěn)定作用。相信，這種干燥減少了可交叉反應(yīng)的化學(xué)官能團(tuán)的靠近，從而引起蛋白質(zhì)-骨架和骨架-骨架的進(jìn)一步自發(fā)的化學(xué)偶合。此外，可以在干燥過程中將添加劑陷入到基質(zhì)中，這可用于控制孔徑或官能分子或添加物的陷入。用本發(fā)明的顆粒使高蛋白質(zhì)負(fù)載成為可能，即較大數(shù)量的蛋白質(zhì)可被負(fù)載入小顆粒體積內(nèi)。權(quán)利要求一種由乳液得到的顆粒，其包括通過交聯(lián)劑交聯(lián)的聚合鏈的格狀結(jié)構(gòu)、靠近和圍繞所述鏈的填隙孔以及在所述格狀結(jié)構(gòu)上的官能團(tuán)，并且蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)能夠與所述官能團(tuán)反應(yīng)從而使蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)結(jié)合到所述格狀結(jié)構(gòu)上并因此被固定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顆粒，其中，所述官能團(tuán)存在于所述鏈的聚合物上，并被選擇以使能夠通過共價(jià)結(jié)合、離子結(jié)合、疏水結(jié)合和親合結(jié)合中的一種或多種將蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)結(jié)合到聚合物上，其能夠通過所述格狀結(jié)構(gòu)的改性而具有這種官能性。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其包括至少一種通過官能團(tuán)結(jié)合到所述格狀結(jié)構(gòu)上從而被固定的蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的顆粒，其中，多種不同的蛋白質(zhì)和/或多種不同的改性的蛋白質(zhì)被固定于其中。5.根據(jù)權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的顆粒，其中，所述鏈或纖維的聚合物為聚乙烯亞胺。6.根據(jù)權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的顆粒，其中，所述顆粒包含陷入所述格狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的添加物。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的顆粒，其中，所述添加物選自輔助因子、改性的輔助因子、化學(xué)介體、磁石和/或磁性物質(zhì)中。8.—種制造顆粒的方法，該方法包括提供分散在第二液相中的第一液相的液滴的乳液，一種液相為水相而另一種液相為油相，并且所述水相包含溶于其中的聚合物以及溶于其中的交聯(lián)劑；使交聯(lián)劑交聯(lián)所述聚合物的鏈，從而形成顆粒，各顆粒包含通過交聯(lián)劑交聯(lián)的聚合物鏈的格狀結(jié)構(gòu)、靠近和圍繞所述鏈的填隙孔以及在所述格狀結(jié)構(gòu)上的官能團(tuán)，并且蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)能夠與所述官能團(tuán)反應(yīng)從而使蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)結(jié)合到所述格狀結(jié)構(gòu)上并因此被固定。9.一種制造顆粒的方法，該方法包括提供分散在第二液相中的第一液相的液滴的第一乳液，一種液相為水相而另一種液相為油相，并且所述水相包含溶于其中的聚合物；將分散在第二液相中的第一液相的液滴的第二乳液與第一乳液混合，其中，一種液相為水相而另一種液相為油相，并且水相包含溶于其中的交聯(lián)劑；使交聯(lián)劑交聯(lián)所述聚合物的鏈，從而形成顆粒，各顆粒包含通過交聯(lián)劑交聯(lián)的聚合物鏈的格狀結(jié)構(gòu)、靠近和圍繞所述鏈的填隙孔以及在所述格狀結(jié)構(gòu)上的官能團(tuán)，并且蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)能夠與所述官能團(tuán)反應(yīng)從而使蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)結(jié)合到所述格狀結(jié)構(gòu)上并因此被固定。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中，所述聚合物為聚乙烯亞胺。11.根據(jù)權(quán)利要求810中任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括將添加物至少加入到所述相之一，以使所述添加物陷入到所述顆粒的格狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。12.根據(jù)權(quán)利要求811中任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括回收顆粒和干燥回收的顆粒。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，該方法包括在干燥顆粒之前將添加物加入到所述回收的顆粒中，以使所述添加物陷入到所述顆粒的格狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。14.根據(jù)權(quán)利要求1113中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述添加物選自輔助因子、改性的輔助因子、化學(xué)介體、磁石和/或磁性物質(zhì)中。全文摘要一種由乳液得到的顆粒包括通過交聯(lián)劑交聯(lián)的聚合鏈的格狀結(jié)構(gòu)和靠近和圍繞所述鏈的填隙孔。官能團(tuán)被設(shè)置在格狀結(jié)構(gòu)上并且蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)能夠與其反應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)和/或改性的蛋白質(zhì)結(jié)合到所述格狀結(jié)構(gòu)上并因此被固定。文檔編號(hào)C08J3/00GK101874061SQ200880114052公開日2010年10月27日申請(qǐng)日期2008年10月29日優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日發(fā)明者伊薩克·巴塞洛繆斯·格貝爾,克林頓·辛普森,尼爾·斯托肯斯托姆·加德納,賈斯廷·約爾旦,迪安·布拉迪申請(qǐng)人:Csir公司