從細胞中有效提取蛋白質(zhì)的方法發(fā)明背景在許多診斷方法中，從受試者中獲取細胞并將其存放在含有固定劑的液體培養(yǎng)基中。將細胞固定在培養(yǎng)基中，并通過細胞學方法對其進行檢查，從而提供診斷。例如，檢測子宮頸組織中的癌前或癌細胞通常通過顯微鏡評估剝離的子宮頸細胞進行。這種由GeorgeN.Papanicolaou開發(fā)并稱為“Pap”檢驗的方法包括利用取樣裝置從女性子宮頸剝離細胞，將剝離的細胞存放在含有固定劑的運送培養(yǎng)基中，然后將該細胞放置在載玻片上。然后，染色細胞，并由受過訓練的醫(yī)學專業(yè)人員通過光學顯微鏡法檢查細胞的異常性。僅在美國，每年進行超過五千五百萬次的Pap檢驗。盡管該細胞學檢驗很成功，但是該檢驗容易出錯。例如，估計多至40％的常規(guī)Pap檢驗受到存在污染物諸如粘液、血細胞和不明顯的炎性細胞的危害。這些污染物引起假陰性結果、假陽性結果、和非常大量的后繼工作量。參見，例如，Koss，L.G.(1989)，用于子宮頸癌檢測的巴帕尼科拉烏試驗：成功和災難(ThePapanicolaouTestforCervicalCancerDetection：ATriumphandaTragedy)，JAMA261：737-743；還參見DeMay，“Pap涂片解釋中的問題”(″ProblemsinPapSmearInterpretation″)，病理學實驗室醫(yī)學紀錄(Arch.Pathol.Lab.Med.)121：229-23(1997)。鑒于上述內(nèi)容，存在著對用于分析在含有固定劑的液體培養(yǎng)基中存在的細胞的補充分子診斷方法的需要。然而，該方法不是直接的，因為不總是可能在固定的細胞上進行該方法。例如，某些固定劑(例如，THINPREPTM或SUREPATHTM檢驗系統(tǒng)中使用的那些運送培養(yǎng)基)可以導致特定的細胞蛋白沉淀或聚集，由此使得那些蛋白質(zhì)不能溶解并難于或不可能通過常規(guī)方法，例如利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或其他免疫學檢驗，而得到可靠的檢測。因此，存在著對從固定的細胞和未固定的細胞中，以這樣的方式提取蛋白質(zhì)的方法和組合物的巨大需要，所述方式容許提取的蛋白質(zhì)適合于在分子檢測測定，例如免疫學檢測測定中使用。本文描述的發(fā)明滿足了這一需要以及其他需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于從細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的方法。概括地，該方法包括：使細胞樣品與包含聚氧乙烯烷基醚(例如，BrijTM35)的高pH(至少約pH10)提取試劑接觸，從而產(chǎn)生中間組合物，然后，在存在中和試劑的條件下，中和所述中間組合物的pH，例如，至pH值約為6-9，任選地至pH值為7-8.5，從而產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)提取物。在某些實施方案中，提取試劑和中和試劑中之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。細胞可以是固定的或未固定的剝離的子宮頸細胞。在某些實施方案中，該方法包括從細胞樣品中提取靶病毒蛋白，如HPVE6蛋白。本發(fā)明還提供用于檢測蛋白如靶病毒蛋白的存在的方法，其包括按照上述方法從固定的或未固定的細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)提取物，并且檢測所述蛋白在所述蛋白質(zhì)提取物中的存在。另外，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)提取物的系統(tǒng)，其包括：a)包含固定的或未固定的細胞的細胞樣品；b)pH至少約為10.0的提取試劑，和c)中和試劑，其中所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者含有聚氧乙烯烷基醚，并且其中所述提取試劑和中和試劑可以用在上述方法中以產(chǎn)生適用于結合測定的蛋白質(zhì)提取物。此外，本發(fā)明提供用于從固定的或未固定的細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)提取物的試劑盒。所述試劑盒還可以包括用于檢測所述蛋白質(zhì)提取物中的靶蛋白的成分和/或試劑。附圖簡述圖1A顯示使用與某些添加劑組合的具有高pH的提取試劑對檢測提取的HPV16E6蛋白的增效作用。按照本文所述的流程，將預先純化的重組HPV16E6蛋白(MBP-E6)懸浮在提取試劑中，然后用中和試劑中和。E6蛋白用本文所述的側向流動(LF)測定法捕獲并用UMM讀取儀檢測。圖1B支持在中和階段引入添加劑對檢測提取的HPV16E6蛋白的影響不如在提取階段過程中引入的影響強。圖2顯示在提取試劑中使用多種添加劑檢測由表達HPV16的SiHa細胞提取的HPV16E6蛋白。圖3顯示滴定細胞濃度對提取的HPV16E6蛋白的檢測的影響。使用兩種HPV-陽性和一種HPV-陰性細胞系。圖4顯示從摻有表達HPV16的SiHa細胞的未固定的陰性臨床樣品提取HPV16E6蛋白。圖5顯示當提取試劑中BrijTM35濃度增加時和當BrijTM35與其他非離子洗滌劑如TritonTMX-100或TweenTM-20組合時對提取的HPV16E6蛋白的檢測的影響。圖6顯示當使用不同的提取和/或中和時間時對提取的HPV16E6蛋白的檢測的影響。圖7顯示使用4％BrijTM35/高pH緩沖液2提取源自HPV毒株18和45的E6蛋白。圖8顯示對來源于HPV毒株16和18的E6蛋白的檢測的劑量-反應影響。圖9顯示對提取試劑中BrijTM35濃度(有或無其他非離子添加劑)的進一步優(yōu)化。圖10顯示對提取試劑中BrijTM35濃度(有或無其他非離子添加劑)的進一步優(yōu)化，和對由摻有表達HPV的細胞的未固定的臨床陰性樣品提取HPV16E6蛋白的影響。圖11顯示檢測由表達HPV的SiHa細胞提取的HPV16E6蛋白的細胞計數(shù)珠陣列(CBA)形式。圖12顯示在由固定的或未固定的細胞提取HPV16E6蛋白中使用4％BrijTM35/高pH緩沖液2。圖13顯示樣品通過5.0mmMilliporePVDF注射器濾器過濾不顯著減小樣品的信號。定義除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬技術領域中普通技術人員的通常理解相同的含義。盡管如此，為了清楚和容易參考起見，在下文中定義了某些要素。當用于本文時，術語“細胞樣品(cellularsample)”或“細胞樣品(cellsample)”涉及含有一種或多種目的細胞的液體組合物。細胞樣品可以是含有從個體取出(例如，切除或剝離)的細胞的臨床樣品，所述細胞包括但不僅限于，例如，來自血漿、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮膚表面部分(externalsections)、呼吸道、腸道、和生殖泌尿道、淚液、唾液、乳汁、血細胞、腫瘤、或器官的細胞。在其他實施方案中，細胞樣品可以包含體外生長的細胞(包括但不僅限于在細胞培養(yǎng)基中的細胞、病毒感染的細胞、重組細胞等)。在某些實施方案中，細胞樣品可以包含最容易被HPV感染的細胞。在這些實施方案中，可以從子宮頸、外陰、陰道、肛門、陰莖、口腔或喉嚨中獲得細胞。在某些實施方案中，細胞來自粘膜，并可以是上皮來源的。除剝離或切除的細胞外，細胞樣品可以或可以不包含污染物。例如，粘液細胞、或細菌細胞、酵母細胞或血細胞可以存在于細胞樣品中。“HPV”是人乳頭瘤病毒屬(Papillomavirus)，其包括但不限于HPV毒株4、6、11、20、24、28、36、48、50、16、18、31、35、30、39、45、51、52、56、59、58、33、66、68、69、26、53、73、和82。“致癌HPV毒株”是已知為如由國家癌癥研究所(NCI，2001)確定的引起子宮頸癌的HPV毒株?！爸掳〦6蛋白”是由致癌HPV毒株編碼的E6蛋白。示范性的致癌毒株是：HPV26、HPV53、HPV66、HPV73、HPV82、HPV16、HPV18、HPV31、HPV35、HPV30、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV59、HPV58、HPV33、HPV66、HPV68、HPV69、和HPV82。致癌E6蛋白的氨基酸序列存放在NCBI基因庫(NCBI′sGenBank)數(shù)據(jù)庫中。雖然不希望受到理論的限制，但是通常認為HPV毒株4、11、20、24、28、36、48、和50不是致癌的。術語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用。術語“多肽”包括這樣的多肽和肽，在所述多肽中用非-天然存在的或合成的主鏈替換常規(guī)主鏈，且在所述肽中用一個或多個非-天然存在的或合成的氨基酸替換一個或多個常規(guī)氨基酸。術語“融合蛋白”或其語法等價物指包括許多多肽成分的蛋白質(zhì)，所述多肽成分在不以它們的天然狀態(tài)附著時，由它們各自的氨基和羧基末端通過肽鍵連接，從而形成單一連續(xù)多肽。融合蛋白可以是2種、3種或甚至4種以上不同蛋白質(zhì)的組合。術語多肽包括融合蛋白，其包括但不僅限于具有異源氨基酸序列的融合蛋白，融合體，具有異源和同源前導序列，具有或不具有N-末端的甲硫氨酸殘基；免疫學標記的蛋白質(zhì)；具有能檢測的融合配偶體的融合蛋白，例如包括熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、熒光素酶等作為融合配偶體的融合蛋白。通常，多肽可以是任意長度，例如多于2個氨基酸，多于4個氨基酸，多于約10個氨基酸，多于約20個氨基酸，多于約50個氨基酸，多于約100個氨基酸，多于約300個氨基酸，通常至多約500或1000個以上氨基酸?！半摹蓖ǔ槎嘤?個氨基酸，多于4個氨基酸，多于約10個氨基酸，多于約20個氨基酸，通常至多約50個氨基酸。在一些實施方案中，肽長度為5-30個氨基酸。多肽可以是天然的，因為它們可以由生物體或病毒的基因組編碼，或是非-天然的，因為它們是非天然存在的。術語“捕獲劑”指通過這樣的相互作用結合蛋白質(zhì)的試劑，所述相互作用足以允許該試劑結合并且濃縮來自不同蛋白的均勻混合物中的蛋白質(zhì)。因此，術語“捕獲劑”指這樣的分子或多分子復合物，其能夠以低于約10-6M的解離常數(shù)(KD)，特異性結合分析物，例如，特異性結合關于所述捕獲劑的分析物，而不結合其他靶標。該結合相互作用可以由捕獲劑的親合區(qū)域介導。代表性的捕獲劑包括抗體(包括其片段和模擬體)和含有PDZ結構域的蛋白質(zhì)等。術語“特異性結合”指捕獲劑優(yōu)先結合不同蛋白質(zhì)的均勻混合物中存在的特定蛋白質(zhì)的能力。在某些實施方案中，特異性結合相互作用應該區(qū)樣品中的特定蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)，在一些實施方案中，超過約10-100倍以上(例如，超過約1000-或10,000-倍)。術語“捕獲劑/蛋白質(zhì)復合物”是由捕獲劑與蛋白質(zhì)的特異性結合產(chǎn)生的復合物，即“結合配偶體對”。捕獲劑和關于該捕獲劑的蛋白質(zhì)在“適合于特異性結合的條件”下，彼此特異性結合，其中所述條件是容許在處于溶液中的捕獲劑和待結合的蛋白質(zhì)之間發(fā)生結合的那些條件(在鹽濃度、pH、洗滌劑、蛋白質(zhì)濃度、溫度等方面)。該條件，特別是關于抗體和它們的抗原，是本領域中眾所周知的(見，例如，Harlow和Lane，抗體：冷泉港實驗室實驗室手冊(Antibodies：ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，紐約(1989))。在某些實施方案中，在捕獲劑/蛋白質(zhì)復合物中特異性結合的捕獲劑和蛋白質(zhì)之間的親和性由KD(解離常數(shù))表征，所述KD低于10-6M，低于10-7M，低于10-8M，低于10-9M，或低于約10-10M?！敖Y合配偶體”和等價物指能夠存在于捕獲劑/分析物復合物中的，即表現(xiàn)出彼此間特異性結合的分子對。術語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可互換使用，指至少具有抗體的表位結合結構域的捕獲劑。這些術語是本領域技術人員所熟知的，且指含有一種或多種與抗原特異性結合的多肽。一種抗體形式構成抗體的基本結構單位。該形式是四聚物，且由兩對相同的抗體鏈對組成，每對具有一條輕鏈和一條重鏈。在每對中，輕鏈和重鏈可變區(qū)共同負責與抗原的結合，且恒定區(qū)負責抗體效應子功能。識別的免疫球蛋白多肽包括κ和λ輕鏈和α、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ、ε和μ重鏈或其他物種中的等價物。全長免疫球蛋白“輕鏈”(約25kDa或約214個氨基酸)包括位于NH2-末端的約110個氨基酸的可變區(qū)和位于COOH-末端的κ和λ恒定區(qū)。全長免疫球蛋白“重鏈”(約50kDa或約446個氨基酸)，類似地包括可變區(qū)(約116個氨基酸)和上述重鏈恒定區(qū)之一，例如γ(約330個氨基酸)。術語“抗體”和“免疫球蛋白”包括任何同種型的抗體和免疫球蛋白，保持與抗原特異性結合的抗體片段，其包括但不僅限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、以及包括抗體的抗原-結合部分和非-抗體蛋白的融合蛋白。可以例如利用放射性同位素，產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的酶、熒光蛋白等，可檢測地標記所述抗體?？贵w可以進一步與其他結構部分，諸如特異性結合對成員，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結合對的成員)等綴合?？贵w還可以與固相支持體結合，所述固相支持體包括但不僅限于聚苯乙烯平板或珠，金膠粒等。該術語還包括Fab′、Fv、F(ab′)2和或其他保持與抗原特異性結合的抗體片段。抗體還可以與可擴增的檢測顆粒聯(lián)合使用?？贵w可以以多種其他形式存在，所述其它形式包括例如，F(xiàn)v、Fab、和(Fab′)2、以及雙-功能(即，雙-特異性)雜種抗體(Lanzavecchia等，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)17，105(1987))，和以單鏈存在(例如，Huston等，美國國家科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，85，5879-5883(1988)和Bird等，科學(Science)，242，423-426(1988)，將其引入本文作為參考)。(通常參見，Hood等，“免疫學”(″Immunology″)，Benjamin，N.Y.，第2版.(1984)，和Hunkapiller和Hood，自然(Nature)，323，15-16(1986))。單克隆抗體和“噬菌體展示”抗體在本領域中眾所周知，且包含在術語“抗體”中。術語“評估”包括任何形式的測量，并包括確定元素是否存在。術語“確定”、“測量”、“評價”、“評估”和“測定”可互換使用，并且可以包括定量和/或定性的確定。評估可以是相對的或絕對的?！霸u估……的存在”包括確定某物存在的量，和/或確定其是存在還是不存在。“遠程位置”意指除了獲得細胞并將其存放在含有固定劑的液體中的位置以外的位置。例如，遠程位置可能是在獲得細胞的同一建筑物中的不同房間(例如，另一個實驗室)，在與獲得細胞的同一建筑群中的不同建筑物，或同一城市、州或國家中不同的位置，等等。例如，當顯示細胞樣品是從遠程位置“接收”的時，該細胞樣品可以從遠程位置獲得，或從遠程位置交送、郵寄或信使遞送。“傳達”信息指使所述信息從一個位置到達另一個位置的任何方法，無論是通過實體傳送包含該信息的打印材料或計算機可讀媒體(例如，通過郵寄)，還是通過傳輸信息。如果傳輸信息，則通過合適的通訊通道(例如，私人的、公共的或無線網(wǎng)絡)傳輸代表該信息的數(shù)字或模擬信號(例如，電磁信號，諸如光或電信號)。可以使用任何便利的方法傳輸數(shù)據(jù)，例如傳真、調(diào)制解調(diào)器、因特網(wǎng)、電子郵件、等等。用于本文時，術語“運送培養(yǎng)基”用于描述適合于收集細胞和以某種方式保存那些細胞的液體，所述方式是容許它們適合于基于-液體的細胞學研究。Pap檢驗中普遍使用運送培養(yǎng)基。存放在運送培養(yǎng)基中的細胞可以或可以不在該培養(yǎng)基中，被從一個位置運輸?shù)搅硪粋€位置。運送培養(yǎng)基含有固定劑。將細胞存放在運送培養(yǎng)基中固定該細胞，從而產(chǎn)生固定的細胞。典型的運送培養(yǎng)基包括SUREPATHTM或PRESERVCYTTM運送培養(yǎng)基?！肮潭ǖ募毎笔怯没瘜W固定劑處理并通過化學固定劑進行細胞學保存的細胞。固定的細胞通常適合于染色和隨后通過光學顯微鏡法進行的形態(tài)學和/或細胞學分析。作為參考的引入以如同每篇單獨出版物或?qū)＠暾執(zhí)貏e和分別指出進行參考引用的相同的程度，通過參考將本說明書提及的所有出版物和專利申請引入本文。發(fā)明詳述盡管在本文中顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是所述實施方案僅以舉例的方式提供，這對于本領域技術人員而言是顯然的?，F(xiàn)在，在不偏離本發(fā)明的條件下，本領域技術人員應該想到許多變體、改變、和替換。應該理解本文中所述發(fā)明的實施方案的不同備選方案可以用于實施本發(fā)明。下列權利要求意欲定義本發(fā)明的范圍，且這些權利要求范圍內(nèi)的方法和結構以及它們的等價物包括在其中。本發(fā)明提供了用于從固定的或未固定的細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的方法。概括地，該方法包括：使細胞樣品與包含聚氧乙烯烷基醚(例如，BrijTM35)的高pH(至少約pH10.0)的提取試劑接觸，從而產(chǎn)生中間組合物，并且然后，在中和試劑的存在下，中和中間組合物的pH，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物。所述提取試劑和中和試劑之一或二者含有聚氧乙烯烷基醚。在某些實施方案中，所述細胞可以是固定的或未固定的剝離的子宮頸細胞。本發(fā)明還提供了用于實施本主題方法的試劑盒和組合物。本主題方法用于多種不同的應用，包括在由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物中檢測特殊蛋白質(zhì)的診斷檢驗中。進一步描述本發(fā)明前，應該理解本發(fā)明不受限于以下所述的本發(fā)明的特殊實施方案，因為可以產(chǎn)生所述特殊實施方案的變體，并且其仍然屬于所附權利要求的范圍。還應該理解，所使用的術語是為了描述特殊實施方案的目的，且不意欲進行限制。替代地，本發(fā)明的范圍應該由所附權利要求確定。在該說明書和所附權利要求中，單數(shù)形式“一”(″a″)、“一”(″an″)和“這”(″the″)包括復數(shù)涵義，除非上下文另外明確指示。在提供數(shù)值范圍時，除非上下文另外明確指示，應該理解為本發(fā)明包括在該范圍上限和下限之間的每個介于其間的數(shù)值，直到下限單位的1/10，和該指定范圍內(nèi)的任何其他指定的或介于其間的數(shù)值。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在該較小的范圍內(nèi)，并也包括在本發(fā)明內(nèi)，服從于該指定范圍內(nèi)的任何明確排除的界限。當該指定范圍包括所述界限之一或二者時，排除那些包括的界限之一或二者的范圍也包括在本發(fā)明中。除非另外定義，本文中使用的全部技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域中普通技術人員普遍理解的相同的含義。盡管類似于或等價于本文所述內(nèi)容的任何方法、裝置和材料能夠用在本發(fā)明的實踐或檢驗中，現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。出于描述和公開在出版物中所描述的、可以與本文所述的發(fā)明聯(lián)合使用的要素的目的，將本文提及的全部出版物引入本文作為參考。如上總結，本主題發(fā)明提供用于從固定的或未固定的細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的方法和組合物。在對本發(fā)明更詳細的描述中，首先描述了該方法，隨后描述在實踐本主題方法中使用的試劑盒和系統(tǒng)。蛋白質(zhì)提取方法如上所示，本發(fā)明提供用于從固定的或未固定的細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的方法。通常，該方法包括兩個步驟：a)使所述固定的或未固定的細胞與具有高于約pH10.0的pH的提取試劑相接觸，從而產(chǎn)生中間組合物，和b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸。所述提取試劑和/或中和試劑含有聚氧乙烯烷基醚。由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物含有聚氧乙烯烷基醚，并具有中性pH(即，約pH7.0-約pH8.0)。該方法通常產(chǎn)生含有這樣的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)提取物，所述蛋白質(zhì)可以容易地通過利用有關那些蛋白質(zhì)的捕獲劑檢測。同樣地，由本方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物通常適合用于為了檢測那些蛋白質(zhì)的結合測定，例如免疫學測定。在某些實施方案中，所述方法包括：a)使細胞與包含聚氧乙烯烷基醚和高pH的提取試劑相接觸，從而產(chǎn)生具有至少約pH10.0的pH的中間組合物；和b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸，從而中和所述中間組合物的所述pH并產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物。由于，如上所述，聚氧乙烯烷基醚可以存在于提取試劑或中和試劑的任一種中(或提取試劑和中和試劑二者中)，所以本方法的某些實施方案包括a)和b)使所述中間組合物與包含聚氧乙烯烷基醚的中和試劑相接觸，從而中和所述中間組合物的所述pH并產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物。在某些實施方案中，與利用其他方法，例如不使用：高pH提取步驟(即，增高pH至高于約pH10.0或pH11.0的步驟)、中和步驟(即，調(diào)節(jié)pH至約pH6.0-約pH9.0的步驟)和聚氧乙烯烷基醚的方法生成的蛋白質(zhì)提取物相比，由本方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物可以含有更多易受捕獲劑影響的蛋白質(zhì)。單獨的高pH和單獨的聚氧乙烯烷基醚都不產(chǎn)生這樣的蛋白質(zhì)提取物。在特殊的實施方案中，高pH提取試劑溶解固定的或未固定的細胞中的蛋白質(zhì)，而聚氧乙烯烷基醚防止中間組合物中溶解的蛋白質(zhì)在中和所述中間組合物的pH時再-聚集或沉淀。以下更詳細地描述了本方法中使用的試劑和由本方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物，也更詳細描述了可以如何使用所述試劑產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物。如下文中所討論地，本方法中使用的試劑的最適濃度和pH可以根據(jù)使用哪種試劑而變化。然而，試劑的最適濃度和pH容易通過試驗或憑經(jīng)驗確定。通過利用本發(fā)明的方法從中提取蛋白質(zhì)的細胞根據(jù)本發(fā)明的方法學能夠用于從細胞樣品中提取靶蛋白或目的蛋白。細胞樣品可以是同源細胞群、或不同類型細胞的異源混合物。細胞樣品還可以含有“污染物”，諸如粘液、血液細胞和炎性細胞，所述污染物對于靶蛋白提取目的不重要或不含有靶蛋白。在一些實施方案中，所述靶蛋白是在受到病毒、優(yōu)選地病理學病毒感染的細胞中存在的病毒蛋白，并且所述細胞優(yōu)選地是從哺乳動物如人中分離的細胞。致病病毒可以是在人或其他動物中引起致病作用或疾病的任何致病病毒。所述致病病毒可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的各種毒株，諸如HIV-1和HIV-2。病毒蛋白可以是HIV糖蛋白(或表面抗原)諸如HIVGP120和GP41，或衣殼蛋白(或結構蛋白)諸如HIVP24蛋白。致病病毒可以是依波拉或馬爾堡病毒。病毒蛋白可以是依波拉糖蛋白或表面抗原，諸如依波拉GP1或GP2蛋白。致病病毒可以是肝炎病毒，諸如甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒。例如，病毒蛋白可以是乙型肝炎病毒的表面抗原或核心蛋白，諸如小乙型肝炎表面抗原(SHBsAg)(也稱為澳大利亞抗原(Australiaantigen))，中乙型肝炎表面抗原(MHBsAg)和大乙型肝炎表面抗原(LHBsAg)。病毒抗原可以是丙型肝炎病毒的表面抗原或核心蛋白，諸如NS3、NS4和NS5抗原。致病病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)。例如，RSV病毒蛋白可以是RSV的糖蛋白(G-蛋白)或融合蛋白(F-蛋白)。致病病毒可以是單純皰疹病毒(HSV)，諸如HSV-1和HSV-2。例如，HSV病毒抗原可以是來自HSV-2的糖蛋白D。靶蛋白可以是腫瘤抗原，諸如乳腺癌細胞的Her2和淋巴瘤細胞上的CD20，病毒致癌基因諸如人乳頭瘤病毒的E6和E7，或是細胞致癌基因諸如突變的ras。在一些實施方案中，細胞樣品含有其中存在靶蛋白的固定的細胞。本方法中使用的固定的細胞通常通過將細胞樣品(例如，通過切除、剝離或灌洗從受試者摘除細胞而獲得)存放在液體培養(yǎng)基中獲得。可以將細胞樣品存放在已經(jīng)包含化學固定劑的液體培養(yǎng)基中，或可以在將細胞置于所述培養(yǎng)基后，向所述液體培養(yǎng)基中添加化學固定劑。含有固定劑和固定的細胞的液體培養(yǎng)基以及未固定的細胞包含在本文中術語″細胞樣品″的含義內(nèi)。本方法中可以使用的代表性化學固定劑包括：醇(例如，甲醇或乙醇)，醛(例如，戊二醛(gluteraldehyde)或甲醛)和酮(例如，丙酮)，以及四氧化鋨，乙酸，苦味酸(picricacid)和重金屬離子鹽。本方法可以使用的固定劑的其他實例包括基于亞硫酸氫鹽(bi-sulfite)的固定劑(其可以還包括乙酸)，基于PVP的固定劑(其可以還含有丙二醇和甲醇)以及美國專利號3,546,334、4,578,282、4,857,300、5,104,640、5,256,571、5,432,056和5,196,182中記述的那些。本方法可能使用的固定劑的實例，包括那些固定劑的工作濃度，可以在Baker，(生物學顯微技術原理：固定和染色的研究(PrinciplesofBiologicalMicrotechnique：AStudyofFixationandDyeing)，1959)和Williams(“用于免疫細胞化學的組織制備”(″Tissuepreparationforimmunocytochemistry″)，臨床病理學雜志(JClinPathol)199750：422)中找到。本方法中特別感興趣的是被稱為″運送培養(yǎng)基″并作為婦科檢查一部分常規(guī)用于收集、保存(即，固定)和運送子宮頸陰道細胞(例如，剝離的子宮頸細胞)的液體培養(yǎng)基。FDA批準的運送培養(yǎng)基是特別感興趣的?？梢允褂玫目缮藤忂\送培養(yǎng)基的實例包括：例如，基于甲醇的PRESERVCYTTM運送培養(yǎng)基(其作為Mass.莫爾伯勒(Marlborough)Cytyc公司(Cytyc，Inc.)的THINPREPTM婦科取樣試劑盒的一部分出售)，基于乙醇的、正式稱為CYTORICHTM的SUREPATHTM運送培養(yǎng)基(TriPath公司(TriPath，Inc.)Burlington，N.C.)，和基于甲醇的CYTOLYTTM運送培養(yǎng)基(Cytyc，公司，莫爾伯勒(Marlborough)，Mass.).可以通過任何常規(guī)方法，包括但不僅限于剝離(例如，刮)、切除和灌洗，而獲得細胞。特別感興趣的是子宮頸來源的上皮細胞，該細胞典型地是通過利用適合的刷子、藥簽、抹刀或刮刀的剝離方法獲得的，并將其存放在含有或不含有固定劑的液體培養(yǎng)基中。提取試劑本方法中使用的提取試劑含有以這樣的量存在的成分，所述量在濃度上足以在將該提取試劑加入到細胞中時，產(chǎn)生具有至少pH10.0的pH的蛋白質(zhì)提取物。因此，所述提取試劑通常具有至少約pH10.0的pH。使提取試劑與細胞相接觸，從而產(chǎn)生中間組合物。提取試劑和由此產(chǎn)生的中間組合物的pH通常是至少約pH10.0，例如，在約pH10.0-約pH13.0或約pH12.0-約pH13.0的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，提取試劑可以具有約pH10.0-約pH10.5、pH10.5-約pH11.0、pH11.0-約pH11.5、pH11.5-約pH12.0、pH12.0-約pH12.5或pH12.5-約pH13.0的pH。在某些優(yōu)選的實施方案中，提取試劑具有約pH12.5-約pH12.9的pH。例如，提取試劑可以利用任何合適的氫氧離子來源，例如氫氧化鈉或氫氧化鉀，或碳酸鈣制成。在某些實施方案中，提取試劑可以含有緩沖劑，從而將該試劑維持在所需的pH。如果本主題提取試劑中存在緩沖劑，則該緩沖劑在25℃，可以具有約9.0-約12.5范圍內(nèi)的pKα?？梢栽谥黝}蛋白質(zhì)提取試劑中使用的示范性緩沖劑包括例如，CABS、哌啶、磷酸鹽、CAPS、甘氨酸或乙醇胺。本發(fā)明所用的提取試劑包含以這樣的量存在的成分，所述量在濃度上足以在將該提取試劑加入到固定的或未固定的細胞中時，產(chǎn)生具有至少pH10.0的pH的蛋白質(zhì)提取物。因此，所述提取試劑通常具有至少約pH10.0的pH。在優(yōu)選的實施方案中，提取試劑包含檸檬酸三鈉和NaOH。例如，提取試劑可以包含0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0或2.0NNaOH。示例性的提取試劑包含約0.1NNaOH，約50mM檸檬酸三鈉，且pH為12.5-12.9。在一些優(yōu)選的實施方案中，使樣品達到目標pH如大于pH10的pH所需要的提取試劑的量或pH應該在添加提取試劑前憑經(jīng)驗預先確定。在這樣的實施方案中，將憑經(jīng)驗確定的提取試劑添加到細胞樣品中。在其他實施方案中，在加入提取試劑后，測量中間組合物的pH。在該測量步驟之后，如果需要，調(diào)節(jié)pH，以達到目標pH。提取試劑還可以包含下列各項中的一種或多種、或其混合物：HEPES，TritonTMX-100，NaCl，甘油和EGTA。示例性的提取試劑可以包含約50mMHEPES，pH約pH7.5，約1.1％TritonTMX-100，約150mMNaCl，約10％甘油，和約1mMEGTA。在某些實施方案中，除了具有至少10.0的pH，提取試劑還可以包含式為CH3(CH2)n1CH2(OCH2CH2)n2OH的聚氧乙烯烷基醚。所述聚氧乙烯烷基醚，也稱為聚氧乙烯醇，在工業(yè)、化妝品和藥學應用上通常用作乳化劑，濕潤劑，增溶劑，脫泡劑，洗滌劑和/或潤滑劑。(參見，例如，默克索引(TheMerckIndex).第13版，7659)。在某些實施方案中，聚氧乙烯烷基醚是BrijTM表面活性劑如BrijTM35或本文所述的其他BrijTM家族成員。BrijTM35CAS[9002-92-0]是一種非離子表面活性劑，其通常用在高效液相色譜法(HPLC)應用中，用于分離膜復合物。其通常用來防止與色譜支持體的非特異性結合。其具有16.9的親水-親脂平衡數(shù)值(HLB)，這表明其為一種能夠用作增溶劑，如膜蛋白的非變性增溶，或用作乳化劑的親水化合物。(參見，例如，Umbreit，J.N.，和Strominger，J.L.1973.洗滌劑HLB數(shù)值與來自枯草芽胞桿菌膜的D-丙氨酸羧肽酶的增溶和穩(wěn)定作用的關系(RelationofdetergentHLBnumbertosolubilizationandstabilizationofD-alaninecarboxypeptidasefromBacillussubtillismembreanes).美國國家科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)70，2997)。BrijTM35，包含一個月桂基(CH3(CH2)10CH2)和23個乙烯氧基(OCH2CH2)單位，且具有化學式CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)23OH。其他化學同義詞包括：聚氧乙烯月桂醚(polyoxyethylenelaurylether)；LAURETH-23；聚氧乙烯(23)月桂醚C12E23；聚氧乙烯二醇十二烷醚(Polyoxyethyleneglycoldodecylether)；月桂醇環(huán)氧乙烷(LaurylAlcoholEthyleneOxide)，乙氧基化月桂醇(EthoxylatedLaurylAlcohol)，月桂醇，乙氧基化的(Laurylalcohol，ethoxylated)，；月桂基聚乙二醇醚(laurylpolyethyleneglycolether)；α-十二烷基-ω-羥基-聚氧乙烯(alpha-Dodecyl-omega-hydroxy-polyoxyethylene)；聚乙二醇，單十二烷醚(PolyethyleneGlycols，monododecylether)；十二烷醇乙氧基化物(Dodecanolethoxylate)；十二烷醇，聚氧乙基化的(Dodecanol，polyethoxylated)；十二烷基聚(氧乙烯)醚(Dodecylpoly(oxyethylene)ether)；Lauromacrogol；月桂基聚(氧乙烯)醚(Laurylpoly(oxyethylene)ether)；氧乙烯基化的十二烷醇(Oxyethylenateddodecylalcohol)；聚(環(huán)氧乙烷)十二烷醚(Poly(ethyleneoxide)dodecylether)；α-十二烷基-ω-羥基-聚(氧-1，2-乙二基)(alpha-dodecyl-omega-hydroxy-Poly(oxy-1，2-ethanediyl))；聚(氧乙烯)單月桂醚(Poly(oxyethylene)monolaurylether)；聚乙氧基化的十二烷醇(Polyethoxylateddodecanol)；聚乙二醇十二烷醚(Polyethyleneglycoldodecylether)；聚乙二醇月桂醚(Polyethyleneglycollaurylether)；聚氧乙烯十二烷醇(Polyoxyethylenedodecanol)；聚氧乙烯月桂酸醇(Polyoxyethylenelauricalcohol)；和聚氧乙烯月桂醇(Polyoxyethylenelaurylalcohol.)；3，6，9，12，15，18，21，24，27-Nonaoxanonatriacontan-1-ol；十二烷醇，乙氧基化的(Dodecylalcohol，ethoxylated)；；Laureth4[USAN]；Laureth9[USAN]；Laureth-11；Lauromacrogol400[INN]；PEG-11月桂醚(PEG-11Laurylether)；Polidocanol，40L(聚醚)；ActinolL7；ActinolL3；AdekaCarpolM2；AdekaCarpolMBF100；AdekatolLA1275；乙氧硬化醇(Aethoxysklerol)；AkyporoxRLM160；AkyporoxRLM22；AkyporoxRLM230；AkyporoxRLM40；AldosperseL9；AlkasurfLAN1；AlkasurfLAN3；Arapol0712；AtlasG2133；AtlasG3705；AtlasG3707；AtlasG4829；AtlasG-2133；AtlasG-3705；B205；堿(BASE)LP12；BL9；BL9(聚乙二醇)；堿(BASE)LP12；BrijTM22；BrijTM23；BrijTM30；BrijTM30ICI；BrijTM30SP；BrijTM35；BrijTM35L；BrijTM36T；CCRIS3397；Calgene40L；CarsonolL2；CarsonolL3；ChemalLA23；ChimipalAE3；Cimagel；Conion275-100；Conion275-20；Conion275-30；Conion275-80；Conion2P80；十二烷醇聚氧乙烯醚(Dodecylalcoholpolyoxyethyleneether)；DuPontWK；EthosperseLA12；EthosperseLA23；；G3707；乙二醇，聚乙烯，單十二烷醚(Glycols，polyethylene，monododecylether)；HSDB4351；羥基聚乙氧基十二烷(Hydroxypolyethoxydodecane)；LA(醇)；LA7；Laureth；Laureth9；Lipal4LA；Lubrol12A9；LubrolPX；Marlipal1217；MergitalLM11；NCI-C54875；Newcol1203；NikkolBL；NoigenET160；NoigenET170；NoigenYX500；NonioliteAL20；PegnolL12；；聚(氧-1，2-乙二基)，α-十二烷基-ω-羥基-(Poly(oxy-1，2-ethanediyl)，alpha-dodecyl-omega-hydroxy-)；聚乙二醇單十二烷醚(Polyethyleneglycolmonododecylether)；聚乙二醇單十二烷醚，名稱之后接著數(shù)字(400)，其近似對應于聚乙二醇部分的平均分子量；聚乙二醇單月桂醚(Polyethyleneglycolmonolaurylether)；聚氧乙烯月桂醚(Polyoxyethylenelaurylether)；RokanolL；RomopalLN；SimulsolP23；SimulsolP4；SiponicL；SlovasolS；StandamulLA2；Stmer135；表面活性劑WK；TexoforB9；Thesat；Thesit；α-十二烷基-ω-羥基聚(氧-1，2-乙二基)(alpha-Dodecyl-omega-hydroxypoly(oxy-1，2-ethanediyl))；或α-十二烷基-ω-羥基聚(氧乙烯)(alpha-Dodecyl-omega-hydroxypoly(oxyethylene))。其他BrijTM聚氧乙烯烷基醚包括：BrijTM30聚氧乙烯(4)月桂醚CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～4)；BrijTM52，聚氧乙烯(2)十六烷醚C16H33(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM56聚氧乙烯(10)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM58，聚氧乙烯(20)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM72聚氧乙烯(2)十八烷醚，(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM76，聚氧乙烯(10)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM78聚氧乙烯(20)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM92，聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM93，聚氧乙烯(2)油基醚；(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM97，聚氧乙烯(10)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM98，聚氧乙烯(20)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM700，聚氧乙烯(100)十八烷醚，C18H37(OCH2CH2)21OH，n～100；和BrijTM721，聚氧乙烯(21)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～21)。聚氧乙烯烷基醚，如果存在的話，可以以不顯著降低將來測定的靈敏性的濃度存在。聚氧乙烯烷基醚的濃度，在某些實施方案中，可以在樣品處理過程中減小，例如，通過用中和緩沖液稀釋該聚氧乙烯烷基醚或通過在使用前向蛋白質(zhì)提取物加入稀釋劑，如緩沖液或水。取決于所用的聚氧乙烯烷基醚的強度和提取緩沖液的pH，聚氧乙烯烷基醚可以在提取緩沖液中以約0.05％-約0.1％，約0.1％-0.5％，約0.5％-約1％，約1％-約5％，約5％-約10％，或約10％-約20％的濃度(v/v)存在。在優(yōu)選的實施方案中，聚氧乙烯烷基醚，例如BrijTM35，在提取試劑中以約2％-約10％的濃度(v/v)存在。在其他實施方案中，所述聚氧乙烯烷基醚存在于中和試劑中。在其他實施方案中，所述聚氧乙烯烷基醚存在于提取試劑和中和試劑二者中。在其他優(yōu)選的實施方案中，提取試劑和/或中和試劑除聚氧乙烯烷基醚外還包括其他非離子型洗滌劑。所述非離子型洗滌劑可以存在于提取試劑或中和試劑中，或者存在于提取試劑和中和試劑二者中。在某些實施方案中，使用的非離子型洗滌劑可以是諾乃洗滌劑(Nonidet)P-40、n-辛基葡萄糖苷(n-octylglucoside)、TRITONTM洗滌劑諸如TRITONTMX-100、辛基β-硫葡糖吡喃糖苷(octylβ-thioglucopyranoside)、TWEENTM洗滌劑諸如Tween-20、或NP-40。根據(jù)所用洗滌劑的強度，洗滌劑可以以約0.01M-約0.05M、約0.05M-約0.1M、01M-約0.2M、約0.2M-約0.5M、約0.5M-約1.0M、約1.0M-約2.0M、約2.0M-約4.0M、或約4.0M-約8.0M的濃度存在于提取緩沖液或中和緩沖液中。洗滌劑可以以約0.1％-20％，優(yōu)選0.5％-10％，1％-6％或2％-5％的濃度存在于提取緩沖液中。美國專利6,488,671的第7和8欄中列出了可以在本方法中使用的其他洗滌劑，該專利的全部內(nèi)容引入本文作為參考。示例性的洗滌劑及其在所述中和試劑和/或提取試劑中的濃度包括：TritonX-100：約0.1％至約10％，例如，約1％，NP40：約0.1％至約10％，例如，約1％和Tween-20：約0.1％至約10％，例如，約1％，重量/體積。在優(yōu)選實施方案中，提取試劑和/或中和試劑包括與其他非離子型洗滌劑組合的聚氧乙烯烷基醚。所述聚氧乙烯烷基醚可以是BrijTM表面活性劑且可以與TweenTM洗滌劑或TritionTM洗滌劑中的一種或兩種組合。在某些優(yōu)選實施方案中，所述BrijTM表面活性劑為與下述非離子型洗滌劑中的一種或多種組合的BrijTM35：TweenTM-20，約0.1％-約10％，例如，約2％；或TritionTMX-100，約0.1％-約10％，例如，約2％。在某些實施方案中，提取試劑可以不含有顯著量的變性劑。然而，在其他實施方案中，除了具有至少10.0的pH和聚氧乙烯烷基醚如BrijTM35外，提取試劑還可以含有變性劑，例如，離子型洗滌劑，諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)或十二烷基肌氨酸鈉，或離液劑如尿素。在這些實施方案中，變性劑，如果存在的話，可以以這樣的濃度存在，所述濃度不顯著降低將來測定的靈敏性。變性劑的濃度，在某些實施方案中，可以在樣品處理過程中降低，例如，通過用中和緩沖液稀釋該變性劑或在使用前對蛋白質(zhì)提取物添加稀釋劑，例如緩沖液或水。變性劑也可以在不存在聚氧乙烯烷基醚的情況下單獨存在。根據(jù)所使用的變性劑的強度和提取緩沖液的pH，變性劑可以以約0.01M-約0.05M、約0.05M-約0.1M、0.1M-約0.2M、約0.2M-約0.5M、約0.5M-約1.0M、約1.0M-約2.0M、約2.0M-約4.0M、或約4.0M-約8.0M的濃度存在于提取緩沖液中。變性劑，如果存在于提取試劑中的話，可以以這樣的濃度存在，所述濃度充分低于使蛋白質(zhì)變性典型使用的變性劑濃度。換言之，提取試劑可以含有處于這樣濃度的變性劑，所述濃度容許在按照本主題方法產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物后，利用關于該蛋白質(zhì)的捕獲劑檢測蛋白質(zhì)。所使用的變性劑濃度通常足以產(chǎn)生含有這樣的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)提取物，所述蛋白質(zhì)是在使用捕獲劑的結合測定，例如在抗體檢測測定中可容易檢測的。示范性變性劑及其在本提取試劑中的濃度：十二烷基硫酸鈉(SDS)：約0.01％-約2％，例如，0.05％，十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)：約0.01％-約5％，例如，0.5％，胍：約0.1M-約6M，例如，約0.5M，和尿素：約0.1M-約8M，例如，約0.5M，重量/體積。典型地使用濃度為0.1％-0.5％的SDS變性蛋白質(zhì)，典型地使用濃度為2％w/v的十二烷基肌氨酸鈉變性蛋白質(zhì)，典型地使用濃度為2M-8M的尿素變性蛋白質(zhì)，典型地使用濃度為3M-8M的鹽酸胍變性蛋白質(zhì)，典型地使用濃度為5％w/v的N-十六烷基三甲基銨氯化物(N-cetyltrimethylammoniumchloride)變性蛋白質(zhì)，且典型地使用濃度為2％，w/v的N-辛基葡萄糖苷變性蛋白質(zhì)(見蛋白質(zhì)純化手冊(ProteinpurificationHandbook)，安瑪西亞法瑪西亞生物技術(AmershamPharmaciaBiotech)，第71頁(1999))。除上述成分外，本主題蛋白質(zhì)提取試劑可以含有其他成分，例如鹽離子螯合劑、蛋白酶抑制劑、等。蛋白質(zhì)提取試劑可以是液體或固體組合物，并且在某些實施方案中，可以含有不同變性劑的組合。本提取緩沖液中可以使用的變性劑通常是強變性劑，且包括但不僅限于：離液劑(例如，尿素、鹽酸胍、或硫氰酸鹽諸如硫氰酸鈉或硫氰酸胍、碘化鈉、高氯酸鈉等；參見K.Hamaguchi等，國家科學院學報(ProcNatl.Acad.Sci.)62：1129-1136，1962)和離子型洗滌劑(例如，十二烷基硫酸鈉(SDS)，十二烷基肌氨酸鈉或N-十六烷基三甲基銨氯化物)，其包括陽離子、陰離子和兩性離子洗滌劑(諸如CHAPS或CHAPSO)。本方法中可以使用的其他變性劑列在美國專利6,488,671的第7和8欄中，將其全部內(nèi)容引入本文作為參考。在某些實施方案中，在提取緩沖液中不使用弱變性劑，諸如LiCl、LiClO4、LiBr、CaCl2或NaCl作為變性劑，盡管在提取緩沖液或蛋白質(zhì)提取物中除了前段列出的變性劑外，可以存在這樣的化合物。如上所示，使提取試劑與固定的或未固定的細胞相接觸(例如，與之組合或混合)。在某些實施方案中，可以將含有細胞的細胞樣品(例如，含有固定的細胞的運送培養(yǎng)基)直接加入到提取試劑中。在其他實施方案中，可以在向蛋白質(zhì)提取試劑添加細胞之前，從細胞樣品中分離(例如，通過沉降、離心、過濾或親合方法)細胞。在將細胞加入到提取試劑中前，可以洗滌細胞，或使細胞與其他試劑相接觸。全部或一部分可用的固定的或未固定的細胞可以與提取試劑相組合。例如，在某些實施方案中，一部分細胞可以在細胞學檢驗中使用，并且一部分細胞可以與提取試劑相接觸，從而產(chǎn)生中間組合物。細胞和提取試劑可以組合并溫育或被維持在合適的溫度(例如，冰上，在約室溫下或在約37℃)并且持續(xù)合適的時間(例如，10秒-24小時)，從而產(chǎn)生中間組合物。例如，細胞和提取試劑可以組合至少1，2，3，4，5，10，15，30分鐘或1，2，3，4，5，10，15小時。作為另一個實例，細胞和提取試劑可以組合5分鐘-10小時或10分鐘-1小時或10-30分鐘。在某些實施方案中，在使細胞與提取試劑相接觸后，立即使中和試劑和中間組合物相接觸。細胞和中和試劑可以組合并溫育或被維持在合適的溫度(例如，冰上，在約室溫下或在約37℃)并且持續(xù)合適的時間(例如，10秒-24小時)，從而產(chǎn)生中間組合物。例如，細胞和中和試劑可以組合至少1，2，3，4，5，10，15，30分鐘或1，2，3，4，5，10，15小時。作為另一個實例，細胞和中和試劑可以組合5分鐘-10小時或10分鐘-1小時或10-30分鐘。中和試劑本方法中使用的中和試劑具有在與所述中間組合物相接觸時，足以中和上述中間組合物pH的pH。換言之，中和試劑具有這樣的pH，所述pH在該中和試劑與上文討論的中間組合物相混合時，足以中和該中間組合物的pH。如在下文中更詳細描述地，在某些實施方案中，中和試劑可以含有聚氧乙烯烷基醚或其他非離子型洗滌劑或洗滌劑混合物。中和試劑的pH足以中和通過使固定的或未固定的細胞與主題提取試劑相接觸產(chǎn)生的中間組合物。根據(jù)提取試劑的pH和是否使用緩沖劑，中和試劑的pH可以是pH4.0-pH8.0。在某些實施方案中，中和試劑可以具有約pH4.0-約pH4.5、pH4.5-約pH5.0、pH5.0-約pH5.5、pH5.5-約pH60、pH6.0-約pH6.5、pH6.5-約pH7.0或pH7.0-約pH7.5的pH。例如，中和試劑可以是利用任何合適的氫離子來源，例如鹽酸或乙酸制成的。在某些實施方案中，中和試劑可以具有低于pH4.0的pH。中和試劑可以是緩沖的或非緩沖的。例如，如果所述中和試劑是緩沖的，則所述中和試劑可以是利用具有約6-約8的pKa的任何緩沖劑，例如，tris，hepes或tricine來緩沖的。在某些優(yōu)選的實施方案中，中和試劑包含2MTris-HCl，pH約為pH6.0。在其他優(yōu)選的實施方案中，中和試劑包含0.9MTris-HCl，pH約為pH7.8。在一些優(yōu)選的實施方案中，在加入中和試劑之前，憑經(jīng)驗預先確定使得樣品達到目標pH，例如約pH6.0-9.0，或pH7.0-8.5或pH7.5-8.5或pH8.0-8.5的pH所需要的中和試劑的量或pH。在這樣的實施方案中，將憑經(jīng)驗確定的中和試劑添加到細胞樣品中。在其他實施方案中，在加入中和試劑后，測量被中和的樣品的pH。在該測量步驟之后，如果需要，調(diào)節(jié)pH，以達到目標中性pH。在其他實施方案中，中和試劑包含下列各項中的一種或多種、或其混合物：HEPES，TritonTMX-100，NaCl，甘油和EGTA。示例性的中和試劑包含約50mMHEPES，pH約為pH7.5，約1.1％TritonTMX-100，約150mMNaCl，約10％甘油，和約1mMEGTA。另一種示例性的中和緩沖液包含：約20mMTris，pH8，約2％BSA，約1％TritonTMX-100，約2％TweenTM-20，約0.2％肌氨酸，約250mMNaCl，和約50mMEDTA(或EGTA)。如上所示，提取試劑和/或中和試劑可以含有非離子型洗滌劑或表面活性劑，其包括但不限于式為CH3(CH2)n1CH2(OCH2CH2)n2OH的聚氧乙烯烷基醚。示例性的聚氧乙烯烷基醚為BrijTM表面活性劑，其包括以下一種或多種：BrijTM35，聚氧乙烯(23)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～23)；BrijTM30聚氧乙烯(4)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～4)；BrijTM52，聚氧乙烯(2)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM56聚氧乙烯(10)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM58，聚氧乙烯(20)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM72聚氧乙烯(2)十八烷醚，(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM76，聚氧乙烯(10)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM78聚氧乙烯(20)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM92，聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM93，聚氧乙烯(2)油基醚；(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM97，聚氧乙烯(10)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM98，聚氧乙烯(20)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM700，聚氧乙烯(100)十八烷醚，C18H37(OCH2CH2)21OH，n～100；或BrijTM721，聚氧乙烯(21)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～21)。取決于所用的聚氧乙烯烷基醚的強度和提取緩沖液的pH，聚氧乙烯烷基醚可以在提取緩沖液中以約0.05％-約0.1％，約0.1％-0.5％，約0.5％-約1％，約1％-約5％，約5％-約10％，或約10％-約20％的濃度(v/v)存在。在某些實施方案中，使用的非離子型洗滌劑可以是諾乃洗滌劑(Nonidet)P-40、n-辛基葡萄糖苷、TRITONTM洗滌劑諸如TRITONTMX-100、辛基β-硫葡糖吡喃糖苷、TWEENTM洗滌劑諸如Tween-20、或NP-40。根據(jù)所用洗滌劑的強度，洗滌劑可以以約0.01M-約0.05M、約0.05M-約0.1M、01M-約0.2M、約0.2M-約0.5M、約0.5M-約1.0M、約1.0M-約2.0M、約2.0M-約4.0M、或約4.0M-約8.0M的濃度存在于提取緩沖液或中和緩沖液中。美國專利6,488,671的第7和8欄中列出了可以在本方法中使用的其他洗滌劑，將該專利的全部內(nèi)容引入本文作為參考。在某些實施方案中，洗滌劑可以存在于提取和中和緩沖液二者中。示范性洗滌劑及其在該中和試劑和/或提取試劑中的濃度包括：TritonX-100：約0.1％-約10％，例如，約1％，NP40：約0.1％-約10％，例如，約1％，和Tween-20：約0.1％-約10％，例如，約1％，重量/體積。如上所示，聚氧乙烯烷基醚或其他非離子型洗滌劑可以單獨地、組合地存在于中和試劑中，或不存在于中和試劑中。聚氧乙烯烷基醚可以是BrijTM表面活性劑，且可以與TweenTM洗滌劑或TritionTM洗滌劑之一或二者組合。在某些優(yōu)選的實施方案中，BrijTM表面活性劑為與下述非離子型洗滌劑中的一種或多種組合的BrijTM35：TweenTM-20，約0.1％-約10％，例如約2％；或TritionTMX-100，約0.1％-約10％，例如約2％。如上所示，使中和試劑與中間組合物相接觸(例如，與之組合或混合)，從而產(chǎn)生具有中性pH(即，在約pH6.5-約pH8.0范圍內(nèi)，例如，在約pH7.0-約pH7.8范圍內(nèi)的pH)的蛋白質(zhì)提取物。蛋白質(zhì)提取物還含有來自固定的或未固定的細胞的蛋白質(zhì)、處于以上列出的濃度的聚氧乙烯烷基醚，和在某些實施方案中，用于將蛋白質(zhì)提取物維持在特定pH范圍內(nèi)的緩沖劑和/或其他非離子型洗滌劑。如果將變性劑加入到固定的或未固定的細胞中，則蛋白質(zhì)提取物還可以含有該變性劑。pH、洗滌劑的選擇和所用洗滌劑的濃度(和，如果使用變性劑，則變性劑的身份(identity)和濃度)足以容許蛋白質(zhì)提取物直接用于結合測定，從而檢測在蛋白質(zhì)提取物中存在的蛋白質(zhì)。細胞提取物的中和還可以通過使該提取物流經(jīng)充滿中和試劑的過濾器或過濾嘴而實現(xiàn)。在提取物流過過濾材料時，中和試劑被溶解，且該提取物的pH接近中性。用于中和細胞提取物的備選方法是使所述提取物流過經(jīng)處于中性pH的溶液預平衡的BioSpin柱(BioRad)。還可以將提取物置于容納含有中和劑的凝膠(或過濾材料)的注射器或相似的裝置中，并通過正壓使其從所述注射器中釋放出來。在某些實施方案中，本主題蛋白質(zhì)提取物含有溶解的HPVE6蛋白(特別是來自HPV致癌毒株的E6蛋白質(zhì))，所述HPVE6蛋白在對蛋白質(zhì)提取物不進行進一步處理的條件下(例如，在不進一步加入變性劑、改變pH或加熱的條件下)，容易被捕獲劑接近和容易檢測。蛋白質(zhì)提取物還可以含有溶解的或不可溶的膜、除HPVE6蛋白外的蛋白質(zhì)、和其他細胞內(nèi)容物諸如DNA、RNA、碳水化合物、等等。還可以存在其他污染物，諸如源自原始細胞樣品的mucal污染的那些。蛋白質(zhì)提取物組成通常不含有完整的(即，細胞學完整)細胞。蛋白質(zhì)提取物可以立即使用，或在使用前，例如，以冷凍形式對其進行保存。在特殊的實施方案中，由上述方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物可以用在蛋白質(zhì)檢測方法中，下文中更加詳細地描述了該方法。如由上文明顯地，在上述試劑中可以使用多種不同的變性劑、洗滌劑、緩沖劑、pH和組分濃度。任何試劑中的最佳變性劑、洗滌劑、緩沖劑或pH、或組分濃度是容易利用常規(guī)方法確定的。在中和細胞提取物后，通過用含有關于E6的粘合劑的粒子溫育該提取物，可以從所述細胞提取物中濃縮E6蛋白。該粘合劑可以包括PDZ、E6關聯(lián)蛋白(E6AP)或其片段、或E6結合蛋白(E6BP)或其片段。在E6被該粒子捕獲后，洗滌該粒子，并且然后通過用pH高于10的緩沖液溫育，將E6從所述粒子中釋放出來。將粒子從洗脫溶液中分離出來，并且然后通過前述過程中和剩余的溶液。備選地，可以在不從所述捕獲粒子中釋放出來的條件下，檢測E6蛋白。美國專利6,488,671的第7和8欄中列出了可以在本方法中使用的其他洗滌劑，該專利的全部內(nèi)容引入本文作為參考。在某些實施方案中，洗滌劑可以存在于提取和中和緩沖液二者中。在其他實施方案中，樣品可以在中和步驟后稀釋。示例性的稀釋劑可以包括：約50mMHEPES，pH約為pH7.5，約1.1％TritonTMX-100，約150mMNaCl，約10％甘油，和約1mMEGTA。另一種示例性的稀釋劑可以包括：約50mMTris，pH8.2，約2％BSA，約2％TritonTMX-100，約0.1％肌氨酸，約150mMNaCl，和約50mMEDTA(或EGTA)。蛋白質(zhì)檢測方法由上述方法制成的蛋白質(zhì)提取物可以直接或間接地(即，添加其他試劑后)用于評估該蛋白質(zhì)提取物中存在一種或多種蛋白質(zhì)的方法中。蛋白質(zhì)檢測法通常涉及特異性結合蛋白質(zhì)的捕獲劑。在進行所述方法時，待檢測蛋白質(zhì)的身份可以是已知的(即，預-確定的)或未知的身份。可以利用本主題蛋白質(zhì)檢測方法檢測的蛋白質(zhì)包括這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是疾病或病癥，例如癌癥、炎性疾病、或由例如病毒、細菌或真菌引起的感染的診斷標記。在某些實施方案中，利用本主題方法檢測的蛋白質(zhì)是常規(guī)不可檢測的，除非使用本主題蛋白質(zhì)提取物方法?？梢岳帽痉椒z測的示范性蛋白質(zhì)包括由傳染性介質(zhì)，諸如人乳頭瘤病毒(HPV)編碼的蛋白質(zhì)。在特殊的實施方案中，本方法可以用于檢測HPV的E6蛋白質(zhì)，其是被證明在由固定的細胞制成的蛋白質(zhì)提取物中通過其他方法很難或不可能檢測的蛋白質(zhì)。概括地，蛋白質(zhì)檢測方法是本領域中眾所周知的，且包括結合測定，即，檢測蛋白質(zhì)和關于該蛋白質(zhì)的捕獲劑之間的結合的測定。所述測定包括免疫學測定，即，使用與蛋白質(zhì)特異性結合的抗體的結合測定，包括但不僅限于，利用諸如下列技術的競爭和非競爭測定系統(tǒng)：僅指出一些，蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、″夾心″免疫測定、酶免疫測定、細胞計數(shù)珠陣列(CBA)、多元珠測定、蛋白質(zhì)印跡法、免疫組織化學測定、免疫細胞化學測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體-結合測定、免疫放射測定、熒光免疫測定、和蛋白質(zhì)A免疫測定。所述測定是本領域中常規(guī)的和眾所周知的(見，例如，Ausubel等，編，1994，分子生物學中的通用方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，卷1，JohnWiley和Sons，公司，紐約，將其全部內(nèi)容引入本文作為參考)。以下簡要描述示范性免疫測定。利用E6BP或AP肽、特異性抗體、或PDZ結構域蛋白的捕獲或釋放可以用作濃縮HPVE6的提取后測定前方法。備選地，可以使用二元單克隆抗體形式。免疫沉淀方案通常包括產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物，向蛋白質(zhì)提取物中添加捕獲劑如抗體，和在一段合適的時間和溫度下，溫育所述蛋白質(zhì)提取物和捕獲劑。捕獲劑然后與固相支持體，例如，親合基底諸如與蛋白質(zhì)A和/或蛋白質(zhì)G相連的珠子相結合，并溫育和洗滌該混合物。將固相支持體重新混懸在樣品緩沖液中，并可以通過例如，蛋白質(zhì)印跡法檢測目的蛋白質(zhì)。ELISA可以包括制備蛋白質(zhì)提取物，連接蛋白質(zhì)提取物和固相支持體(例如，多孔微量滴定平板的孔)，使該支持體-結合的蛋白質(zhì)提取物與捕獲劑例如抗體相接觸，和檢測所述捕獲劑和所述蛋白質(zhì)之間的結合。在某些ELISA方法中，在使捕獲劑與支持體-結合的蛋白質(zhì)提取物相接觸前，可以用可檢測結構部分如酶底物(例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)可檢測地標記捕獲劑。然而，在其他實施方案中，可以通過可檢測的第二捕獲劑(例如，第二抗體)，檢測捕獲劑與蛋白質(zhì)提取物的結合，所述第二捕獲劑結合與所述蛋白質(zhì)提取物相接觸的捕獲劑。在其它ELISA測定中，捕獲劑可以與固相支持體相連接，且蛋白質(zhì)提取物和與固相支持體-結合的捕獲劑相接觸。利用關于該蛋白質(zhì)的第二捕獲劑，可以檢測蛋白質(zhì)提取物中的蛋白質(zhì)和固相-支持體抗體的結合。所述“夾心測定”是本領域中眾所周知的。在其他測定中，在捕獲劑的表面固定前，可以在溶液中發(fā)生該捕獲劑和蛋白質(zhì)之間的結合。特別地，本方法可以用于檢測來自HPV致癌毒株的E6蛋白。在這些實施方案中，該檢測方法中使用的捕獲劑可以是，例如，包括與E6蛋白中包含的PDZ配體(即，關于PDZ結構域的結合位點)結合的PDZ結構域的抗體或多肽。例如，本E6檢測結合方法可以使用包含PDZ結構域的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)含有MAGI-1的第二PDZ、或DLG或TIP1的PDZ結構域，等等，如在公開的申請US20040018487(2004年1月29日公開)中所述，并將其全部內(nèi)容引入本文作為參考。示范性的包含PDZ結構域的蛋白質(zhì)和PDZ結構域序列顯示在申請US20040018487的表2和實施例4中。術語″PDZ結構域″還包括該序列的變體(例如，天然存在的變體)(例如，多形變體，具有保守取代的變體、等)和來自備選物種(例如，小鼠、大鼠)的結構域。典型地，PDZ結構域與美國專利申請系列號09/724,553中顯示的那些基本相同，將該申請引入本文作為參考，例如，當為了最大對應性而進行比較和比對時，至少約70％，至少約80％，或至少約90％的氨基酸殘基相同。本領域中認識到能夠突變PDZ結構域，從而提供能夠加強或削弱結合的氨基酸變化和改變特異性，但它們保持PDZ結構域(Schneider等，1998，自然生物技術(Nat.Biotech.)17：170-5)。除非另外指出，引用特殊PDZ結構域(例如，MAGI-1結構域2)意欲包括該特殊PDZ結構域及其HPVE6-結合變體。換言之，如果對特殊PDZ結構域作出引用，則也對結合HPV的致癌E6蛋白質(zhì)的PDZ結構域的變體作出引用，如下所述。在這方面，注意到蛋白質(zhì)中PDZ結構域的編號可以改變。例如，如本文中所引用的MAGI-1結構域2(氨基酸序列為PSELKGKFIHTKLRKSSRGFGFTVVGGDEPDEFLQIKSLVLDGPAALDGKMETGDVIVSVNDTCVLGHTHAQWKIFQSIPIGASVDLELCRGYPLPFDPDDPN的)，在其他文獻中可以被引用為MAGI-1結構域1。同樣地，當在本申請中引用蛋白質(zhì)的特殊PDZ結構域時，應該鑒于如本文，特別是在申請US20040018487的序列列表表2中所述的該結構域的序列，對該引用進行理解，當合適時，申請US20040018487的序列列表表2顯示了所述序列列表的序列和關于不同結構域的名稱和Genbank編號之間的關系。用于本文時，術語″PDZ蛋白質(zhì)″指天然存在的含有PDZ結構域的蛋白質(zhì)。示范性PDZ蛋白質(zhì)包括CASK，MPP1，DLG1，DLG2，PSD95，NeDLG，TIP-33，SYN1a，TIP-43，LDP，LIM，LIMK1，LIMK2，MPP2，NOS1，AF6，PTN-4，prIL16，41.8kD，KIAA0559，RGS12，KIAA0316，DVL1，TIP-40，TIAM1，MINT1，MAGI-1，MAGI-2，MAGI-3，KIAA0303，CBP，MINT3，TIP-2，KIAA0561，和TIP-1。用于本文時，術語″PDZ-結構域多肽″指含有PDZ結構域的多肽，諸如包括PDZ結構域序列的融合蛋白、天然存在的PDZ蛋白質(zhì)、或分離的PDZ結構域肽。因此，PDZ-結構域多肽可以是約60或更多個氨基酸的長度、約70或更多個氨基酸的長度、約80或更多個氨基酸的長度、約90或更多個氨基酸的長度、約100或更多個氨基酸的長度、約200或更多個氨基酸的長度、約300或更多個氨基酸的長度、約500或更多個氨基酸的長度、約800或更多個氨基酸的長度、約1000或更多個氨基酸的長度，通常至多約2000或更多個氨基酸的長度、約50-2000個氨基酸的長度、約50-1500個氨基酸的長度、約50-1000個氨基酸的長度、約60-1000個氨基酸的長度、約70-1000個氨基酸的長度。PDZ結構域肽通常不多于約200個氨基酸(例如，50-200個氨基酸、60-180個氨基酸、80-120個氨基酸、或90-110個氨基酸)，并編碼PDZ結構域。例如，適合于檢測HPV的E6蛋白質(zhì)的抗體記述在20050142541(2005年6月30日公開的)中。在公開的美國專利申請US20040018487中找到用于識別來自HPV致癌毒株的E6蛋白的詳細方法，將該方法的全部內(nèi)容引入本文。這些公開的方法易于適合在本方法中使用。在某些實施方案中，抗-E6抗體可以與固相支持體結合，并且由本主題方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物和與固相支持體結合的抗體相接觸。所述固相支持體在本領域中是公知的，且可以包括但不限于：膠體金粒子，化學發(fā)光粒子，染色的膠乳粒子，或SERS拉曼粒子，例如，具有報告染料的硅石-包被的金核或銀核。在某些實施方案中，抗-E6抗體可以綴合到熒光標記上。利用包含PDZ結構域的蛋白質(zhì)，可以檢測蛋白質(zhì)提取物中的致癌E6蛋白的結合。在其他實施方案中，包含PDZ結構域的蛋白質(zhì)可以與固相支持體結合，并且由本主題方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物和與固相支持體結合的包含PDZ結構域的蛋白質(zhì)相接觸。利用抗-E6抗體，可以檢測蛋白質(zhì)提取物中的致癌E6蛋白的結合。在備選的方法中，在包含PDZ結構域的蛋白質(zhì)的抗體之間的結合可以發(fā)生在溶液中(即，在缺乏抗體或包含PDZ結構域的蛋白質(zhì)與固相支持體結合的條件下)，并且，結合后，該抗體或包含PDZ結構域的蛋白質(zhì)可以與固相支持體(例如，珠或類似物，諸如上述那些)結合。在這些實施方案中，包含PDZ結構域的蛋白質(zhì)可以是具有親合結構域的融合蛋白，所述親合結構域與固相支持體相結合。利用識別E6蛋白的第二捕獲劑，能夠檢測E6蛋白的存在。在優(yōu)選的實施方案中，利用側向流動(LF)測定、免疫色譜測定、浸染棒檢測(dipsticktests)或流過免疫測定(flow-throughimmunoassays)來檢測提取的、捕獲的E6蛋白。在優(yōu)選實施方案中，將包括包含PDZ結構域的蛋白的“捕獲區(qū)”的側向流動(LF)條帶置于含有提取的樣品的小瓶或孔中，其中已經(jīng)加入了第二捕獲劑如與金顆粒綴合的抗-HPVE6單克隆抗體(mAb)。然后允許該金顆粒和樣品通過毛細管作用在條帶上遷移。可以將吸附墊附著在遠端以促進液體在條帶上流動。在樣品在條帶上遷移的過程中，捕獲區(qū)中的PDZ結構域蛋白可以與E6蛋白結合。如果溶液中存在金綴合的mAb的結合，則抗-E6-金綴合物可以結合PDZ結構域蛋白。備選地，E6蛋白可以結合PDZ結構域蛋白，然后捕獲E6金綴合物。在任一種情形中，成功的捕獲可以導致在LF條帶上形成可視和可檢測的線條。在優(yōu)選實施方案中，利用細胞計數(shù)珠陣列(CBA)輔助檢測捕獲的E6蛋白。CBA，還稱為多元珠測定，是一系列可以用于捕獲和定量可溶分析物的光譜離散性顆粒。然后，通過檢測基于熒光的發(fā)射的檢測和流式細胞術分析來測量分析物。BectonDickinson(BD)TMCBA產(chǎn)生與基于ELISA的測定相當?shù)摹⒌浴岸嘣被蛲瑫r方式的數(shù)據(jù)。如使用任一種夾心形式的測定相同，未知分析物濃度的計算通常通過使用已知的標準物且將未知物針對標準曲線繪圖而進行。有效用于檢測捕獲的E6蛋白的儀器室本領域中公知的。例如，可以使用反射計儀器或UMN讀取儀來檢測LF條帶上得到的線條。備選地，如果使用熒光標記的抗E6mAb捕獲E6蛋白，則可以使用熒光計讀取儀。還可以使用其中結合探測粒子作為裝置的固有部分的裝置。備選地，本發(fā)明的提取方法可以產(chǎn)生由E6結構部分單獨地或與特異性抗體、肽或蛋白(與粒子附著或不附著的)復合組成的輸入樣品。所述輸入樣品可以引入到特異性捕獲或基于非特異性膜的流過檢測裝置中，并且隨后通過酶或基于粒子的系統(tǒng)或放大檢測系統(tǒng)進行檢測?？梢岳枚喾N方法提高信號檢測。一種這樣的方法利用綴合至金粒子上的酶綴合的(例如，辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP))單克隆抗體(mAbs)與沉淀底物結合。具有多個生物素接著鏈霉抗生物素蛋白金粒子的抗體也可以導致放大的信號。生物素酪胺可以用來在檢測線條周圍沉積更多生物素，然后是鏈霉抗生物素蛋白-綴合的金來進行放大和檢測。備選地，信號增強可能由使用雙重方法導致，所述雙重方法包括由生物素和特異性mAb-共綴合的金粒子(或熒光標記的粒子)組成的一級粒子，其后是與鏈霉抗生物素蛋白綴合的二級粒子。一級粒子可以是特異性E6重復標記的粒子，其后是抗-標記的二級粒子。一級粒子還可以是能夠與來源于一些、許多或全部致癌HPV毒株的E6蛋白和/或與該E6蛋白的一個或多個表位反應的抗體的混合物。所述抗體混合物可以被生物素?；⒕Y合至固相支持體(例如，金粒子)上、或熒光標記；并且本文所述的多種方法可以與所述混合物聯(lián)合使用以檢測E6蛋白。在某些實施方案中，可以增加提取緩沖液中的活性成分，以增加臨床樣本的溶解。這樣增加的溶解可以消除對澄清樣品的需要，并且減少測定中的一個步驟。還可以可能地沉淀抗-E6-mAb-金復合物，并且在小體積中重建，從而濃縮樣品，由此富集E6蛋白且提高測定的靈敏性?？梢栽跈z測之前過濾樣品，以去除可能干擾樣品流動和檢測的不需要的物質(zhì)。過濾可以降低樣品的粘度，導致樣品提高的流速。這可以提高將樣品濃縮為樣品膜的效率或在側向流動裝置上的流速。另外，通過減少樣品中較大粒徑的物質(zhì)，可以降低樣品的粘度，這導致樣品提高的流速。這可以增加將樣品濃縮為樣品膜的效率或在側向流動裝置上的流速?？梢允褂脧V泛多樣的天然的和合成的有機和無機聚合物來過濾樣品。示例性的聚合物包括聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚(對苯二甲酸乙二酯)(poly(ethyleneterephthalate))，人造絲，尼龍，聚(丁酸乙烯酯)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride)(PVDF)，硅氧烷，聚甲醛，纖維素，醋酸纖維素，硝化纖維素，玻璃纖維濾紙，聚氯乙烯，聚乙酸乙烯酯(polyvinylacetate)，乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物，聚酰胺，聚碳酸酯，奧綸(orlon)，聚酯，聚苯乙烯，等等，或者還可以使用摻合物。在優(yōu)選的實施方案中，濾器的孔徑允許樣品蛋白通過而防止其他物質(zhì)(例如，細胞碎片)通過。例如，濾器孔徑可以在例如0.1μm-50.0μm范圍內(nèi)。優(yōu)選地，孔徑在0.5-25μm，1.0-20μm，2.0-15μm，3.0-10μm，或4.0-6.0μm范圍內(nèi)。例如，在通過使細胞與本發(fā)明的提取試劑接觸然后與本發(fā)明的中和試劑接觸進行的蛋白提取步驟后，樣品可以通過孔徑為0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0或8.0μm的濾器。本領域技術人員應該認識到，基于待過濾的樣品，可能需要不同的孔徑?？梢云仁箻悠吠ㄟ^濾器(例如，通過包含膜濾器孔的注射器或使用通過濾器的真空吸力)。存在本領域技術人員公知的多種過濾樣品的方法。樣品過濾可以導致樣品的提高的流速。在一些情形中，相比于不過濾的樣品，樣品的流速可以提高5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。適當?shù)臑V器尺寸可以在信號檢測沒有任何可評估的損失的條件下引起流速的提高?？梢詫@自上述測定方法的結果與獲自合適的對照，例如，陽性對照(其中，可以使用已知含有與捕獲劑結合的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)提取物)或陰性對照(例如，其中可以使用不與細胞樣品相接觸的蛋白質(zhì)提取試劑)的結果進行比較。獲自上述測定方法的結果可以顯示在蛋白質(zhì)提取物中蛋白質(zhì)的存在、缺乏，或在某些實施方案中，顯示在蛋白質(zhì)提取物中蛋白質(zhì)的量。在某些實施方案中，可以將獲自上述測定方法的結果傳達回遠程位置，例如，通過電話、傳真、電子郵件、郵寄或任何其他方式。例如，可以將所述結果傳達給受試者或受試者的醫(yī)生。以上蛋白質(zhì)檢測方法可以與不同的檢驗，諸如細胞學檢驗，例如用于確定癌或癌前子宮頸細胞的Pap檢驗、或其他分子檢驗聯(lián)合進行。在這些實施方案中，在使用前，可以將細胞樣品分為幾部分。第一部分可以在細胞學測定中使用，且第二部分可以在上述方法中使用。依照以上內(nèi)容，本發(fā)明的某些實施方案還提供了用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的系統(tǒng)。該系統(tǒng)通常含有：a)包含固定的或未固定的細胞的細胞樣品；b)具有至少約pH10.0的pH的提取試劑；和c)中和試劑，其中所述固定的或未固定的細胞、提取試劑和中和試劑可以在以上方法中使用，從而產(chǎn)生適合于在結合測定中使用的蛋白質(zhì)提取物。所述提取試劑和/或中和試劑含有聚氧乙烯烷基醚。試劑盒在另一方面中，本發(fā)明提供用于實施本主題方法的試劑盒，例如，用于從固定的或未固定的細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的試劑盒，在某些實施方案中，用于檢驗蛋白質(zhì)提取物中蛋白質(zhì)的存在的試劑盒。本主題試劑盒至少包括具有至少約pH10.0的pH的提取試劑，和中和試劑。所述提取試劑和/或中和試劑含有聚氧乙烯烷基醚。另外，該試劑盒可以包括用于檢測蛋白質(zhì)的捕獲劑，和，在某些實施方案中，用于利用捕獲劑檢測蛋白質(zhì)的試劑(例如，緩沖劑和檢測試劑)。以上成分可以存在于分別的容器中或可以將一種或多種成分組合到一個容器，例如玻璃或塑料瓶中。除以上成分外，本主題試劑盒還可以包括用于實施本主題方法的說明書。這些說明書可以以多種形式出現(xiàn)在本主題試劑盒中，在試劑盒中可以存在一份或多份說明書。這些說明書可以出現(xiàn)的一種形式是作為在試劑盒包裝中、在包裝插頁等中的合適媒介或基底上印刷的信息，例如在一張或數(shù)張在其上印刷了該信息的紙上的印刷的信息。另一種方式是其上記錄了該信息的計算機可讀媒體，例如，磁盤、CD、等。再一種可以出現(xiàn)的方式是可以用來通過互聯(lián)網(wǎng)訪問處于遠端的信息的網(wǎng)站地址。該試劑盒中可以存在任何便利的方式。效用上述方法和系統(tǒng)易于用于多種研究和診斷方法，包括診斷特殊疾病或病癥、或由傳染性媒介諸如病毒或細菌引起的感染的方法。在一個實施方案中，將本方法用作檢測HPV感染的細胞的診斷的一部分。由于HPV的致癌毒株的存在與癌細胞和癌前細胞相關，所以本方法可以用于檢測癌或癌前子宮頸細胞。已知HPV是下列疾病中的病原體：疣狀表皮發(fā)育不良(epidermodysplasiaverruciformis)(EV)，即導致皮膚(例如，鱗狀細胞的(squamocelllar))癌高風險的終身皮膚病癥；子宮頸瘤形成(cervicalneoplasias)，諸如子宮頸上皮內(nèi)瘤形成(cervicalintraepithelialneoplasia)(CIN)和侵入性子宮頸癌(invasivecervicalcarcinoma)(ICC)；陰道瘤形成(viginalneoplasias)，諸如陰道上皮內(nèi)瘤形成(vaginalintraepithelialneoplasia)(VAIN)和陰道癌(vaginalcarcinoma)(VC)；外陰瘤形成(vulvalneoplasias)，諸如外陰上皮內(nèi)瘤形成(vulvarintraepithelialneoplasia)(VIN)和外陰癌(vulvarcarcinoma)；陰莖癌(penilecarcinoma)(包括，退行發(fā)育丘疹病(Bowenoidpapulosis))；肛門(AC)和肛周癌(PC)(anal(AC)andperianalcarcinomas(PC))；口咽癌(oropharyngealcarcinomas)(OS)；食管癌(esophagealcarcinomas)(EC)；非-黑素瘤皮膚癌(non-melanomaskincancers)(例如，基細胞癌(basalcellcarcinoma)-BCC和鱗狀細胞癌(squamouscellcarcinoma)-SCC)；和黑素瘤(melanoma)。同樣，在一個實施方案中，本方法可以用作對任何這些疾病的診斷。在一個實施方案中，從受試者獲得(例如，剝離或切除)細胞，并將其存放在含有固定劑的液體培養(yǎng)基中，在某些實施方案中，所述含有固定劑的液體培養(yǎng)基可以是用于細胞學檢驗的運送培養(yǎng)基。通常在醫(yī)生的辦公室或診室中獲得細胞，將細胞樣品轉(zhuǎn)送到檢驗機構并且由其接收，在所述機構中，進行上述蛋白質(zhì)檢測方法和，任選地，進行細胞學測定。將來自該檢驗的結果傳達給受試者，在一些實施方案中，通過醫(yī)生及其同事傳達。其細胞被采用的受試者可以是哺乳動物，例如，狗或貓，嚙齒動物(例如，小鼠、豚鼠、或大鼠)，或靈長類動物(例如，人、黑猩猩、或猴)。在許多實施方案中，受試者應該是人，具體地，男性或女性。在某些實施方案中，受試者可以表現(xiàn)出HPV感染的癥狀(例如，可以在身體的一處或多處具有疣)，可以被懷疑受到HPV的感染(例如，可以含有與所述感染在細胞學上一致的細胞)或可以已被檢驗出HPV陽性。在某些實施方案中，受試者可以不具有HPV感染的適應證，且以上方法可以用作常規(guī)篩查的一部分。在一個實施方案中，本方法可以用于檢測致癌HPV的任何毒株，例如，HPV26，HPV53，HPV66，HPV73，HPV82，HPV16，HPV18，HPV31，HPV35，HPV30，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV59，HPV58，HPV33，HPV66，HPV68或HPV69，(特別地，任何最普遍的HPV毒株，例如，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33和HPV45)，其通過檢測來自所述毒株的E6蛋白而進行。在一個實施方案中，在本方法的起始點，尚不知固定的或未固定的細胞是否含有致癌E6蛋白或致癌E6蛋白來自哪種毒株。如果檢測測定顯示出在細胞中存在致癌E6蛋白，則感染那些細胞的HPV毒株的身份能夠通過其他分子測定或通過病毒DNA測序而確定，所述分子測定例如使用對特殊E6蛋白或由病毒編碼的其他蛋白質(zhì)特異的抗體的那些。通過舉例說明而非限制的方式，提供了以下實施例。實施例實施例1：提取摻加的(spiked)臨床樣品將受HPV16E6基因(C33A+)轉(zhuǎn)染的細胞用THINPREPTM培養(yǎng)基固定，并如下所列出地，將其添加(即，“摻加”)到部分THINPREPTM-固定的臨床樣品中。將細胞摻加到5種臨床樣品中每一種的一半中(每一半臨床樣品具有兩千萬個C33A+細胞)。提取方案：C33A(+)ThinPrep細胞/20M細胞/ml1-將20MC33A(+)ThinPrep細胞添加到1/2臨床陰性#229(1.0ml提取物)中2-將20MC33A(+)ThinPrep細胞添加到1/2臨床陰性#230(1.0ml提取物)中3-將20MC33A(+)ThinPrep細胞添加到1/2臨床陰性#231(1.0ml提取物)中4-將20MC33A(+)ThinPrep細胞添加到1/2臨床陰性#232(1.0ml提取物)中5-將20MC33A(+)ThinPrep細胞添加到1/2臨床陰性#233(1.0ml提取物)中6-20MC33A(+)ThinPrep細胞(1.0ml提取物)提取試劑：TritonX-100/Lot092K0171-(1％＝250μl)5MNaCl/Lot5701-53-(0.15M＝750μl)0.5MTris堿/Lot5708-20-(0.1M＝5ml)05M甘氨酸/Lot5708-9-(0.1M＝5ml)10％SDS/Lot5708-8-(0.05％＝125μl)8M尿素/Lot5678-83-(0.25M＝781μl)加入RO/DI至20ml-(8.1ml)5NNaOH/LotA09522-(525μl)加入RO/DI至25ml-(4.475ml)最終pH-11.48最終制劑：0.1MTris/0.1M甘氨酸/0.15MNaCl/1％TritonTMX-100/0.05％SDS/0.25M尿素pH11.48蛋白質(zhì)提取程序：1.將細胞混懸液加入到50ml離心管中2.在3000rpm旋轉(zhuǎn)10-15分鐘3.小心地去除上清液4.將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到1.5mlnunc管中5.在3000rpm旋轉(zhuǎn)10-15分鐘6.小心地去除上清液7.向沉淀加入需要量的提取試劑8.重新混懸，從而打碎細胞沉淀a.添加劑(處于1∶100的DTT)9.檢查pH，調(diào)節(jié)到11.510.在RT(或?qū)μ崛『线m的溫度)下混合30分鐘11.在14,000rpm旋轉(zhuǎn)10-15分鐘12.去除澄清的上清液13.加入處于1∶100的DTT14.用5NHCl中和到pH8.0，并在ELISA中檢驗(用31.0μl5NHCl/1ml中和到pH8.0)100mMDTT/NR5701-90/DOM2/7/05ELISA方法1-用5ug/ml處于PBS(lot021405)中的GST-Magi-PDZ(lot88.18/0.65ug/ul)包被平板(Nunc439454MaxisorpF96/lot542043)-100ul/孔11mlx5ug/ml＝55ugx1ul/0.65ug＝84.6ulGST-Magi-PDZ2-在4℃溫育過夜3-用平板清洗劑清洗3次(TBS-Tween)4-用250ul封閉緩沖液(lot033005)封閉平板5-在25℃溫育2小時6-用平板清洗劑清洗3次(TBS-Tween)7-將100ulMBP-E6/溶解產(chǎn)物樣品加入到合適的孔中8-在25℃溫育1小時9-用平板清洗劑清洗3次(TBS-Tween)10-將100ul處于5ug/ml的抗-E6抗體(4C6-2.85mg/ml-lot02)加入到處于2％BSAHNTG緩沖液(lot031805B)中的合適孔中。將N-末端肽(HPV16E6lot#PN3952-2)以10ug/ml加入到合適的樣品中，從而證實信號的特異性(在加入前，用抗-E6抗體預培養(yǎng)肽45分鐘)11-在25℃溫育2小時12-用平板清洗劑清洗3次(TBS-Tween)13-在2％BSA/0.05％Tween20緩沖液(lot040505)中制備山羊抗-小鼠IgG-HRP(杰克遜(Jackson)GxMIgG-HRP/目錄#115-035-062/lot60988)的1∶5000稀釋液。10.0mlx1/5000＝0.002mlx1000ul/ml＝2.0ul山羊抗-小鼠IgG-HRP14-將100ul1∶5000山羊抗-小鼠IgG-HRP稀釋液加入到合適的孔中(去除TMB底物并置于室溫下)15-在25℃溫育1小時16-用平板清洗劑清洗5次(TBS-Tween)17-加入100ulNeogenK-藍TMB底物(lot041018)18-在25℃溫育30分鐘19-加入100ul終止溶液(lot030705)并讀取A450制劑：2％BSA/0.05％Tween緩沖液-(lot040505)2％BSA封閉劑lot033005(49.975ml)Tween20lotA016759301(0.025ml)結果如能夠從上表中所示結果看到地，對所有摻加的臨床樣品檢測到E6結合。實施例2：高pH緩沖液加添加劑對MBP-E6檢測的影響圖1所述的實施例舉例說明不同組成的緩沖液對重組麥芽糖結合蛋白(MBP)-E6蛋白的檢測的影響。通常，應該使用本文所述的提取緩沖液從細胞中提取蛋白。然而，此處，使用預先純化的重組蛋白以最優(yōu)化條件。簡言之，圖1A所述的實驗包括將MBP-E6蛋白懸浮在新鮮制備的、在添加劑含量和pH方面不同的提取緩沖液中。該“提取”步驟之后是中和步驟，在中和步驟中，樣品的pH被調(diào)節(jié)至中性pH。然后，使用側向流動測定檢測MBP-E6蛋白。緩沖液的組成本文所述的實驗中所用的緩沖液來源于兩種緩沖液之一，一種為較低pH緩沖液，即“緩沖液1”，另一種為較高pH緩沖液，即“緩沖液2”。緩沖液1(pH約為11.5)由下列組成：約100mMTris/甘氨酸，約50mMHepes，約150mMNaCl，約1mMEGTA，約1.1％TritonTMX-100，和約0.125-0.14NNaOH。緩沖液2(pH約為12-13)由下列組成：約0.1NNaOH和約50mM檸檬酸三鈉。然后用或不用“低量”或“高量”圖1A所示的添加劑補充每種緩沖液。添加劑在低-添加劑緩沖液中的濃度為約：0.25M尿素；0.05％SDS；2％TweenTM-20；2％BrijTM35(西格瑪(Sigma))；2％皂苷(saponin)；2％TergitolNP40；或10mMEDTA，pH8。添加劑在高-添加劑緩沖液中的濃度為約2M尿素；0.5％SDS；4％TweenTM-20；4％BrijTM35；4％皂苷；4％TergitolNP40；或50mMEDTA，pH8。如上文所示，緩沖液1具有1.1％TritonTMX-100的儲備水平，其用于低的和高的樣品二者。對于緩沖液2，TritonTMX-100的濃度為2％(低)或4％(高)。在本文所述的大部分實施例中，緩沖液，包括各種添加劑，在即將加入至樣品之前制備。然而，在某些情形中，在向樣品中引入一種或多種添加劑之前，首先用緩沖液處理該樣品。檢測MBP-E6蛋白在圖1A所述的實驗中，將520pgMBP-E6懸浮在1.03-1.13ml用所示添加劑新鮮配制的所示提取緩沖液中。然后，將該混懸液在RT下輕輕混合(末端-對-末端)約30分鐘。對于中和步驟，使用約2MTris將該混懸液調(diào)節(jié)至較低的pH(約7.8-8)，并且再在RT下旋轉(zhuǎn)30分鐘。將約150-200ul樣品通過本文所述的側向流動(LF)測定進行分析，以檢測MBP-E6重組蛋白。側向流動(LF)測定的描述本文所述的側向流動(LF)測定也稱為免疫色譜測定或浸染棒測定(dipstickassay)。簡言之，本文的LF測定包括將金-粒子結合的病毒蛋白捕獲在LF棒上存在的“捕獲區(qū)”上。成功的捕獲導致在LF條帶上出現(xiàn)可視且可檢測的線條。材料：20％(w/v)BSA0.22μm過濾的(西格瑪(Sigma)A7906)；膠體金8G11(BBI)；側向流動條帶，PDZ捕獲。方法：1)將約150-200μl樣品一式兩份置于96孔平板的兩個孔中。2)向每個孔中加入約20μl20％BSA，并且用移液管吸頭混合。3)向每個孔中加入約10μl8G11-綴合的膠體金，并且用移液管吸頭混合。8G11是識別HPV16E6蛋白的單克隆抗體(mAb)。4)將LF條帶置于每個孔中約120分鐘，以允許樣品通過毛細管作用在該條帶上遷移?？梢栽谶h端附著有吸附墊，以促進液體在條帶上流動。在樣品遷移過程中，HPV16E6蛋白可以與附著在膠體金粒子上的mAb結合。E6蛋白還被LF條帶上包含多種攜帶PDZ結構域蛋白的區(qū)域所捕獲，所述多種攜帶PDZ結構域蛋白能夠識別E6蛋白。所述捕獲導致在LF條帶上出現(xiàn)可視且可檢測的紅線。5)然后通過UMM儀器分析該LF條帶，所述UMM儀器為能夠量化可視信號輸出的測量反射系數(shù)的讀取儀。所獲得的值是相對的反射系數(shù)值。結果圖1所示的實施例表明組合某些添加劑和高pH提取緩沖液(緩沖液2，pH12.9)對MBP-E6蛋白的檢測產(chǎn)生協(xié)同作用。例如，當在不存在添加劑條件下比較緩沖液1和緩沖液2時，似乎提高的pH對重組MBP-E6蛋白的檢測沒有影響(圖1A，后4列)。某些添加劑，特別是SDS，TWEENTM-20，BrijTM35和TergitolNP40，在甚至使用較低pH的緩沖液，即緩沖液1，pH11.5時，的確提高MBP-E6蛋白的檢測(圖1A)。然而，當將添加劑與較高pH緩沖液(緩沖液2)組合時，在SDS，TWEENTM-20，TritonTMX100，和BrijTM35樣品中，極大提高了重組蛋白的檢測。例如，當提高pH時，在TritonTMX-100處理的樣品中的蛋白檢測由0躍至高于～2.4UMM的讀數(shù)。因此，有可能推論在“提取”步驟中組合高pH與某些添加劑對E6蛋白的檢測產(chǎn)生協(xié)同作用。圖1B描述了與在1A中進行的實驗相似的實驗。然而，圖1B中，是在中和步驟而不是之前的“提取”步驟過程中向樣品中引入添加劑。與在提取步驟過程中引入添加劑時相比，這一方法產(chǎn)生低得多的信號強度。因此，在中和步驟引入添加劑不是最理想的方法。實施例3：添加劑對由細胞提取E6蛋白的影響圖2所示的實施例評價了不同百分數(shù)的緩沖液添加劑對由細胞提取E6蛋白的影響。在該實施例中，蛋白提取自表達HPV16E6基因的SiHa細胞或提取自C33A-細胞，C33A-細胞為非HPV感染的子宮頸癌細胞系。提取步驟對于提取步驟，首先從-80℃冰箱中取出包含約一千萬個細胞的細胞沉淀物，并且允許在RT下解凍約10分鐘。然后，向大部分樣品中加入約750μl實施例2所述的緩沖液2。還向指定的樣品中引入添加劑，如BrijTM35，TweenTM-20，或TritonTMX-100。這些添加劑以2％或4％(v/v)的終濃度存在。作為對照，一些樣品用緩沖液673提取，緩沖液673為一種中性pH緩沖液，其包含20mMTrispH8，2％BSA，1％TritonTM-X100，2％TweenTM-20，0.2％肌氨酸，250mMNaCl，和50mMEDTA。將樣品短時渦旋振蕩，然后在RT下旋轉(zhuǎn)30分鐘。中和步驟對于中和步驟，加入約140-180ul的2MTris，pH6.0，以將每份樣品的pH減小為約pH7.8-8。中和樣品的pH所需要的Tris，pH6.0的體積預先憑經(jīng)驗確定。在加入Tris和短時渦旋后，將樣品在RT下旋轉(zhuǎn)30分鐘。然后，通過以14Krpm離心10分鐘而澄清樣品。然后，在通過實施例2所述的LF測定進行分析之前，將澄清的溶解產(chǎn)物(終體積約為1.09)轉(zhuǎn)移至干凈管中。結果當在提取步驟中使用含有4％BrijTM35的緩沖液2時，最好地檢測到HPV16E6蛋白(圖2)，另外，比較來自SiHa細胞與HPVE6-陰性C33A-細胞的信號，表明這種條件還極大地提高了所述測定的信噪比(圖2)。實施例4：在用4％BrijTM35/緩沖液2提取后HPV-16E6蛋白的劑量響應檢測在該實施例中，用實施例2和3中所述的4％BrijTM35/緩沖液2提取漸增數(shù)量的表達HPV-16E6的SiHa和Caski細胞。提取方法與實施例3所述的方法相似，并且使用約9.2X106細胞/ml的起始濃度。然而，LF測定的不同在于，每個LF條帶使用遞增的細胞數(shù)目。如圖3所示，LF測定中所用的每個條帶的細胞數(shù)目為約31,000；約62,000；約125,000；約250,000；約500,000；約1,000,000；或約1,700,000。陰性對照包括用中性pH的緩沖液673提取這些細胞(實施例3所述)和用4％BrijTM35/緩沖液2或緩沖液673提取HPV-陰性C33A細胞。如圖3所示，當使用C33A細胞時不存在劑量響應，當使用中性pH緩沖液673時僅有有限的劑量響應。然而，由于使用了漸增的細胞數(shù)目，在兩種表達HPV-16E6的細胞系(SiHa和Caski)中檢測到漸增量的E6蛋白。這些結果表明該測定以劑量-響應方式檢測HPV-16E6蛋白。實施例5：在由摻加的臨床樣品提取HPV-16E6蛋白中使用4％BrijTM35/緩沖液2圖4所示的實施例舉例說明在來自已經(jīng)組合或“摻加”了表達HPV-16E6的SiHa細胞的PAP正常臨床樣品的提取物中檢測HPV-16E6蛋白。本實施例中所用的臨床樣品是傳統(tǒng)Pap涂片檢測為陰性的未固定的、子宮頸刷拭樣品(brushsample)。首先將該樣品由-80℃冰箱取出，并且允許在RT下解凍約10分鐘。然后用小剪鉗剪掉每個刷子，然后將其置于含有約一千萬個SiHa細胞的冷凍細胞沉淀物的微量離心管中。以與實施例3和4所述的那些相似的方式進行樣品的提取、中和和LF測定。對于這一實驗，在提取步驟過程中使用4％BrijTM35/緩沖液2或中性緩沖液673(二者均在前述實施例中描述過)。兩種緩沖液的提取體積約為1ml。在5份使用4％BrijTM35/緩沖液2提取的SiHa-細胞-摻加的臨床樣品中檢測到非常大量的HPV16E6蛋白(圖4)。相反，5份非-SiHa摻加樣品的提取產(chǎn)生較低的信號。類似地，使用緩沖液673提取每種細胞類型也產(chǎn)生較低的信號。這些結果表明，在將來可以成功地使用BrijTM35/緩沖液2來檢測臨床樣品中的HPV16E6蛋白。實施例6：進一步優(yōu)化用于蛋白提取的BrijTM35/緩沖液2該實施例舉例說明使用不同百分比的BrijTM35和/或不同的添加劑組合進一步優(yōu)化BrijTM35提取。此處，使用含有不同BrijTM35水平的緩沖液2(實施例2所述)輔助由SiHa細胞提取HPV16E6，SiHa細胞為轉(zhuǎn)染了HPV16E6的基因的細胞系(圖5)。另外，還檢測了含有與其他添加劑如EDTA，TweenTM-20，或TritonTMX-100組合的BrijTM35的緩沖液2。對于這一實驗，提取、中和和LF測定步驟與實施例2和3所述的那些相似，區(qū)別在于提取緩沖液中所用的添加劑水平不同。提取緩沖液中所用的添加劑的量為：4％BrijTM35，5％BrijTM35，6％BrijTM35，4％BrijTM35+10mMEDTA，2％BrijTM35+2％Tween-20，2％BrijTM35+2％TritonTMX-100，2％BrijTM35+2％TweenTM-20+2％TritonTMX-100，或2％BrijTM35+2％TweenTM-20+10mMEDTA。作為對照，一些樣品用中性pH緩沖液673提取。每個LF條帶的近似細胞數(shù)目為約1,300,000。如圖5所示，BrijTM35百分數(shù)由4％增加至6％導致對HPV16E6蛋白的提高的檢測。該測定還通過向BrijTM35緩沖液中添加TritonTMX-100和/或TweeTMn-20而改善。實施例7：提取和/或中和步驟的時間對HPV16E6蛋白檢測的影響本實施例舉例說明提取和/或中和步驟的時間對HPVE6蛋白的最終檢測所具有的影響。在本實施例中，通常按照實施例3所述的步驟，同樣從SiHa細胞提取E6蛋白。然而，在該實施例中，提取和/或中和步驟的溫育時間改變(圖6)。SiHa細胞以約10,000,000細胞/ml提取30分鐘或10分鐘，并且中和30分鐘或10分鐘，如圖6所示。中和步驟的終止時間由澄清步驟的離心時間所確定。另外，對于LF測定，每個條帶使用1,700,000或500,000個SiHa細胞。當使用不同的提取或中和溫育時間時，沒有檢測到HPV-16E6蛋白的顯著不同(圖6)。因此，本實施例表明，當提取和/或中和溫育步驟的時間由30分鐘改變?yōu)?0分鐘時，所述測定沒有受到不利的影響。實施例8：使用4％BrijTM35/緩沖液2提取E6蛋白的HPV18和HPV45變體本實施例舉例說明實施例2和3中所述的4％BrijTM35/緩沖液2提取系統(tǒng)提取不同HPV毒株的E6蛋白的應用(圖7)。E6蛋白提取自表達HPV18的HeLa細胞或表達HPV45的MS751細胞。HPV陰性C33A-細胞系用作陰性對照。提取和中和步驟與實施例2和3所述的那些相似。對于LF測定，每個LF條帶使用相等的約1,700,000個各種類型的細胞。此外，LF測定中所用的膠體金與識別HPV毒株18和45的E6蛋白的F82-5A2單克隆抗體綴合。如圖7所表明的，4％BrijTM35/緩沖液2提取系統(tǒng)可以成功地用于提取HPV18E6蛋白和HPV45E6蛋白。實施例9：使用4％BrijTM35/緩沖液2提取E6蛋白的HPV16和HPV18變體本實施例比較了HPV16E6蛋白的和HPV18E6蛋白的4％BrijTM35/緩沖液2提取。關于圖8所述實驗的提取和中和步驟以與實施例8的那些相似的方式進行。然而，本實施例使用的是表達的HPV16的SiHa細胞和表達HPV18的HeLa細胞。同前，將C33A-細胞用作陰性對照。對于LF測定，每個LF條帶使用漸增數(shù)量的細胞(與實施例4相同的范圍)。另外，在SiHa細胞提取物的LF測定中使用抗-HPV16金，而在HeLa細胞提取物的LF測定中使用抗-HPV18金.在來自HeLa和SiHa細胞的提取物中檢測到E6蛋白(圖9)。HPV16E6蛋白和HPV18E6蛋白二者的檢測以劑量-響應方式發(fā)生(圖9)。實施例10：進一步優(yōu)化BrijTM35/緩沖液2系統(tǒng)本實施例舉例說明將緩沖液2(實施例2所述)中的BrijTM35水平由約4％改變?yōu)榧s10％的影響。對于圖9所述的實驗，提取和中和步驟與實施例3的那些相似。如在該實施例中，起始細胞為HPV16-感染的SiHa細胞或HPV-陰性C33A-細胞。然而，此處，在提取時存在的BrijTM35百分比不同。更具體地，所用的BrijTM35百分比為：約4％，約6％，約8％或約10％。另外，還檢測了2％BrijTM35/2％TweenTM20和2％BrijTM35/2％TweenTM-20/10mMEDTA。LF測定如本文所述那樣進行。每個LF條帶使用約170萬個細胞。如圖9所示，來自SiHa細胞提取物的陽性信號隨著BrijTM35濃度增加而增加。然而，在由HPV-陰性C33A-細胞制備的提取物中，信號也增加，這導致在較高的BrijTM百分比處的減小的信噪比。然而，當使用4％或6％BrijTM時，該測定的信噪比似乎得到改善。另外，組合BrijTM與TweenTM-20也似乎改善了信噪比。實施例11：優(yōu)化由SiHa-摻加的陰性臨床樣品的提取本實施例舉例說明改變提取條件對由SiHa-摻加的陰性臨床樣品提取E6蛋白的影響。此處所用的樣品制備以及提取和中和步驟與實施例5所用的那些相似。然而，在本實施例中，陰性臨床樣品(NCS)存在于藥簽上而不是刷子上。另外，在本實驗中改變提取條件，從而包括具有4％BrijTM35；2％BrijTM35/2％TweenTM-20，或；2％BrijTM35/2％TweenTM-20/10mMEDTA的緩沖液2(圖10)。如所示，對于LF測定使用約170萬個SiHa細胞/條帶。如圖10所示的結果所示，由于SiHa-摻加的樣品產(chǎn)生相對一致的陽性信號，而陰性樣品產(chǎn)生相對較低的信號(圖10)，所以4％BrijTM35/緩沖液2條件可能是檢測臨床樣品中的HPV16E6蛋白的優(yōu)越條件。實施例12：在存在HPV-陰性細胞的條件下由SiHa細胞提取HPV16E6蛋白本實施例舉例說明在存在HPV-陰性C33A-細胞的條件下由SiHa細胞提取HPV16E6蛋白。對于本實施例，將漸增量的SiHa提取物滴定至含有固定量(約1百萬/ml)C33A-細胞的緩沖液中(圖11)。對于這一實驗，每種細胞系分別使用4％BrijTM35/緩沖液2或ArborVita溶胞緩沖液(AVLB)提取。AVLB由下列組成：約50mMHEPES，pH約為pH7.5，約1.1％TritonTMX-100，約150mMNaCl，約10％甘油和約1mMEGTA。提取和中和步驟以與實施例3相似的方式進行。然而，在這一實驗中，制備由AVLB或中和的4％BrijTM35/緩沖液2組成的稀釋劑。然后，將C33A-提取物以約1百萬個細胞/ml的水平摻加至每種緩沖液中。然后，將SiHa細胞提取物連續(xù)稀釋至所示的包含C33A-的緩沖液中。樣品通過細胞計數(shù)珠陣列(CBA)分析，并由熒光計進行讀數(shù)。本實驗的結果揭示檢測E6蛋白的最佳條件為4％BrijTM35/緩沖液2提取和中和然后稀釋在AVLB緩沖液中(圖11)。另外，檢測E6蛋白的水平似乎為約5000個細胞/ml或500個細胞/孔(圖11)。實施例13：由固定在ThinPrepTM或SurePathTM固定劑中的SiHa細胞提取HPV16E6蛋白本實施例舉例說明緩沖液2/4％BrijTM35提取系統(tǒng)可以用于從固定的細胞提取蛋白。在圖12所述的實驗中，將一千萬個HPV16陽性SiHa或HPV-陰性C33A-細胞添加至1ml所示的固定劑或DMEM培養(yǎng)基中在RT下1小時。然后，將細胞以1000RPM離心15分鐘，沉淀，并且重懸在1ml實施例3所述的4％BrijTM35/緩沖液2中。然后，對樣品進行實施例3所述的提取、中和和LF測定。如圖12所示，在提取步驟中使用4％BrijTM35/緩沖液2時，成功地檢測到ThinPrepTM-和SurePathTM-固定的SiHa細胞二者中存在的E6蛋白。由以上結果和討論證明本主題方法為固定的或未固定的細胞的分子分析提供許多獨特的優(yōu)勢。具體地，本方法提供用于從固定的或未固定的細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)提取物的常規(guī)方法，其中蛋白質(zhì)提取物中的蛋白質(zhì)是可以在結合測定中檢測的。由于通常很難檢測固定的或未固定的細胞中的某些蛋白質(zhì)，所以，本主題發(fā)明表現(xiàn)出對本領域的顯著貢獻。實施例14：通過膜濾器過濾蛋白質(zhì)提取物對樣品流速的影響在本實施例中，蛋白提取自表達HPV16E6蛋白的SiHa細胞或提取自C33A-細胞，C33A-細胞為非HPV感染的子宮頸癌細胞系，并且在評估得到的樣品的流速之前使其通過過濾膜運行。提取步驟對于提取步驟，首先從-80℃冰箱中取出包含約一千萬個細胞的細胞沉淀物，并且允許在RT下解凍約10分鐘。然后，向大部分樣品中加入約750μl實施例2所述的緩沖液2。還向指定的樣品中引入添加劑，如BrijTM35，TweenTM-20，或TritonTMX-100。這些添加劑以2％或4％(v/v)的終濃度存在。將樣品短時渦旋，然后在RT下旋轉(zhuǎn)30分鐘。中和步驟對于中和步驟，加入約140-180ul0.9MTris，pH7.8，以將每份樣品的pH減小為約pH8.5。中和樣品的pH所需要的Tris，pH7.8的體積預先憑經(jīng)驗確定。在加入Tris和短時渦旋后，將樣品在RT下旋轉(zhuǎn)30分鐘。然后，通過以14Krpm離心10分鐘而澄清樣品。過濾步驟將澄清的溶解產(chǎn)物(終體積約為1.09)通過5.0μmMilliporePVDF注射器濾器過濾。然后，使樣品通過樣品流通裝置運行，并且測量運行整份樣品所需要的時間。還評估樣品的免疫測定信號強度，并且在視覺上或用CAMAG密度計進行讀數(shù)。HPVE6的存在視覺上以0-4等級計分。結果樣品通過5.0μmPVDF注射器濾器的流動時間減少，在一些情形中，減少幾乎50％。數(shù)據(jù)顯示在下表1中。另外，通過視覺讀取評估樣品表明在通過5.0μm注射器濾器過濾后SiHa信號沒有顯著損失(圖13)。表1.過濾后樣品的流動評估樣品池樣品流動時間(未過濾的)(分鐘)樣品流動時間(過濾的)(分鐘)樣品池樣品流動時間(未過濾的)(分鐘)樣品流動時間(過濾的)(分鐘)110:418:521012:2310:10219:129:37118:216:4633:333:2212＞30分鐘15:45419:4612:13134:124:055＞30分鐘27:3614＞30分鐘16:4164:264:2015＞30分鐘28:12711:568:24500KSiHa3:513:42825:1214:34500KC33A-3:573:37917:5810:40將本說明書中引用的全部出版物和專利申請引入本文作為參考，如同將每篇單獨的出版物或?qū)＠暾執(zhí)貏e地和個別地指定引入作為參考。任何出版物的引用是關于其在提交日前的公開，并且不應該將其解釋為承認本發(fā)明沒有資格通過在先的發(fā)明先于所述出版物。盡管為了清楚理解的目的，通過舉例說明或?qū)嵤├敿毭枋隽饲笆霭l(fā)明，但是對于本領域中普通技術人員明顯地是，根據(jù)本發(fā)明的教導，在不偏離所附權利要求的精神或范圍的條件下，可以對其進行某些改變和改進。