專利名稱：蛇莓多糖及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從植物中提取的多糖，該多糖的制備方法和用途，屬于生物制 藥領域。
背景技術：
水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-Zoster Virus,簡稱VZV )屬于皰疹病毒科， a皰滲病毒亞科，水痘病毒屬，其基因組序列與同屬于a皰瘆病毒亞科的單純 皰疹病毒1型(Herpes Simplex Virus 1， HSV-1 )及單純皰疹病毒2型(Herpes Simplex Virus 2, HSV-2 )極為相近。水痘-帶狀皰瘆病毒(VZV)為DNA雙鏈病 毒，長度約為125000個堿基對，可以引起水痘和帶狀皰滲兩種疾病。其原發(fā)感 染為水痘，潛伏再度激活則引起帶狀皰疹。水痘大多見于1-10歲的兒童，潛 伏期在2-3周，起病較急，會出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、全身倦怠等前驅癥狀。水痘 病變主要在表皮棘細胞，個別病例病變可累及肺、食管、胃、小腸、肝、腎 上腺、胰等處，引起局部充血、出血、炎細胞侵潤及局灶性壞死。帶狀皰瘆 多發(fā)于成年人和老年人，成因是水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)原發(fā)感染后病毒進 入皮膚的感覺神經(jīng)末梢，持久地潛伏于脊髓神經(jīng)后根或腦神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中。 在多種誘發(fā)因素刺激的作用下，如發(fā)熱、惡性腫瘤、使用免疫抑制劑、外傷、 過勞等，神經(jīng)節(jié)內的病毒可被激活，沿周圍神經(jīng)波及皮膚，誘發(fā)帶狀皰瘆(Herpes Zoster, HZ)，且伴隨后遺神經(jīng)痛(Postherpetic neuralgia, PHN)。
皰疹凈(Idoxuridine， IDU)是第一個進行臨床治療帶狀皰疹(HZ)的有 效抗病毒藥物，為胸腺嘧啶核苷的結構類似物，在細胞內可以置換病毒DNA中 胸腺嘧嚏核苷，形成異常核酸而抑制水痘-帶狀皰麥病毒復制。阿糖胞苷 (Cytarabine)、阿糖腺苷(Vidarabine )也被用于皰疹病毒的治療。以上三種藥物早期曾被用于皰疹病毒的治療，因受到高毒低活性的局限，目前已經(jīng)被阿
昔洛韋(Aciclovir，ACV)替代，阿昔洛韋是治療此種疾病的首選藥物，但是它
生物利用度低，長期使用可引起皮炎，并可造成耐藥性。因此，又陸續(xù)發(fā)展出
了一系列與阿昔洛韋抗病毒機制相近的藥物，其作用機制均是通過病毒DNA編 碼的胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)被磷酸化為含磷酸基的活性分子，進 一步通過宿主細胞內細胞激酶(Cellular kinase)作用而生成二磷酸活性分子 及三磷酸活性分子。三磷酸活性分子通過與病毒DM聚合酶的底物dGTP竟爭， 從而終止病毒DNA的合成，可競爭性抑制病毒DNA聚合酶，阻斷DAN合成、病 毒復制。此類藥物中抗帶狀皰滲病毒的代表藥物有噴昔洛韋(Penciclovir， PCV)、泛昔洛韋(Famciclovir, FCV)、昔多福韋(Cidofovir)。盡管這些藥物 作為抗病毒藥已廣泛應用于臨床,但是受藥物副作用的影響以及病毒抗藥株的 出現(xiàn)，急需研制新型的、毒副作用低且高效的抗病毒藥物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術存在的缺陷，提供一種從植物中提取的、具 有抗水痘帶狀皰瘆病毒活性的多糖，該多糖安全、無毒、對病毒表現(xiàn)出明顯的 抑制作用，可以作為抗水痘帶狀皰疹病毒的候選藥物。
本發(fā)明涉及的植物是蛇莓Duchesnea indica (Andr.) Focke，為薔薇科蛇莓 屬植物，又名地莓、三葉莓、野楊梅等，藥用干燥全草，或鮮用。民間用以治 療帶狀皰疹、白喉、腸炎、痢疾、燙傷等。《本草綱目》記載"此物就地引 細蔓，節(jié)節(jié)生根，每枝三葉，葉有齒刻，四五月開小黃花，五出，結實鮮紅， 狀似復盆，而面與蒂則不同也，其根甚細。"《屬本草》、《本草衍義》、《植 物名實圖考》等傳統(tǒng)醫(yī)藥書籍中均有記載。蛇莓適應力強，在我國遼寧以南地 區(qū)廣泛分布。蛇莓性耐寒，喜生于陰濕環(huán)境，常生于溝邊潮濕草地。對土壤要求不嚴。蛇莓全草多纏繞成團，被白色毛茸，具匍匐莖，葉互生。三出復葉，
基生葉的葉柄長6-10cm,小葉多鮍縮，完整者倒卵形，長l. 5-4cm,寬l-3cm， 基部偏斜，邊緣有鈍齒，表面黃綠色，上面近無毛，下面被疏毛?；▎紊谌~ 腋，具長柄。聚合果棕紅色，痩果小，花萼宿存。氣微，味微澀。顯微鑒定 葉表面觀上表皮細胞類多角形，下表皮細胞略波狀彎曲，垂周壁念珠狀增厚。 下表皮非腺毛及腺毛較上表皮為多，非腺毛單細胞，長166-900 pm，基部直徑 18-38 jum，壁厚6-12um,表面有螺狀紋理；腺毛頭部2細胞，直徑25-32 jum; 柄部2-3細胞。氣孔不定式或不等式，副衛(wèi)細胞4-5個。葉肉細胞有的含草酸 鈣簇晶。蛇莓全草外敷或取汁外涂，治療帶狀皰疹的效果比阿昔洛韋或聚肌胞 注射液更為顯著(蘆啟興《蛇莓治療帶狀皰瘆療效觀察》)。
本發(fā)明所提供的多糖來源于蛇莓，以中藥蛇莓為原料，水洛9-12小時后回 收提取液；將所得提取液在2000-8G00rpm下離心8-12min后去除沉淀，減壓濃 縮，以75%醇濃度醇沉，得到蛇莓多糖，命名為DIP。 一種存在于蛇莓多糖DIP 中的中性多糖，是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖構成， 命名為DIPn其制備方法包括如下步驟
(1) 將所述蛇莓多糖DIP用水配成1%~20%溶液，離心去雜質，按DIP溶液 氯仿正丁醇(V/V) 10~50:5:1進行萃取，振搖，靜置分層，保留水 相層，重復操作2-10次；
(2) 減壓濃縮上層水相溶液，醇沉，去除沉淀后干燥得脫蛋白后的蛇莓多糖 DIP;
(3) 稱取脫蛋白后蛇莓多糖DIP，用水配成0.5~5%溶液，離心去雜質，離 子交換柱層析，恒流上樣，結東后，用水洗脫，洗至苯酚-硫酸法檢測 無陽性反應后，收集洗脫液；(4 )將所述步驟(3 )中的洗脫液減壓濃縮至原來體積的1/2 ~ 1/15,加入2 ~ 6倍體積無水乙醇，室溫靜置2-24h，傾出上清液，離心，沉淀加無水 乙醇洗滌脫水，離心，重復上述過程2次，加熱干燥，得到中性多糖 DIP"
一種存在于蛇莓多糖DIP中的酸性多糖，是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖 醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖構成，命名 為DIP"其制備方法包括如下步驟
(1) 將所述蛇莓多糖DIP用水配成1% ~ 20%溶液，離心去雜質，按DIP溶液 氯仿正丁醇(V/V) 10~50:5:1進行萃取，振搖，靜置分層，保留水 相層，重復搡作2 10次；
(2) 減壓濃縮上層水相溶液，醇沉，去除沉淀后千燥得脫蛋白后的蛇莓多 糖DIP;
(3) 稱取脫蛋白后蛇莓多糖DIP,用水配成0. 5~5%溶液，離心去雜質，離
子交換柱層析，恒流上樣，結東后，用水洗脫，洗至苯酚-硫酸法檢測 無陽性反應后，用0-2.0 mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，按洗脫曲 線收集糖集中部分，將收集的組分減壓濃縮至原來體積的1/2-1/15， 過濾，除中性鹽后得到洗脫液；
H)將所述步驟(3)中的洗脫液減壓濃縮至原來體積的1/2-1/15,加入 2-6倍體積無水乙醇，室溫靜置2 24h，傾出上清液，離心，沉淀加 無水乙醇洗滌脫水，離心，重復上述過程2次，加熱干燥，得到酸性 多糖DIP2。
一種存在于酸性多糖DIP2中的活性單體成分多糖，其結構為含有甘露糖、 鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、磷酸基和氨基的酸性雜多糖，命名為DIP3。，分子量為198萬，其制備方法包括如下步驟
(1) 稱取中藥蛇莓，將其溶于5-25倍體積水中，水洛3 6小時后回收提 取液，過濾后得濾液，另將濾渣溶于5~25倍體積、pH7~13的NaOH 溶液中，繼續(xù)加熱水洛3 6小時，過濾后得濾液；混合上述兩次濾液 得水煮提取液；
(2) 將所述水煮提取液濃縮至原體積的1/2-1/15,冷卻后離心去除沉淀， 上清溶液加入乙醇，使乙醇終濃度為0%~50%,得到活性單體成分多糖 DIP3。粗品；
(3) 將活性單體成分多糖DIP3。粗品配成5~20mg/ml水溶液，加入活化后的 堿性陰離子交換樹脂脫色，樹脂用量控制在溶液體積的5~20倍，加熱 振搖，去除色素后水溶液濃縮，醇沉，過夜，醇沉產(chǎn)物用無水乙醇洗滌 加離心反復3次，加熱烘干，得到除色素后的DIP3。；
(4) 稱取除色素后的DIP3。，用水配成0. 5~5%溶液，離心去雜質，離子交換 柱層析，恒流上樣，結東后，用水洗脫，洗至苯酚-硫酸法檢測無陽性 反應后，用0~2. Omol/LNaCl溶液線性梯度洗脫，按洗脫曲線收集糖 集中部分，將收集的組分減壓濃縮至原體積的1/2 ~ 1/15，過濾，除中 性鹽；
(5) 將經(jīng)過離子交換柱層析的DlP3a進行分子篩柱層析，分部收集，用硫酸
苯酴法檢測，合并糖峰主要部分，冷凍干燥，得到DIP3。精品。
一種存在于酸性多糖DIP2中的活性單體成分多糖，其結構為含有鼠李糖、 葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、磷酸基和氨基的酸性雜多糖，命名為DIP6。， 分子量為3.4萬，其制備方法，包括如下步驟(1) 稱取中藥蛇莓，將其溶于5 25倍體積水中，水浴3 6小時后回收提 取液，過濾后得濾液，另將濾渣溶于5~25倍體積、pH7~13的NaOH 溶液中，繼續(xù)加熱水洛3 6小時，過濾后得濾液；混合上述兩次濾液 得水煮提取液；
(2) 將所述水煮提取液濃縮至原體積的1/2-1/15，冷卻后離心去除沉淀， 上清溶液加入乙醇，使乙醇終濃度為50%~90%，得到活性單體成分多 糖DIP6。粗品；
(3) 將活性單體成分多糖DIPm粗品配成5 ~ 20mg/ml水溶液，加入活化后的 堿性陰離子交換樹脂脫色，樹脂用量控制在溶液體積的5~20倍，去除 色素后水溶液濃縮，醇沉，過夜，醇沉產(chǎn)物用無水乙醇洗滌加離心反復 3次，加熱烘干，得到除色素后的DIPm;
(4) 稱取除色素后的DIP6。，用水配成O. 5~5%溶液，離心去雜質，離子交換 柱層析，恒流上樣，結東后，用水洗脫，洗至苯酚-硫酸法檢測無陽性 反應后，用0~2. Omol/LNaCl溶液線性梯度洗脫，按洗脫曲線收集糖 集中部分，將收集的組分減壓濃縮至原體積的1/2-1/15,過濾，除中
性鹽；
(5) 將經(jīng)過離子交換柱層析的DIPw進行分子篩柱層析，分部收集，用硫酸 苯酚法檢測，合并糖峰主要部分，冷凍干燥，得到DIPm精品。
同時，對上述的多糖DIPm和多糖DIP6。的純度和分子量采用高效液相色譜(HPLC) 檢測。選取Agilent高效液相層析系統(tǒng)，色譜柱為Shodex公司KS-805柱，示 差折光檢測器檢測，分析軟件為Agilent Data Analysis,流動相為樂百氏純凈 水，柱溫10 50。C，流速0. 1~ 3. Oml/min,最大柱壓20 ~ 10Qbar。稱取適量標 準糖TIO、 T40、 T70、 T500、 T2000,配成0. 01 ~ 20mg/ml的樣品，每個樣品進
li樣20 200ul，根據(jù)標準糖分子量的對數(shù)為縱坐標，出峰時間為橫坐標做標準曲 線。稱取適量DIP3。、DIP6。，配成0. 01~20mg/ml的樣品，每個樣品進樣20 ~ 200ul ，
根據(jù)出峰情況判斷待測樣品的純度，同時將出峰時間帶入標準曲線，計算分子 量。對上述制得的多糖DIPi，多糖DIP2，多糖DIPn和多糖DIP6。結構的鑒定是應 用1-苯基-3-甲基吡唑啉啁(PMP)柱前衍生化高效液相色譜法、核磁共振氫譜 。H畫R)、核磁共振碳譜(13C NMR)、紅外光譜(IR)、紫外(UV)及甲基化分
析得出。
本發(fā)明的另一個目的是提供以上蛇莓多糖在制備抗水痘-帶狀皰疹病毒的
藥物中的用途。通過建立水痘-帶狀皰疹病毒(vzv)感染人胚肺成纖維細胞
(HELF)的模型，由多糖抑制水痘帶狀皰瘆病毒(VZV)感染的實驗結果表明， 本發(fā)明對水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)活性有明顯抑制作用。與傳統(tǒng)的抗病毒藥物 阿昔洛韋(ACV)相比，DIP,DIP!,DIP2,DIP3。和DIP6。半效濃度ECs。更低，抗帶狀 皰滲病毒(VZV)活性更強。
本發(fā)明的來源是薔薇科的蛇莓屬植物蛇莓，該植物易繁殖，適應生長地域 廣泛，栽培技術簡單，因此，植物來源豐富。本發(fā)明利用生物技術從蛇莓全草 中提取分離出具有明顯抗帶狀皰疹病毒活性的總多糖DIP、總多糖DIP其中的中 性多糖DIP!和酸性多糖DIP2、以及酸性多糖DIP2中兩種主要活性單體成分多糖 DIP3。和多糖DIPm,方法便于操作，安全、無毒、對病毒表現(xiàn)出明顯的抑制作用， 可以作為活性成分添加進抗水痘帶狀皰瘆病毒藥物中，是優(yōu)質的抗病毒候選藥 物。


圖1為多糖DIP3。的HPLC譜圖。 圖2為多糖DIPe。的HPLC譜圖。
12圖3為多糖DIP3。的紫外(UV)譜圖。
圖4為多糖DIP6。的紫外0JV)譜圖。 圖5為多糖DIP3。的紅外(IR)譜圖 圖6為多糖DIP3。的紅外(IR)譜圖。 圖7為多糖DIP3。的'H蘭R譜圖。 圖8為多糖DIP3。的'H麗R譜圖。 圖9為多糖DIP3。的"CNMR譜圖。 圖IO為多糖Dm。的13CNMR譜圖。
圖11為多糖DIP,的PMP柱前衍生化高效液相色譜法譜圖。 圖12為多糖DIP2的PMP柱前衍生化高效液相色譜法譜圖。 圖13為多糖DIP3。的PMP柱前衍生化高效液相色譜法譜圖。 圖14為多糖DIP3。的PMP柱前衍生化髙效液相色譜法譜圖。 圖15為多糖DIP, DIP!, DIP2, DIP3。， DIP。。與ACV比較的ECs。和TI。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步說明。
制備并鑒定蛇莓多糖DIP:
將干燥并粉碎的蛇莓全草用水溶脹過夜后，10(TC水浴10小時，每lh攪拌一 次，回收提取液，6000rpm離心10min去除沉淀，減壓濃縮，75%醇濃度醇沉，得 DIP。細胞病變抑制實驗(詳細方法請參照實施例八)證明DIP即為抗病毒活性 物質。釆用a-萘酚-硫酸顯色反應，鑒定所得溶液呈橙色，為多糖特征反應， 證明所得的主要成分為多糖。
實施例二制備蛇莓多糖中的中性多糖DIP,:
將蛇莓多糖DIP用水配成1%溶液，離心去雜質，按DIP溶液氯仿正丁 醇(V/V) 25:5:1進行萃取，振搖10min，靜置分層，保留水相層，重復操作5 次。減壓濃縮上層水相溶液，醇沉。用DEAE-52離子交換柱以IO倍水浸泡溶漲 過夜，換水漂洗1 2次，然后依次用0, 5mol/L HC1、 0. 5mol/L NaOH、 0. 5mol/L HC1活化，真空脫氣，裝柱平衡。稱取脫蛋白后的DIP,用水配成O. 5%溶液，離 心去雜質，用恒流泵上樣，上樣流速為lml/min。上樣結東后，用水洗脫，洗至 苯酚-硫酸法檢測無陽性反應后，收集水洗脫液，減壓濃縮至原來體積的1/10, 加入3倍體積無水乙醇，室溫靜置8h。傾出上清液，液固部分以8000rpm離心 lOmin,沉淀加無水乙醇洗滌脫水，800Grpm離心10min，重復上述過程2次， 6(TC真空干燥8h,得到中性多糖DIP,。
實施例三
制備蛇莓多糖中的酸性多糖DIP2:
將蛇莓多糖DIP用水配成1%溶液，離心去雜質，按DIP溶液氯仿正丁 醇(V/V) 25:5:1進行萃取，振搖10min,靜置分層，保留水相層，重復操作5 次。減壓濃縮上層水相溶液，醇沉。用DEAE-52離子交換柱以IO倍水浸泡溶漲 過夜，換水漂洗1 2次，然后依次用0.5fflol/LHCl、 0. 5raol/LNa0H、 0. 5mol/L HC1活化，真空脫氣，裝柱平衡。稱取脫蛋白后的DIP適量，用水配成0.5%溶 液，離心去雜質，用恒流泵上樣，上樣流速為lml/min。上樣結東后，用水洗脫， 洗至苯酴-硫酸法檢測無陽性反應后，用0-2. Omol/LNaCl溶液線性梯度洗脫， 自動部分收集器分管收集，3ml/管，控制滴速0.5ml/min。按洗脫曲線收集糖集 中部分，將收集的組分減壓濃縮至原來體積的1/10,過濾，透析。透析過的溶 液減壓濃縮至原來體積的1/10，加入3倍體積無水乙醇，室溫靜置8h。傾出上清液，液固部分8000rpm離心10min,沉淀加無水乙醇洗滌脫水，8000rpm離 心10min,重復上述過程2次，6(TC真空干燥8h,得到酸性多糖DIP2。
實施例四
制備多糖DIP2中的酸性雜多糖DIP3。
稱取蛇莓全草lOOg溶于1500ml水中，85°C水浴中攪拌加熱3h，紗布過濾， 得濾液。另精確調pH9的NaOH溶液1500ml繼續(xù)85'C水洛中浸泡攪拌加熱3h, 過濾溶渣最后共得水煮提取液。將水煮提取液濃縮至1/1G,冷卻后有不溶物用 4000rpm離心10min，上清溶液加入乙醇，使乙醇終濃度為30%，得DIPm粗品。 DIP3。粗品配成5mg/ml水溶液，分別加入活化后的弱堿性陰離子交換樹脂 (D311,D301R, 96C， 330,D318,900，717)，每100ml溶液中加入8g樹脂，搖床 220r/m震搖8h，溫度為3(TC。去除色素后水溶液濃縮，醇沉，過夜。然后將脫 色后的醇沉產(chǎn)物用無水乙醇洗滌，8000rpm離心10min,洗滌加離心反復3次， 烘箱烘干，得除色素后DIP3。粗品。用DEAE-52離子交換柱以IO倍水浸泡溶漲過 夜，換水漂洗1 ~ 2次，然后依次用0. 5raol/L HC1、 0. 5mol/L NaOH、 0. 5mol/L HC1 活化處理，真空脫氣，裝柱平衡。稱取DIP3。粗品適量，用水配成2.5%溶液，離 心去雜質，用恒流泵上樣，上樣流速為lmi/min。上樣結束后，用水洗脫，洗至 苯酚-硫酸法檢測無陽性反應后，用0~2. 0 mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，自 動部分收集器分部收集，3ml/管，控制滴速0.5ml/min。按洗脫曲線收集糖集中 部分，將收集的組分減壓濃縮至原來體積的1/10,過濾。濃縮液上SEPHADEXG25 填料，水洗脫，流速為0. 5ml/min，3ral/管，用苯酚硫酸法測定糖峰的起始，用 AgNO"容液測定NaCl的出峰管數(shù)，收集糖峰部分。將分子篩填料(Sephacryl-300, S印hacry1-400， SEPHADEX G-200, SEPHADEX G-300 )溶漲過夜，與pH13的NaOH 溶液(V: V )1: 1混合，撹勻放置lh,用蒸餾水洗至中性，裝柱備用。將經(jīng)過DEAE-52離子交換柱分離的DIP3。進行分子篩柱層析，分部收集，硫酸苯酚法檢測，合并 糖峰主要部分，冷凍干燥，得到酸性雜多糖DIP3。精品。
實施例五
制備多糖DIP2中的酸性雜多糖DIP6。
稱取蛇莓全草100g溶于1500ml水中，85°C水浴中攪拌加熱3h，紗布過 濾，得濾液。另精確調PH9的NaOH溶液1500ml繼續(xù)85。C水浴中浸泡攪拌加熱 3h,過濾溶渣最后共得水煮提取液。將水煮提取液濃縮至1/10，冷卻后有不溶 物，4000rpm離心10min,上清溶液依次加入乙醇，使乙醇終濃度為60%,得DIP6。 粗品。DIP6。粗品配成5mg/ml水溶液，分別加入活化后的弱堿性陰離子交換樹脂 (D311,D301R, 96C， 330，D318，900，717)，每100ml溶液中加入8g樹脂，搖床 220r/m震搖8h，溫度為3(TC。去除色素后水溶液濃縮，醇沉，過夜。然后將脫 色后的醇沉產(chǎn)物用無水乙醇洗滌，8000rpm離心10min，洗滌加離心反復3次， 烘箱烘干，得除色素后DIP60。 DEAE-52離子交換柱以數(shù)十倍水浸泡溶漲過夜， 中途換水漂洗1 ~ 2次，然后依次用0. 5mol/L HC1、 0. 5mol/L NaOH、 0. 5mol/L HC1 活化處理，真空脫氣，裝柱平衡。稱取DIP6。粗品適量，用水配成2.5%溶液，離 心去雜質，用恒流泵上樣，上樣流速為lml/min。上樣結束后，用水洗脫，洗至 苯酴-硫酸法檢測無陽性反應后，用0-2.0 mol/LNaCl溶液線性梯度洗脫，自 動部分收集器分部收集，3ml/管，控制滴速O. 5ml/min。按洗脫曲線收集糖集中 部分，將收集的組分減壓濃縮至原來體積的1/10，過濾。濃縮液上SEPHADEXG25 填料，水洗脫，流速為0.5ml/min，3ml/管，用苯酚硫酸法測定糖峰的起始，用 AgN03溶液測定NaCl的出峰管數(shù)，收集糖峰部分。將分子篩填料(Sephacry1-300， S印hacryl-400， SEPHADEX G-200, SEPHADEX G-300 )溶漲過夜，與pH13的NaOH 溶液(V:V) 1:1混合，攪句放置lh,用蒸餾水洗至中性，裝柱備用。將經(jīng)過離
16子交換柱(DEAE-52)分離的DIP6。進行分子篩柱層析，分部收集，硫酸苯酚法檢 測，合并糖峰主要部分，冷凍干燥，得到酸性雜多糖DIP6。精品。
實施例六
檢測多糖DIP3。和多糖DIPw的純度和分子量
對上述的多糖DIP3 和多糖DIP6。的純度和分子量采用高效液相色譜(HPLC ) 檢測。稱取DIP;。、DIP6。，配成10nig/ml的樣品，每個樣品進樣25ul，選取Agilent 髙效液相層析系統(tǒng)，色譜柱為Shodex公司KS-805柱，示差折光檢測器檢測， 分析軟件為Agilent Data Analysis,流動相為樂百氏純凈水，柱溫30'C，流速 LOml/min，最大柱壓50bar。根據(jù)出峰情況判斷待測樣品的純度，同時將出峰 時間帶入標準曲線，計算分子量。計算后得DIP3。的分子量為198萬，見圖l; DIPw的分子量為3. 4萬，見圖2。 實施例七
檢測所得多糖的結構
取多糖DIP3。，多糖DIP6 ，各3ml,配制成0. 1%溶液，紫外下全波長掃描(見 圖3，圖4)。取多糖DIPm，多糖DIP,各3mg,加溴化鉀壓片，Nicolet Impact 410紅外光譜儀下掃描，見圖5和圖6。吸取100ul的濃度為4~5mg/ml的多糖 DIPi、多糖DIP,、多糖DIP3。和多糖DIPw樣品溶液于具塞刻度試管中，通過1-苯基-3-甲基吡唑啉啁(PMP)柱前衍生，采用反相高效液相色譜/紫外檢測器分 離檢測。取多糖DIP3。，多糖DIP6。，各50mg，溶于氘代水(020)， 3(TC于Varian300 兆核磁共振儀上分析。DIP3。的核磁共振氫譜('HNMR)、核磁共振碳譜(13CNMR) 見圖7和圖8; DIPw的核磁共振氫譜('HNMR)、核磁共振碳譜(13C NMR )見圖9 和圖IO。檢測結果多糖DIP,為含甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿 拉伯糖的中性多糖，見圖ll。多糖DIP2為含甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半說明書第13/13頁
乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖的酸性多糖，見圖12。 DIP3。的結構為含甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和磷酸基、氨 基的酸性雜多糖，見圖13。 DIP6。的結構為含鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、 半乳糖和磷酸基、氨基的酸性雜多糖，見圖14。 實施例八
待96孔板中的人胚肺成纖維細胞(Human Embryo Lung Fibroblast, HELP) 長成單層后，每孔加入100TCID5。的水痘-帶狀皰瘆病毒(Varicella-Zoster Virus，VZV)液，感染l小時后，棄去病毒液。每塊細胞板每孔分別加入蛇莓多 糖DIP，中性多糖DIPi，酸性多糖DIP2，酸性多糖DIP3。，酸性多糖DIP6。溶液，以 藥物最大無毒濃度為最高濃度，用無血清MEM培養(yǎng)基對樣品溶液做連續(xù)的2倍 稀釋，每個稀釋度3孔；同時設置陽性(ACV)、陰性對照。將96孔板于37'C二 氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日記錄細胞病變(Cytopathic effect, CPE)程 度，按Reed-Muench公式計算各樣品的藥物安全指標EC5。及治療指數(shù)TI(T士S， n=3)。結果見表l。由此得出蛇莓多糖DIP、 DIP,、 DIP2、 DIPs。和DIPm抗水痘 -帶狀皰疹病毒(VZV)的藥效優(yōu)于傳統(tǒng)抗病毒藥物阿昔洛韋(Aciclovir,ACV)， 同時DIP2、 DIP3。和DIP6。的治療指數(shù)(TI)高于阿昔洛韋(ACV)。
ACVDIPDIP,DIP2DIP30DIP60
￡C5。 (ug/ml) TI13,76±0.76 25.665.69±0.50 23.385.35±0.31 21.774.78±0.39 52.112.71±0.32 183.463.66±0.62 118.76
表l.多糖DIP、 DIP、DIP2、 DIP3。、 DIP6。和ACV的ECs。和TI對照
除上述實施例外，本發(fā)明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效 變換形成的技術方案，均落在本發(fā)明要求的保護范圍。
權利要求
1. 蛇莓多糖，是由以下方法制備得到以中藥蛇莓為原料，水浴9～12小時后回收提取液；將所得提取液在2000～8000rpm下離心8～12min后去除沉淀，減壓濃縮，以75％醇濃度醇沉，得到蛇莓多糖，命名為DIP。
2. 根據(jù)權利要求1所述的蛇莓多糖中的中性多糖，是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖構成，命名為DIP"
3. 根據(jù)權利要求2所述的中性多糖的制備方法，包括如下步驟(1) 將所述蛇莓多糖DIP用水配成1%~20%溶液，離心去雜質，按DIP溶液氯仿正丁醇(V/V) 10-50:5:1進行萃取，振搖，靜置分層，保留水相層，重復搡作2 10次；(2) 減壓濃縮上層水相溶液，醇沉，去除沉淀后干燥得脫蛋白后的蛇莓多糖DIP;(3) 稱取脫蛋白后蛇莓多糖DIP,用水配成0. 5~5%溶液，離心去雜質，離子交換柱層析，恒流上樣，結束后，用水洗脫，洗至苯酚-硫酸法檢測無陽性反應后，收集洗脫液；(4 )將所述步驟(3 )中的洗脫液減壓濃縮至原來體積的1/2 ~ 1/15，加入2 ~6倍體積無水乙醇，室溫靜置2-24h,傾出上清液，離心，沉淀加無水乙醇洗滌脫水，離心，重復上述過程2次，加熱干燥，得到中性多糖DIP丄。
4. 根據(jù)權利要求1所述的蛇莓多糖中的酸性多糖，是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖構成，命名為DIP2。
5. 根據(jù)權利要求4所述的酸性多糖的制備方法，包括如下步驟(1 )將所述蛇莓多糖DIP用水配成1% ~ 20%溶液，離心去雜質，按DIP溶液 氯仿正丁醇(V/V) 10-50:5:1進行萃取，振搖，靜置分層，保留水 相層，重復操作2-10次；(2) 減壓濃縮上層水相溶液，醇沉，去除沉淀后干燥得脫蛋白后的蛇莓多 糖DIP;(3) 稱取脫蛋白后蛇莓多糖DIP,用水配成0. 5~5%溶液，離心去雜質，離 子交換柱層析，恒流上樣，結東后，用水洗脫，洗至苯酚_硫酸法檢測 無陽性反應后，用0-2.0 mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，按洗脫曲 線收集糖集中部分，將收集的組分減壓濃縮至原來體積的1/2-1/15, 過濾，除中性鹽后得到洗脫液；(4) 將所述步驟(3)中的洗脫液減壓濃縮至原來體積的1/2 ~ 1/15,加入 2 6倍體積無水乙醇，室溫靜置2 2化，傾出上清液，離心，沉淀加 無水乙醇洗滌脫水，離心，重復上述過程2次，加熱干燥，得到酸性 多糖DIP2。
6. 根據(jù)權利要求4所述的酸性多糖DIP2中的活性單體成分多糖，其結構為含有 甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、磷酸基和氨基的酸性雜多 糖，命名為DIP3。，分子量為198萬。
7. 根據(jù)權利要求6所述的活性單體成分多糖的制備方法，包括如下步驟(1) 稱取中藥蛇莓，將其溶于5 25倍體積水中，水洛3-6小時后回收提 取液，過濾后得濾液，另將濾渣溶于5~25倍體積、pH7 13的NaOH 溶液中，繼續(xù)加熱水洛3-6小時，過濾后得濾液；混合上述兩次濾液 得水煮提取液；(2) 將所述水煮提取液濃縮至原體積的1/2 ~ 1/15，冷卻后離心去除沉淀，上清溶液加入乙醇，使乙醇終濃度為0%~50%，得到活性單體成分多糖DIP3。粗品；(3 )將活性單體成分多糖DIP^粗品配成5 ~ 20mg/ml水溶液，加入活化后的 堿性陰離子交換樹脂脫色，樹脂用量控制在溶液體積的5~20倍，，去 除色素后水溶液濃縮，醇沉，過夜，醇沉產(chǎn)物用無水乙醇洗滌加離心反 復3次，加熱烘干，得到除色素后的DIP3。；(4) 稱取除色素后的DIP3。，用水配成0. 5~5%溶液，離心去雜質，離子交換 柱層析，恒流上樣，結東后，用水洗脫，洗至苯酚-硫酸法檢測無陽性 反應后，用0~2. Omol/LNaCl溶液線性梯度洗脫，按洗脫曲線收集糖 集中部分，將收集的組分減壓濃縮至原體積的1/2-1/15,過濾，除中 性鹽；(5) 將經(jīng)過離子交換柱層析的DIP3。進行分子篩柱層析，分部收集，用硫酸 苯酚法檢測，合并糖峰主要部分，冷凍干燥，得到DIP3。精品。
8. 根據(jù)權利要求4所述的酸性多糖DIP2的活性單體成分多糖，其結構為含有鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、磷酸基和氨基的酸性雜多糖，命 名為DIPw,分子量為3.4萬。
9. 根據(jù)權利要求8所述的活性單體成分多糖的制備方法，包括如下步驟(1) 稱取中藥蛇莓，將其溶于5 25倍體積水中，水浴3~6小時后回收提 取液，過濾后得濾液，另將濾渣溶于5~25倍體積、pH7~13的NaOH 溶液中，繼續(xù)加熱水浴3 6小時，過濾后得濾液；混合上述兩次濾液 得水煮提取液；(2) 將所述水煮提取液濃縮至原體積的1/2 ~ 1/15，冷卻后離心去除沉淀， 上清溶液加入乙醇，使乙醇終濃度為50%~90%,得到活性單體成分多糖DIPm粗品；(3) 將活性單體成分多糖DIP6。粗品配成5~20mg/ml水溶液，加入活化后的 堿性陰離子交換樹脂脫色，樹脂用量控制在溶液體積的5~20倍，去除 色素后水溶液濃縮，醇沉，過夜，醇沉產(chǎn)物用無水乙醇洗滌加離心反復 3次，加熱烘干，得到除色素后的DIPs。；(4) 稱取除色素后的DIP6。，用水配成0. 5~5%溶液，離心去雜質，離子交換 柱層析，恒流上樣，結束后，用水洗脫，洗至苯酚-硫酸法檢測無陽性 反應后，用0~2. Omol/LNaCl溶液線性梯度洗脫，按洗脫曲線收集糖 集中部分，將收集的組分減壓濃縮至原體積的1/2-1/15，過濾，除中 性鹽；(5) 將經(jīng)過離子交換柱層析的DIP6。進行分子篩柱層析，分部收集，用硫酸 苯酴法檢測，合并糖峰主要部分，冷凍干燥，得到DIPm精品。
10.蛇莓多糖在制備抗水痘-帶狀皰滲病毒的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及從植物中提取的多糖、該多糖的制備方法和用途，屬于生物制藥領域。本發(fā)明中多糖的制備是從蛇莓全草中提取分離出具有明顯抗水痘-帶狀皰疹病毒活性的總多糖DIP、總多糖DIP其中的中性多糖DIP₁和酸性多糖DIP₂、以及酸性多糖DIP₂中兩種主要活性單體成分多糖DIP₃₀和多糖DIP₆₀。原料蛇莓全草來源廣泛，易再生；制備方法便于操作，重復性高。該多糖對水痘-帶狀皰疹病毒表現(xiàn)出明顯的抑制作用，并且安全、無毒、穩(wěn)定，是優(yōu)質的抗病毒候選藥物。
文檔編號C08B37/00GK101486771SQ20091002485
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權日2009年2月27日
發(fā)明者安 周, 婧 王, 陳建華 申請人:中國藥科大學