專利名稱：一種具有抗Ⅱ型糖尿病活性的海洋寡糖化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗糖尿病活性的化合物。具體地說(shuō)，是涉及一種來(lái)源于海洋褐藻的 聚甘露糖醛酸鉻配合物及其制備方法和在抗II型糖尿病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種多病因的常見(jiàn)內(nèi)分泌代謝性疾病。據(jù)2007年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，全球糖 尿病患者總?cè)藬?shù)己達(dá)2.46億，其中11型糖尿病占總糖尿病患者的90%以上。據(jù)估計(jì)，全球每 分鐘約有6人死于糖尿病，因糖尿病及其并發(fā)癥而死亡的人數(shù)僅次于癌癥和心腦血管疾病， 已經(jīng)成為影響人類生命健康的第三大殺手。目前，臨床上應(yīng)用的抗糖尿病藥物主要有雙胍類、 磺脲類、a-糖苷酶抑制劑和噻唑垸二酮類等藥物。這些藥物的作用機(jī)理各不相同雙胍類藥 物主要是通過(guò)抑制肝糖元的分解和增加外周組織對(duì)葡萄糖的利用而發(fā)揮降糖作用；磺脲類藥 物具有促胰島素分泌的作用，但存在增加體重和易發(fā)生低血糖等副作用；a-糖苷酶抑制劑是 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制小腸上皮絨毛膜上的淀粉和二糖水解酶的活性來(lái)延緩葡萄糖的吸收，易引起 胃腸道的不良反應(yīng)；噻唑垸二酮類藥物具有增加胰島素敏感性的作用，但對(duì)于胰島素功能缺 陷的病人難以發(fā)揮理想的療效?？傮w來(lái)看，上述抗糖尿病藥物雖具有較明顯的降糖效果，但 它們大多具有不同程度的毒副作用和不良反應(yīng)，或存在作用方式較為單一的缺點(diǎn)。因此，研
究和開(kāi)發(fā)具有良好降糖活性的新型藥物仍是臨床上的迫切需要。
大量研究表明，鉻具有明顯改善糖代謝的作用，三價(jià)鉻是構(gòu)成葡萄糖耐量因子(GIF)的 重要成分，也是胰島素正常發(fā)揮生理功能必要的輔助因子。鉻通過(guò)與煙酸或氨基酸結(jié)合形成 GTF而協(xié)同胰島素發(fā)揮作用，并可作用于葡萄糖代謝中的磷酸變位酶和琥珀酸脫氫酶來(lái)增加 糖的利用。血清中鉻的含量與胰島素的活性呈正相關(guān)，當(dāng)鉻缺乏時(shí)會(huì)造成糖耐量受損，胰島 素的活性及組織對(duì)胰島素的敏感性下降，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致糖代謝紊亂，引發(fā)或加重糖尿病。另 外，鉻還參與了脂肪代謝、蛋白代謝和核酸代謝的調(diào)節(jié)作用，鉻缺乏時(shí)還會(huì)導(dǎo)致高脂血癥、 動(dòng)脈粥樣硬化病變和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等。因此，三價(jià)鉻對(duì)于糖尿病，尤其是由胰島素抵抗等引 起的II型糖尿病的預(yù)防和治療具有重要的意義。鉻的吸收與其化學(xué)結(jié)合形式密切相關(guān)，無(wú)機(jī) 鉻不僅毒性大，而且吸收率極低(<0.5%)，但有機(jī)鉻如吡啶甲酸鉻、煙酸鉻等的吸收率可達(dá) 10-25%。毒理學(xué)研究結(jié)果表明，三價(jià)鉻不能透過(guò)紅細(xì)胞膜，其毒性遠(yuǎn)低于六價(jià)鉻，三價(jià)鉻的 中毒劑量比推薦的每日安全攝入量至少大1000倍，因而是人體必需微量元素中最為安全的元 素之一。
糖類藥物的研究與開(kāi)發(fā)是本世紀(jì)生化藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前巳有較多的糖類化 合物在糖尿病的防治方面顯示出了良好的應(yīng)用前景，如研究發(fā)現(xiàn)植物來(lái)源的南瓜多糖和苦瓜 多糖，真菌來(lái)源的銀耳多糖、靈芝多糖和蟲草多糖，海洋動(dòng)植物來(lái)源的殼聚糖、褐藻多糖和
螺旋藻多糖等均有不同程度的降血糖作用，但目前由T這些多糖的作用靶點(diǎn)不明確，目.存在 口服吸收差、生物利用度低等缺點(diǎn)從而限制了其在臨床上的應(yīng)用。如對(duì)多糖類化合物，特別是來(lái)源于海洋的多糖類化合物，進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕到獾玫浇Y(jié)構(gòu)明確、口服吸收好的低聚糖或寡糖 化合物，并根據(jù)糖尿病的發(fā)病作用機(jī)理進(jìn)行合理的分子修飾，將會(huì)大大提高糖類化合物的降 糖效果，有望成為一類新型的抗糖尿病藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以來(lái)源于海洋褐藻的聚甘露糖酸酸寡糖為分子骨架，將其與三價(jià)鉻進(jìn)行 配位絡(luò)合，以提供一種具有良好降糖活性的海洋寡糖鉻配合物，滿足臨床上預(yù)防和治療糖尿 病的需要。
一種海洋聚甘露糖醛酸寡糖絡(luò)配合物，其特征是它的糖殘基由D-甘露糖醛酸組成，并以 (3-l，4-糖苷鍵連接，與三價(jià)鉻離子進(jìn)行配位絡(luò)合制備，鉻的質(zhì)量百分含量為0.1-15%，重均分
子量為《10kD，其分子式可表述為[C6H8-m(VCrm]n，其中!11=0.1-1， 11=1-50。
一種海洋聚甘露糖醛酸寡糖鉻配合物的制備方法，其特征是將聚甘露糖酸酸溶液在
pH-5-12和溫度45-75'C條件下，逐滴加入適量稀堿和鉻鹽溶液，保溫反應(yīng)lh，過(guò)濾，用2-4 倍體積的有機(jī)溶劑沉淀，靜置，收集沉淀，用有機(jī)溶劑洗滌、脫水，減壓干燥即得。 一種海洋聚甘露糖醛酸寡糖鉻配合物，其特征是用于II型糖尿病的預(yù)防和治療。 本發(fā)明所述的鉻鹽是指氯化鉻、醋酸鉻和硝酸鉻；所述的稀堿是指稀氫氧化鈉、氫氧化 鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀。
本發(fā)明以聚甘露糖醛酸這種在每個(gè)糖環(huán)上中均含有羧基的海洋生物寡糖為原料，將其與 糖尿病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中密切相關(guān)的三價(jià)鉻離子進(jìn)行配位絡(luò)合，得到了一種具有良好抗II型 糖尿病活性的海洋寡糖化合物。與同類產(chǎn)品相比，本發(fā)明產(chǎn)品來(lái)源于海洋天然生物，具有安 全性好，結(jié)構(gòu)獨(dú)特、分子量低，絡(luò)結(jié)合率高，口服吸收好等特點(diǎn)，并可在多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮降糖 作用，在II型糖尿病的防治方面具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)一些具體的實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例1
稱取10g聚甘露糖醛酸(重均分子量為7350道爾頓)溶于500ml純水中，用氫氧化鈉 溶液調(diào)節(jié)pH-lO，在45T:水浴中逐滴加入2mol/L氫氧化鈉和2mol/L氯化鉻溶液，當(dāng)溶液中 剛出現(xiàn)綠色絮狀沉淀時(shí)，停止加入氫氧化鈉和氯化鉻，繼續(xù)保溫lh。取出反應(yīng)液，過(guò)濾，將 濾液濃縮至200mL后加入3倍體積的95。/。乙醇，沉淀，靜置，收集沉淀，用無(wú)水乙醇脫水， 在45'C下減壓干燥，得到含鉻量約為15%的聚甘露糖醛酸鉻配合物。
實(shí)施例2
稱取10g聚甘露糖醛酸(重均分子量為5200道爾頓)溶于500ml純水中，用碳酸鈉溶 液調(diào)節(jié)pH=8，在70。C水浴中逐滴加入2mol/L碳酸鈉和2mol/L醋酸鉻溶液lmL，保溫反應(yīng) lh。取出反應(yīng)液，過(guò)濾，將濾液濃縮至200mL后加入3倍體積的丙酮，沉淀，靜置，收集沉 淀，用丙酮脫水，在45'C下減壓干燥，得到含鉻量約為1%的聚甘露糖醛酸鉻配合物。
實(shí)施例3
稱取10g聚甘露糖醛酸(重均分子量為1500道爾頓)溶下-500ml純水中，調(diào)節(jié)pH二5，
4在6(TC水浴中逐滴加入2mol/L氫氧化鈉和2mol/L硝酸鉻溶液5mL，保溫反應(yīng)lh。取出反應(yīng) 液，過(guò)濾，將濾液濃縮至200mL后加入4倍體積的丙酮，沉淀，靜置，收集沉淀，用丙酮脫 水，在45'C下減壓干燥，得到含鉻量約為5%的聚甘露糖醛酸鉻配合物。 實(shí)施例4
稱取10g聚甘露糖醛酸(重均分子量為3000道爾頓)溶f 500ml純水中，用碳酸鉀溶 液調(diào)節(jié)pH=9，在55'C水浴中逐滴加入2mol/L碳酸鉀和2mol/L氯化鉻溶液10mL，保溫反應(yīng) lh。取出反應(yīng)液，過(guò)濾，將濾液濃縮至200tnL后加入4倍體積的95。/。乙醇，沉淀，靜置，收 集沉淀，用無(wú)水乙醇脫水，在45'C下減壓干燥，得到含鉻量約為10%的聚甘露糖醛酸鉻配合 物。
實(shí)施例5
稱取10g聚甘露糖醛酸(重均分子量為9500道爾頓)溶于500ml純水中，用氫氧化鉀 溶液調(diào)節(jié)pH41，在50'C水浴中逐滴加入2mol/L氫氧化鉀和2mol/L醋酸鉻溶液3mL，保溫 反應(yīng)lh。取出反應(yīng)液，過(guò)濾，將濾液濃縮至200mL后加入2倍體積的丙酮，沉淀，靜置，收 集沉淀，用丙酮脫水，在45'C下減壓干燥，得到含鉻量約為3%的聚甘露糖醛酸鉻配合物。
實(shí)施例6
稱取10g聚甘露糖醛酸(重均分子量為2400道爾頓)溶于500ml純水中，用碳酸氫鈉溶 液調(diào)節(jié)pH-7，在65'C水浴中逐滴加入2mol/L碳酸氫鈉和2mol/L硝酸絡(luò)溶液0.5mL，保溫反 應(yīng)lh。取出反應(yīng)液，過(guò)濾，將濾液濃縮至200mL后加入4倍體積的丙酮，沉淀，靜置，收集 沉淀，用丙酮脫水，在45'C下減壓干燥，得到含鉻量約為0.5%的聚甘露糖醛酸絡(luò)配合物。
本發(fā)明制備的海洋聚甘露糖醛酸寡糖鉻配合物為淺綠色至深綠色無(wú)定形粉未或晶體，溶 于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚和氯仿等有機(jī)溶劑，鉻的質(zhì)量百分含量為0.1-15%,重均分 子量^10kD。
海洋聚甘露糖醛酸寡糖鉻配合物(PMc)抗n型糖尿病的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)
1 PMC對(duì)胰島細(xì)胞的促胰島素分泌作用研究
下面是重均分子量為3000Da的PMC在不同濃度卜，對(duì)RIN-5F胰島細(xì)胞胰島素分泌作 用的影響以及胰淀素存在下對(duì)PMC促胰島素分泌作用的影響研究結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)方法將胰島細(xì)胞RIN-5F置入96孔板中，每孔約2X1()S個(gè)細(xì)胞，在溫度37'C和 5。/。的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。更換RPMI 1640培養(yǎng)液再培養(yǎng)24h，移去培養(yǎng)液，將細(xì)胞用新 鮮培養(yǎng)液洗滌后，加入高濃度葡萄糖溶液，再加不同濃度經(jīng)0.22pm濾膜過(guò)濾滅菌的PMC樣 品溶液。以純水為空白組，以lmmol/L的格列苯脲為陽(yáng)性對(duì)照組，在溫度37'C和5%的C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。取各孔培養(yǎng)液300)LiL，離心除去細(xì)胞，將上清液用培養(yǎng)液稀釋100倍，采 用ELISA試劑盒測(cè)定胰島素的濃度，考察PMC對(duì)胰島細(xì)胞的促胰島素分泌作用。
另取RIN-5F胰島細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)液洗滌后，各加入100pmol/L的胰淀素孵育30min。除 純水空白組外，各組加入高濃度葡萄糖溶液和100pmol/L的PMC溶液，以lOOpmol/L的格 列苯脲為陽(yáng)性對(duì)照組，在溫度37'C和5n/。的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。取各孔培養(yǎng)液300nL，離 心除去細(xì)胞，將上清液用培養(yǎng)液稀釋IOO倍，采用ELISA試劑盒測(cè)定胰島素的濃度，考察高濃度胰淀素存在下對(duì)PMC促胰島素分泌作用的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)與空白對(duì)照組相比，高糖組胰島素的分泌量顯著增加，陽(yáng)性對(duì)照組胰島 素的分泌量有非常顯著的增加，表明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂尚?。PMC在30pmol/L濃度下即具有顯著刺 激胰島細(xì)胞分泌胰島素的作用，且隨著PMC濃度的增加，其剌激RIN-5F胰島細(xì)胞分泌胰島 素的作用增強(qiáng)，呈劑量依賴關(guān)系。
(2)在格列苯脲為陽(yáng)性對(duì)照組中，經(jīng)胰淀素孵育過(guò)的RIN-5F胰島細(xì)胞，其胰島素的分 泌量明顯降低。但在PMC實(shí)驗(yàn)組中，在胰淀素孵育RIN-5F胰島細(xì)胞前后，胰島素的分泌量 無(wú)明顯差異。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論P(yáng)MC和格列苯脲均具有明顯的刺激胰島細(xì)胞分泌胰島素的作用。高濃度胰淀 素的存在，可明顯降低格列苯脲的促胰島素分泌作用，但對(duì)PMC的促胰島素分泌作用無(wú)明顯 影響。
胰淀素是由胰島細(xì)胞分泌的一種正常激素，在病理?xiàng)l件下其分泌和代謝出現(xiàn)異常，可聚 集形成纖絲參與胰島淀粉樣蛋白沉積的形成。胰淀素在胰島中的沉積，使(3-細(xì)胞發(fā)生凋亡進(jìn) 而導(dǎo)致胰島素的分泌減少是II型糖尿病的典型發(fā)病機(jī)制，胰淀素在II型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展 過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。胰淀素通過(guò)在細(xì)胞表面的沉積，使格列苯脲的促胰島素分泌作用 明顯降低，這是磺脲類藥物繼發(fā)性失效的原因之-、本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃度胰淀素的存在對(duì)PMC 的促胰島素分泌作用無(wú)明顯影響，這表明PMC可通過(guò)與胰淀素的相互作用干擾其在細(xì)胞表面 的沉積，抵抗胰淀素對(duì)胰島細(xì)胞產(chǎn)生的毒性，從而在II型糖尿病的預(yù)防和治療中顯示出了良 好的應(yīng)用前景。
2 PMC對(duì)Wistar II型糖尿病模型大鼠的治療作用
實(shí)驗(yàn)方法取Wistar大鼠112只，雌雄各半，體重200 250 g。動(dòng)物預(yù)飼養(yǎng)7天后用于 試驗(yàn)。隨機(jī)選取12只作為正常對(duì)照組，雌雄各半，喂以基礎(chǔ)飼料，自由進(jìn)食，其余100只大 鼠喂以高糖高脂詞料(基礎(chǔ)飼料中加蔗糖10°/。、豬油10%、膽固醇5%)詞養(yǎng)4周，同時(shí)自 由飲水。4周后，喂高糖高脂飼料大鼠均注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病，按30 mg-kg" —次腹腔注射1%STZ溶液，臨用前用枸椽酸-枸椽酸鈉緩沖液配制。72 h后鼠尾取血 測(cè)定各組大鼠空腹血糖，血糖dl.l mmol/L者可認(rèn)為造模成功。對(duì)造模成功的大鼠按體重隨 機(jī)分成5組，分別為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、高劑量組。以上各組動(dòng)物分別 給藥，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠給予蒸餾水10 ml'kg+d—1，陽(yáng)性對(duì)照組給予鹽酸二甲雙 胍腸溶片150 mg'kg—^cT1， PMC低、中、高劑量組分別給予PMC溶液，給藥劑量分別為17 mg-kg".cT1、 35 mg'kg".cT1、 70 mg'kg+cT1，給藥體積10 ml'kg-'， 1次/d，連續(xù)給藥30天。給 藥第l天藥后2h測(cè)定血糖，觀察是否具有急性降糖作用，給藥開(kāi)始后每周固定時(shí)間測(cè)定體 重和攝食量，給藥第15天和第30天測(cè)定空腹血糖和空腹胰島素，進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)， 計(jì)算糖耐量曲線下面積(AUC)和胰島素敏感指數(shù)(ISI)。末次藥后lh，用3%戊巴比妥鈉 麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心取血清，測(cè)定大鼠血清中游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、 白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、總膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量。處死動(dòng)物，分離肝臟、腎臟、胰、脾臟、心臟，稱
6重，并計(jì)算臟器系數(shù)，將動(dòng)物腎臟、胰腺，用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，H-E染色， 進(jìn)行病理組織學(xué)檢査。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)試驗(yàn)期間動(dòng)物一般狀態(tài)和體重變化情況模型對(duì)照組動(dòng)物出現(xiàn)毛色無(wú)光 澤，尿量增多，少動(dòng)，蜷臥等癥狀。陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、高劑量組動(dòng)物也有類似表現(xiàn)， 但其癥狀較模型對(duì)照組有明顯改善；各組動(dòng)物體重變化無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
(2) 攝食量變化試驗(yàn)期間，各組動(dòng)物在不同時(shí)期內(nèi)，攝食量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 給藥3和4wk， PMC低、中、高劑量組平均攝食量較陽(yáng)性對(duì)照組和模型對(duì)照組低。
(3) 急性降糖作用試驗(yàn)藥前陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、高各組與模型對(duì)照組比較未 見(jiàn)顯著性差異(P>0.05)，藥后各組血糖隨給藥劑量增加有一定的降低趨勢(shì)。
(4) 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)給藥第15天，模型對(duì)照組動(dòng)物空腹血糖較高，給予葡萄糖 后，血糖升高明顯，AUC較空白對(duì)照組明顯增加；陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物空腹血糖較模型對(duì)照組低， 給予葡萄糖后血糖亦有升高，但各時(shí)間點(diǎn)血糖值和AUC明顯低于模型對(duì)照組，且30和60 min 血糖及AUC與模型對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.05); PMC低劑量組動(dòng)物空腹血糖和血 糖升高趨勢(shì)與陽(yáng)性對(duì)照組一致，較模型對(duì)照組低，伊.其數(shù)值略高于陽(yáng)性對(duì)照組，弓模型對(duì)照 組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；隨給藥劑量增加，PMC中、高劑量組血糖降低效果減弱，高劑量組各 時(shí)間點(diǎn)血糖值和AUC與模型對(duì)照組基本-致。模型對(duì)照組動(dòng)物較空白對(duì)照組空腹胰島素含量 升高，胰島素敏感指數(shù)降低；陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物較模型對(duì)照組空腹胰島素含量降低，胰島素敏 感指數(shù)升高，胰島素敏感指數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(PO.05); PMC低劑量組動(dòng)物與陽(yáng) 性對(duì)照組相似，與模型對(duì)照組比較有明顯的降低空腹胰島素含量、升高胰島素敏感指數(shù)作用， 有顯著性差異(P<0.05);隨給藥劑量增加，PMC中、高劑量降低空腹胰島素含量、升高胰 島素敏感指數(shù)作用減弱。給藥第30天，與給藥第15天結(jié)果一致；陽(yáng)性對(duì)照組和PMC低劑量 組動(dòng)物空腹血糖值和給予葡萄糖造成的血糖升高明顯低于模型對(duì)照組；PMC隨給藥劑量增加 抑制血糖升高作用明顯減弱。陽(yáng)性對(duì)照組和PMC低、高劑量組胰島素敏感指數(shù)較模型對(duì)照組 高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P<0.05)。高劑量組胰島素敏感指數(shù)相對(duì)高于低劑量組和中劑 量組，但低、中、高劑量組未出現(xiàn)劑量依賴性增加趨勢(shì)。
(5) PMC對(duì)大鼠血脂的影響給藥第30d，模型對(duì)照組、陽(yáng):性對(duì)照組、PMC低、中、 高劑量組FFA和TG均較空白組增加，說(shuō)明胰島素抵抗在模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、PMC 低、中、高劑量組均存在。模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、高劑量組、空白對(duì)照組 各組之間TP無(wú)顯著性差異，而模型對(duì)照組、PMC中、高劑量組ALB較空白對(duì)照組降低，提 示腎臟功能可能有一定程度損傷。模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、高劑量組CHOL、 LDL-C均較空白對(duì)照組增加，且隨著PMC劑量的增加，CHOL、 LDL-C有增加趨勢(shì)。HDL-C 各組之間無(wú)顯著性差異。
(6) PMC對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響給藥結(jié)束后模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、 高劑量組肝臟系數(shù)較空白組增加，PMC低劑量組肝臟系數(shù)相對(duì)較低，與模型對(duì)照組有顯著性 差異(P<0.05)。心臟系數(shù)、脾臟系數(shù)、胰腺系數(shù)各組無(wú)顯著性差異。腎臟系數(shù)模型對(duì)照組、 陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、高劑量組較空白組增高，空白組左右腎臟系數(shù)與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。隨PMC劑量的增加，肝臟系數(shù)、胰腺系數(shù)、左右腎臟系數(shù)有增加 趨勢(shì)。
(7)病理學(xué)檢査結(jié)果①空白對(duì)照組大鼠腎臟皮、髓質(zhì)分界清楚，腎小管各段結(jié)構(gòu)清晰， 間質(zhì)纖維組織少，腎小球分布均勻，體積正常，腎小球囊無(wú)粘連狹窄；胰島多為圓形或橢圓 形的細(xì)胞團(tuán)，分散于胰腺腺泡之間，數(shù)量較多，胰島的界限清，無(wú)包膜，細(xì)胞團(tuán)的大小不一， 胰島細(xì)胞的胞質(zhì)豐富，胞漿淡染呈淺粉紅色，核多為圓形深染；②模型對(duì)照組大鼠，與空白 組大鼠比較，腎臟腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，個(gè)別伴有蛋白管型，腎皮質(zhì)內(nèi)腎小球毛細(xì)血管 袢減少，基質(zhì)增多，腎小囊囊腔增大；胰腺內(nèi)胰島體積減小，數(shù)量減少，界限不清，胰島細(xì) 胞數(shù)量也減少，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)淺染，細(xì)胞核固縮；③陽(yáng)性對(duì)照組大鼠，亦存在腎臟腎小管 上皮空泡變性，腎小球毛細(xì)血管袢減少，基質(zhì)增多，腎小囊囊腔增大，但與模型對(duì)照組大鼠 比較程度減輕；胰腺內(nèi)胰島數(shù)量減少，胰島細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)淺染，細(xì)胞核固 縮，與模型對(duì)照組大鼠比較未見(jiàn)明顯差異；④低劑量組大鼠，腎臟腎小管上皮空泡變性，皮 質(zhì)內(nèi)腎小球毛細(xì)血管袢減少，基質(zhì)增多，腎小囊囊腔增大，但與模型對(duì)照組大鼠比較程度減 輕，未見(jiàn)腎小管內(nèi)蛋白管型；胰腺內(nèi)胰島數(shù)量減少，胰島細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)淺 染，細(xì)胞核固縮，與模型對(duì)照組大鼠比較未見(jiàn)明顯差異； 中劑量組大鼠，腎臟未見(jiàn)明顯異 常，與空白組大鼠比較未見(jiàn)明顯差異；胰腺內(nèi)胰島數(shù)量比模型對(duì)照組有所增加，但胰島細(xì)胞 數(shù)量仍然較少，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)淺染，細(xì)胞核固縮；⑥高劑量組大鼠，腎臟未見(jiàn)明顯異常， 與空白組大鼠比較未見(jiàn)明顯差異；胰腺內(nèi)胰島數(shù)量增加，胰島細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞腫脹程度 減輕，與模型對(duì)照組大鼠比較，胰腺損傷減輕。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論本試驗(yàn)條件下，PMC對(duì)II型糖尿病大鼠體重和攝食量無(wú)明顯影響，無(wú)急性降 糖作用，不存在一過(guò)性血糖降低的危險(xiǎn)，PMC能夠減輕糖負(fù)荷，改善血脂代謝，通過(guò)降低 FFA提高II型糖尿病大鼠胰島素敏感指數(shù)，且具有一定的腎臟保護(hù)和減輕胰腺損傷作用。 3 PMC對(duì)KM II型糖尿病模型小鼠的治療作用
實(shí)驗(yàn)方法取KM小鼠112只，雄性，體重18 22 g。隨機(jī)選取12只小鼠作為正常對(duì) 照組，喂以基礎(chǔ)飼料，自由飲水，其余100只小鼠喂以高糖高脂飼料(含蔗糖10%、豬油10%、 膽固醇5%)飼養(yǎng)6周，同時(shí)自由飲水。6周后，喂高糖高脂飼料小鼠腹腔注射150 mg'kg" 體重的STZ，分5次給予，并繼續(xù)給予高糖高脂飼料1周后，測(cè)定各組小鼠空腹血糖，濃度S1 U mmol/L者作為II型糖尿病小鼠模型。對(duì)造模成功的小鼠按體重隨機(jī)分成5組，分別為模型 對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、高劑量組，未做模型12只小鼠為正常對(duì)照組。正常對(duì) 照組和模型對(duì)照組小鼠給予蒸餾水20n^kg+d—1，陽(yáng)性對(duì)照組給予鹽酸二甲雙胍腸溶片225 mg-kg"《1, PMC低、中、高劑量組分別給予PMC溶液，給藥劑量分別為25mg'kg+(T1、 50 mg-kg"《1、 100mg'kg—1《1，給藥體積20ml'kg—1， 1次/d，連續(xù)給藥30天。給藥第1天藥后 2h測(cè)定血糖，觀察是否具有急性降糖作用。末次藥后lh，尾靜脈針刺取血測(cè)定空腹血糖， 再摘除小鼠眼球取血，離心取血清，測(cè)定小鼠血清中胰島素、游離脂肪酸(FFA)、甘油三 酯(TG)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、總膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量。將動(dòng)物腎臟、胰腺，用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，H-E染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)急性降糖作用試驗(yàn)結(jié)果空白對(duì)照組藥前和藥后2h血糖與模型對(duì)照組 比較具有顯著性差異(PO.05);陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、高劑量組動(dòng)物藥后2h血糖與模 型對(duì)照組比較有一定的降低趨勢(shì)，但與模型對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，各組給藥前后自身對(duì) 照比較，二甲雙胍組較藥前降低0.72mmol/L具有顯著性差異(P<0.05)、低劑量組較藥前降 低0.46 mmol/L具有顯著性差異(P<0.05)、中劑量組較藥前降低0.59 mmol/L、高劑量組較藥 前降低0.37mmol/L。
(2) 末次藥后空腹血糖和空腹胰島素PMC各劑量組動(dòng)物空腹血糖值劑量依賴性升高；
陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中劑量組空腹血糖值與模型對(duì)照組相比均降低，具有顯著性差異 (P<0.05)，但仍高于空白對(duì)照組，高劑量組與模型對(duì)照組比較未見(jiàn)顯著性差異(P>0.05)。
陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、高劑量組空腹胰島素水平均低于空白對(duì)照組，與空白對(duì)照組 比較均具有顯著性差異(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中、高劑量組空腹胰島素與模型 對(duì)照組比較未見(jiàn)顯著性差異(P〉0.05)。
陽(yáng)性對(duì)照組、PMC低、中劑量組動(dòng)物胰島素敏感指數(shù)較模型對(duì)照組升高，具有顯著性差 異(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組胰島素敏感指數(shù)與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，模型 對(duì)照組、PMC低、中、高劑量組均較空白對(duì)照組低，具有顯著性差異(P<0.05)。
(3) PMC對(duì)KM小鼠血脂的影響模型對(duì)照組FFA、 TG、 LDL-C、 CHOL顯著升高， HDL-C顯著降低，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.05)，提示模型對(duì)照組存在高脂 血癥和胰島素抵抗。模型對(duì)照組TP與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，但ALB較空白對(duì)照組 顯著性降低，提示腎功能可能存在一定的損傷。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組 FFA降低，具有顯著性差異(P<0.05)，提示胰島素抵抗作用降低。PMC低、中、高各劑量 組TG均較模型對(duì)照組顯著性降低(PO.05), PMC低、中劑量組CHOL較模型對(duì)照組顯著 性降低(P<0.05)，此外，PMC低劑量組HDL-C較模型對(duì)照組顯著性升高，提示PMC具有 一定的改善血脂代謝的作用。
(4) 病理學(xué)檢査結(jié)果①空白對(duì)照組，腎臟皮、髓質(zhì)分界清楚，腎小管各段結(jié)構(gòu)清晰， 間質(zhì)纖維組織少，腎小球分布均勻，體積正常，腎小球囊無(wú)粘連狹窄。胰島多為圓形或橢圓 形的細(xì)胞團(tuán)，分散于胰腺腺泡之間，數(shù)量較多，胰島的界限清，無(wú)包膜，細(xì)胞團(tuán)的大小不一， 胰島細(xì)胞的胞質(zhì)豐富，胞漿淡染呈淺粉紅色，核多為圓形深染；②模型對(duì)照組，與空白組比 較，腎臟腎小管上皮細(xì)胞空泡變性；胰島體積減小，數(shù)量減少，分布稀疏，胰島細(xì)胞腫脹， 胞質(zhì)著色淺，空泡增多，細(xì)胞核固縮；③陽(yáng)性對(duì)照組，腎臟未見(jiàn)明顯異常；胰島與模型對(duì)照 組比較體積增大，數(shù)量增多，胰島細(xì)胞腫脹減輕；④低劑量組，腎臟未見(jiàn)明顯異常；胰島與 模型對(duì)照組比較體積增大，數(shù)量增多，胰島細(xì)胞腫脹減輕；⑤中劑量組和高劑量組，腎臟未 見(jiàn)明顯異常；胰島體積增大，數(shù)量增多，與模型對(duì)照組大鼠比較，胰腺損傷有所恢復(fù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論在本試驗(yàn)條件下，PMC對(duì)II型糖尿病小鼠無(wú)急性降糖作用，不存在一過(guò)性血 糖降低的危險(xiǎn)，PMC能夠改善n型糖尿病小鼠血脂代謝，降低II型糖尿病小鼠胰島素抵抗， 具有一定的增強(qiáng)胰島素敏感性的作用，且具有一定的腎臟保護(hù)和減輕胰腺損傷作用。
權(quán)利要求
1.一種海洋聚甘露糖醛酸寡糖鉻配合物，其特征是它的糖殘基由D-甘露糖醛酸組成，并以β-1，4-糖苷鍵連接，與三價(jià)鉻離子進(jìn)行配位絡(luò)合制備，鉻的質(zhì)量百分含量為0.1-15％，重均分子量≤10kD，其分子式可表述為[C6H8-mO6·Crm]n，其中m＝0.1-1，n＝1-50。
2. —種海洋聚甘露糖醛酸寡糖鉻配合物的制備方法，其特征是將聚甘露糖醛酸溶液在 pH-5-12和溫度45-75'C條件下，逐滴加入適量稀堿和鉻鹽溶液，保溫反應(yīng)lh，過(guò)濾，用 2-4倍體積的有機(jī)溶劑沉淀，靜置，收集沉淀，用有機(jī)溶劑洗滌、脫水，減壓干燥即得。
3. 權(quán)利要求2所述的鉻鹽是指氯化鉻、醋酸鉻和硝酸鉻。
4. 權(quán)利要求2所述的稀堿是稀氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫 鉀。
5. —種海洋聚甘露糖醛酸寡糖鉻配合物，其特征是用于n型糖尿病的預(yù)防和治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗II型糖尿病活性的海洋寡糖化合物，它是以來(lái)源于海洋并在每個(gè)糖環(huán)上中均含有羧基的D-聚甘露糖醛酸寡糖為原料，與稀堿和鉻鹽溶液反應(yīng)，將與糖尿病發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的三價(jià)鉻離子引入寡糖分子形成的配合物。經(jīng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明產(chǎn)品具有明顯的促胰島素分泌作用，且不受胰淀素的影響；對(duì)II型糖尿病大鼠和小鼠均具有減輕糖負(fù)荷，改善血脂代謝，提高胰島素敏感性和一定的腎臟保護(hù)和減輕胰腺損傷作用。本發(fā)明產(chǎn)品來(lái)源于海洋天然生物，具有安全性好，結(jié)構(gòu)獨(dú)特、分子量低，鉻結(jié)合率高，口服吸收好等特點(diǎn)，并可在多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮降糖作用，在II型糖尿病的防治方面具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101649004SQ200910177710
公開(kāi)日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者于廣利, 李廣生, 管華詩(shī), 峽 趙, 翠 郝 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)