專利名稱：磁性聚合物粒子和羧甲基化天冬氨酸的結(jié)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及攜帶螯合基體(chelating matrix)的磁性聚合物粒子，以及制備攜帶所述螯合基體的磁性聚合物粒子的方法，所述鰲合基體負載有金屬。更具體地，本發(fā)明涉及攜帶羧甲基化天冬氨酸(Cm-Asp)螯合基團的磁性聚合物粒子，以及涉及Cm-Asp基團和所述磁性聚合物粒子的連接。

背景技術(shù)：
磁性聚合物粒子在各種醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛用途，例如，作為傳輸媒介，用于遞送藥物、診斷用途、分離和合成目的。該粒子依賴于它們的磁性來實現(xiàn)這些功能在診斷檢測應(yīng)用中，例如向包含與磁性聚合物粒子結(jié)合的分析物的樣品施加磁場，使分析物分離而無需使用離心分離或過濾；以及在治療應(yīng)用中，例如向患者施加磁場可以將攜帶藥物的磁性聚合物粒子靶向所需的身體部分。
磁性在本文指聚合物粒子含有超順磁晶體。因此，所述磁性聚合物粒子是可磁性偏移的但不是永久可磁化的。已知許多制備磁性聚合物粒子的方法，這些方法的多種方法，包括從預(yù)先形成的磁性鐵氧化物如磁鐵礦中制備含有磁赤鐵礦或磁鐵礦的聚合物粒子。US-A-4,654,267(Ugelstad)中描述了相關(guān)的一些方法，其內(nèi)容在此引入作為參考。
固定化金屬離子親和層析(immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)的使用已經(jīng)知道多年了。IMAC純化法是基于負載有過渡金屬離子(如Cu2+或Ni2+)的螯合基體的使用，該基體能夠結(jié)合蛋白質(zhì)表面存在的給電子基團，特別是組氨酸的咪唑側(cè)鏈。認為給電子基團配位在金屬離子周圍的空配位點。金屬離子和蛋白質(zhì)表面存在的給電子基團之間的相互作用可以通過，例如改變pH而變化，因此通過可逆的金屬絡(luò)合物/蛋白質(zhì)的相互作用可以實現(xiàn)純化。最常見的，如果蛋白質(zhì)通過金屬離子和組氨酸的咪唑側(cè)鏈之間的相互作用結(jié)合在固相，則蛋白質(zhì)可以通過加入咪唑本身，即通過競爭洗脫(competitive elution)而除去。
在IMAC中已經(jīng)采用幾種不同的螯合配體來純化蛋白質(zhì)。次氨基三乙酸酯(NTA)(四齒配位體)和五齒配位體(三(羧甲基)乙二胺)是這些配體的實例，但它們苦于有各種缺點，例如不確定的蛋白質(zhì)相互作用、金屬泄漏等。
US 6242581提出通過應(yīng)用IMAC中的羧甲基化天冬氨酸(Cm-Asp)解決金屬泄漏問題的方法，在所述IMAC中結(jié)合的過渡金屬離子具有八面體幾何結(jié)構(gòu)。據(jù)稱該配體對于分離組氨酸標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)是理想的。在US5962641中討論了Cm-Asp的其它優(yōu)點，例如，對還原劑性的耐性。
在這些專利中Cm-Asp配體與瓊脂糖固相結(jié)合，所述鯨脂糖優(yōu)選是交聯(lián)的，盡管提出了其它聚合物基體，例如聚苯乙烯、尼龍和SEPHAROSE。雖然這些基體可以是磁性的，但磁性粒子不能保持在懸浮液中，而在檢測(assay)中固相的使用是受限的。
現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)Cm-Asp螯合配體可以連接至磁性聚合物粒子，產(chǎn)生具有與重組蛋白質(zhì)中的組氨酸-標(biāo)記物結(jié)合的能力，或與天然蛋白質(zhì)或肽的金屬蛋白活性位中存在的His、Cys、Met、Gln、Asn、Lys或Tyr殘基結(jié)合的能力，及與磷酸化蛋白質(zhì)或肽的部分結(jié)合的能力，以及還具有磁性。這使得有經(jīng)驗的生物化學(xué)家在其檢測過程中更加靈活。
本發(fā)明的發(fā)明人還設(shè)計了高產(chǎn)率地將Cm-Asp配體連接至磁性聚合物粒子的方法，從而得到優(yōu)異的IMAC試劑。


發(fā)明內(nèi)容
因此，從第一個方面看，本發(fā)明提供了一種結(jié)合物，所述結(jié)合物包含磁性聚合物粒子，所述磁性聚合物粒子結(jié)合在羧甲基化天冬氨酸螯合配體上。
從本發(fā)明的另一個方面看，本發(fā)明提供了一種結(jié)合物，所述結(jié)合物包含磁性聚合物粒子，所述磁性聚合物粒子結(jié)合在與金屬原子或離子螯合的羧甲基化天冬氨酸配體上。
從本發(fā)明的又一方面看，本發(fā)明涉及制備以上限定的結(jié)合物的方法，該方法包括使磁性聚合物粒子和Cm-Asp螯合配體反應(yīng)。
以下描述Cm-Asp配體與磁性聚合物粒子(MPP)的結(jié)合，以未配位的狀態(tài)或與金屬配位的狀態(tài)來描述(波浪線表示Cm-Asp和粒子之間的鍵或連接體(linker))
在本發(fā)明的方法中使用的磁性聚合物粒子可以為任何磁性聚合物粒子，例如US-A-4,654,267中描述的。該粒子優(yōu)選是多孔的，以便它的空隙中存在超順磁性晶體。磁性粒子的表面通常被官能化，以使Cm-Asp配體和聚合物粒子連接，例如，該粒子可以被官能化以攜帶任何已知的表面結(jié)構(gòu)，如羧基、甲苯磺?；?tosyl)、氨基、環(huán)氧基團、馬來酰胺基團、硫醇基團等。因此，在Cm-Asp連接之前，表面可以是胺官能化的?；蛘?，胺官能化的表面本身可以進一步官能化以攜帶其它官能團，例如COOH基團。
聚合物粒子優(yōu)選由乙烯類聚合物(例如，苯乙烯)、丙烯酸酯類和/或甲基丙烯酸酯類的組合制成。聚合材料可任選交聯(lián)，例如，通過加入交聯(lián)劑，作為共聚單體(例如，二乙烯苯(DVB)或乙二醇二甲基丙烯酸酯)而交聯(lián)。所需要的交聯(lián)劑(例如共聚單體)的合適量是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選聚合物是交聯(lián)的苯乙烯聚合物(例如，苯乙烯-二乙烯苯聚合物，表面通過使用含有硝基的共聚單體如硝基苯乙烯及隨后還原而官能化)或交聯(lián)的(甲基)丙烯酸聚合物，表面通過使用含有環(huán)氧基團的共聚單體(例如縮水甘油基甲基丙烯酸酯)及隨后胺化(例如通過與乙二胺反應(yīng))而官能化。
在本發(fā)明的方法中使用的聚合物粒子中的超順磁性晶體可以是能夠在多孔聚合物粒子中以超順磁性結(jié)晶形式沉積的任何材料。磁性氧化鐵，例如磁鐵礦或磁赤鐵礦是優(yōu)選的；然而，在需要時，該晶體可以是混合金屬氧化物或其它磁性材料。存在的結(jié)晶磁性材料的總量通常大于1％，優(yōu)選大于3％，更優(yōu)選大于或等于5％(以重量計，例如高達40wt％)?；谕扛擦Ｗ拥目偢芍?，在Fe(或者在非氧化鐵磁性材料的情況下當(dāng)量金屬)重量基礎(chǔ)上計算該百分數(shù)。
本發(fā)明各個方面的聚合物粒子通常具有微米范圍的尺寸(即直徑)，例如為0.3-100μm，尤其為0.5-50μm，更尤其為0.8-8μm，例如0.8-1.2μm。
通常，當(dāng)折算為2.7μm的平均粒徑(即，表面積乘以2.7/MD，其中MD是平均直徑，單位為微米)時，所用多孔粒子的表面積至少為15m2/g(根據(jù)BET氮氣吸附法測量)，更優(yōu)選至少30m2/g，例如高達700m2/g。以類似的比例，粒子孔隙體積優(yōu)選為至少0.1mL/g。
通常，在涂覆前，聚合物粒子是球形的并基本上是單分散的，特別優(yōu)選地，在涂覆之后，該聚合物粒子保持球形和基本上為單分散。
基本上單分散是指對于大量粒子(例如，至少100，更優(yōu)選至少1000)，粒子的變化因子(coefficient of variation，CV)小于20％，例如小于15％，優(yōu)選小于12％，更優(yōu)選小于11％，還更優(yōu)選小于10％，且最優(yōu)選小于約8％，例如2-5％。Cv百分比，如下確定
其中，平均值是平均粒徑，而標(biāo)準(zhǔn)偏差是粒徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差。優(yōu)選基于主要模式計算CV，即將單峰分布曲線擬合至測定的粒徑分布。因此，在計算中可能低估一些低于或高于模型尺寸(mode size)的粒子，該計算例如可基于約90％的總粒子(可檢測的粒子)數(shù)。在Coulter LS 130粒度分析器上完成該CV的測定。
在聚合反應(yīng)之后，通過例如硝化和隨后將如此形成的硝基還原為側(cè)鏈胺基來進行聚合材料的官能化；或通過直接胺化，例如用氨基乙醇處理來進行聚合材料的官能化。作為另外的替代，通過廣為人知的Ugelstad兩步溶脹法制備聚合物粒子，以及可以使用WO 00/61647(Dyno)披露的對該方法的改進方案。根據(jù)這一公開物描述的方法制得的多孔聚合物粒子可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在其孔隙中沉積磁性粒子。
作為另外可能發(fā)生的情況，多孔聚合物粒子可以由硝基苯乙烯和DVB，以及引入的磁性材料制備，如US-A-4,654,267教導(dǎo)的。
由Dynal Biotech ASA出售的商品名為Dynabeads的超順磁性聚合物珠，尤其Dynabeads MyOne是特別優(yōu)選的。Dynabeads特別有利，因為它們保存在懸浮液中而沒有表現(xiàn)出磁性粒子的沉降，而其它磁性粒子常常會發(fā)生這種沉降。與其它存在高鐵含量的磁性粒子相比，Dynabeads還表現(xiàn)出優(yōu)異的磁性遷移率(magentic mobility)。Dynabeads表現(xiàn)出有利的動力學(xué)，從而允許較短反應(yīng)時間和較高產(chǎn)量。它們的不確定結(jié)合低于其它磁性珠，而且它們的適當(dāng)使用得到所需材料的濃度，導(dǎo)致更加容易和有效的清洗過程。最后，Dynabeads例如MyOne珠易于自動化操作且是單分散的。
Cm-Asp配體結(jié)合在磁性聚合物粒子上。結(jié)合是指配體共價連接至聚合物粒子，任選使用下面詳細討論的連接基團。Cm-Asp配體可以通過各種程序結(jié)合在磁性聚合物粒子上，盡管在聚合物粒子表面和Cm-Asp的氮原子之間至少有三個連接原子時是優(yōu)選的。優(yōu)選有至少五個原子將Cm-Asp配體和磁性聚合物粒子表面隔開，更優(yōu)選有6-20個原子將Cm-Asp配體和磁性聚合物粒子表面隔開。
形成磁性聚合物粒子表面的原子是在剛好與連接體/Cm-Asp配體連接之前在位于表面上的那些原子。因此，當(dāng)磁性聚合物粒子在其制造期間以某種方式被活化(例如，硝化和還原，形成氨基官能化表面)時，該磁性聚合物粒子是由表面氮原子形成的。氮原子將構(gòu)成Cm-Asp配體和粒子之間的連接體的第一個原子。在被官能化以攜帶親電表面(例如，溴化物表面)的磁性粒子中，連接體的第一個原子將是取代溴原子的那些原子。
因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了通式(I)的結(jié)合物或其與金屬螯合的類似物，
(其中，MPP是磁性聚合物粒子，波浪線代表包含至少三個原子的連接基團，例如3-20個原子的連接基團)。
在US 6242581中，天冬氨酸在羧甲基化之前連接至固相，以形成Cm-Asp配體，然而，使用該方法，在磁性聚合物粒子上提供Cm-Asp基團是不可行的。相反，本發(fā)明人設(shè)計了可替代的合成，其中在連接至磁性聚合物粒子之前，Cm-Asp配體完全形成。
在這點上，發(fā)現(xiàn)當(dāng)在聚合物表面和Cm-Asp配體之間少于3個原子時，則連接產(chǎn)率低。與攜帶Cm-Asp的瓊脂糖載體(如US-A-5962641中描述的)相反，在本發(fā)明中需要保證磁性聚合物粒子和Cm-Asp之間的連接產(chǎn)率相對較高。瓊脂糖載體的表面積遠高于聚合物顆粒的，因此不需要高產(chǎn)率完成Cm-Asp至(瓊脂糖)載體的連接以便獲得有用的IMAC螯合劑。在這種情況下，需要更高的產(chǎn)率來保證足夠的聚合物粒子攜帶Cm-Asp配體，從而保證可以成功地實現(xiàn)IMAC。
優(yōu)選所述至少3個原子的連接體包含氨基(-NH-)。磁性聚合物珠常常由苯乙烯聚合物制成，所述苯乙烯聚合物被小化，在其表面上形成了硝基。在例如使用氨水還原這些基團后，形成氨基。
因此，連接體優(yōu)選包括親電基團的殘基，即在親電試劑與親核試劑反應(yīng)之后保留下來的基團。從而，該連接體可以包括氧代基團(C＝O，酯/羧基的殘基)，-CH(OH)C2-基團(環(huán)氧化物的殘基)，-CH2-(其中親電試劑是，例如CH2Hal)。連接體還可以加入大量的原子將實際親電基團連接至Cm-Asp配體的氮原子，例如，亞烷基鏈和醚鏈，例如-CH2CH2CH2-或-CH2CH2CH2-O-。
因此，式(I)中的波浪線可表示-NH-Er-N-，其中Er代表2-20個原子的連接體，其為親電殘基(Er)，例如-(CH2)n-，其中n為2-20，該連接體連接粒子表面的氨基和Cm-Asp配體的氮原子。
磁性聚合物粒子攜帶親電基團，而Cm-Asp被官能化攜帶親核基團當(dāng)然在本發(fā)明的范圍內(nèi)。有經(jīng)驗的化學(xué)家將會設(shè)計連接粒子和配體的其它方法。
在特別優(yōu)選的實施方案中，提供攜帶碳-碳雙鍵的粒子涂層。這可以通過，例如粒子和烯丙基或乙烯基化合物(例如，巴豆酸)的反應(yīng)獲得。羥基官能化的粒子表面可以與烯丙基溴化物反應(yīng)，在粒子表面形成雙鍵。同樣，羧基官能化的粒子表面可以與丙烯胺反應(yīng)，在粒子表面得到雙鍵。然后，使用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法可以將Cm-Asp直接連接至雙鍵，或者，更優(yōu)選地，雙鍵可以在鹵化物水溶液存在下被還原，得到可以與Cm-Asp配體反應(yīng)的鹵化物親電試劑，以保證成功連接。
另一個優(yōu)選的制備方法包括官能化磁性聚合物粒子的表面以攜帶羧基。該羧酸基團可以通過與N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)而活化并和上述Cm-Asp配體反應(yīng)。
因此，合適的連接體包括包含高達20個原子的氨基亞烷基、酰氨基亞烷基、醚、酯、硫代亞烷基或硫代酯，例如，NH-亞烷基、NH-CO-亞烷基、O-亞烷基、OCO-亞烷基、S-亞烷基或SCO-亞烷基。Cm-Asp配體的氮原子不形成連接體的部分。
Cm-Asp配體也可以在與磁性聚合物粒子連接之前官能化。例如，已經(jīng)證實，將攜帶伯位親核試劑(primary nucleophile)的連接基團提供至Cm-Asp配體，以幫助與粒子表面的親電基團反應(yīng)是有利的。Cm-Asp配體的氮原子是仲位的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該原子可能由于空間位阻過于化學(xué)惰性，而不能與親電基團(例如，鹵化物)在粒子表面上高產(chǎn)率地反應(yīng)。
因此，優(yōu)選將Cm-Asp連接至具有至少兩個原子并包含親核試劑的連接基團，例如胺、羥基或硫醇基。優(yōu)選該連接體為烷基胺，例如，C5/6-烷基胺連接體或醚/聚醚連接，例如包括一個或兩個氧原子和3-6個碳原子的醚/聚醚連接。使用如實施例中描述的已知化學(xué)方法完成連接體和Cm-Asp(經(jīng)由其氮原子)的連接。Cm-Asp配體本身可以使用已知的化學(xué)方法來制造。合成整個連接體CmAsp結(jié)構(gòu)也是可行的。
因此，可以從被適當(dāng)保護的天冬氨酸化合物，例如在該化合物中羧基是酯保護的開始制備連接體CmAsp結(jié)構(gòu)。該化合物可以與通式Hal-X1-CN(其中X表示C1-9亞烷基，Hal為鹵素，例如Br)的化合物反應(yīng)，其中天冬氨酸衍生物的氨基取代鹵原子。所得的仲氨基化合物然后與Hal-CH2COOPr類基團(其中Hal為鹵素如Br，Pr為保護基團)反應(yīng)，以引入最終的亞甲基羧基，形成Cm-Asp結(jié)構(gòu)。例如使用氫和氧化鉑(IV)選擇性還原腈得到理想的連接體，該連接體在需要時可以隨后脫去保護。
因此，可以看到，本發(fā)明另外的方面提供了制備下式化合物的方法，
(其中每個R獨立地表示氫或保護基團，X代表C2-20亞烷基連接體，特別是C5/6-亞烷基)； 該方法包括將通式Hal-X1-CN(其中Hal是鹵素，X1代表C1-19亞烷基連接體)的化合物和下式的化合物反應(yīng)
(其中Pr代表保護基團)； 將生成的產(chǎn)物和通式Hal-CH2COOPr的化合物反應(yīng)，形成化合物
以及將腈還原為氨基，優(yōu)選不除去保護基團。然后在需要時可除去這些基團。有經(jīng)驗的化學(xué)家將會認識到，X連接體比衍生自腈的連接體X1多一個碳原子。
有經(jīng)驗的化學(xué)家能夠進一步設(shè)計用于合成本發(fā)明的Cm-Asp連接體分子的方法。
從另一個方面看，本發(fā)明提供了制備包含磁性聚合物粒子的結(jié)合物的方法，該磁性聚合物粒子結(jié)合在Cm-Asp配體上，該方法包括將式(II)的Cm-Asp配體和磁性聚合物粒子反應(yīng)，所述磁性聚合物離子為例如官能化以攜帶親電涂層的磁性聚合物粒子，所述涂層例如為如酯涂層、環(huán)氧涂層、烯丙基化物涂層、烷基鹵化物涂層等，
(其中，每個R獨立地表示氫或保護基團，X表示2-20個原子的連接體，例如C2-10亞烷基連接體，特別是C5/6-亞烷基連接體)。
式(II)的化合物及其與金屬螯合的類似物本身是新型的，并和Cm-Asp配體自身構(gòu)成本發(fā)明的另一個方面，即式(III)的化合物及其與金屬螯合的類似物。

在本發(fā)明的一些實施方案中，在合成中可能需要保護Cm-Asp配體的羧基。這可以使用已知的保護策略，例如使用本領(lǐng)域已知的能在酸或堿中水解的酯保護基可以容易地實現(xiàn)。
Cm-Asp配體可以配位任何金屬原子或離子。這里金屬是指周期表中1-13族的任何金屬、鑭系金屬或錒系金屬或金屬Si、Ge、Sn、Pb、As、Sb、Bi、Te、Po或At。該金屬應(yīng)優(yōu)選為金屬離子且優(yōu)選為過渡金屬或13族金屬。優(yōu)選的金屬離子是2+或3+氧化態(tài)的那些。當(dāng)金屬離子是2+氧化態(tài)時，整個粒子-連接體-配體-金屬離子組合體是不帶電的，這降低了非特異性連接的可能性。
優(yōu)選的金屬是Ni、Fe、Ga、Mn、Co、Cu和Zn，其中Fe、Ga、Mn和Co是優(yōu)選的，特別是Co2+。例如通過將Cm-Asp和金屬氯化物接觸可以容易地完成配位。
通常，相關(guān)金屬的結(jié)合物可用于連接和結(jié)合肽、蛋白質(zhì)或其它高分子(例如抗體)，從而可用于多種檢測中。然而，借助固定化金屬離子親和層析，它們在分離標(biāo)記的或天然的蛋白質(zhì)/肽中尤其有用。特別是，它們在分離組氨酸-標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)/肽、含有His、Cys、Met、Gln、Asn，、Lys和/或Tyr的天然蛋白質(zhì)和/或肽和磷酸化的蛋白質(zhì)或肽中是有用的。特別優(yōu)選地，該結(jié)合物用于在分離組氨酸-標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)/肽中是有用的。因此，從另一方面看，本發(fā)明提供了結(jié)合物在檢測中的用途，該結(jié)合物包含與Cm-Asp配體結(jié)合的磁性聚合物粒子，所述配體配位金屬原子或離子。實施它們的合適檢測和方法是有經(jīng)驗的生物化學(xué)家公知的。
例如，組氨酸-標(biāo)記蛋白質(zhì)俘獲在本發(fā)明Cm-Asp官能化粒子上有各種用途。分離蛋白質(zhì)的快速反應(yīng)動力學(xué)和溫和處理使得該技術(shù)很好地適用于“拉開(pulldown)”大蛋白質(zhì)復(fù)合物(complex)。因此，Cm-Asp官能化珠可以用于質(zhì)譜分析的樣品制劑中。認為用Cm-Asp官能化珠分離的復(fù)合物可能比用柱或固體載體分開的復(fù)合物(包括其它具有不平整表面的磁性粒子)更加完整，因此對于在質(zhì)譜樣品分離中的使用是理想的。
Cm-Asp技術(shù)還可以用作檢測程序應(yīng)用中的固相。Cm-Asp珠不易于聚集且在溶液中是高度分散的，顯示低程度的非特異性結(jié)合(non-specificbinding)。這些性質(zhì)允許高質(zhì)量篩分結(jié)果和協(xié)議(protocol)，它們?nèi)菀自诙喾N自動化平臺上實現(xiàn)自動化。Cm-Asp珠還可以用于噬菌體展示，或者作為固相或者用于從庫種純化表達的噬菌體展示的選擇蛋白。
因此，通常組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或含His、Cys、Met、Gln、Asn、Lys和/或Tyr殘基的天然蛋白質(zhì)或肽的俘獲可允許微觀蛋白質(zhì)的純化，清理突變蛋白質(zhì)庫，使蛋白質(zhì)/肽的洗脫變性，適度洗脫蛋白質(zhì)/肽，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究和篩選技術(shù)，例如用于藥品發(fā)現(xiàn)、分子顯示、適體篩選，噬菌體展示，工程酶分離和診斷。
現(xiàn)參考以下非限制性實施例進一步描述本發(fā)明。

具體實施例方式 實施例1 Cm-Asp配體的合成 如下制備下面的Cm-Asp三酯
實施例2 Cm-Asp三酯的可選擇合成方法
2-氨基-琥珀酸二乙酯的合成
在0℃向DL-天冬氨酸(91.5g，0.69mol)的無水乙醇(800ml)中逐滴添加亞硫酰氯(150ml，2.06mol)。移去冷卻浴將混合物回流3小時。在冷卻至室溫后，真空蒸發(fā)溶劑并向殘留物中添加飽和的K2CO3水溶液至pH為8。水相用醋酸乙酯(×3)萃取，合并的有機相用鹽水洗滌并干燥(MgSO4)，過濾和真空蒸發(fā)后，得到124.8g(96％)化合物1，為黃色油狀物。該粗產(chǎn)物直接用于下一個步驟中。
1H NMR(200MHz，CDCl3)4.06(m，4H)，3.68(m，1H)，2.61(m，2H)，1.73(s，2H)，1.06(m，6H)。
2-(4-氰基-丁基氨基)-琥珀酸二乙酯的合成
向1(93.0g，0.49mol)，K2CO3(34.0g，0.25mol)和KI(12.3g，0.07mol)的THF(600ml)懸浮液中逐滴添加5-溴戊腈(28.4ml，0.25mol)?；亓骷訜岱磻?yīng)混合物，并攪拌5天。冷卻至室溫之后，過濾該混合物，并真空蒸發(fā)濾液。在硅膠上純化，用己烷/醋酸乙酯(7∶3)洗脫，得到64.1g(97％)化合物2，為黃色油狀物。
1H NMR(200MHz，CDCl3)4.06(m，4H)，3.40(t，1H)，2.50(m，4H)，2.25(t，2H)，1.45(m，4H)，1.15(m，6H)。
2-[(4-氰基-丁基)-乙氧基羰基甲基-氨基]-琥珀酸二乙酯的合成
向2(86.6g，0.32mol)，K2CO3(44.3g，0.32mol)和KI(16.0g，0.10mol)在THF(650ml)的混合物中添加溴乙酸乙酯(42.5ml，0.38mol)。加熱回流反應(yīng)混合物，并攪拌5天。冷卻至室溫之后，過濾該混合物，并真空蒸發(fā)濾液。在硅膠上純化，用己烷/醋酸乙酯(8∶2)洗脫，得到103.7g(91％)化合物3。
1H NMR(200MHz，CDCl3)4.18(m，6H)，3.91(t，1H)，3.42(s，2H)，2.77(m，4H)，2.40(t，2H)，1.65(m，4H)，1.25(m，9H)。
2-[(5-氨基-戊基)-乙氧基羰基甲基-氨基]-琥珀酸二乙酯的合成
向3(15g，42mmol)在95％乙醇(60ml)和濃HCl(10ml)的溶液中添加PtO2(600mg，2.6mmol)的95％乙醇(20ml)的懸浮液。在50psi下氫化該反應(yīng)混合物過夜。過濾該混合物，真空蒸發(fā)濾液并抽吸一整夜，得到定量產(chǎn)率的標(biāo)題化合物，為HCl-鹽。
1H NMR(200MHz，D2O)4.82(t，1H)，4.20(m，6H)，3.53(q，4H)，3.34(m，2H)，3.18(b d，2H)，2.92(b t，2H)，1.65(m，4H)，1.10(b m，9H)。
實施例3 溴化 用45mL醋酸鈉緩沖溶液(pH＝5.9)將17.3g具有0.5mmol/g烯丙基的磁性苯乙烯粒子的甲醇懸浮液洗滌4次。在調(diào)節(jié)粒子濃度至9wt％之后，添加0.96g溶于10mL DMF的三溴吡啶，同時在350rpm下攪拌。五分鐘后，在室溫下用45mL去離子水洗滌粒子五次。
實施例4 用Cm-Asp螯合劑官能化 用20mL50mM碳酸氫鈉18.0g如實施例3制備的粒子懸浮液洗滌3次。調(diào)節(jié)粒子含量至12wt％。向該懸浮液中添加0.17g Cm-Asp三酯(如實施例1制備)。添加50mM的碳酸氫鈉直到獲得10wt％的粒子含量。在40℃、600rpm下振蕩該反應(yīng)混合物15小時。然后用20mL去離子水洗滌粒子4次。
實施例5 水解 將20.0g如實施例4制備的粒子懸浮液用20mL 1M氫氧化鋰洗滌2次。調(diào)節(jié)粒子含量至10wt％之后，在室溫250rpm下振蕩混合物4小時。然后用去離子水洗滌粒子直到pH為6-7。
實施例6 常規(guī)金屬負載條件 用5mL反滲透水洗滌250mg如實施例5制備的粒子2次，然后超聲處理15分鐘。將5ml10mM金屬鹽(MX)添加至粒子中并培養(yǎng)30分鐘。將試管置于磁鐵中，除去上清液。用5ml磷酸鹽緩沖鹽水(0.01％Tween 20，pH7.4)洗滌粒子兩次。然后在20％乙醇中洗滌粒子一次。將粒子存儲在20％的乙醇中。
使用以下金屬鹽MX＝CoCl2、CuSO4、FeCl3、GaCl2、GaCl3、MnSO4、MgCl2、NiCl2、CaSO4、ZnCl2。
實施例7 將羧酸基團官能化為N-羥基琥珀酰亞胺酯 通過用0.1M乙酸(3×50mL)洗滌，酸化含有5.0g MyOne羧酸珠(DynalBiotech ASA)粒子的懸浮液(50g)。然后用丙酮(4×50mL)洗滌該酸化的粒子(其羧酸含量為0.5mmol/g DS)，并密集在磁鐵上。添加過量的丙酮直到獲得總量為35.6g的懸浮液。然后加入N-羥基琥珀酰亞胺(2.90g，25mmol)和二異丙基碳二亞胺(3.16g，25mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌5小時。然后用丙酮(5×50mL)洗滌粒子。
實施例8 用Cm-Asp螯合劑官能化 用50mL異丙醇實施例7的珠的丙酮懸浮液(44g)洗滌3次。調(diào)節(jié)粒子含量至12wt％之后，添加5.6g三乙胺。然后添加0.10g溶于異丙醇中的Cm-Asp三酯(制備如實施例1所述)。得到10wt％的粒子含量。然后在室溫250rpm下振蕩反應(yīng)混合物20小時。用50mL異丙醇洗滌粒子三次。
實施例9 用Cm-Asp螯合劑和乙醇胺官能化 向如實施例8制備的粒子的異丙醇懸浮液(10g)中添加0.32g乙醇胺。然后反應(yīng)混合物在室溫250rpm下振蕩18小時。再用10mL異丙醇洗滌粒子三次。
實施例10 用Cm-Asp螯合劑官能化 將1.2克干燥的Dynabeads 270 Epoxy和8.8g、50mM碳酸氫鈉混合。向懸浮液中加入0.17克Cm-Asp三酯(制備如實施例1所述)，然后反應(yīng)混合物在60℃、600rpm下振蕩16小時。通過用20ml去離子水洗滌四次而處理粒子。
實施例11 組氨酸-標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的純化 1.用700μl 50mM磷酸鈉，pH 8.0，300mM NaCl，0.01％

-20洗滌如實施例6制備的帶有Co2+的粒子懸浮液(2mg)。
2.移出上清液，將粒子再次懸浮于100μl和步驟1相同的緩沖液中。
3.將具有表達的重組組氨酸-標(biāo)記蛋白質(zhì)的lysed E.大腸桿菌細胞的懸浮液添加至粒子懸浮液中?？傮w積用和步驟1相同的緩沖液調(diào)節(jié)至700μl。培養(yǎng)該懸浮液10分鐘。
4.移出上清液，連接有組氨酸-標(biāo)記蛋白質(zhì)的粒子用700μl和步驟1相同的緩沖液洗滌4次。
5.在100μl150mM咪唑，50mM磷酸鈉，pH 8.0，300mM NaCl，0.01％

-20中洗脫組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
6.通過SDS-Tris-HCl聚丙烯酰胺凝膠和溴酚藍著色(bromphenol bluestaining)分析該純化的蛋白質(zhì)。
實施例12 磷酸化肽的純化 1.用500ml 5％的乙酸洗滌如實施例6制備的帶有Fe2+的粒子懸浮液(2mg)。
2.移出上清液并加入100μl、10％乙酸。添加100μl、30μg胰酶化b-酪蛋白。培養(yǎng)30分鐘。
3.移出上清液，連接有磷酸化肽的粒子用250μl 1％的乙酸洗滌2次。
4.移出上清液，結(jié)合有磷酸化肽的粒子用250μl 0.1％的乙酸，10％的乙腈洗滌2次。
5.移出上清液，結(jié)合有磷酸化肽的粒子用250μl H2O洗滌2次。
6.在50μl 0.1M碳酸氫銨中洗脫磷酸化肽。
7.通過HPLC分析該純化的磷酸化肽。
實施例13 金屬結(jié)合的蛋白質(zhì)的純化 1.用250μl、pH為4.0的乙酸緩沖液，250mM NaCl洗滌如實施例6制備的帶有Mn2+的粒子懸浮液(2mg)2次。
2.移出上清液并加入250ml和步驟1相同的緩沖液。添加30μg(3μl)Mn結(jié)合的蛋白質(zhì)。培養(yǎng)10分鐘。
3.移出上清液，結(jié)合有蛋白質(zhì)的粒子用步驟1相同的緩沖液洗滌2次。
4.在50μl 0.1M碳酸氫銨中洗脫Mn-結(jié)合的蛋白質(zhì)。
5.通過SDS-Tris-HCl聚丙烯酰胺凝膠和銀著色(silver staining)分析該純化的蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.通式(II)的化合物或其類似物，該類似物中不存在R基團并與金屬螯合，
其中每個R獨立地表示氫或保護基團，X代表2-20個原子的基團。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中X是C5或C6-亞烷基。
3.通式(III)的化合物或其與金屬螯合的類似物
4.制備下式化合物的方法
其中每個R獨立地表示氫或保護基團，X代表C2-20亞烷基連接體；
該方法包括將通式為Hal-X1-CN(其中Hal是鹵化物，X1代表C1-19亞烷基連接體)的化合物和下式的化合物反應(yīng)
(其中Pr是保護基團)；
將生成的產(chǎn)物和通式為Hal-CH2COOPr的化合物反應(yīng)，得到下式化合物
將腈還原為氨基；以及任選對羧基脫保護。
全文摘要
本發(fā)明披露一種結(jié)合物，其包含磁性聚合物粒子，所述磁性聚合物粒子結(jié)合在羧甲基化天冬氨酸螯合配體上，所述配體任選與金屬離子螯合。
文檔編號C08F8/00GK101717344SQ200910225870
公開日2010年6月2日 申請日期2004年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月27日
發(fā)明者帕爾·桑格, 蓋爾·方南, 尼尼·H·克賈斯, 馬塞爾·桑德伯格, 索爾維格·諾德斯特蘭德, 英格·R·奧克拉斯特 申請人:英維特羅根戴內(nèi)爾公司