專利名稱：海濱錦葵多糖制備工藝及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從海濱錦葵中分離制備錦葵多糖的工藝 及用途。
二.
背景技術(shù)：
海濱錦葵(kostelezkya virginica)是錦葵科錦葵屬多年生宿根鹽生植物，天然分 布于美國東部沿海鹽沼海岸帶。1992年由南京大學(xué)引種至中國。有文獻(xiàn)報道，海濱錦 葵的花、葉、根部可食用。尤其是根部可生食、可烹炸、可作茶飲，焙干碾碎可用作 糖果和口香糖原料，以增加膠粘度。根部浸出液可濃縮至蛋清狀替代蛋清使用。多糖
在生物界分布很廣，從其他動植物中分離制備多糖的研究方法有不少論文和專利。但 從海濱錦葵中提取錦葵多糖以及對錦葵多糖的研究論文很少見到，專利至今未有。
根據(jù)我們的研究我們認(rèn)為錦葵多糖是一種雜多糖，屬多糖類。在錦葵根部含量豐 富。從生物學(xué)實驗證明，錦葵多糖具有增強免疫力的生物學(xué)功能?？勺鳛槿梭w非特異 性免疫增強劑，促進(jìn)體液免疫及細(xì)胞免疫，加強抗體或補體生成。該多糖可制成片劑、 口服液、膠囊等作為保健食品給免疫低下者使用，促進(jìn)他們的健康。也可進(jìn)一歩制成 藥品，供免疫低下或腫瘤病人輔助治療使用。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是從海濱錦葵的根中提取出錦葵多糖，并利用錦葵多糖的 生物學(xué)功能將其制成片劑、膠囊、口服液等保健食品，供免疫力低下者使用。還可制 成藥品供病患者使用。
本發(fā)明技術(shù)方案
l.海濱錦葵多糖提取工藝採集海濱錦葵新鮮根，洗凈、曬干或烘干，粉碎。取 干粉，按比例l: 15加入蒸餾水，用超聲儀加溫超聲提取。超聲條件功率200瓦， 溫度6(TC，時間1小時。超聲后用紗布過濾。同樣條件再重復(fù)一次；兩次濾液合并。
將濾液蒸發(fā)部分后，用乙醇沉淀，將沉淀干燥得粗多糖。將錦葵粗多糖加入適量水溶
解后，加入等體積20%三氯乙酸，沉淀夫除蛋白，離心得上清液，減壓蒸餾后的濃縮
液對水透析，透析后的溶液加乙醇沉淀，干燥，得去蛋白錦葵多糖(錦葵多糖簡稱
JKDT，以下同)溶液,簡稱為JKDT-1。
從上步驟得到的JKDT-1用DEAE-纖維素柱層析，梯度洗脫，分別檢測，得到洗 脫液，合并有效組分，濃縮，乙醇沉淀，干燥，得組分JKDT-2A 、 JKDT-2B。得到
3的JKDT-2A組分再用sephcryl -200柱層析，純化分離，得到三個組分，分別是 JKDT-3A、 JKDT-3B、 JKDT-3C。根據(jù)實驗結(jié)果，JKDT-2B用sephacryl-200層析后仍 為一個峰，不需要再層析。因此錦葵多糖最后組分為四個，分別是:JKDT-2B、JKDT-3A、 JKDT-3B、 JKDT-3C。
2.錦葵多糖的生物學(xué)功能實驗 錦葵多糖免疫活性試驗
表l多糖對T細(xì)胞增殖的影響(培養(yǎng)24h)
齊懂(U g/ml)A值A(chǔ)值(加conA)
(X±S)(X±S)
對照0. 3715±0. 04330. 4408±0. 0280
3001. 7162±0. 1636*1. 7839±0. 1055*
2001. 7277±0. 2898*1. 7164土0. 1755*
1001. 5621±0. 5384*1. 6524±0. 1770*
501. 5879±0. 5450*1. 7720±0. 2324*
401. 3701±0. 5670*1. 1304±0. 7834*
P*<0. 05
表2多糖對B細(xì)胞增殖的影響(培養(yǎng)24h)劑量(U g/ml)A值A(chǔ)值(加conA)
(x±S)(X±S)
對照0. 4840±0. 06280. 4467±0. 0537
3001. 7556±0. 0701*1. 6803±0. 0563*
2001.6967±0. 0577*1. 5382±0. 5727*
1001. 5463±0. 1927*1.4199±0. 4631*
501. 1781±0. 5431*1.4526±0. 4327*
401. 1938±0. 5144*1. 0293±0. 5641*
P*〈0.05
3.錦葵多糖的測定-酚-硫酸法。
本方法是用苯酚-硫酸試劑與錦葵多糖的己糖醛酸起反應(yīng)，在490nm處產(chǎn)生特征 性光吸收，以光吸收值大小參比標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定錦葵多糖的含量。苯酚試劑取苯酚 200克，加鋁片0.2克和NaHC03 0.1克，蒸餾，收集180-182。C餾分稱取15克，加 蒸餾水溶解，定容于250ml容量瓶。取干燥的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確配制濃度為 250^g/ml。分別取O.O， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6， 0.7， 0.8ml,放入試管， 再分別補加蒸餾水至l.Oml，加入苯酚試劑l.Oml,再加入濃硫酸5.0ml,冷卻后于 490nm處測定光吸收值，以濃度對光吸收值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。錦葵多糖同法配制 25-200)^g/ml范圍內(nèi)濃度，取1. (M后再加入1. Oml苯酚試劑，5. Oml濃硫酸，冷卻后測490nm處光吸收值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算錦葵多糖的含量。
本發(fā)明有益效果是使用了超聲方法，并且采用中溫度技術(shù)(60°C)，從海濱錦葵 中第一次提取了錦葵多糖，并利用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行了純化。從我們對模型動物的實驗發(fā) 現(xiàn)，錦葵多糖具有增強實驗動物免疫力的功能。可制備成提高免疫功能的保健食品。 通過進(jìn)一步的實驗和研究，錦葵多糖也可制備成治療腫瘤的藥物。 四.
具體實施例方式
取新鮮採集的海濱錦葵根，洗凈、干燥、粉碎，取樣200克干粉，以1;15的比 例加入蒸餾水，用超聲儀超聲抽提，抽提條件溫度6(TC，超聲功率200W,時間l小 時，超聲后用紗布過濾，濾渣再用上述條件處理一次。合并兩次濾液，得4500ml，減 壓蒸發(fā)得860ml,加乙醇至最終濃度為70%，攪拌，得粘性沉淀，去上清，綢布過濾， 沉淀5(TC烘干，得錦葵多糖粗品10. 2克。
取錦葵多糖粗品5. 0克，加蒸餾水250ml,溶解后加入20%三氯乙酸250ml，冷藏 于8"冰箱冷藏，次閂取上清，沉淀部分離心5000 r/分，10分鐘，合并得上清490ml， 減壓濃縮至50ml,裝透析袋對水透析。除去三氯乙酸，得無蛋白錦葵多糖溶液194ml。
將按常規(guī)方法處理好的DEAE-纖微素，裝柱后水洗至中性，取上述無蛋白錦葵多 糖溶液94ml,加水一倍，上樣；上樣結(jié)束后，先用水洗滌兩個床體積，再用0-1.0MNaCL 洗脫錦葵多糖，經(jīng)檢測洗脫峰有兩個，I峰收集120ml, II峰收集448ml，再分別^k縮 至I峰60ml， II峰162ml;兩峰濃縮液分別加入4倍體積95%乙醇沉淀多糖，放置4-6 小時后，用砂芯漏斗抽濾，分次用無水乙醇脫水，5(TC烘干。I峰得干品JKDT-2A 53.6mg, II峰得JKDT-2B 362mg。
將JKDT-2A 53.6mg樣品加水10ml溶解，上樣于按常規(guī)處理并裝好的 s印hacryl-200柱，經(jīng)洗脫得到三個組分，經(jīng)檢測計算其含量分別是JKDT-3A 1.16mg, JKDT-3B 3.95mg.JKDT-3C 8. 3mg。
錦葵多糖含量純度檢查酚-硫酸法。本方法是用苯酚-硫酸試劑與錦葵多糖的己 糖醛酸起反應(yīng)，在490nm處產(chǎn)生特征性光吸收，以光吸收值大小參比標(biāo)準(zhǔn)曲線來確 定錦葵多糖的含量。苯酚試劑取苯酚200克，加鋁片0.2克和NaHC03 0.1克，蒸 餾，收集180-182'C餾分。稱15克，加蒸餾水溶解，定容于250ml容量瓶。放入棕色 瓶，冰箱保存?zhèn)溆?。取干燥的葡萄糖?biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確配制濃度為25(^g/ml。分別取O.O， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6， 0,7， C ftr〗,放入試管，再分別補加蒸餾水至1. Oml， 加入苯酚試劑1. Oml,再加入濃硫酸5. Oml，冷卻后于490nm處測定光吸收值，以'濃度 對光吸收值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。錦葵多糖同法配制25-20(^g/ml范圍內(nèi)濃度， 1.0ml后再 加入1. Oml苯酚試劑，5. Oml濃硫酸，冷卻后測490nm處光吸收值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計 算錦葵多糖的含量。
權(quán)利要求
1.一種從海濱錦葵中分離制備錦葵多糖的工藝，其特征是探集海濱錦葵鮮根，洗凈，烘干，粉碎，干粉中加入1∶15的蒸餾水，用超聲儀超聲提取，超聲條件溫度60℃，功率200W，時間1小時，超聲結(jié)束后，用兩層紗布過濾，濾液存放，濾渣再用上述條件重復(fù)一次，兩次濾液合并，減壓蒸發(fā)，得濃縮液，加入乙醇使最終濃度為70％，攪拌后低溫靜置10-12小時，虹吸去上清，將沉淀抽濾，烘干，得錦葵多糖粗品。
2. 根據(jù)權(quán)利1所述從海濱錦葵中分離制備錦葵多糖的工藝，其特征是錦葵粗多 糖產(chǎn)品，加適量蒸餾水溶解，加入等體積20%三氯乙酸，靜置12小時以上，離心去、沉 淀，上清液為去蛋白多糖溶液，減壓濃縮，再對蒸餾水透析去除三氯乙酸，得除蛋白 錦葵多糖溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利2所述制備從海濱錦葵中分離制備錦葵多糖的工藝，其特征是用 DEAE-纖維素柱層析進(jìn)行分離，上樣液以合適濃度上樣，洗脫液為0-lmol/LNaCL梯 度，分部收集，用苯酚-硫酸法檢測糖濃度，得到糖濃度-洗脫體積曲線，根據(jù)洗脫曲 線辨別分離峰，分別合并有效洗脫部分，減壓濃縮后用95%乙醇調(diào)乙醇最終濃度為 80%，靜置過夜，用砂芯漏斗抽濾多糖，再分別用95%乙醇、無水乙醇脫水，烘干， 得錦葵多糖，錦葵多糖簡稱JKDT，兩個組分分別是JKDT-2A、 JKDT-2B。
4. 根據(jù)權(quán)利3所述方法得到的JKDT-2A，其特征是進(jìn)行sephacryl-200柱層析， 柱層析后得JKDT-3A、 JKDT-3B、 JKDT-3C，根據(jù)以上方法，從海濱錦葵根中分離得 到四個純組分分別是JKDT-2B、 JKDT-3A、 JKDT3B、 JKDT-3C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法制備的海濱錦葵多糖純品在制備具有調(diào)節(jié)免疫功能 的保健食品中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法制備的海濱錦葵多糖純品在制備治療腫瘤藥物中的 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生化分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及海濱錦葵多糖的制備工藝及用途，本發(fā)明從海濱錦葵中分離、純化錦葵多糖工藝，從新鮮海濱錦葵根、得干粉，超聲，乙醇沉淀，三氯乙酸去蛋白，DEAE-柱層析，sephacryl-200再層析。共得到四個組分JKDT-2B、JKDT-3A、JKDT-3B、JKDT-3C。該產(chǎn)品可制成片劑、口服液、膠囊作為保健品給免疫低下者使用。還可進(jìn)一步制成治療腫瘤的藥品。
文檔編號C08B37/00GK101638444SQ200910032020
公開日2010年2月3日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者張?zhí)? 張鶴云, 佩 欽 申請人:南京大學(xué)