專利名稱：從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種從發(fā)酵液中分離純化Y-聚谷氨酸的方法。
背景技術(shù)：
γ -聚谷氨酸(Y -PGA)是一種由芽孢桿菌屬細(xì)菌分泌的一種胞外高分子聚合物，由L-或/和D-谷氨酸通過Y -聚谷酰鍵連接而成，其分子量一般在100 IOOOKDa之間，具 有優(yōu)良的水溶性、超強的吸附性和生物可降解性，降解產(chǎn)物為無公害的谷氨酸，是一種優(yōu)良 的環(huán)保型高分子材料，可作為保水劑、重金屬離子吸附劑、絮凝劑、緩釋劑以及藥物載體等， 在化妝品、環(huán)境保護(hù)、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、沙漠治理等產(chǎn)業(yè)均有很大的商業(yè)價值和社會價值。目前，Y-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法主要為微生物發(fā)酵法，通過菌種制備、種子培養(yǎng)、發(fā) 酵制得發(fā)酵液。發(fā)酵結(jié)束后，對發(fā)酵液進(jìn)行分離和提取精制，將發(fā)酵產(chǎn)物制成合乎要求的成 品。再經(jīng)過精確純化提取工藝，將發(fā)酵液的Y-聚谷氨酸提純程度優(yōu)化，以獲得高純度的 Y-聚谷氨酸產(chǎn)品。發(fā)酵液的純化過程一直是一項復(fù)雜而又困難的工作，基本過程包括除菌、沉淀、離 心等部分。一般采用有機溶劑沉淀后，通過離心、干燥得到產(chǎn)品。細(xì)胞通過離心從發(fā)酵液中 分離出來，包含Y _聚谷氨酸的上清液中加入若干倍體積的甲醇，放置過夜，沉淀物通過離 心收集，通過冷凍干燥得到初產(chǎn)品。初產(chǎn)品溶解在蒸餾水中，通過離心除去不溶性物質(zhì)，水 溶液中的Y-聚谷氨酸通過電滲透和冷凍干燥得到純度較高的Y-聚谷氨酸。上述純化方法存在凍干次數(shù)多的缺點，導(dǎo)致分離純化成本過高，而且Y _聚谷氨 酸產(chǎn)品得率不高，同時，甲醇使用也帶來一定的環(huán)保問題，對環(huán)境造成不利影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種從發(fā)酵液中分離純化Y-聚谷 氨酸的方法，其按以下步驟進(jìn)行(1) γ -聚谷氨酸發(fā)酵液用水稀釋2 3倍，調(diào)整pH值為2. 8 3. 2 ；(2)用高效板式密閉過濾機進(jìn)行過濾除菌，所用助濾劑為珍珠巖；(3)調(diào)整步驟2所得濾液pH值為6. 9 7. 3，用3倍體積乙醇進(jìn)行沉淀，在乙醇中 靜置170 190分鐘，脫去沉淀中的水分；(4)離心，分離出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下進(jìn)行減壓干燥，得聚谷氨酸粗
品 ；(5)用等體積的去離子水溶解步驟4所得γ-聚谷氨酸粗品，調(diào)整pH值為6.9 7. 1，加入蛋白酶保溫37°C保溫60分鐘，去除雜蛋白；(6)調(diào)整pH值為2. 9 3. 1，超濾去除色素及小分子雜質(zhì)；(7)調(diào)整pH值為6. 9 7. 1，乙醇沉淀，所得沉淀在0. 2Mpa下進(jìn)行減壓干燥，得高 純度Y-聚谷氨酸成品。
進(jìn)一步地，步驟(2)中過濾除菌所用的過濾膜孔徑為0. 2微米。步驟(3)中所述的pH值為6. 9 7. 1。步驟(5)中所述蛋白酶為效價為1000U/ml的工業(yè)蛋白酶制劑。步驟(6)中超濾壓力為0. 18Mpa。
獲取發(fā)酵液可采用常規(guī)方法，基本過程包括菌種制備、種子培養(yǎng)、發(fā)酵?？蛇x用工 程菌作為發(fā)酵使用菌，首先進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)，將保存在砂上管、冷凍干燥管或冰箱中處于 休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過茄子瓶或搖瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng)而 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種。發(fā)酵過程在無菌狀態(tài)下進(jìn)行，調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)和時間，發(fā)酵溫 度、酸堿度控制均按照大腸桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行，同時還需要加入碳源、氮源、谷氨酸添加 量、培養(yǎng)基成分等。本發(fā)明通過多步pH值調(diào)整、離心、沉淀和過濾來達(dá)到從發(fā)酵液中分離純化高純度 Y “聚谷氨酸的目的。通過PH值的精確控制來控制發(fā)酵液中各組分的分離參數(shù)，是本發(fā)明 分離Y-聚谷氨酸的關(guān)鍵因素。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點體現(xiàn)在下列幾個方面1、提取純度高，Y-聚谷氨酸的純度最高達(dá)99% ；2、得率高，通過多次控制發(fā)酵液的pH值、濃度等參數(shù)可以降低損失；3、成本低，所用試劑均可使用工業(yè)級別，有助于降低成本；4、有利于環(huán)境保護(hù)，所用試劑溫和、不會破壞環(huán)境。Y-聚谷氨酸純品具備良好的吸水性，可作為醫(yī)藥中間體、食品添加劑、化妝品原 料及農(nóng)業(yè)保水劑等。
具體實施例方式實施例1IOOmL Y -聚谷氨酸發(fā)酵液用水稀釋3倍，調(diào)整pH值為3. 0 ；用高效板式密閉過濾 機對稀釋后的發(fā)酵液進(jìn)行過濾除菌，所用助濾劑為珍珠巖，所用過濾膜孔徑為0. 2微米，得 濾液；調(diào)整上述濾液pH值為7. 1，用3倍體積乙醇進(jìn)行沉淀，在乙醇中靜置180分鐘，脫 去沉淀中的水分；離心，分離出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下進(jìn)行減壓干燥，得Y-聚谷氨酸 粗品；用等體積的去離子水溶解Y-聚谷氨酸粗品，調(diào)整PH值為7.0，加入28效價為 1000U/ml的工業(yè)蛋白酶制劑37°C保溫60分鐘，去除雜蛋白；調(diào)整pH值為3.0，超濾去除色 素及小分子雜質(zhì)；再調(diào)整PH值為7. 0，進(jìn)行乙醇沉淀，所得沉淀在0. 2Mpa下進(jìn)行減壓干燥， 得高純度Y “聚谷氨酸成品7. 3克。經(jīng)凝膠液相色譜峰面積分布法檢測，Y-聚谷氨酸的純度為97.0%，谷氨酸的轉(zhuǎn) 化率為80. 2% ο實施例2IOOmL γ -聚谷氨酸發(fā)酵液用水稀釋3倍，調(diào)整pH值為3. 2 ；用高效板式密閉過濾 機對稀釋后的發(fā)酵液進(jìn)行過濾除菌，所用助濾劑為珍珠巖，所用過濾膜孔徑為0. 2微米，得 濾液；
調(diào)整上述濾液pH值為7. 3，用3倍體積乙醇進(jìn)行沉淀，在乙醇中靜置180分鐘，脫 去沉淀中的水分；離心，分離出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下進(jìn)行減壓干燥，得聚谷氨酸 粗品；用等體積的去離子水溶解聚谷氨酸粗品，調(diào)整pH值為7. 1，加入2g效價為 1000U/ml的工業(yè)蛋白酶制劑37°C保溫60分鐘，去除雜蛋白；調(diào)整pH值為3. 1，超濾去除色 素及小分子雜質(zhì)；再調(diào)整PH值為7. 1，進(jìn)行乙醇沉淀，所得沉淀在0. 2Mpa下進(jìn)行減壓干燥， 得高純度、_聚谷氨酸成品5. 4克。經(jīng)凝膠液相色譜峰面積分布法檢測，聚谷氨酸的純度為90. 5%，谷氨酸的轉(zhuǎn) 化率為77.1%。實施例3100mL Y _聚谷氨酸發(fā)酵液用水稀釋3倍，調(diào)整pH值為3. 0 ；用高效板式密閉過濾 機對稀釋后的發(fā)酵液進(jìn)行過濾除菌，所用助濾劑為珍珠巖，所用過濾膜孔徑為0. 2微米，得 濾液；調(diào)整上述濾液pH值為7. 1，用3倍體積乙醇進(jìn)行沉淀，在乙醇中靜置170分鐘，脫 去沉淀中的水分；離心，分離出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下進(jìn)行減壓干燥，得聚谷氨酸 粗品；用等體積的去離子水溶解聚谷氨酸粗品，調(diào)整pH值為7.0，加入28效價為 1000U/ml的工業(yè)蛋白酶制劑37°C保溫60分鐘，去除雜蛋白；調(diào)整pH值為3.0，超濾去除色 素及小分子雜質(zhì)；再調(diào)整PH值為7. 0，進(jìn)行乙醇沉淀，所得沉淀在0. 2Mpa下進(jìn)行減壓干燥， 得高純度、_聚谷氨酸成品5. 2克。經(jīng)凝膠液相色譜峰面積分布法檢測，聚谷氨酸的純度為93. 2%，谷氨酸的轉(zhuǎn) 化率為71. 1%。實施例4100mL Y _聚谷氨酸發(fā)酵液用水稀釋3倍，調(diào)整pH值為2. 8 ；用高效板式密閉過濾 機對稀釋后的發(fā)酵液進(jìn)行過濾除菌，所用助濾劑為珍珠巖，所用過濾膜孔徑為0. 2微米，得 濾液；調(diào)整上述濾液pH值為6. 9，用3倍體積乙醇進(jìn)行沉淀，在乙醇中靜置170分鐘，脫 去沉淀中的水分；離心，分離出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下進(jìn)行減壓干燥，得聚谷氨酸 粗品；用等體積的去離子水溶解聚谷氨酸粗品，調(diào)整pH值為6.9，加入2g效價為 1000U/ml的工業(yè)蛋白酶制劑37°C保溫60分鐘，去除雜蛋白；調(diào)整pH值為3. 1，超濾去除色 素及小分子雜質(zhì)；再調(diào)整PH值為7. 1，進(jìn)行乙醇沉淀，所得沉淀在0. 2Mpa下進(jìn)行減壓干燥， 得高純度、_聚谷氨酸成品4. 8克。經(jīng)檢測(凝膠液相色譜峰面積分布法)，聚谷氨酸的純度為88.0%，谷氨酸的 轉(zhuǎn)化率(得率)為71.4%。以上對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，對本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而 言，依據(jù)本發(fā)明提供的思想，在本發(fā)明具體實施方式
和應(yīng)用范圍上均會有改變之處，這些改 變也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行(1)γ-聚谷氨酸發(fā)酵液用水稀釋2～3倍，調(diào)整pH值為2.8～3.2；(2)用高效板式密閉過濾機進(jìn)行過濾除菌，所用助濾劑為珍珠巖；(3)調(diào)整步驟(2)所得濾液pH值為6.9～7.3，用3倍體積乙醇進(jìn)行沉淀，在乙醇中靜置170～190分鐘，脫去沉淀中的水分；(4)離心，分離出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下進(jìn)行減壓干燥，得γ-聚谷氨酸粗品；(5)用等體積的去離子水溶解步驟(4)所得γ-聚谷氨酸粗品，調(diào)整pH值為6.9～7.1，加入蛋白酶37℃保溫60分鐘，去除雜蛋白；(6)調(diào)整pH值為2.9～3.1，超濾去除色素及小分子雜質(zhì)；(7)調(diào)整pH值為6.9～7.1，乙醇沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下進(jìn)行減壓干燥，得高純度γ-聚谷氨酸成品。
2.如權(quán)利要求1所述從發(fā)酵液中分離純化聚谷氨酸的方法，其特征在于，步驟(2) 中過濾除菌所用的過濾膜孔徑為0. 2微米。
3.如權(quán)利要求1所述從發(fā)酵液中分離純化聚谷氨酸的方法，其特征在于，步驟(3) 中所述的pH值為6. 9 7. 1。
4.如權(quán)利要求1所述從發(fā)酵液中分離純化聚谷氨酸的方法，其特征在于，步驟(5) 中所述蛋白酶為效價為1000U/ml的工業(yè)蛋白酶制劑。
5.如權(quán)利要求1所述從發(fā)酵液中分離純化聚谷氨酸的方法，其特征在于，步驟(6) 中超濾壓力為0. 18Mpa。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法，首先用水稀釋發(fā)酵液，調(diào)整pH值為2.8～3.2；經(jīng)過板式過濾除菌，調(diào)整濾液pH值為6.9～7.3，乙醇沉淀，脫去沉淀中的水分；離心，分離出沉淀，減壓干燥得γ-聚谷氨酸粗品；再溶解，調(diào)整pH值為6.9～7.1，加入蛋白酶保溫，去除雜蛋白；調(diào)整pH值為2.9～3.1，超濾去除色素及小分子雜質(zhì)；調(diào)整pH值為6.9～7.1，乙醇沉淀，減壓干燥，得高純度γ-聚谷氨酸成品。本發(fā)明通過多步pH值調(diào)整、離心、沉淀和過濾來達(dá)到從發(fā)酵液中分離純化高純度γ-聚谷氨酸的目的。本發(fā)明具有提取純度高、得率高、成本低和環(huán)保的優(yōu)點。
文檔編號C08G69/10GK101857673SQ20101018823
公開日2010年10月13日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者劉金明, 湯瑜, 王震, 黃云戰(zhàn) 申請人:杭州普濟(jì)醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司