專利名稱：從黑木耳中分離制備β-葡聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，涉及黑木耳深加工技術(shù)，特別是從黑木耳中分離 制備葡聚糖的方法。
背景技術(shù)：
黑木耳具有清肺、益氣補(bǔ)血等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明黑木耳中的多糖具有增強(qiáng)人體 免疫力，防癌抗癌和防止血栓的形成等功能。0 -葡聚糖是多糖中的一種，其活性結(jié)構(gòu)是由 葡萄糖單位組成的多聚糖，它們大多數(shù)通過0-1，3結(jié)合，這是葡萄糖鏈連接的方式。它能 夠活化巨噬細(xì)胞、嗜中性白血球等，因此能提高白細(xì)胞素、細(xì)胞分裂素和特殊抗體的含量， 全面刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)。因此葡聚糖具有重要的應(yīng)用價(jià)值。采用高速逆流色譜方法 從黑木耳中分離制備葡聚糖高分子未見文獻(xiàn)報(bào)道。現(xiàn)有的關(guān)于0 -葡聚糖的分離純化方法主要是采用凝膠色譜，其局限性是分離成 本高，分離速度慢。其次，凝膠色譜回收率低，再生使用相對困難，難以發(fā)展成為制備量大的 分離技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種成本較低、效率高的從黑木耳中分離制備0 -葡聚糖的 方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案采用熱水(100°c)浸提黑木耳中的多 糖成分；用醇沉的方法對浸提得到提取物進(jìn)行初步純化，得到黑木耳多糖粗提物；以逆流 色譜儀為分離設(shè)備分離純化黑木耳多糖粗提物中的葡聚糖，其溶劑系統(tǒng)由常溫常壓下 處于固體的聚乙二醇1000、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和處于液體的水組成。先將聚乙二醇 1000的溶液達(dá)到飽和，再通過添加磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉使聚乙二醇1000飽和溶液分 層，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉的用量重量比為1 3 3 1。上相做固定相，下相做流動(dòng) 相。用截留分子量為20kDa的透析袋流水透析去除溶劑中的磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和聚 乙二醇1000，得到葡聚糖水溶液，冷凍干燥即得葡聚糖粉末。操作步驟如下(1)采用沸水浸提黑木耳干粉中的多糖，得到黑木耳多糖提取液；(2)將黑木耳多糖提取液真空濃縮至含固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)40% -50% ；(3)在上述濃縮液中加入5-10倍體積的無水乙醇，得到醇沉多糖，將其真空濃縮 干燥，得到固體黑木耳多糖提物；(4)采用逆流色譜方法分離純化黑木耳多糖提取物；(5)收集逆流色譜分離的葡聚糖組分，用截留分子量為20kDa的透析袋流水透 析去除溶劑中的磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和聚乙二醇1000，得到0 -葡聚糖水溶液；(6)將葡聚糖水溶液真空濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60%以上，再采用冷凍 干燥，得到純化的葡聚糖粉末。步驟(1)所述的浸提過程是采用沸水浸提溶劑與黑木耳干粉的液料體積比為 5 10 1，條件為溫度100°C，浸提時(shí)間2小時(shí)，浸提次數(shù)2 3次。
步驟(2)和步驟(3)所述真空濃縮的真空度低于0. 09Mpa，溫度為50 60°C。步驟(4)所述逆流色譜方法為采用逆流色譜儀為分離設(shè)備，溶劑系統(tǒng)由常溫常壓下處于固體的聚乙二醇1000、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和處于液體的水組成；先用水溶 解聚乙二醇1000，使溶液達(dá)到飽和，再添加磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉使聚乙二醇1000飽和 溶液分層，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉的使用重量比為1 3 3 1;上相做固定相，下相做 流動(dòng)相；用泵將上述溶劑系統(tǒng)的上相注入逆流色譜儀的色譜柱，并取上述溶劑系統(tǒng)的部分 上相溶解固體黑木耳多糖提物制備逆流色譜樣品溶液；開啟逆流色譜儀和流動(dòng)相輸液泵， 將樣品溶液和流動(dòng)相輸入逆流色譜分離柱；部分收集器收集流出組分，用薄層層析的方法 檢測各組分，并收集葡聚糖組分。步驟(4)所述逆流色譜方法所用的逆流色譜儀為高速逆流色譜儀HSCCC。步驟(6)所述冷凍干燥的真空度低于50Pa，溫度低于_35°C。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。圖2為實(shí)施例1的HSCCC分離圖譜。Fraction II ^-葡聚糖組分。圖3為實(shí)施例2的HSCCC分離圖譜。Fraction II ^-葡聚糖組分。圖4為實(shí)施例3的HSCCC分離圖譜。Fractionll 3 -葡聚糖組分。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例110kg黑木耳粉末，加80kg水，煮至沸騰，并保持100°C 2小時(shí)，壓濾；濾渣再加80kg 水，煮至沸騰，并保持100°c 2小時(shí)，壓濾。合并兩次濾液，得到黑木耳多糖提取液。將黑木 耳多糖提取液真空濃縮至含固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)40% -50%,加8倍體積無水乙醇沉淀多糖，過 濾，沉淀物經(jīng)真空干燥，得到固體黑木耳多糖提物。此木耳多糖提物含0 -葡聚糖約6.9%， 直接用于逆流色譜分離。本實(shí)施例的溶劑系統(tǒng)采用在35°C下的聚乙二醇1000飽和溶液，磷酸氫二鈉磷 酸二氫鈉=1 1，每1000毫升飽和液含鹽量80克；逆流色譜儀為HSCCC-D800高速逆流 色譜儀，黑木耳粗多糖中葡聚糖約占6.9%。量取蒸餾水2000ml，加入聚乙二醇1000 265g，充分溶解后已經(jīng)達(dá)到飽和，分別加 入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉240g，置于5000ml分液漏斗，充分搖勻，靜置分層后，將上下兩 相分別裝入試劑瓶。將上相以lOml/min的流速注入高速逆流色譜的色譜柱。稱取黑木耳 多糖粗提物2. 0g溶于50ml上相中制備逆流色譜樣品溶液，開啟逆流色譜儀至800rpm，然后 以1. 0ml/min的流速輸入樣品溶液，待進(jìn)樣結(jié)束后，再以1. 5ml/min的流速輸入流動(dòng)相以洗 脫柱內(nèi)的組分，用收集器收集洗脫組分，應(yīng)用薄層色譜法檢測黑木耳多糖組分。收集逆流色 譜分離的0 -葡聚糖組分，用截留分子量為20kDa的透析袋流水透析去除溶劑中的磷酸二 氫鈉、磷酸氫二鈉和聚乙二醇1000，得到葡聚糖水溶液。葡聚糖水溶液50°C減壓 濃縮至漿狀(固形物含量約50%)，冷凍干燥得到黑木耳葡聚糖粉末93. 2mg，純度為 90%以上。實(shí)施例2
10kg黑木耳粉末，加50kg水，煮至沸騰，并保持100°C 2小時(shí)，壓濾；濾渣再加80kg水，煮至沸騰，并保持100°c 2小時(shí)，壓濾。合并兩次濾液，得到黑木耳多糖提取液。將黑木 耳多糖提取液真空濃縮至含固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)40% -50%,加5倍體積無水乙醇沉淀多糖，過 濾，沉淀物經(jīng)真空干燥，得到黑木耳多糖提物。此木耳多糖提物含0 -葡聚糖約6. 9 %，直接 用于逆流色譜分離。本實(shí)施例的溶劑系統(tǒng)采用在30°C下的聚乙二醇1000飽和溶液，磷酸氫二鈉磷 酸二氫鈉=3 1，每1000毫升飽和液含鹽量80克；逆流色譜儀為HSCCC-D800高速逆流 色譜儀，黑木耳粗多糖中葡聚糖約占6.9%。量取蒸餾水3000ml，加入聚乙二醇1000 375g，充分溶解后已經(jīng)達(dá)到飽和，分別加 入磷酸氫二鈉180g，磷酸二氫鈉60g，置于5000ml分液漏斗，充分搖勻，靜置分層后，將上下 兩相分別裝入試劑瓶。將上相以15ml/min的流速注入高速逆流色譜的色譜柱。稱取黑木 耳多糖粗提物2. 5g溶于50ml上相中制備逆流色譜樣品溶液，開啟逆流色譜儀至800rpm，然 后以1. Oml/min的流速輸入樣品溶液，待進(jìn)樣結(jié)束后，再以1. 5ml/min的流速輸入流動(dòng)相以 洗脫柱內(nèi)的組分，用收集器收集洗脫組分，應(yīng)用薄層色譜法檢測黑木耳多糖組分。收集逆流 色譜分離的0 “葡聚糖組分，用截留分子量為20kDa的透析袋流水透析去除溶劑中的磷酸 二氫鈉、磷酸氫二鈉和聚乙二醇1000，得到葡聚糖水溶液。葡聚糖水溶液50°C減壓 濃縮至漿狀(固形物含量約50%)，冷凍干燥得到黑木耳葡聚糖粉末110. 7mg，純度為 86%。實(shí)施例310kg黑木耳粉末，加100kg水，煮至沸騰，并保持100°C 2小時(shí)，壓濾；濾渣再加 80kg水，煮至沸騰，并保持100°C 2小時(shí)，壓濾。合并兩次濾液，得到黑木耳多糖提取液。將 黑木耳多糖提取液真空濃縮至含固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)40% -50%，加10倍體積無水乙醇沉淀 多糖，過濾，沉淀物經(jīng)真空干燥，得到黑木耳多糖提物。此木耳多糖提物含葡聚糖約 6.9%,直接用于逆流色譜分離。本實(shí)施例的溶劑系統(tǒng)采用在25°C下的聚乙二醇1000飽和溶液，磷酸氫二鈉磷 酸二氫鈉=1 3，每1000毫升飽和液含鹽量80克；逆流色譜儀為HSCCC-D800高速逆流 色譜儀，黑木耳粗多糖中葡聚糖約占6.9%。量取蒸餾水10L，加入聚乙二醇1000 1. 2Kg，充分溶解后已經(jīng)達(dá)到飽和，分別加入 磷酸氫二鈉200g，磷酸二氫鈉600g，充分搖勻，靜置分層后，將上下兩相分別裝入試劑瓶。 將上相以lOml/min的流速注入高速逆流色譜的色譜柱。稱取黑木耳多糖粗提物3. Og溶于 60ml上相中制備逆流色譜樣品溶液，開啟逆流色譜儀至800rpm，然后以1. Oml/min的流速 輸入樣品溶液，待進(jìn)樣結(jié)束后，再以1. 5ml/min的流速輸入流動(dòng)相以洗脫柱內(nèi)的組分，用收 集器收集洗脫組分，應(yīng)用薄層色譜法檢測黑木耳多糖組分。收集逆流色譜分離的葡聚 糖組分，用截留分子量為20kDa的透析袋流水透析去除溶劑中的磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 和聚乙二醇1000，得到0 -葡聚糖水溶液。0 -葡聚糖水溶液50°C減壓濃縮至漿狀(固形 物含量約50% )，冷凍干燥得到黑木耳0 -葡聚糖粉末116. 7mg，純度為88%。黑木耳中的葡聚糖具有抗腫瘤、提高人體免疫力等生物活性，本發(fā)明的方案 提供了產(chǎn)品純度高、成本較低、效率高的從黑木耳中分離制備葡聚糖的方法。解決了現(xiàn) 有技術(shù)分離成本高，分離速度慢的問題，可以發(fā)展成大量制備的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)。
權(quán)利要求
從黑木耳中分離制備β-葡聚糖的方法，其特征在于以下步驟(1)采用沸水浸提黑木耳干粉中的多糖，得到黑木耳多糖提取液；(2)將黑木耳多糖提取液真空濃縮至含固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)40％-50％；(3)在上述濃縮液中加入5-10倍體積的無水乙醇，得到醇沉多糖，將其真空濃縮干燥，得到固體黑木耳多糖提物；(4)采用逆流色譜方法分離純化黑木耳多糖提取物；(5)收集逆流色譜分離的β-葡聚糖組分，用截留分子量為20kDa的透析袋流水透析去除溶劑中的磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和聚乙二醇1000，得到β-葡聚糖水溶液；(6)將β-葡聚糖水溶液真空濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60％以上，再采用冷凍干燥，得到純化的β-葡聚糖粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從黑木耳中分離制備葡聚糖的方法，其特征在于步驟(1) 所述的浸提過程是采用沸水浸提溶劑與黑木耳干粉的液料體積比為5 10 1，條件為 溫度100°C，浸提時(shí)間2小時(shí)，浸提次數(shù)2 3次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述從黑木耳中分離制備葡聚糖的方法，其特征在于步驟(2) 和步驟(3)所述真空濃縮的真空度低于0. 09Mpa，溫度為50 60°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述從黑木耳中分離制備葡聚糖的方法，其特征在于步驟(4) 所述逆流色譜方法為采用逆流色譜儀為分離設(shè)備，溶劑系統(tǒng)由常溫常壓下處于固體的聚 乙二醇1000、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和處于液體的水組成；先用水溶解聚乙二醇1000，使 溶液達(dá)到飽和，再添加磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉使聚乙二醇1000飽和溶液分層，磷酸二氫 鈉、磷酸氫二鈉的使用重量比為1 3 3 1 ；上相做固定相，下相做流動(dòng)相；用泵將上 述溶劑系統(tǒng)的上相注入逆流色譜儀的色譜柱，并取上述溶劑系統(tǒng)的部分上相溶解固體黑木 耳多糖提物制備逆流色譜樣品溶液；開啟逆流色譜儀和流動(dòng)相輸液泵，將樣品溶液和流動(dòng) 相輸入逆流色譜分離柱；部分收集器收集流出組分，用薄層層析的方法檢測各組分，并收集葡聚糖組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述從黑木耳中分離制備葡聚糖的方法，其特征在于步驟(4) 所述逆流色譜方法所用的逆流色譜儀為高速逆流色譜儀HSCCC。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述從黑木耳中分離制備葡聚糖的方法，其特征在于步驟(6) 所述冷凍干燥的真空度低于50Pa，溫度低于-35°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從黑木耳中分離制備β-葡聚糖的方法。采用沸水浸提黑木耳中的多糖；用醇沉法初步純化；以逆流色譜儀為分離設(shè)備分離純化黑木耳多糖精提物中的β-葡聚糖，其溶劑系統(tǒng)由常溫常壓下處于固體的聚乙二醇1000、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和處于液體的水組成。用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉使聚乙二醇1000飽和溶液分層，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉使用量比為1∶3～3∶1；用截留分子量為20kDa的透析袋流水透析后，得到β-葡聚糖水溶液，冷凍干燥獲其粉末。本發(fā)明的方案成本較低、分離效率較高，分離所得β-葡聚糖純度在86％以上。
文檔編號(hào)C08B37/02GK101798358SQ20101011623
公開日2010年8月11日 申請日期2010年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者宋廣磊, 杜琪珍 申請人:浙江工商大學(xué)