專利名稱：：低分子量葡聚糖、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種低分子量葡聚糖、所述低分子量葡聚糖的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
：黃芪(i^fe血raga/M)是豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根，味甘、性溫，歸肺、脾經(jīng)，是重要的益氣中藥。黃芪多糖是其主要有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究證明，黃芪多糖具有提高人體免疫功能、抗腫瘤、抗輻射損傷、調(diào)節(jié)血糖、抗衰老等作用(張小梅.黃萬多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及抗腫瘤作用研究進(jìn)展.大連大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24(6):101-104;包文奇，呂美，王志祥.黃芪多糖的藥理研究進(jìn)展.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，(4):78-80)。目前對黃芪多糖的研究主要集中在分子量較大的多糖上(李鵬飛，杜海燕，趙孟春.黃芪多糖的化學(xué)和免疫學(xué)研究.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2005，(5):4-6;單俊杰，王順春，劉滌，胡之璧.黃芪多糖的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，14(3):61-65)，而對低分子量多糖的研究幾乎處于空白。
發(fā)明內(nèi)容為解決上述的黃芪中低分子量多糖的研究處于空白的技術(shù)問題，本發(fā)明從黃芪中分離純化獲得一種低分子量葡聚糖，經(jīng)化學(xué)分析和光譜分析相結(jié)合的方法確定出其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并通過藥理實(shí)驗(yàn)證明該類結(jié)構(gòu)的葡聚糖具有明顯的免疫增強(qiáng)活性，可應(yīng)用于藥品或保健食品中。因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種低分子量葡聚糖，其特征在于，其是從黃芪中分離得到的。所述低分子量葡聚糖的重均分子量為1204，其僅由葡萄糖組成，不含蛋白質(zhì)和核酸。發(fā)明人將該葡聚糖命名為MAPS-1-W1-1G。MAPS-1-W1-1G具有如下通式(l)所示的重復(fù)單元a—D—GIca—D—Glc11I6丄6，Xy其中x+y=13。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供該低分子量葡聚糖的制備方法，為采用柱層析的分離純化方法制備。所述方法可包括如下步驟a.取黃芪多糖，溶解、離心，上清液透析并濃縮，得到濃縮物；b.取濃縮物，溶解、離心，上清液用陰離子交換樹脂或離子交換凝膠柱層析進(jìn)行初步分離，將所得流分分別濃縮、透析并干燥，得到若干組分；c.繼續(xù)用凝膠柱反復(fù)層析上述組分，得到純化的低分子量葡聚糖。其中，b步驟中所述的陰離子交換樹脂可以選自DEAE-CelluloseDE52、DEAE-CelluloseDE32、CM-CelluloseCM52或CM-CelluloseCM32，優(yōu)選DEAE-CelluloseDE52;所述的離子交換凝膠柱可以選自DEAESepharoseF.F.、CMSepharoseF.F.、DEAESepharoseCL-6B或CMSepharoseCL-6B;而c步驟中所述的凝膠柱可以選自SephadexG25、SephadexG50、SephadexG75、SephadexG100、SephacrylS-100HR、SephacrylS-200HR、SephacrylS-300HR、SephacrylS-400HR、ToyopealHW-40、ToyopealHW-50、ToyopealHW-55、Superdex30、Superdex75、Superdex200、Superdex6或Superdex12，優(yōu)選自SephadexG25、SephadexG50、SephadexG75或SephadexG100，最優(yōu)選SephadexG-50。由于通過藥理實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明從黃芪中分離得到的低分子量葡聚糖具有明顯的免疫增強(qiáng)活性，因此，本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述的低分子量葡聚糖在制備免疫增強(qiáng)及腫瘤輔助治療藥物或保健食品中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種藥物組合物或保健食品組合物，其由所述的低分子量葡聚糖和藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的賦形劑組成。圖1為低分子量葡聚糖MAPS-1-W1-1G在高效凝膠色譜柱上的色譜圖2為低分子量葡聚糖MAPS-1-W1-1G的單糖組成分析結(jié)果；圖3為低分子量葡聚糖MAPS-1-W1-1G的紫外掃描圖譜；圖4為低分子量葡聚糖MAPS-1-W1-1G的^C-NMR譜圖；圖5為低分子量葡聚糖MAPS-1-W1-1G的IR譜圖；圖6為低分子量葡聚糖MAPS-1-W1-1G的甲基化分析結(jié)果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:黃芪多糖分離純化(1)黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳，許海燕，黃春躍.一種精制黃芪多糖的方法.中國發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取，得率為8.37%，純度為85.74%。(2)取(1)中得到的MAPS50g，溶于適量的蒸餾水，5000rpm離心20min，上清液對水透析(截留分子量3500)，透析袋內(nèi)溶液濃縮得到MAPS-1(12.6g)。(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g，分5次，加入10ml蒸餾水溶解，離心，上清液用DEAE-CelluloseDE52柱(OH-型，40x4.0cm，填料高30cm)層析進(jìn)行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.01mol/L和O.lmol/L的NaCl溶液洗脫，自動(dòng)部分收集儀分別收集各流分，示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤撿測，并且根據(jù)檢測的結(jié)果合并相同流分，經(jīng)濃縮，蒸餾水透析及冷凍干燥得到5個(gè)組分MAPS-1-W1(808.8mg)，MAPS-l-W2(383.2mg)，MAPS-1-W3(341.8mg)，MAPS-1-0.01M(1477.4mg)，MAPS-1-0.1M(227.9mg)。(4)組分MAPS-1-0.1M多糖含量較低，棄去。MAPS-1-W1，MAPS-1-W2，MAPS-1-W3部分分別繼續(xù)用SephadexG-50凝膠柱(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，MAPS-1-0.01M繼續(xù)用SephacrylS-400HR凝膠柱(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，分別用蒸餾水洗脫，示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢觀U，合并流分，冷凍干燥。MAPS-1-W16部分純化得到一個(gè)純葡聚糖MAPS-1-W1-1G(1);MAPS-1-W2部分純化得到兩個(gè)純多糖MAPS-1-W2-1G(2)和MAPS-1-W2-2G(3);MAPS-1-W3部分純化得到兩個(gè)純多糖MAPS-1-W2-2G(3)禾卩MAPS-1-W3-1G(4);MAPS-1-0.01M部分純化得到一個(gè)純多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。實(shí)施例2:黃芪多糖分離純化(1)黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳，許海燕，黃春躍.一種精制黃芪多糖的方法.中國發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取，得率為8.37%，純度為85.74%。(2)取(1)中得到的MAPS50g，溶于適量的蒸餾水，5000rpm離心20min，上清液對水透析(截留分子量3500)，透析袋內(nèi)溶液濃縮得到MAPS-1(12.6g)。(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g，分5次，加入10ml蒸餾水溶解，離心，上清液用DEAE-CelluloseDE52柱(OH-型，40x4.Ocm，填料高30cm)層析進(jìn)行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.01mol/L和O.lmol/L的NaCH容液洗脫，自動(dòng)部分收集儀分別收集各流分，示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測，并且根據(jù)檢測的結(jié)果合并相同流分，經(jīng)濃縮，蒸餾水透析及冷凍干燥得到5個(gè)組分MAPS-1-W1(808.8mg)，MAPS-l-W2(383.2mg)，MAPS-1-W3(341.8mg)，MAPS-1-0.01M(1477.4mg)，MAPS-1-0.1M(227.9mg)。(4)組分MAPS-1-0.1M多糖含量較低，棄去。MAPS-1-W1，MAPS-1-W2，MAPS-1-W3部分分別繼續(xù)用ToyopealHW-40F凝膠柱(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，MAPS-1-0.01M繼續(xù)用ToyopealHW-50F凝膠柱(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，分別用蒸餾水洗脫，示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測，合并流分，冷凍干燥。MAPS-1-W1部分純化得到一個(gè)純葡聚糖MAPS-1-W1-1G(1);MAPS-1-W2部分純化得到兩個(gè)純多糖MAPS-1陽W2-1G(2)和MAPS-1-W2-2G(3);MAPS-1-W3部分純化得到兩個(gè)純多糖MAPS-1-W2-2G(3)禾BMAPS-1-W3-1G(4);MAPS-1-0.01M部分純化得到一個(gè)純多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。實(shí)施例3:黃芪多糖分離純化(1)黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳，許海燕，黃春躍.一種精制黃芪多糖的方法.中國發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取，得率為8.37%，純度為85.74%。(2)取(1)中得到的MAPS50g，溶于適量的蒸餾水，5000rpm離心20min，上清液對水透析(截留分子量3500)，透析袋內(nèi)溶液濃縮得到MAPS-1C12.6g)。(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g，分5次，加入10ml蒸餾水溶解，離心，上清液用DEAESepharoseF.F.柱(40x4.0cm，填料高30cm)層析進(jìn)行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.01mol/L的NaCl溶液洗脫，自動(dòng)部分收集儀分別收集各流分，示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測，并且根據(jù)檢測的結(jié)果合并相同流分，經(jīng)濃縮，蒸餾水透析及冷凍干燥得到5個(gè)組分。將水洗脫得到的四個(gè)組分繼續(xù)分別用SephacrylS-100HR凝膠柱(100x2.6cm，填料高卯cm)反復(fù)層析，得到四個(gè)純多糖MAPS-1-W1-1G(1)、MAPS-1-W2-1G(2)、MAPS-1-W2-2G(3)禾卩MAPS-1陽W3-1G(4);將0.01mol/LNaCl溶液洗脫得到的組分繼續(xù)用SephadexG-100凝膠柱(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，得到一個(gè)純多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。實(shí)施例4:黃芪多糖分離純化(1)黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳，許海燕，黃春躍.一種精制黃芪多糖的方法.中國發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取，得率為8.37%，純度為85.74%。(2)取(1)中得到的MAPS50g，溶于適量的蒸餾水，5000rpm離心20min，上清液對水透析(截留分子量3500)，透析袋內(nèi)溶液濃縮得到MAPS-1(12.6g)。(3)取(2)中得到的MAPS-14.0g，分5次，加入10ml蒸餾水溶解，離心，上清液用DEAESepharoseCL-6B柱(40x4.0cm，填料高30cm)層析進(jìn)行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.01mol/L的NaCl溶液洗脫，自動(dòng)部分收集儀分別收集各流分，示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測，并且根據(jù)檢測的結(jié)果合并相同流分，經(jīng)濃縮，蒸餾水透析及冷凍干燥得到5個(gè)組分。將水洗脫得到的四個(gè)組分繼續(xù)分別用Superdex30凝膠柱(100x2.6cm，填料高卯cm)反復(fù)層析，得到四個(gè)純多糖MAPS-1-W1-1G(1)、MAPS-1-W2-1G(2)、MAPS-1-W2匿2G(3)禾卩MAPS-1-W3-1G(4);將0.01mol/LNaCl溶液洗脫得到的組分繼續(xù)用Superdex6凝膠柱(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，得到一個(gè)純多糖MAPS-1-0.01M-1S(5)。實(shí)施例5:低分子量葡聚糖MAPS-1-W1-1G的化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定葡聚糖MAPS-1-W1-1G，經(jīng)高效凝膠色譜柱色譜(PolySep-GFC-P200，300x7.8mm)，譜圖出現(xiàn)單一對稱峰(圖1)，表明純度已達(dá)到對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)、藥理研究的要求，同時(shí)測定其重均分子量為1204，經(jīng)氣相色譜圖分析(圖2)，MAPS-1-W1-1G僅由葡萄糖組成，為一葡聚糖。經(jīng)紫外掃描圖譜(圖3)，MAPS-1-W1-1G在260nm和280nm附近均無蛋白質(zhì)和氨基酸的特征吸收峰，同時(shí)茚三酮反應(yīng)、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)均呈陰性，表明其不含蛋白質(zhì)和核酸。MAPS-1-W1-1G的"C-NMR譜圖中(圖4)，端基碳的化學(xué)位移均在103ppm以下，其中94-103ppm信號(hào)峰為C-l信號(hào)，表明其構(gòu)型為a構(gòu)型，這與IR譜圖(圖5)分析結(jié)果是一致的。根據(jù)NMR譜峰的歸屬、甲基化分析(圖6)以及高碘酸氧化和Smith降解結(jié)果，證明多糖MAPS-1-W1-1G的一級(jí)結(jié)構(gòu)是具有分支的(1—4)-a-葡聚糖，主鏈上平均約每15個(gè)糖殘基中有2個(gè)糖殘基的C-6位被葡萄糖取代，其重復(fù)單元可表示如下無菌條件下取低分子量葡聚糖MAPS-1-W1-1G5g，加入注射用水2000ml中，經(jīng)G4漏斗過濾后，分裝滅菌，制得1000支注射液?！?^a—D—Glc^~^實(shí)施例69實(shí)施例7取低分子量葡聚糖MAPS-1-W1-1G10g，藥用淀粉60g，糊精60g，50%乙醇適量，將上述原料充分?jǐn)嚢杌旌现瞥深w粒，在60-70。C干燥2-4小時(shí)，制成1000片。實(shí)施例8取低分子量葡聚糖MAPS-1-W1-1G10g，藥用淀粉100g，50%乙醇適量，制粒，整粒，烘干，裝成1000個(gè)膠囊。實(shí)驗(yàn)例l:本發(fā)明化合物MAPS-l-Wl-lG在體外對刀蛋白(ConA)或脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響對照物為黃芪多糖AG-1、AG-2和A2Nb，其中黃芪多糖AG-1和AG-2按文獻(xiàn)黃喬書，呂歸寶，李雅臣，等.黃芪多糖的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1982,17(3):200-206所述方法分離純化得到。其中，AG-1為水溶性多糖，結(jié)構(gòu)為a-(1—4)(1—6)-葡聚糖，(1—4)和(1—6)糖苷鍵的糖基組成比例為5:2;AG-2為水不溶性多糖，結(jié)構(gòu)為a-(1—4)-葡聚糖；黃芪多糖A2Nb按文獻(xiàn)王瑩，趙毅民，張起鳳，等.黃芪中一種新葡聚糖的分離純化與化學(xué)結(jié)構(gòu)研究[J].中草藥，2001，32(11):962-964所述方法分離純化得到。A2Nb的平均分子量為3.6X105，主要連接方式為a-(1—4)-D-Glc，在每25個(gè)葡萄糖中有一個(gè)C-6位上的分支。按照文獻(xiàn)(徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第三版)[M].北京人民衛(wèi)生出版社，2001，1426-1427;ZhaoC,LiM,LuoYF,etal.IsolationandstructuralcharacterizationofanimmunostimulatingpolysaccharidefromFuzi:Aconitumcarmichaeli[J].CarbohydrateResearch,2006,341(4》485-491)的方法，將小鼠脾細(xì)胞懸液點(diǎn)于96孔培養(yǎng)板上，每孔lOO)iL，設(shè)一個(gè)對照組，再加入50jiL的ConA或LPS(終濃度為2.5|ig/mL或10|ig/mL)，最后加入不同量的多糖樣品(終濃度為10,50,100ng/mL)，每孔培養(yǎng)液補(bǔ)足為200(iL。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于含有5%C02，37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h后，加入MTT溶液(5mg/mL)1Q^L，置于5%C02，37。C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出反應(yīng)物，離心(2000rpm，5min)，棄上清，每孔加入15Q|_iLDMSO，充分振蕩，待凝塊完全溶解后在酶標(biāo)測定儀上570nm讀出A值。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用meaniS.D.表示，測試樣品與對照組的顯著性差異與否用t-檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)。結(jié)果如表l所示。表1MAPS-1-W1-1G在體外對ConA或LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響樣品濃度(pg/mL)ConA(A570)LPS(A570)空白-0.185±0.0130.196±0.014100.268±0.0940.146±0.034MAPS500.328±0.039"0.182±0.0531000.244±0.0480.157±0.017*100.278±0.0670.189±0.041MAPS-1-W1-1G500.344±0.026***0.191±0.0301000.311±0.0880.139±0.030*100.254±0.026*0.175±0.030MAPS-1-W2-1G500.302土0.022"0.197±0.0171000.335±0.034**0.168±0.017100.345±0.014***0.185±0.001MAPS-1-W2-2G500.276±0.010,0.180±0.0301000.340±0.015***0.190±0.012100.330士0.034"0.204±0.020MAPS-1-W3-1G500.304±0.009,0.181±0.0321000.256±0.019**0.171±0.024100.314±0.009,0.163±0.030MAPS-1-0.01M-1500.335±0.015***0.204±0.028S1000.28I士0.023"0.190±0.013100.163±0.0160.195±0.019AG-1500.172±0.0120.1卯±0.0151000.176±0.0220.257±0.037100.193±0.0060.193±0.030AG-2500.196±0.0210.212土0.0211000.193±0.0130.189±0.01611<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從上表可以看出葡聚糖MAPS-1-W1-1G具有顯著的促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖活性，且活性較未經(jīng)分離純化的黃芪多糖MAPS以及多糖AG-1、AG-2和A2Nb活性好；而對于LPS誘導(dǎo)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，葡聚糖MAPS-1-W1-1G對細(xì)胞增殖沒有明顯的影響。權(quán)利要求1、低分子量葡聚糖，其特征在于，其是從黃芪中分離得到的。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量葡聚糖，其特征在于，其重均分子量為1204。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低分子量葡聚糖，其特征在于，其具有如下通式(l)所示的重復(fù)單元<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>(1)其中x+y=13。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖的制備方法，其特征在于，該方法采用柱層析分離純化制得所述低分子量葡聚糖。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，該方法包括如下歩驟a.取黃芪多糖，溶解、離心，上清液透析并濃縮，得到濃縮物；b.取濃縮物，溶解、離心，上清液用陰離子交換樹脂或離子交換凝膠柱層析進(jìn)行初步分離，將所得流份分別濃縮、透析并干燥，得到若干組分；c.繼續(xù)用凝膠柱反復(fù)層析上述組分，得到純化的低分子量葡聚糖。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，b步驟中所述的陰離子交換樹脂選自DEAE-CelluloseDE52、DEAE-CelluloseDE32、CM-CelluloseCM52或CM-CelluloseCM32，單獨(dú)或混合使用。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，b步驟中所述的陰離子交換樹脂選自DEAE-CelluloseDE52。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，b步驟中所述的離子交換凝膠柱選自DEAESepharoseF.F.、CMSepharoseF.F.、DEAESepharoseCL-6B或CMSepharoseCL-6B，單獨(dú)或混合使用。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，c步驟中所述的凝膠柱選自SephadexG25、SephadexG50、SephadexG75、SephadexG100、SephacrylS-100HR、SephacrylS-200HR、SephacrylS-300HR、SephacrylS-400HR、ToyopealHW-40、ToyopealHW-50、ToyopealHW-55、Superdex30、Superdex75、Superdex200、Superdex6或Superdex12，單獨(dú)或混合使用。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，c步驟中所述的凝膠柱選自SephadexG25、SephadexG50、SephadexG75或SephadexG100o11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，c步驟中所述的凝膠柱是SephadexG50。12、權(quán)利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖在制備免疫增強(qiáng)及腫瘤輔助治療藥物或保健食品中的應(yīng)用。13、一種組合物，其由權(quán)利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖和藥學(xué)上可接受的賦形劑組成。全文摘要本發(fā)明公開一種低分子量葡聚糖，其特征在于，其是從黃芪中分離得到的。本發(fā)明也公開上述低分子量葡聚糖的分離純化方法。本發(fā)明還公開所述低分子量葡聚糖在制備免疫增強(qiáng)及腫瘤輔助治療藥物或保健食品中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C08B37/00GK101676302SQ20091013325公開日2010年3月24日申請日期2009年4月1日優(yōu)先權(quán)日2008年9月16日發(fā)明者楊義芳,林夢感申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院