專利名稱：交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及交聯(lián)殼聚糖表面仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和作為生物和醫(yī)學(xué)材 料的應(yīng)用，具體涉及改性交聯(lián)殼聚糖材料，屬于表面科學(xué)和生物醫(yī)用高分 子材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
當(dāng)生物醫(yī)用材料用于體內(nèi)時，材料與血液接觸后會發(fā)生凝血，形成血
栓；與組織接觸一般會產(chǎn)生炎癥。目前還沒有一種能完全滿足生物相容性 要求的合成或天然醫(yī)用生物材料。因而選擇物理性能良好的現(xiàn)有材料進(jìn)行 生物相容性表面改性成為研究的重點(diǎn)。
殼聚糖作為自然界唯一大量存在的堿性多糖，是一種無毒、無污染的 可再生資源，具有較好的生物相容性，且容易改性，在國際上受到廣泛的 關(guān)注。越來越多的研究表明殼聚糖及其衍生物材料可以用于血液凈化。 殼聚糖分子上的氨基有助于對血液中多種毒素的吸附，可以用于血液灌流 材料(王虹等.庫箏夢趁眾夢夢疾2002， 23(1)， 75 77; Chandy T. etalJowma/ 6)/M/crae"capra/加'o" 1993, 10(4), 475~486.)。殼聚糖膜具有高的透析 率，選擇性和強(qiáng)度，可以用作血液透析材料(QurashiM.T.etaUo^7 a/0/ 々^//W尸o/少ww5We"ce 1992， 46,255-261; 263-269)。雖然殼聚糖及其衍 生物作為血液凈化材料具有許多優(yōu)點(diǎn)，但是也存在著蛋白質(zhì)吸附，血小板 黏附，最終導(dǎo)致凝血，形成血栓等問題，所以進(jìn)一步提高殼聚糖及其衍生 物材料的抗凝血性，降低對蛋白質(zhì)的吸附，血小板的黏附，提高血液相容 性迫在眉睫(Zhu A. P. et al 4 ; //^/Sw/ace Sde"ce 2005， 241, 485 492; Johan Benesch et al 所ow她n'a/s 2002， 23, 2561~2568; WangX. H. etal 所omafen'a^ 2003， 24, 3213~3220.)。磷酰膽堿(Phosphoiycholine， PC)是生物細(xì)胞外層膜的主要成份，是 細(xì)胞外層膜中的外層官能團(tuán)，是組成細(xì)胞膜基本單元卵磷脂的親水端基。 從結(jié)構(gòu)來看，磷酰膽堿帶有兩性離子端基，即同時帶有正、負(fù)兩種電荷， 因而具有很強(qiáng)的結(jié)合水的能力。這種性質(zhì)使富含磷酰膽堿基團(tuán)的材料表面 不易吸附及沉集蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體等生物體成分，表現(xiàn)出良好的生物相容性。 近年來的研究表明，用磷酰膽堿基團(tuán)及其聚合物對生物材料表面進(jìn)行仿細(xì) 胞膜結(jié)構(gòu)的修飾，可以提高材料的生物相容性，明顯降低對蛋白質(zhì)的吸附， 血小板的黏附，顯著提高血液相容性?？傊?，在交聯(lián)殼聚糖表面上，利用 磷酰膽堿基團(tuán)構(gòu)建仿細(xì)胞膜的方法改性交聯(lián)殼聚糖，具有重要的學(xué)術(shù)意義 和巨大的應(yīng)用巿場。
QurashiM. T.等人為了提高殼聚糖的生物容性，采用聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)和殼聚糖共混，研究了血液中尿素，尿酸等的透過率(QurashiM.T. et al Jo固a/ 。/尸o/戸r 5We"ce 1992， 46, 255-261; 263-269 )。伴 隨著科研人員對殼聚糖的研究日益深入，用磷酰膽堿基團(tuán)在殼聚糖表面構(gòu) 建仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，可以降低對蛋白質(zhì)的吸附，血小板的黏附，提高血液相 容性成為了研究的重點(diǎn)。ShengMeng等人用2-氯-2-氧代-l，3，2-二氧磷雜環(huán) 戊烷(COP,沸點(diǎn)為98 °C/120 Pa)先接技在殼聚糖上，然后在高壓反應(yīng)條件 下，用三甲胺開環(huán)制備具有仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的殼聚糖(Sheng M. et al CaAo/^dra e尸o/少wera2007, 70, 82-88)。加拿大的科研小組采用含有醛 基磷酰膽堿，接枝改性獲得了水溶性殼聚糖(Kujawa P. et al 5/ow"crowo/ecw/es 2007 , 8 (10)， 3169 -3176 ; Tiera M. J. et al 所o附flcramo/ecw/es 2006, 7 (11), 3151 -3156 ),研究了細(xì)胞在含有改性殼聚 糖材料表面上增長情況。ZhuA.P.等人在苯甲酸殼聚糖接枝磷酰膽堿基團(tuán)， 殼聚糖上接枝甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿，并進(jìn)一步研究了細(xì)胞，蛋白在 其表面的黏附和吸附行為(Zhu A.P. et al Jowr"a/ o/J/^/ZW尸o/ymer 5Wewce 2003， 88(2)， 489-493; Zhu A.P. et al尸o/少證/"妙雄'麵/ 2003， 52(1)，81-85; Zhu A.P. et al Jowwo/ 0/6/ow(^en."/s sde"ce.尸o/ywer e力Y/ow 2002, 13(5)， 501-510)。孟晟等人用縮合反應(yīng)得到了一種磷脂基團(tuán)修飾的多糖或 其衍生物(ZL200410054022.2)。林思聰?shù)热擞煤u基的磷酰膽堿對表面含 有異氰酸酯基團(tuán)的生物材料進(jìn)行了改性(ZL 02113066.3 )。
如上所述，改性后的殼聚糖可以明顯改善其生物相容性。要達(dá)到理想 的生物相容性，材料表面的磷酰膽堿基團(tuán)密度必須接近細(xì)胞膜外層磷酰膽 堿基團(tuán)的密度。但目前的改性殼聚糖表面的磷酰膽堿基團(tuán)密度較低，當(dāng)密 度較高時與體液接觸存在溶解現(xiàn)象，因而限制了其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方 法，以改善現(xiàn)有技術(shù)溶解性能。 本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過程
一種在交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方法，先將殼聚糖用 戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，然后在交聯(lián)殼聚糖表面接枝磷酰膽堿基團(tuán)構(gòu)建仿細(xì)胞膜 結(jié)構(gòu)。使用帶有磷酰膽堿兩性離子基團(tuán)的二氯磷酰膽堿對交聯(lián)殼聚糖及其 衍生物材料表面進(jìn)行仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的接技修飾。二氯磷酰膽堿分子中 的活潑氯可與殼聚糖單元中的氨基及羥基反應(yīng)得到高表面密度的磷酰膽堿 基團(tuán)，在材料表面形成仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)。
接枝反應(yīng)在無水非質(zhì)子性溶劑中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為40~80°C， 二氯磷 酰膽堿濃度為0.1~20mg/mL,所述的無水非質(zhì)子性溶劑為四氫呋喃、氯仿、 甲苯、二甲苯或其混合溶劑。
接枝反應(yīng)在堿性催化劑三乙胺或吡啶類化合物的協(xié)同作用下進(jìn)行。 交聯(lián)殼聚糖是顆粒狀、膜狀或附著在固體材料表面的涂層。 戊二醛與殼聚糖在水溶液中進(jìn)行交聯(lián)殼聚糖制備反應(yīng)，戊二醛與殼聚 糖的質(zhì)量比為0.2%-20%。
具體的講，交聯(lián)殼聚糖的制備方法如下用醋酸溶解殼聚糖，得到(0.1 0.8 wt。/。的殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液過濾后靜置脫泡，加入的5%的
戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，得到淡黃色交聯(lián)殼聚糖溶液，將交聯(lián)殼聚糖制成顆粒狀、
膜狀或附著在固體材料表面的涂層，用氫氧化鈉溶液浸泡交聯(lián)殼聚糖，之 后用二次蒸餾水充分水洗，直到洗滌水的電導(dǎo)率與蒸餾水相當(dāng)為止，即得
到戊二醛交聯(lián)殼聚糖。
殼聚糖表面接枝磷酰膽堿方法如下用無水三氯甲烷溶解二氯磷酰膽 堿，將交聯(lián)殼聚糖浸入二氯磷酰膽堿溶液中，加入三乙胺作為催化劑， 40 80。C下反應(yīng)3 12h。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果本發(fā)明的制備過程簡單，原料易得，表面 接枝密度可調(diào)。交聯(lián)處理不僅使含大量親水基團(tuán)的材料不溶于水，而且提 高了仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)表面的穩(wěn)定性。這種接枝密度高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的仿細(xì)胞膜 表面可顯著抑制蛋白質(zhì)吸附和血小板粘附，可阻止或大大延緩免疫系統(tǒng)激 活及血栓形成。本發(fā)明在人造心血管涂層材料，血液凈化裝置，新型藥物 控釋材料，組織工程及基因治療等領(lǐng)域有明顯的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
二氯磷酰膽堿按文獻(xiàn)報道方法制備(Durrani A. A， et al 5/ow"fm'afa 1986, 7,121-125;楊珊等豕論義夢夢疾(^辨存夢i^) 2008， 3)。釆用氯化 膽堿與三氯氧磷在無水條件下一步合成得到。
交聯(lián)殼聚糖膜和二氯磷酰膽堿接枝交聯(lián)殼聚糖膜的化學(xué)組成用傅立葉 衰減全反射紅外光譜及X射線光電子能譜(XPS)測量。改性前后表面的親疏 水性用DCAT21型表面張力儀測定水接觸角來衡量。磷酰膽堿接枝交聯(lián)殼 聚糖膜的前進(jìn)角從接技前的72.6±1.5°降低到50.6士U。，后退角由15.1±1.5。 降低到9.6±2.2°。這種動態(tài)接觸角的顯著降低說明磷酰膽堿基團(tuán)被成功引入 到交聯(lián)殼聚糖膜表面。XPS測定結(jié)果顯示，接枝后出現(xiàn)磷元素含量也說明 磷酰膽堿基團(tuán)被鍵合在殼聚糖表面。對氮元素不同價態(tài)分析推測，磷酰膽 堿基團(tuán)的表面為含量為28~56%。交聯(lián)殼聚糖膜的制備用1 y。(v/v)的醋酸溶解殼聚糖，得到0.卜0.8 wt。/。的殼聚糖溶液。將上述的殼聚糖溶液過濾后靜置脫泡，加入5%的戊二
醛進(jìn)行交聯(lián)。室溫下攪拌過夜，得到淡黃色交聯(lián)殼聚糖溶液。將清洗干凈 的載玻片豎直浸入交聯(lián)殼聚糖溶液中，待交聯(lián)殼聚糖溶液浸沒載玻片之后，
輕輕將載玻片提出。將鋪有交聯(lián)殼聚糖膜的載玻片在室溫下晾干。用0.5 wt。/。的氫氧化鈉溶液浸泡交聯(lián)殼聚糖膜片1.5 h,之后用二次蒸餾水充分水 洗，直到洗滌水的電導(dǎo)率與蒸餾水相當(dāng)為止，最后30'C真空干燥。
二氯磷酰膽堿接枝交聯(lián)殼聚糖膜用無水三氯甲烷溶解二氯磷酰膽 堿，將交聯(lián)殼聚糖膜片小心、豎直浸入二氯磷酰膽堿溶液中，加入無水三 乙胺作為催化劑，40 8(TC下反應(yīng)3 12h。反應(yīng)結(jié)束后將樣片取出，待表面
上的溶劑揮發(fā)之后，用蒸餾水小心淋洗，30 x:真空干燥得到二氯磷酰膽堿
接枝改性交聯(lián)殼聚糖膜。
蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)(S/omflcra/wo/ecM/^, 2004， 5(6): 2238~2246 ) 方法進(jìn)行。分別用緩沖液(pH-7.4)溶解一定量的牛血清白蛋白(BSA沐纖維 蛋白原(Fg)，得到 一定濃度的蛋白溶液。將樣品在PBS緩沖溶液中平衡1 h， 小心的將樣品表面的緩沖液擦拭干凈，之后將樣品轉(zhuǎn)移到吸附容器中，加 入一定量的BSA和Fg蛋白溶液，37 t孵育2h。孵育結(jié)束后，采用微量 BCA法計算出吸附液中蛋白的濃度。樣品表面吸附的蛋白含量通過蛋白吸 附液濃度的變化來確定。
血小板黏附實(shí)驗(yàn)參照Chen等人(所ow"fenWs,2007, 28: 1752~1760) 方法進(jìn)行。按體積比9:1在新鮮血液中，加入3.8 wt。/。的檸檬酸三鈉鹽溶液 作為抗凝劑，以1000 r/min離心10 min，溶液分層，上層淡黃色清液為富 含血小板血漿(PRP)。血小板黏附實(shí)驗(yàn)在靜態(tài)條件下進(jìn)行。將樣品放置在干 凈的培養(yǎng)皿中，用40 ^的富含血小板血漿(PRP)滴在樣品表面上，37°。孵 育2h后，用PBS緩沖液(pH二7.4)小心沖洗樣品表面，將黏附不牢的血小板 洗去之后用2.5wt。/。的戊二醛浸泡lh進(jìn)行固定，之后用PBS緩沖溶液和蒸餾水沖洗。再將樣品用考馬斯亮藍(lán)溶液浸泡0.511進(jìn)行染色，之后用蒸餾水 進(jìn)行漂洗，在室溫下干燥后放置于IBE-2003型熒光倒置顯微鏡下觀察并拍 昭
'、"o
實(shí)施例1:
將0.5g殼聚糖溶于lOOmL 1%醋酸水溶液中，室溫條件下攪拌20小時， 然后再用砂心漏斗過濾，靜置消除氣泡。取過濾后的溶液50mL,加入5% 戊二醛50iiL，室溫條件下攪拌8小時，涂覆于干凈的玻璃片上，室溫條件 下晾置24小時。將晾干的殼聚糖膜放置于0.1%的氫氧化鈉的溶液浸泡0.5 小時，然后再用蒸餾水浸泡40小時。最后3(TC真空干燥8小時，即可得到 交聯(lián)殼聚糖膜。
實(shí)施例2:
將lg殼聚糖溶于100mL， 2%醋酸水溶液中，室溫條件下?lián)璋?0小時， 然后再用砂心漏斗過濾，靜置消除氣泡，待用。將100mL四氯化碳100mL 石油醚10mLspan-80加入到500mL三頸瓶中，轉(zhuǎn)速設(shè)置700，室溫條件下 攪拌0.5小時，然后再將加入上述的殼聚糖溶液攪拌0.5小時，接著加入5% 戊二醛2mL反應(yīng)1.5小時，再用10。/。氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH-8-9，然后4(TC反應(yīng) 3小時，60。C反應(yīng)4小時。最后50。C真空干燥6小時，即可得到交聯(lián)殼聚 糖顆粒。
實(shí)施例3:
取用實(shí)施例1制備的交聯(lián)殼聚糖膜5片，浸泡于2mg/mL 二氯磷酰膽 堿無水氯仿溶液100mL中，三乙胺催化，65。C條件下反應(yīng)4小時，再用蒸 餾水沖洗，然后3(TC真空千燥，即可得到改性的交聯(lián)殼聚糖膜。實(shí)施例4:
取用實(shí)施例1制備的交聯(lián)殼聚糖膜5片，浸泡于lOOmL, 0.2mg/mL的
二氯磷酰膽堿無水氯仿溶液中，三乙胺催化，45i:條件下反應(yīng)8小時，用 蒸餾水沖洗，然后3(TC真空干燥，即可得到改性的交聯(lián)殼聚糖膜。
實(shí)施例5:
取用實(shí)施例2制備的交聯(lián)殼聚糖顆粒0.5g,浸泡于120mL, 12mg/mL
的二氯磷酰膽堿在無水氯仿與二甲苯溶液中，吡啶催化，73"C條件下反應(yīng)2 小時，再用蒸餾水沖洗，然后3(TC真空干燥，即可得到改性的交聯(lián)殼聚糖 顆粒。
權(quán)利要求
1、一種在交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于先將殼聚糖用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，然后在交聯(lián)殼聚糖表面接枝磷酰膽堿基團(tuán)構(gòu)建仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方 法，其特征在于接枝磷酰膽堿基團(tuán)反應(yīng)在無水非質(zhì)子性溶劑中進(jìn)行，反 應(yīng)溫度為40~80°C, 二氯磷酰膽堿濃度為0.1-20 mg/mL。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方 法，其特征在于無水非質(zhì)子性溶劑為四氫呋喃、氯仿、甲苯、二甲苯或 其混合溶劑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方 法，其特征在于接技磷酰膽堿基團(tuán)反應(yīng)在堿性催化劑三乙胺或吡啶類化 合物的協(xié)同作用下進(jìn)行。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方 法，其特征在于交聯(lián)殼聚糖是顆粒狀、膜狀或附著在固體材料表面的涂 層。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方 法，其特征在于戊二醛與殼聚糖在水溶液中進(jìn)行交聯(lián)殼聚糖制備反應(yīng)， 戊二醛與殼聚糖的質(zhì)量比為0.2%-20%。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu) 的方法，其特征在于用醋酸溶解殼聚糖，得到0.1 0.8wt。/。的殼聚糖溶液， 將殼聚糖溶液過濾后靜置脫泡，加入的5%的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，得到淡黃色交聯(lián)殼聚糖溶液，將交聯(lián)殼聚糖制成顆粒狀、膜狀或涂層，用氫氧化鈉溶 液浸泡交聯(lián)殼聚糖，之后用二次蒸餾水充分水洗，直到洗滌水的電導(dǎo)率與 蒸餾水相當(dāng)為止，即得到戊二醛交聯(lián)殼聚糖。
8、根據(jù)權(quán)利要求1至6任意之一所述的交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于接枝磷酰膽堿基團(tuán)反應(yīng)用無水三氯甲烷溶解二氯嫌酰膽堿，將交聯(lián)殼聚糖浸入二氯磷酰膽堿溶液中，加入三乙胺作為催化劑，40 80'C下反應(yīng)3~12h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種交聯(lián)殼聚糖表面構(gòu)建仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的方法。該方法先將殼聚糖用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，然后在交聯(lián)殼聚糖表面接枝磷酰膽堿基團(tuán)構(gòu)建仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，接枝磷酰膽堿基團(tuán)反應(yīng)在無水非質(zhì)子性溶劑中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為40～80℃，二氯磷酰膽堿濃度為0.1～20mg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)修飾后的表面，對蛋白質(zhì)吸附和血小板黏附明顯降低，血液相容性顯著提高。這種仿細(xì)胞外層膜結(jié)構(gòu)的改性材料，在血液凈化，體內(nèi)植入材料，組織工程，藥物緩釋及生物傳感器等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C08F251/00GK101531740SQ20091002087
公開日2009年9月16日 申請日期2009年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日
發(fā)明者銘 宮, 宮永寬, 姍 楊, 皇甫蓬勃 申請人:西北大學(xué)