專利名稱：γ-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，并提供該Y -聚谷氨酸-天冬氨 酸復(fù)合物的制備方法及用途，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Y-聚谷氨酸是一種由枯草桿菌自身合成并分泌到細胞外的線型高分子量 聚合物，由谷氨酸的a-氨基和Y-羧基縮合而成。自1937年Ivanovics等人首 次發(fā)現(xiàn)以來，Y-聚谷氨酸因其組成單一，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，良好的生物相容性和生物 可降解性，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、環(huán)保和醫(yī)藥等各個領(lǐng)域，農(nóng)田灌溉的保水劑，環(huán) 保工業(yè)的絮凝劑，以及制藥行業(yè)的藥物載體均有聚谷氨酸的相關(guān)報道。
Y -聚谷氨酸分子側(cè)鏈上存在大量游離的羧基，易于一些藥物結(jié)合生成穩(wěn)定 的復(fù)合物，因其在體內(nèi)可以被溶酶體降解內(nèi)源性谷氨酸，并釋放出藥物，且不 易產(chǎn)生積蓄和毒副作用，已被廣泛應(yīng)用于緩釋以及靶向藥物載體。作為生物可 降解的高分子聚合物，Y -聚谷氨酸主要用于藥物釋放和送達載體及非永久性植 入裝置，它除了可以滿足一般物理、化學(xué)性能要求之外，還可以滿足生物相容 性要求，如美國華盛頓州細胞治療公司開發(fā)的抗腫瘤藥物——聚谷氨酸-紫杉醇 [PG-TXL (CT22103)]，該產(chǎn)品以聚谷氨酸作為藥物載體可增強藥物輸送到腫瘤部 位的能力，起到更好的療效，并且比紫杉醇更能抗腫瘤細胞的耐藥。又如 200610024353. 0公開了Y-聚谷氨酸-順鉑復(fù)合物、制備及用途，該復(fù)合物以微 生物發(fā)酵制備的Y-聚谷氨酸作為藥物載體，顯著改善了藥物的水溶性，延長了 藥物的作用時間，降低了藥物的毒副作用。
目前作為藥物載體用的Y -聚谷氨酸的來源主要有兩種， 一種是通過化學(xué)合 成獲得的，該方法合成步驟復(fù)雜，成本高，產(chǎn)量低，不利于產(chǎn)業(yè)化；另一種是 由微生物發(fā)酵合成的，該方法利用微生物自身的表達系統(tǒng)大量合成聚谷氨酸， 制備工藝簡單，成本低，產(chǎn)量高，越來越多的被采納，本發(fā)明所提供的Y-聚谷 氨酸均是通過微生物發(fā)酵方法合成的。但是，以Y-聚谷氨酸作為藥物載體往往
有以下缺點首先，以線性的單氨基酸聚合物作為藥物載體由于活性基團排列 緊密，載藥量往往不高；其次，單氨基酸聚合物材料進入生物體內(nèi)后，由于降解位點單一，降解和吸收的速度較慢，易造成聚合物在生物體內(nèi)的累積；另外， 谷氨酸分子的水溶性極好，在提高藥物相容性的同時，在藥物的控釋方面還有 不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一在于提供一種y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)。 本發(fā)明提供的y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物是指天冬氨酸與y -聚谷氨酸共價 結(jié)合的聚合物，其中的鍵合是通過y-聚谷氨酸的羧基基團與天冬氨酸的氨基基 團之間在多肽縮合劑作用下形成酰胺鍵來實現(xiàn)的，其通式為^x
n=50 1000的正整數(shù) m=l/10 n n的正整數(shù) y -PGA為y -聚谷氨酸 ASP為天冬氨酸
X為可以與羧基反應(yīng)的活性基團，包括但不局限于氨基，羥基，巰基。
本發(fā)明所提供的y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其特征在于復(fù)合物中y -聚谷氨酸比天冬氨酸分子個數(shù)比為1:1 10:1，優(yōu)選為2:1 5:1，進一步優(yōu)選 為2:1。
本發(fā)明所提供的y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其分子量為12KDa 120KDa，優(yōu)選為24KDa 72KDa，進一歩優(yōu)選為48KDa 72KDa。
本發(fā)明所提供的y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其特征在于，所述X可以 是抗腫瘤藥物順式二氯二胺合鉑CDDP，該y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物即y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物， 其通式為^~CDDP
n=50 1000的正整數(shù) m二l/10 n n的正整數(shù)
5Y-PGA為Y-聚谷氨酸 ASP為天冬氨酸 CDDP為順式二氯二胺合鉑
本發(fā)明目的之二在于提供Y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的制備方法。該方 法包括
(a) 由微生物發(fā)酵的方法得到大分子Y-聚谷氨酸鈉鹽；
(b) 配制1 3%大分子y -聚谷氨酸鈉鹽溶液，調(diào)節(jié)pH到2. 0 3. 0，通過高溫 高壓降解的方法提供一種小分子Y -聚谷氨酸鈉鹽的水溶液；
(C)將小分子Y-聚谷氨酸鈉鹽轉(zhuǎn)化為質(zhì)子化形式的小分子Y-聚谷氨酸，并通 過冷凍干燥的方式得到白色粉末結(jié)晶；
(d) 使Y-聚谷氨酸與羧基被保護的天冬氨酸溶于反應(yīng)溶劑，在多肽縮合劑作 用下，通過所述羧基被保護的天冬氨酸的氨基和Y-聚谷氨酸的a -羧基之間形 成的酰胺鍵，將天冬氨酸結(jié)合到Y(jié)-聚谷氨酸上；
(e) 將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中脫去天冬氨酸羧基的保 護基團，并以乙醚終止脫保護反應(yīng)；
(O透析除去雜質(zhì)和未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，收集質(zhì)子化形式的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物。
本發(fā)明提供的大分子Y-聚谷氨酸鈉鹽是由微生物發(fā)酵合成的，其分子量為 100KDa 2000KDa。
本發(fā)明提供的小分子Y -聚谷氨酸鈉鹽是由大分子降解而來，包括Y -聚谷 氨酸鈉鹽形式和Y-聚谷氨酸形式兩種，其分子量為10KDa 100KDa，優(yōu)選為 20KDa 60KDa，進一步優(yōu)選為40KDa 60KDa。
本發(fā)明提供的質(zhì)子化形式的小分子Y-聚谷氨酸是由小分子Y -聚谷氨酸鈉 鹽形式轉(zhuǎn)化而來的，配制1 3%大分子Y-聚谷氨酸鈉鹽溶液，分別以酸透析 48h，去離子水透析24h，收集沉淀，冷凍干燥得到白色粉末結(jié)品，測定pH 6. 0 7.0，鈉的重量％不超過7000卯m。
本發(fā)明所提供的的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其分子量為12KDa 120KDa，優(yōu)選為24KDa 72KDa，進一步優(yōu)選為48KDa 72KDa。
6本發(fā)明所提供的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的制備方法，其特征在于， 歩驟(d)所述的Y-聚谷氨酸與天冬氨酸的摩爾比為0.2: 1 5: 1，反應(yīng)溫度
0°C 70°C，反應(yīng)時間0. 5 5h。
本發(fā)明提供的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所
述溶劑可以是蒸餾水或是惰性有機溶劑，其中所述惰性有機溶劑可以是二甲基
亞砜(DMS0)， N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，優(yōu)選為二甲基亞砜(DMS0)。
本發(fā)明提供的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物是在多肽縮合劑作用下發(fā)生反
應(yīng)，形成酰胺鍵的，這種縮合劑可以是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺
鹽酸鹽(EDAC)， N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)， 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基
碳二亞胺(EDC)， N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)，優(yōu)選為l-乙基-(3-二
甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)。
本發(fā)明目的之三在于提供該藥物載體Y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的用
途。本發(fā)明所提供的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物可以與分子結(jié)構(gòu)上含有羧基
反應(yīng)基團的藥物結(jié)合，充當(dāng)藥物的高分子載體。
本發(fā)明所提供的可以與Y-聚谷氨酸-天冬氨酸結(jié)合的藥物，是指分子結(jié)構(gòu)
上含有羧基反應(yīng)基團的藥物，這種反應(yīng)基團包括但不局限于氨基、羥基或巰基，
優(yōu)選為氨基。
本發(fā)明所提供的可以與Y -聚谷氨酸-天冬氨酸結(jié)合的藥物可以是多肽類藥 物，蛋白質(zhì)類藥物，或水溶性較差的芳香族類藥物，包括但不局限于胰島素， 胸腺肽，降鈣素，生長激素，干擾素，生長因子，杉醇，喜樹堿，藤黃酸，烷 諾酮。
本發(fā)明提供的一種Y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的制備方法，是將Y -聚谷 氨酸-天冬氨酸復(fù)合物和順鉑混合后，溶解于去離子水中，調(diào)節(jié)PH 7.0 8.0， 攪拌48 h使其充分反應(yīng)，經(jīng)透析純化得到如下式的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合 物，即Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物。
本發(fā)明提供Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其優(yōu)點在于在微生物發(fā)酵制 備的Y -聚谷氨酸小分子的基礎(chǔ)上進行改造，通過Y -聚谷氨酸的羧基基團與天 冬氨酸的氨基基團以酰胺鍵結(jié)合形成Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，豐富了作為藥物載體的氨基酸的種類，減少了藥物載體的用量，增加了藥物載體上活性 基團的數(shù)目，改善了以線性的單氨基酸聚合物作為藥物載體活性基團排列緊密 的缺陷，減少了聚合物在生物體內(nèi)的累積，改善了藥物的控釋效果。


圖1為本發(fā)明得到的y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物利用AVANCE 500MHZ核磁共 振儀測定的'H核磁共振圖譜。
圖2為從存活率角度考察y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物在正常昆明小鼠體內(nèi)毒 性實驗圖。
圖3為y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物與y-聚谷氨酸-順鉑復(fù)合物載藥量 比較分析圖。
圖4為y -聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物中順鉑的體外釋放曲線。
圖5為y _聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物作用乳腺癌細胞Bcap37 48小時的細
胞毒性實驗圖。
圖6為從存活率角度考察y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物在正常昆明小鼠 體內(nèi)毒性實驗圖。
圖7為從體重變化角度考察y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物在正常昆明小
鼠體內(nèi)毒性實驗圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行詳細說明 實施例1 y-聚谷氨酸的制備方法 (1)大分子y-聚谷氨酸鈉鹽的制備
菌種活化取芽孢桿菌(Bacillus licheniformisATCC9945a)菌種一環(huán)， 接入斜面培養(yǎng)基，37。C斜面活化llh。斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g/l，氯化鈉5g/1， 酵母膏5g/1，瓊脂20g/l。
種子培養(yǎng)將lml凍存菌種接入種子培養(yǎng)基，37°C， 210r/min，震蕩培養(yǎng) llh。種子培養(yǎng)基蛋白胨10g/l，氯化鈉5g/l，酵母膏5g/l。
發(fā)酵培養(yǎng)以4%接種量接種上述芽孢桿菌(Bacillus licheniformis ATCC 9945a)， 37°C， 210 r/min，搖瓶培養(yǎng)72h。發(fā)酵培養(yǎng)基麥芽糖50g/l，酵母膏10g/l，谷氨酸鈉30g/l， NaCl 10 g/l， KH2P04 5 g/l,MgS04 7H20 0 . 5 g/l， 裝液量200ml/1000ml搖瓶，115°C、 0. IMPa滅菌20min。
發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加蒸餾水稀釋4倍，用鹽酸調(diào)發(fā)酵液pH至2.0 3.0， 12000 r/min、 30min離心去除菌體沉淀，然后將調(diào)節(jié)上清液pH至7. 0 8. 0， 再加入3倍體積冰冷的無水乙醇，攪拌得到Y(jié)-聚谷氨酸沉淀，干燥沉淀得到Y(jié) -聚谷氨酸粗產(chǎn)品，將沉淀重新溶解在蒸餾水中，超濾除去不溶物，然后反復(fù)透 析(截留分子量MW: 10000)除去雜質(zhì)和小分子物質(zhì)，最后將溶液冷凍干燥得 到白色粉末狀物質(zhì)，此白色物質(zhì)即為Y-聚谷氨酸大分子的鈉鹽，產(chǎn)量可達到 30 g/1。
(2)小分子Y-聚谷氨酸鈉鹽的制備
稱取實施例1 (1)中獲得的大分子Y-聚谷氨酸鈉白色粉末，配成2%的大 分子y -聚谷氨酸鈉溶液。取2%的大分子y -聚谷氨酸溶液100 ml ，調(diào)pH至2. 0 3.0，于12lt、 0. lMPa條件下作用15min，立即冰浴冷卻，調(diào)pH至7. 0 8. 0 終止反應(yīng)，用0.45 nm微孔濾膜過濾除去不溶性大分子顆粒，以蒸餾水作為透 析液透析48h (截留分子量MW: 10000，每隔8小時換一次透析液)，將透析后 樣品用0.22 um微孔濾膜過濾除去雜質(zhì)，最后將樣品冷凍干燥得到白色粉末狀 物質(zhì)，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠滲透色譜法鑒定降解產(chǎn)物的分子量。通過 瓊脂糖凝膠電泳可以看出，本發(fā)明的小分子Y-聚谷氨酸分子量隨降解時間的延 長而減小，降解15 min后分子量在20KDa 60KDa之間；取降解15 min的樣品， 由凝膠滲透色譜測定本發(fā)明小分子Y-聚谷氨酸分子量在15KDa 40KDa。 實施例2質(zhì)子化形式的小分子Y-聚谷氨酸的制備
稱取實施例1 (2)中獲得的小分子Y-聚谷氨酸鈉鹽(1 g)，溶解在100 ml 去離子水中后，轉(zhuǎn)入透析帶(截留分子量MW: 10000)，在4"C下以0.01N鹽酸 作為透析液透析48h，再以去離子水作為透析液透析24h，透析過程中，Y-聚 谷氨酸從溶液中沉淀出來，透析結(jié)束后，反應(yīng)混合物在12000 r/min條件下離 心10min，移去上面的水層，收集沉淀，測定pH為7.0 8.0，冷凍干燥直至得 到恒重，Y-聚谷氨酸從鈉鹽形式到質(zhì)子化形式的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為72%。由ICP測定， 鈉的重量％不超過7000卯m。實施例3 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的制備 反應(yīng)方案1:
取以上實施例2所述制備的Y-聚谷氨酸(Y-PGA， lg)，溶解在無水二甲
基亞砜溶液(DMS0， 50ml)中，先后加入羧基被Otbu保護的天冬氨酸(2.82g) 和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC， 1.5 g)，反應(yīng)混合物 在室溫下攪拌4h，加入3倍體積的三氟乙酸(TFA)和二氯甲垸(DCM)的混合 液(v/V = 19:1)，室溫攪拌2h，脫去天冬氨酸羧基的保護基團，隨后加入15 倍體積的無水乙醚以終止脫保護反應(yīng)，此時Y -聚谷氨酸-天冬氨酸反應(yīng)產(chǎn)物沉 淀出來，12000 r/min離心15 min，收集沉淀，透析以除去雜質(zhì)和未結(jié)合天冬 氨酸，然后將產(chǎn)物冷凍干燥，得到L27gY-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物白色粉 末結(jié)晶，該復(fù)合物的分子量為48KDa 72KDa，經(jīng)氨基酸及多肽分析儀(HITACHI L8800)測定，通過此方案獲得的y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其中y-聚谷 氨酸比天冬氨酸分子個數(shù)比約為2:1，也就相當(dāng)于『2，結(jié)構(gòu)通式為
〔Y國PGA^4ASP)sr"X
n=200 600的正整數(shù) m=l/2 n的正整數(shù) Y -PGA為Y -聚谷氨酸 ASP為天冬氨酸
X為可以與羧基反應(yīng)的活性基團，包括但不局限于氨基，羥基，巰基。 反應(yīng)方案2:
取以上實施例2所述制備的Y-PGA (1 g)，溶解在DMSO (50 ml)中，先 后加入羧基被Otbu保護的天冬氨酸(14.1 g)和EDAC (1.5 g)，反應(yīng)混合物 在室溫下攪拌4h，加入3倍體積的TFA和DCM的混合液(v/v = 19:1)，室溫 攪拌2h，脫去天冬氨酸羧基的保護基團，隨后加入15倍體積的無水乙醚以終 止脫保護反應(yīng)，此時Y-聚谷氨酸-天冬氨酸反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來，12000 r/min 離心15min，收集沉淀，透析以除去雜質(zhì)和未結(jié)合天冬氨酸，然后將產(chǎn)物冷凍 干燥，得到1.66gY-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物白色粉末結(jié)晶，該復(fù)合物的分
10子量為48KDa 72KDa，經(jīng)氨基酸及多肽分析儀(HITACHI L8800)測定，通過 此方案獲得的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其中Y-聚谷氨酸比天冬氨酸分子 個數(shù)比約為1.8:1，也就相當(dāng)于iif1.8，結(jié)構(gòu)通式為
〔y國pgA")Hasp)^x
n=200 600的正整數(shù) m=l/1.8 n的正整數(shù)
y -PGA為y -聚谷氨酸 ASP為天冬氨酸
X為可以與羧基反應(yīng)的活性基團，包括但不局限于氨基，羥基，巰基。 反應(yīng)方案3:
取以上實施例2所述制備的Y-PGA (1 g),其他實驗條件與反應(yīng)方案1和反應(yīng) 方案2相同，先后加入羧基被0tbu保護的天冬氨酸(0. 564 g)和EDAC (1. 5 g)， 經(jīng)反應(yīng)后，最后將產(chǎn)物冷凍干燥，得到1.02gY-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物白 色粉末結(jié)品，該復(fù)合物的分子量為48KDa 72KDa，經(jīng)氨基酸及多肽分析儀 (HITACHI L8800)測定，通過此方案獲得的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其 中Y-聚谷氨酸比天冬氨酸分子個數(shù)比約為10:1，也就相當(dāng)于nFlO，其結(jié)構(gòu)通
式為
[y隱pga ")h""(aSp)^~X
n=200 600的正整數(shù) m=l/10 n的正整數(shù)
y -PGA為y -聚谷氨酸 ASP為天冬氨酸
X為可以與羧基反應(yīng)的活性基團，包括但不局限于氨基，羥基，巰基。 反應(yīng)方案4:
取以上實施例2所述制備的Y-PGA (lg)，其他實驗條件與反應(yīng)方案l， 2 和3相同，先后加入羧基被Otbu保護的天冬氨酸(1.128g)和EDAC (1.5g)，經(jīng)反應(yīng)后，最后將產(chǎn)物冷凍干燥，得到O. 71gY-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物白 色粉末結(jié)晶，該復(fù)合物的分子量為48KDa 72KDa，經(jīng)氨基酸及多肽分析儀 (HITACHI L8800)測定，通過此方案獲得的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其 中Y-聚谷氨酸比天冬氨酸分子個數(shù)比約為5:1，也就相當(dāng)于hf5，其結(jié)構(gòu)通式 為
n=200 600的正整數(shù) m=l/5 n的正整數(shù) y -PGA為y -聚谷氨酸 ASP為天冬氨酸
X為可以與羧基反應(yīng)的活性基團，包括但不局限于氨基，羥基，巰基。 反應(yīng)方案5:
取以上實施例1 (2)所述制備的Y-聚谷氨酸鈉鹽，以上述四種反應(yīng)方案 中相同的比例，以蒸餾水作為溶劑，以相同的實驗方案，可以得到相似的實驗結(jié)果。
反應(yīng)方案6:
取以上實施例2所述制備的Y-聚谷氨酸(Y-PGA， lg)，溶解在無水二甲 基亞砜溶液(DMSO， 50ml)中，先后加入羧基被Otbu保護的天冬氨酸(2. 82 g) 和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC， 1.5 g)，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4h，加入 3倍體積的三氟乙酸(TFA)和二氯甲垸(DCM)的混合液(v/v= 19:1)，室溫 攪拌2h，脫去天冬氨酸羧基的保護基團，隨后加入15倍體積的無水乙醚以終 止脫保護反應(yīng)，此時Y-聚谷氨酸-天冬氨酸反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來，12000 r/min 離心15min，收集沉淀，透析以除去雜質(zhì)和未結(jié)合天冬氨酸，然后將產(chǎn)物冷凍 干燥，得到Y(jié)-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物白色粉末結(jié)晶。 反應(yīng)方案7:
取以上實施例2所述制備的Y-聚谷氨酸(Y-PGA， lg)，溶解在無水二甲 基亞砜溶液(DMSO， 50 ml)中，先后加入羧基被Otbu保護的天冬氨酸(2. 82 g)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC，L5 g)，反應(yīng)混合物在室溫下 攪拌4h，加入3倍體積的三氟乙酸(TFA)和二氯甲垸(DCM)的混合液(v/v = 19:1)，室溫攪拌2h，脫去天冬氨酸羧基的保護基團，隨后加入15倍體積的無 水乙醚以終止脫保護反應(yīng)，此時y-聚谷氨酸-天冬氨酸反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來， 12000 r/min離心15 min，收集沉淀，透析以除去雜質(zhì)和未結(jié)合天冬氨酸，然 后將產(chǎn)物冷凍干燥，得到y(tǒng)-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物白色粉末結(jié)晶。 反應(yīng)方案8:
取以上實施例2所述制備的y-聚谷氨酸(y-PGA, lg)，溶解在無水二甲 基亞砜溶液(DMSO， 50ml)中，先后加入羧基被Otbu保護的天冬氨酸(2. 82 g) 和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS， 1.5 g)，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4h， 加入3倍體積的三氟乙酸(TFA)和二氯甲烷(DCM)的混合液(v/v = 19:1)， 室溫攪拌2h，脫去天冬氨酸羧基的保護基團，隨后加入15倍體積的無水乙醚 以終止脫保護反應(yīng)，此時y-聚谷氨酸-天冬氨酸反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來，12000 r/min離心15 min，收集沉淀，透析以除去雜質(zhì)和未結(jié)合天冬氨酸，然后將產(chǎn) 物冷凍干燥，得到y(tǒng)-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物白色粉末結(jié)晶。 實施例4 y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物體內(nèi)毒性
雌性昆明小鼠共30只，體重22 25g，隨機分成三組，每組10只，分別 注射生理鹽水，y-聚谷氨酸和y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，給藥方法為尾靜 脈注射，采取單次注射方式，注射劑量為2 g/kg，每天記錄小鼠的存活情況(圖 2)，結(jié)果表明￥-聚谷氨酸組小鼠存活率為50%，而y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù) 合物組小鼠在20天后存活率仍大于90%,表明y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物比 原來y -聚谷氨酸的毒性更低。
實施例5 y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的制備及載藥量分析 (1) y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的制備
稱取順鉑20 mg和y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物35 mg，溶于5 ml去離子 水中，調(diào)溶液pH至7. 0 8. 0，于37°C避光攪拌反應(yīng)48h，然后用去離子水透 析48h除去未結(jié)合的游離順鉑，將透析后樣品冷凍干燥，得y-聚谷氨酸-天冬 氨酸-順鉑復(fù)合物白色粉末結(jié)晶。(2) Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物中順鉑含量的測定
將(1 )中的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物白色粉末結(jié)晶折合順鉑3 12 Ug溶于O. 6ml雙蒸水中，與O. 6ml鄰苯二胺(0PDA)的N,N-二甲基甲酰胺(面F)溶液(1.2mg/ml)混合，經(jīng)沸水浴反應(yīng)10min，立即在703 nm處測定其紫外吸收值，復(fù)合物中順鉑含量有標(biāo)準工作曲線法標(biāo)定。
(3) Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物載藥量分析
分別稱取順鉑20 mg和y -聚谷氨酸35 mg;順鉑20 mg和y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物35 mg，按照(1)中的方法制備Y-聚谷氨酸-順鉑復(fù)合物和Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物白色粉末結(jié)晶。 以(2)中的方法進行順鉑含量的測定(圖3)，結(jié)果表明Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的載藥量是原來Y-聚谷氨酸的近一倍。
實施例6 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物凍干粉針的制備
取相當(dāng)于順鉑1 g的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物，加適量注射用水溶解，加入甘露醇0.8g攪拌均勻，以鹽酸調(diào)節(jié)pH5.0，加入0.5%針用活性炭，6(TC保溫20min，脫炭后，濾液加滅菌注射用水至40ml，無菌條件下，用0. 22lim微孔濾膜過濾，分裝于10ml西林瓶中，每瓶lml冷凍干燥，出箱，軋蓋即可。
實施例7 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物粉針制備
取相當(dāng)于順鉑1 g的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物結(jié)晶粉末，加入注射用葡萄糖粉末0. 8 g，混合均勻，無菌分裝于西林瓶中，每瓶相當(dāng)于順鉑2 mg，
悉、封禮蓋o
實施例8 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物中順鉑的體外釋放曲線
以實施例5 (2)中定量方法定量后的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物轉(zhuǎn)入透析帶，分別以去離子水和磷酸鹽緩沖液作為透析液透析，于2h， 5h， 8h，12h， 24h， 48h， 72h在透析液中取樣，測定透析液中順鉑的含量，繪制成Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物中順鉑的體外釋放曲線，圖4。結(jié)果表明Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物在蒸餾水中很穩(wěn)定，在72h內(nèi)，溶液未出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象和順鉑的釋放，但是在PBS中，Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物中的
14順鉑被逐漸釋放出來，其特征為在最初的12h內(nèi)極速釋放，達到60%，隨后
的時間內(nèi)呈現(xiàn)緩慢釋放的趨勢，在72h時釋放率為72%。
實施例9 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物對腫瘤細胞的體外細胞毒性
(1) Y _聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物對人乳腺癌細胞Bcap37體外細胞毒性對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞Bcap37接種于96孔培養(yǎng)板中，將游離順鉑和
Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物分別溶于DMEM培養(yǎng)基中(含10y。胎牛血清)，針頭濾器過濾滅菌，加入上述培養(yǎng)基IOO yl于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔含細胞約1X1(T個，使其成一定濃度梯度，y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物折合順鉑濃度為1 160 ug/ml，每個濃度做4個復(fù)孔，以未加藥組作為對照組。將上述細胞于二氧化碳培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h， 48h， 72h后，每孔加入20ul濃度為5 mg/ml的MTT緩沖液，繼續(xù)培養(yǎng)4h,小心吸出細胞培養(yǎng)板孔中的上清液，每孔加入200 u 1 二甲基亞砜，輕輕震搖10min，于酶標(biāo)儀上測定其在490nm處的光吸收值。
每個濃度的4個復(fù)孔的吸光值以對照組吸光值的均值為標(biāo)準計算出平均值(作為細胞存活率)后，對藥物濃度作圖，從實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Y-PGA-ASP-CDDP保留了抗腫瘤生物學(xué)活性，在同等劑量條件下，Y-PGA-ASP-CDDP要比游離的CDDP的體外細胞毒性低，這是因為Y -PGA-ASP-CDDP具有緩釋的生物學(xué)特點。
(2) Y -聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物對人肝癌細胞BEL7404體外細胞毒性取對數(shù)生長期人肝癌細胞，將Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物溶于
DMFJ1培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清)，Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物折合順鉑濃度為1 160 "g/ml，以上述相同的實驗方案進行實驗，可以得到相似的實驗結(jié)果。
實施例10 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的體內(nèi)毒性
雌性昆明小鼠共50只，體重22 25g，隨機分成五組，每組10只，分別注射生理里鹽水；游離順鉑4mg/kg、 12mg/kg， Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-順鉑復(fù)合物4mg/kg、 12mg/kg，給藥方法為尾靜脈注射，共給藥三次，分別于第0、3、 6天給藥，每天記錄小鼠的存活情況和體重變化情況，結(jié)果見圖6和圖7。
從圖6是從正常小鼠存活率的角度來考察藥物的體內(nèi)毒性，以12 mg/kg
15劑量。結(jié)果表明游離CDDP對正常小鼠的毒性非常大，4天后小鼠死亡90%;而y -PGA-ASP-CDDP對小鼠幾乎沒有毒性，小鼠存活率大于90%。
圖7是從正常小鼠體重變化的角度來考察藥物的體內(nèi)毒性，以12 mg/kg劑量。結(jié)果表明游離CDDP組小鼠的體重在原有基礎(chǔ)上急劇下降并最終全部死亡；而y-PGA-ASP-CDDP組小鼠體重基本保持穩(wěn)定，后期更是有逐漸增加的現(xiàn)象，表明其對小鼠的毒性較低。
權(quán)利要求
1、一種γ-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其特征通式為n＝50～1000的正整數(shù)m＝1/10n～n的正整數(shù)γ-PGA為γ-聚谷氨酸ASP為天冬氨酸X為可以與羧基反應(yīng)的活性基團，包括但不局限于氨基，羥基，巰基。
2、 權(quán)利要求1所述的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物是指天冬氨酸與Y -聚谷氨酸共價結(jié)合的聚合物，其中的鍵合是通過Y -聚谷氨酸的羧基基團與天冬氨酸的氨基基團之間在多肽縮合劑作用下形成酰胺鍵來實現(xiàn)的。
3、 權(quán)利要求l所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其特征在于復(fù)合物中Y-聚谷氨酸比天冬氨酸分子個數(shù)比為1:1 10:1，優(yōu)選為2:1 5:1，進一步優(yōu)選為2:1。
4、 權(quán)利要求1所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其分子量為12KDa 120KDa，優(yōu)選為24KDa 72KDa，進一歩優(yōu)選為48KDa 72KDa。
5、 權(quán)利要求l所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其特征在于，所述X可以是順式二氯二胺合鉑CDDP。
6、 權(quán)利要求l所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的制備方法，該方法包括(a) 由微生物發(fā)酵的方法得到大分子Y-聚谷氨酸鈉鹽；(b) 配制1 3%大分子Y-聚谷氨酸鈉鹽溶液，調(diào)節(jié)pH到2. 0 3. 0，通過高溫高壓降解的方法提供一種小分子Y -聚谷氨酸鈉鹽的水溶液；(c) 將小分子Y-聚谷氨酸鈉鹽轉(zhuǎn)化為質(zhì)子化形式的小分子Y-聚谷氨酸，并通過冷凍干燥的方式得到白色粉末結(jié)晶；(d) 使Y-聚谷氨酸與羧基被保護的天冬氨酸溶于反應(yīng)溶劑，在多肽縮合劑的作用下，通過所述羧基被保護的天冬氨酸的氨基和Y-聚谷氨酸的a -羧基之間形成的酰胺鍵，將天冬氨酸結(jié)合到Y(jié)-聚谷氨酸上；(e) 將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中脫去天冬氨酸羧基的保護基團，并以乙醚終止脫保護反應(yīng)；(f)透析除去雜質(zhì)和未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，收集質(zhì)子化形式的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物。
7、 權(quán)利要求6所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的制備方法，所述步驟(d)中所用的溶劑可以是蒸餾水或是惰性有機溶劑，其中所述惰性有機溶劑可以是二甲基亞砜(DMS0)， N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，優(yōu)選為二甲基亞砜(DMS0)。
8、 權(quán)利要求6所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的制備方法，其特征在于，歩驟(d)所述的Y-聚谷氨酸與天冬氨酸的摩爾比為0.2: 1 5: 1，反應(yīng)溫度(TC 70"C，反應(yīng)時間0. 5 5小時。
9、 權(quán)利要求5所述的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的制備方法，該方法包括權(quán)利要求6所述的歩驟(a)-(f)，和步驟(g)，其中，歩驟(g)將Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物與順鉑混合，溶解于去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0 8.0，攪拌48h使其充分反應(yīng)，經(jīng)透析純化得到權(quán)利要求5所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物。
10、 權(quán)利要求1所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物作為藥物載體的用途。
11、 權(quán)利要求1或5所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物在制備預(yù)防或治療腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種γ-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，其特征通式為上式，n＝50～1000的正整數(shù)，m＝1/10n～n的正整數(shù)，γ-PGA為γ-聚谷氨酸，ASP為天冬氨酸，X為可以與羧基反應(yīng)的活性基團，包括但不局限于氨基，羥基，巰基。本發(fā)明還公開了γ-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物的制備方法。本發(fā)明還公開了γ-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物作為藥物載體的用途，以及在制備預(yù)防或治療腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C08G69/48GK101463131SQ200910045189
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日
發(fā)明者震 馮, 吳自榮, 李文娟, 薛曉敏, 靜 黃 申請人:華東師范大學(xué)