專利名稱：一種可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高分子化學(xué)、藥學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種可降解的酸敏 感兩親性嵌段共聚物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，在正常和病理情形中都存在很多pH梯度。例如，腫瘤和發(fā)炎組織 的PH值(約6. 8)均比血液和正常組織(約7. 4)要稍微低一些。而且，雖然細胞的內(nèi)吞作用 通道開始都接近于7. 4的生理環(huán)境，但到內(nèi)酶體時pH降到了 5. 5飛.0，當?shù)竭_溶酶體時pH 還會降得更低，只有4. 5^5. 0。因此，pH反應(yīng)型系統(tǒng)已開始在藥物運輸載體中得到廣泛的應(yīng) 用。經(jīng)驗證，將抗癌藥物包裹或負載到合適的高分子量聚合物上能有效改善藥物的溶解性、 半衰期和靶向性。在這方面，特殊的嵌段共聚物系統(tǒng)——兩親性嵌段共聚物表面活性劑的超分子組 織有著獨一無二的優(yōu)勢。它們不僅涉及到包括微觀和納米結(jié)構(gòu)的新興領(lǐng)域，而且通過化學(xué) 修飾可以促使它們的自組裝具有更為特殊的應(yīng)用功能，例如對外在刺激(像溫度、壓力或PH 值等)作出反應(yīng)。其中，酸敏感的兩親性嵌段共聚物即是被研究和應(yīng)用得最多的一大類材 料。通常，它們利用“質(zhì)子化作用”使共聚物中不帶電荷的疏水段在低的PH值下變得親水， 從而刺激自組裝系統(tǒng)不穩(wěn)定甚至是解體。作為藥物載體，該自組裝體統(tǒng)的不穩(wěn)定或者解體 可以大大促進被負載藥物的釋放，對在目標區(qū)域或特定組織的定點釋放提供了一個不錯的 選擇。而且，在腫瘤細胞和炎癥組織中如同細胞中內(nèi)涵體和溶酶體中(PH5飛)一樣，都有一 個比較微弱的酸性環(huán)境，都能夠提供一個使藥物系統(tǒng)地從PH敏感性載體中釋放出來的潛 在刺激。當前，最受關(guān)注的仍然是聚電解質(zhì)和聚氨基酸。特別是聚氨基酸，由于其生物相容 性佳且可生物降解，并且一些氨基酸帶有活性側(cè)基可供進一步修飾(例如賴氨酸、谷氨酸、 天冬氨酸等)，作為生物醫(yī)用材料自然有著更加廣闊的前景。不過，一般是將無任何修飾的 聚氨基酸作為兩親共聚物中的親水段。經(jīng)驗證，親水性的聚氨基酸段確實能根據(jù)環(huán)境的改 變(如溫度，PH值，離子強度)折疊成很好定義的二級結(jié)構(gòu)，如a_螺旋狀，b-薄片狀或卷曲 狀。然而，親水的聚氨基酸發(fā)生折疊并不能很好地促進自組裝體系的分解，所以很有必要對 其進行進一步的修飾以達到質(zhì)子化作用下親疏水性的轉(zhuǎn)變。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有藥物中存在的溶解性差、半衰期短、靶向性不好的問 題，提供一種可促進負載的藥物的定點釋放的、可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物。本發(fā)明另一目的在于提供上述兩親性嵌段共聚物的制備方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述兩親性嵌段共聚物的應(yīng)用。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)
一種可降解的酸敏感納米藥物載體材料，其親疏水段分別由聚乙二醇和酸敏基團—— 二異丙基叔胺基側(cè)基修飾的聚氨基酸酸敏衍生物組成，對應(yīng)嵌段比為5 廣75，具有生物可 降解性和明顯的酸敏感性；所述酸敏基團二異丙基叔胺基來源于二異丙基乙醇胺，它經(jīng)羰 基二咪唑活化后與聚氨基酸段的活性側(cè)基反應(yīng)來實現(xiàn)鏈接和酸敏修飾，該基團在引入共聚 物中的聚氨基酸段側(cè)基后PKa值降到了 6. 3，十分符合人體內(nèi)微酸性環(huán)境的pH響應(yīng)范圍。為了成功地合成能在接近生理的微酸性環(huán)境下釋放治療分子的系統(tǒng)，就有必要找 出一套可行的聯(lián)接基團，而且它們能夠和許多官能團一起應(yīng)用，并且能對微弱的PH變化作 出反應(yīng)。故此，我們選擇了二異丙基叔胺基(Diisopropyltertiaryaminegroup，可簡寫為 DIP)作為酸響應(yīng)基團，其基礎(chǔ)分子——二異丙基乙醇胺的pKa值大于8且范圍很廣，但在接 入聚合物后由于受高分子鏈的長度和伸展狀況的影響，加之叔胺基接有異丙基大分子阻礙 基團，使得質(zhì)子在水溶液中不易與氨基接近，所以其堿性降低酸性增強，對應(yīng)的PKa值也會 降低。研究表明，接入后DIP的pKa值約為6. 3，符合人體內(nèi)微酸性環(huán)境的pH值范圍，十分 適合作為特定的酸敏感分子基團。此外，引入該基團鏈接的酯 鍵也是生物可降解的，保證了 整個體系的降解性。在側(cè)基接入DIP后，pH響應(yīng)的聚氨基酸段成為兩親性嵌段共聚物中一般情況下的 疏水段，常見的聚乙二醇(Polyethyeneglycol，可簡寫為PEG)則作為親水段。聚乙二醇在 數(shù)均分子量大于lOOOg/mol的情況下是無細胞毒性的，它中性、高親水，生物相容性良好， 不僅可以有效延長共聚物在體內(nèi)的循環(huán)時間，而且經(jīng)過細胞色素P450系統(tǒng)的氧化作用可 分解成小分子經(jīng)膽汁排泄，是一種理想的藥物載體接入材料。因而，該共聚物在中性或弱堿 性的水環(huán)境中會由于不同鏈段親疏水性的差異而發(fā)生自組裝，當總分子量在一定范圍內(nèi)時 組裝形成核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子(即膠束)，如果疏水段進一步延長還有可能形成具有水相內(nèi) 核的雙親分子彎曲閉合結(jié)構(gòu)(即囊泡)。在這個過程中可以同時包負疏水性藥物，囊泡還可 以將親水性藥物包負在其水相內(nèi)核當中，從而成為一種性能優(yōu)異的藥物載體。其適宜的酸 響應(yīng)性更能夠提供對藥物分子的智能控釋。自然，還可以在共聚物親水段(PEG段)的末端 引入靶向分子，在此基礎(chǔ)上衍生其載體分子系統(tǒng)的定點靶向功能。本發(fā)明中可降解的酸敏 感高分子納米藥物載體材料的研究得到了國家自然科學(xué)基金委海外青年學(xué)者合作研究基 金(原杰出青年基金B(yǎng)，20728403)的支持。作為一種優(yōu)選方案，所述聚乙二醇段的分子量必需大于lOOOg/mol以保證無細胞
毒性，而且有唯一的端胺基。作為一種優(yōu)選方案，所述酸敏基團為二異丙基叔胺基側(cè)基修飾的聚氨基酸酸敏衍 生物。作為一種優(yōu)選方案，所述聚氨基酸段的單體單元為帶有活性側(cè)基的L型氨基酸， 所述活性側(cè)基為胺基或羧基，所述L型氨基酸包括賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等。本發(fā)明兩親性嵌段共聚物的制備方法包括如下步驟將1摩爾份數(shù)三光氣與2. 5 摩爾份數(shù)帶有活性側(cè)基的L型氨基酸芐酯在徹底干燥無水的四氫呋喃中反應(yīng)制得相應(yīng)的 N-羧酸酐，然后根據(jù)預(yù)期共聚物嵌段比計算所得的用量以單端胺基PEG引發(fā)其開環(huán)聚合， 再經(jīng)脫芐基后鏈接CDI活化的二異丙基胺基乙醇反應(yīng)進行酸敏修飾，得到兩親性嵌段共聚 物。
作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法包括如下步驟將1摩爾份數(shù)三光氣與2. 5摩爾 份數(shù)帶有活性側(cè)基的L型氨基酸芐酯在徹底干燥無水的四氫呋喃中反應(yīng)制得相應(yīng)的N-羧 酸酐，然后以單端胺基PEG引發(fā)L型氨基酸芐酯的N-羧酸酐開環(huán)發(fā)生聚合，然后在氫溴酸 的冰醋酸溶液中進行酸脫保護以除去聚氨基酸段重復(fù)單元中的側(cè)芐基，接著與CDI活化的 二異丙基胺基乙醇反應(yīng)進行酸敏修飾，制得兩親性嵌段共聚物。本發(fā)明兩親性嵌段共聚物可在中性或弱堿性水中根據(jù)親疏水段的嵌段比自組裝 形成不同的納米粒子，形態(tài)結(jié)構(gòu)為膠束或囊泡，并在此過程中負載藥物。當環(huán)境PH值低于 其酸響應(yīng)值(即PKa值，約6. 3)時納米粒子開始出現(xiàn)膨脹并解體，被負載的藥物釋放速度加 快。本發(fā)明所設(shè)計的藥物載體材料由PEG與聚L型氨基酸的兩親性嵌段共聚物制成， 聚氨基酸段中的重復(fù)單元側(cè)基接有酸響應(yīng)基團DIP。其中PEG作為親水段能夠延長整個藥 物載體的血液循環(huán)時間，以避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)排泄出去；聚氨基酸段具有良好的鏈 柔順性、質(zhì)子響應(yīng)性、生物相容性和生物可降解性，由于鏈接的DIP基團可在質(zhì)子化作用下 完成疏水到親水的轉(zhuǎn)變。當親疏水段的嵌段比為5 廣40時，該共聚物在中性或弱堿性水中 更傾向于自組裝形成核殼結(jié)構(gòu)的膠束，PEG段組成膠束的水性外殼，聚氨基酸段則組成膠束 的疏水性內(nèi)核并可包負疏水性藥物。當親疏水段的嵌段比為1:壙15時，該共聚物在中性或 弱堿性水中更傾向于自組裝形成空心球形的囊泡，PEG段組成囊泡膜的內(nèi)外表層，聚氨基酸 段組成囊泡的疏水性膜本身并可包負疏水性藥物，閉合形成的水相內(nèi)核空間則可包負親水 性藥物。所述兩親性嵌段共聚物自組裝形成球形膠束時包覆的是疏水性藥物， 制備方法如下將5 10份共聚物與1份疏水性藥物共溶于1體積的二甲基亞砜 (dimethylsulfoxide，可簡寫為 DMS0)和四氫呋喃(Tetrahydrofuran，可簡寫為 THF) 1:1 的混合溶液中，在超聲作用下于冰浴中滴加到2. 5^10體積的水中，然后將該混合液裝入 MacrolOOO^HOOO的透析袋中在水中透析一至三天即得；對于酸敏感藥物(例如鹽酸阿霉 素，DoxorubicinHydrochloride，可簡寫為D0X)需在溶解時加1體積三乙胺保證其疏水性。所述兩親性嵌段共聚物自組裝形成囊泡時包覆的是親水性藥物，制備方法如下 將5 10份共聚物與1份親水性藥物加至1體積的水中，調(diào)節(jié)溶液的PH值至3、使共聚物完 全溶解，然后在超聲作用下于冰浴中滴加至20體積及以上中性或弱堿性(pH7、)的水中， 然后將該混合液裝入MacrolOOiTHOOO的透析袋中在pH7、的水中透析一至三天即得。該 方法還適用于包覆酸敏感藥物(例如D0X)的聚合物納米載藥膠束。制備過程中，還可以通過進一步酯化來提高疏水段的疏水性以及對疏水性藥物的 負載率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(1)本發(fā)明可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物載體材料由聚乙二醇與聚氨基酸衍生物 的兩親性共聚物制成，無毒且具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，而且PEG作為親水 段能夠延長藥物載體的血液循環(huán)時間；
(2)本發(fā)明可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物載體材料具有顯著的質(zhì)子響應(yīng)性，其pKa 值(約6. 3)處于體內(nèi)弱酸性生理環(huán)境的pH值范圍內(nèi)，適用于大部分有低pH值要求的部位 或組織；(3)本發(fā)明可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物載體材料在水中能夠自組裝形成納米級 膠束或囊泡，既可利用自組裝包負藥物，而且有利于該納米結(jié)構(gòu)在人體內(nèi)的細胞吸收和被 動聚集；
(4)本發(fā)明可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物載體材料所形成的納米結(jié)構(gòu)可以在質(zhì)子 濃度(即PH值)的影響下實現(xiàn)對藥物的智能控釋；
(5)本發(fā)明可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物載體材料還可以通過在PEG末端引入靶 向配體來實現(xiàn)藥物的定點靶向釋放；
(6 )本發(fā)明可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物載體材料模型還適用于類似結(jié)構(gòu)的兩親 性嵌段共聚物，特別是帶有側(cè)活性基團的醇酸或胺酸(例如蘋果酸)可代替聚氨基酸段中的 L型氨基酸單元。


圖1是實施例2. 1中PEG-聚(L-賴氨酸酸敏衍生物)A(可簡寫為PEG-P (LL-DIP)A，其中PEG段分子量為2000g/mol，含有44個重復(fù)單元；聚氨基酸段的分子量約為 14000g/mol,53個重復(fù)單元中有42個單元接入DIP基團)的酸堿滴定曲線。從該曲線 可以看出，PH8. 4附近有一個明顯的拐點，這個點即為對應(yīng)pKb值，由此計算得到聚合物 PEG-P (LL-DIP)A的pKa值約為5. 6，處于體內(nèi)弱酸性生理環(huán)境的pH值范圍內(nèi)；
圖2是實施例2. 2中PEG-聚(L-谷氨酸酸敏衍生物)A、B和C (可簡寫為 PEG-P (LGA-DIP) A、B和C，其中PEG段分子量約為1000g/mol，含有23個重復(fù)單元。A、B和C 聚氨基酸段的分子量分別為6700g/mOl、7400g/mOl和10500g/mol，A中27個重復(fù)單元里有 13個單元接入DIP基團，尚有2個單元未脫去保護芐基；B中21個重復(fù)單元里有20個單元 接入DIP基團；C中34個重復(fù)單元里有26個單元接入DIP基團)的酸堿滴定曲線；從與相 同濃度的NaCl溶液的滴定曲線的對此中可以看出，三種聚合物均表現(xiàn)出較好的緩沖能力， 在pH7飛處存在顯著的緩沖區(qū)，而且DIP基團的接枝率越高酸響應(yīng)越快；
圖3和圖4分別是實施例4. 1中PEG-P (LL-DIP) A載藥膠束在ρΗ4· 5、ρΗ5· 0、ρΗ6· 0和 ρΗ7. 4四個不同pH值下的粒徑分布圖(即動態(tài)光散射柱狀圖)和掃描電子顯微鏡圖片。其 中，從動態(tài)光散射柱狀圖可以看出，ΡΗ4. 5時載藥膠束的粒徑及強度都很小，說明膠束裂解， 基本無粒子存在；ΡΗ5. 0時膠束粒徑較大，主要分布在200至300nm之間，可能在較強酸性 下膠束粒子有裂解的趨勢，但沒有完全裂解，膠束處于比較松散的狀態(tài)，造成粒子粒徑變 大；pH7. 4時一部分粒徑集中在IOOnm左右，分散性較好，但另一部分則處于400至600nm之 間，可能是在弱堿性條件下粒子較小而表面張力較大，膠束發(fā)生聚集致使粒徑增大；PH6. 0 時粒徑分布則較寬，表明溶液pH值處于中間值既有一部分小粒子比較穩(wěn)定，也有一部分粒 子聚集或因酸性增強而膨脹使得粒徑增大。由此可知，膠束在當溶液的PH值低于時，膠束 粒子開始變得不穩(wěn)定，發(fā)生裂解，而弱堿性條件下則比較穩(wěn)定。同時，從掃描電子顯微鏡圖 片可以明顯地看出，PH4. 5時基本上無膠束粒子存在；pH5. 0時有少量球狀粒子，粒徑基本 在200nm左右；pH6. 0時相對球狀粒子增多，粒徑增大；pH7. 4時則可以明顯地看到大量聚 集的球狀粒子，粒徑基本小于80nm，與圖3中小粒徑少、大粒徑多的結(jié)果相吻合；
圖5是實施例4. 2中PEG-P (LGA-DIP) B載藥膠束在pH3. 0、pH5. 0和pH7. 0三個不同pH 值下的粒徑分布圖(即動態(tài)光散射柱狀圖)。從圖中可以看出，PH7.0時載藥膠束的粒徑集中于90nm左右，pH5. O時粒徑明顯增大到120nm左右，pH3. O時則出現(xiàn)更大幅度的粒徑增加，表明膠束開始發(fā)生裂解性出現(xiàn)再組裝，粒子強度開始降低；
圖6是實施例5. 1中PEG-P (LL-DIP) A載藥膠束在pH4. 5、pH5. 0、pH6. O和pH7. 4四個 不同pH值下DOX的體外釋放曲線。從圖中可以看出，pH4. 5時DOX的釋放速率遠遠大于其 他PH值，10小時釋放即達到50%，20天即達到95%以上。反之，pH7. 4時DOX基本上無釋放， 即使45天也只有約10%的藥物釋放出來。相對于以上兩種環(huán)境，pH5. 0時的釋藥速率相對 PH4. 5時低，但在短期內(nèi)也有很大的藥物釋放，20天達到70%以上，45天釋藥率接近80%， 而pH6. 0時只比pH7. 4稍高，長期釋放仍然較慢；
圖7是實施例5. 2中PEG-P (LGA-DIP) A和B載藥膠束在pH5. 0與pH7. 0的檸檬酸一； 磷酸鹽緩沖溶液中DOX的體外釋放曲線。其中，A和B兩種膠束在pH7.0時的釋放比較緩 慢，34天時釋放比率不超過20%，而在pH5. 0時釋放速率則明顯加快，A膠束在第16天達到 47%的釋放平衡，酸敏基團接枝率最高的B膠束在第8天即達到了 85%的釋放平衡，充分表 現(xiàn)了該材料的酸敏性。
具體實施例方式以下通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但實施例并不對本發(fā)明做 任何形式的限定。本發(fā)明提供了可生物降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物及其藥物載體的制備方法。 所得材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量采用核磁共振氫譜(可簡寫為1H-NMR)、紅外光譜(可簡寫為 IR)和元素分析儀來測定計算，所得納米結(jié)構(gòu)的大小和形態(tài)分別采用動態(tài)光散射和掃描電 子顯微鏡和磁強計來表征，其對藥物包負能力的大小和控釋行為則采用紫外可見分光光度 計來進行檢測。實施例1
可生物降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物的制備 1. IL型氨基酸芐酯的N-羧酸酐的制備
將10g(67mmol)L-賴氨酸芐酯真空干燥至少2小時后，于45°C下用IOOml干燥的四氫 呋喃溶解。另稱取5g三聚光氣固體用50ml干燥的四氫呋喃溶解，然后將該溶液緩慢滴加 至L-賴氨酸溶液中，充分攪拌直至澄清。所有操作均在干燥氬氣的保護下進行。停止加熱， 接通氬氣鼓泡至少2小時，以除去反應(yīng)生成的氯化氫和多余的光氣。將反應(yīng)液倒入過量的 無水石油醚中，充分搖振至有結(jié)晶析出，再于低溫下冷凍靜置兩天，經(jīng)抽濾和多次洗滌得白 色針狀結(jié)晶。所得產(chǎn)品真空干燥后充干燥氬氣冷凍保存，熔點99 102°C。(文獻值熔點 101 102°C )。同法適用于L-谷氨酸芐酯、L-天冬氨酸芐酯等N-羧酸酐的制備，并可在 乙酸乙酯-正己烷中進行重結(jié)晶以進一步純化。1. 2兩親性嵌段共聚物的制備
1. 2. IPEG-聚(L-賴氨酸芐酯)共聚物的制備
將2g單端胺基PEG (分子量2000g/mol)在60°C左右真空干燥至少2小時后溶于15ml 無水隊^二甲基甲酰胺(隊^0丨11^讓71偽1~11^1^(^，可簡寫為01^)中。另稱取17. 4gL-賴 氨酸芐酯N-羧酸酐(可簡寫為Lys (Z)-NCA)用IOml無水DMF溶解，在干燥的氬氣保護下， 將NH2-PEG-OH的DMF溶液轉(zhuǎn)入Lys (Z) - NCA溶液瓶中反應(yīng)三天。所得混合液與過量的無水乙醚中重沉淀，經(jīng)抽濾、洗滌和真空干燥得到淡黃色粘稠固體。1. 2. 2PEG-聚(L-谷氨酸芐酯)共聚物的制備
將約0. 54g單端胺基PEG(分子量lOOOg/mol)在60°C抽真空干燥2小時后溶于20ml新蒸的無水DMF于30°C攪拌溶解。另將6. 12gL-谷氨酸芐酯N-羧酸酐(可簡寫為BLG - NCA) 加20ml無水DMF溶解，并加熱至30°C。然后在干燥氬氣保護下兩種溶液混合并通大氣密封 攪拌至少10天。反應(yīng)結(jié)束后將混合液倒入過量的無水乙醚中進行重沉淀，經(jīng)過濾、無水乙 醚反復(fù)洗滌和真空干燥得到白色略黃粘稠固體產(chǎn)物。1. 2. 3PEG-聚(L-天冬氨酸芐酯)共聚物的制備
將0. 3265g單端胺基PEG(分子量770g/mol)加熱至60°C抽真空干燥2小時后溶于51ml 新蒸的無水二氯甲烷。另將3. 3815g6. 12gL-天冬氨酸芐酯N-羧酸酐(可簡寫為BLA-NCA) 加5. Iml無水DMF攪拌溶解。在干燥氬氣保護下，將兩種溶液混合并于35°C攪拌反應(yīng)27小 時。最后先旋發(fā)除去絕大部分二氯甲烷，再將混合液倒入過量的冷乙醚中重沉淀，經(jīng)抽濾和 反復(fù)洗滌，真空干燥得到最終產(chǎn)物。1. 3兩親性嵌段共聚物的脫保護
稱取4gPEG-聚(L-賴氨酸芐酯)共聚物用25ml冰醋酸溶解，然后緩慢滴加15mlHBr/ HAc溶液，反應(yīng)1小時。將反應(yīng)液倒入過量的無水乙醚中沉淀，經(jīng)抽濾、多次洗滌和真空干 燥得到淡黃色固體產(chǎn)物。同法適用于PEG-聚(L-谷氨酸芐酯)、PEG-聚(L-天冬氨酸芐酯) 等類似共聚物的脫保護。1. 4帶有DIP酸敏基團的兩親性嵌段共聚物的制備
1.4. 1⑶I活化的二異丙基乙醇胺的制備
稱取Ig⑶I溶于IOml干燥氯仿。另將lml2-二異丙基乙醇胺溶于IOml干燥氯仿中， 緩慢滴加至CDI溶液中。持續(xù)反應(yīng)2小時后將該反應(yīng)混合液用水萃取三次，經(jīng)無水硫酸鎂 干燥、過濾和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到黃色粘稠液體。1. 4. 2PEG-聚(L-氨基酸酸敏衍生物)共聚物的制備
將過量⑶I活化的二異丙基乙醇胺溶于3ml干燥DMSO中。另將650mgPEG_聚(L-賴 氨酸)溶于5ml干燥的DMSO中，用少量三乙胺將溶液的pH值調(diào)至9。然后將二異丙基乙醇 胺溶液在干燥的氬氣保護下緩慢滴加至PEG-聚(L-賴氨酸)溶液中，密閉反應(yīng)24小時。所 得反應(yīng)混合液倒入McrolOOO的透析袋中透析48小時，經(jīng)過濾和三次水洗離心凍干得到淡 黃色粉末狀固體。同法適用于PEG-聚(L-谷氨酸酸敏衍生物)、PEG-聚(L-天冬氨酸敏衍 生物)等類似共聚物的制備。1. 5PEG-聚(L-氨基酸酸敏衍生物)共聚物的酯化
將5gPEG-聚(L-谷氨酸酸敏衍生物)和6. 5gNaHC03用125mlDMS0攪拌溶解。在攪拌 過程中緩慢滴加22ml溴代乙烷，于45°C通大氣反應(yīng)5天。將反應(yīng)液倒入大量的冷水中進行 重沉淀，經(jīng)抽濾和三次水洗得到部分酯化的PEG-聚(L-谷氨酸酸敏衍生物)。相同條件操 作兩次，可得到酯化率接近100%的產(chǎn)物。同法適用于帶有側(cè)羧基的PEG-聚(L-天冬氨酸 敏衍生物)等類似共聚物的酯化。實施例2
酸敏感兩親性嵌段共聚物質(zhì)子響應(yīng)性的測定
2.IPEG-聚(L-賴氨酸酸敏衍生物)質(zhì)子響應(yīng)性的測定稱取約400mgPEG-P (LL-DIP) A溶于35ml去離子水中，將溶液調(diào)至pH9左右，用0. IMHCl 溶液進行酸堿滴定并記錄溶液PH值的變化，測試結(jié)果見圖1。2. 2PEG-聚(L-谷氨酸酸敏衍生物)質(zhì)子響應(yīng)性的測定
分別稱取16mgPEG-P(LGA-DIP)A、B和C溶于20ml去離子水中，將溶液調(diào)至pHll，用 0. IMHCl溶液進行酸堿滴定并記錄溶液pH值的變化，以相同濃度的NaCl溶液作為參比，測 試結(jié)果見圖2。實施例3
聚合物納米藥物載體的制備
3.IPEG-聚(L-賴氨酸酸敏衍生物)納米載藥膠束的制備
將25mgPEG-P (LL-DIP) A和5mgD0X溶于IOml去離子水中，用IMHCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH 值至4。待聚合物和藥物全部溶解后滴加少量三乙胺，迅速將pH值調(diào)到10左右。所得溶液 經(jīng)3500Da透析袋在水中透析兩天，凍干即得紅色載藥膠束。3. 2PEG-聚(L_谷氨酸酸敏衍生物)納米載藥膠束的制備
將IOmg共聚物與2mgD0X共溶于2mlDMS0/THFl 1的混合溶液中，另加Iml三乙胺保證 DOX的疏水化。然后在超聲作用下于冰浴中滴加到7ml水中，再將該混合液裝入McrolOOO 透析袋中在水中透析兩天即得。實施例4
聚合物納米藥物載體基本性能的測試
4.IPEG-聚(L-賴氨酸酸敏衍生物)納米載藥膠束大小及形態(tài)的測試
2mg凍干載藥膠束分別溶于10mlpH4. 5、ρΗ5· 0、ρΗ6· 0和ρΗ7· 4的磷酸鹽緩沖溶液 (phosphatebufferedsolution，可簡寫為PBS)中，其粒徑大小和分布采用動態(tài)光散射系統(tǒng) 進行測量，測試結(jié)果見圖3，而形態(tài)則通過掃描電子顯微鏡來觀察確定，測試結(jié)果見圖4。4. 2PEG-聚(L_谷氨酸酸敏衍生物)納米載藥膠束粒徑的測試
分別將所得的載藥膠束溶液用水進行適當稀釋后采用動態(tài)光散射法對其粒徑進行測 量PEG-P (LGA-DIP) A.B和C三種材料制成的載藥膠束的平均粒徑分別為61. 9nm、54. 9nm和 63. 2nm。此外，分別將3ml水加入三份5mlDIP接枝率最高的PEG-P (LGA-DIP) B載藥膠束溶 液中進行適當?shù)南♂?，然后通過PH計將溶液的pH值分別調(diào)節(jié)至3. 0,5. 0、和7. 0，其對應(yīng)的 粒徑大小和分布采用動態(tài)光散射系統(tǒng)進行測量，測試結(jié)果見圖5。實施例5
聚合物納米藥物載體包負量和釋藥行為的測定
5.IPEG-聚(L-賴氨酸酸敏衍生物)納米載藥膠束包負量和釋藥行為的測定
將1. 9mgPEG-P (LL-DIP) A凍干載藥膠束溶于10mlpH4PBS中，攪拌兩天后以相同酸度的 PBS溶液作對比，采用紫外可見分光光度計測定其480nm處的吸光度，由此計算出DOX的平 均負載率為3. 727%。另將一定量凍干載藥膠束分別溶于2. 5mlpH4. 5、pH5. 0、pH6. 0和pH7. 4的緩沖溶 液中并倒入MaCro3500透析袋內(nèi)，將透析袋分別置于37°C水平恒溫振蕩器內(nèi)的IOml對應(yīng) PBS溶液中。定時取出透析袋外部PBS溶液，同時補充新鮮的PBS溶液以維持外部溶液體積 不變。采用紫外可見分光光度計測定其波長480nm處的吸光度，按照對應(yīng)的DOX紫外吸收標準曲線計算每個時間段的藥物釋放量，由此作出載藥膠束的體外釋放曲線，測試結(jié)果見 圖6。5. 2PEG-聚(L_谷氨酸酸敏衍生物)納米載藥膠束包負量和釋藥行為的測定
將2ml膠束溶液凍干后溶于5mlDMS0/氯仿(可簡寫為CHC13) 1:1的混合溶液中，充分 溶解后采用紫外可見分光光度計測定其482. 5nm處的吸光度，由此計算出PEG-P(LGA-DIP) A、B和C三種材料制成的膠束中DOX的平均負載率分別為15. 97%,7. 81%和11. 65%。另將25ml所得的PEG-P (LGA-DIP) A、B膠束溶液分別倒入MacroHOOO透析袋內(nèi)， 將透析袋置于37°C恒溫搖床內(nèi)的75ml的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液(含pH5. 0和pH7. 0兩 種)中。定時取出透析袋外部緩沖溶液，同時補充新鮮的緩沖溶液以維持外部溶液體積不 變。采用紫外可見分光光度計測定其波長480nm處的吸光度，按照對應(yīng)的DOX紫外吸收標準 曲線計算每個時間段的藥物釋放量，由此作出載藥膠束的體外釋放曲線，測試結(jié)果見圖7。以上測試結(jié)果表明，所得的酸敏感兩親性嵌段共聚物載體材料具有顯著的酸敏感性，其質(zhì)子響應(yīng)值位于人體內(nèi)部微酸性環(huán)境的PH響應(yīng)范圍內(nèi)，在水中可自組裝形成納米級 分子組裝體系，根據(jù)親疏水段嵌段比的不同可以形成納米球形膠束或囊泡并能夠成功地包 負藥物。作為藥物載體，該分子組裝體系對藥物有較好的負載率，酸敏基團的接枝率越高越 容易實現(xiàn)微酸性環(huán)境中的藥物控制釋放。
權(quán)利要求
一種可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物，其特征在于所述共聚物的親疏水段分別由聚乙二醇和酸敏基團組成，對應(yīng)的嵌段比為5:1~75。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親性嵌段共聚物，其特征在于所述聚乙二醇的數(shù)均分子量 大于lOOOg/mol，且有唯一的端胺基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親性嵌段共聚物，其特征在于所述酸敏基團為二異丙基叔 胺基側(cè)基修飾的聚氨基酸酸敏衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的兩親性嵌段共聚物，其特征在于所述聚氨基酸段的單體單元 為帶有活性側(cè)基的L型氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的兩親性嵌段共聚物，其特征在于所述活性側(cè)基為胺基或羧基。
6.權(quán)利要求廣5中任意一條權(quán)利要求所述的兩親性嵌段共聚物的制備方法，其特征在 于包括如下步驟將1摩爾份數(shù)三光氣與2. 5摩爾份數(shù)帶有活性側(cè)基的L型氨基酸芐酯在 徹底干燥無水的四氫呋喃中反應(yīng)制得相應(yīng)的N-羧酸酐，然后根據(jù)預(yù)期共聚物嵌段比計算 所得的用量以單端胺基PEG引發(fā)其開環(huán)聚合，再經(jīng)脫芐基后鏈接CDI活化的二異丙基胺基 乙醇反應(yīng)進行酸敏修飾，得到兩親性嵌段共聚物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的兩親性嵌段共聚物的制備方法，其特征在于包括如下步驟 將三光氣與帶有活性側(cè)基的L型氨基酸芐酯在徹底干燥無水的四氫呋喃中反應(yīng)制得相應(yīng) 的N-羧酸酐，然后以單端胺基PEG引發(fā)L型氨基酸芐酯的N-羧酸酐開環(huán)發(fā)生聚合，然后在 氫溴酸的冰醋酸溶液中進行酸脫保護以除去聚氨基酸段重復(fù)單元中的側(cè)芐基，接著與CDI 活化的二異丙基胺基乙醇反應(yīng)進行酸敏修飾，制得兩親性嵌段共聚物。
8.權(quán)利要求廣5中任意一條權(quán)利要求所述的兩親性嵌段共聚物的應(yīng)用，其特征在于所 述高分子兩親性嵌段共聚物在水溶液中自組裝形成納米級的分子組裝結(jié)構(gòu)，根據(jù)親疏水段 嵌段比的不同組裝形成球形膠束或囊泡，并在自組裝過程中負載藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的兩親性嵌段共聚物的應(yīng)用，其特征在于所述兩親性嵌段共聚 物自組裝形成球形膠束時包覆的是疏水性藥物，制備方法如下將5 10份共聚物與1份疏 水性藥物共溶于1體積的二甲基亞砜和四氫呋喃1:1的混合溶液中，在超聲作用下于冰浴 中滴加到2. 5^10體積的水中，然后將該混合液裝入MacrolOOCTMOOO的透析袋中在水中透 析一至三天即得；對于酸敏感藥物需在溶解時加1體積三乙胺保證其疏水性。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的兩親性嵌段共聚物的應(yīng)用，其特征在于所述兩親性嵌段 共聚物自組裝形成囊泡時包覆的是親水性藥物，制備方法如下將5 10份共聚物與1 份親水性藥物加至1體積的水中，調(diào)節(jié)溶液的PH值至;T4使共聚物完全溶解，然后在 超聲作用下于冰浴中滴加至20體積及以上中性或弱堿性的水中，然后將該混合液裝入 Macrol00(Tl4000的透析袋中在pH7、的水中透析一至三天即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明兩親性嵌段共聚物的親疏水段分別由分子量大于1000的聚乙二醇和酸敏基團組成，對應(yīng)的嵌段比為5:1~75。本發(fā)明兩親性嵌段共聚物的制備方法是以單端胺基聚乙二醇引發(fā)帶有活性側(cè)基的L型氨基酸芐酯的N-羧酸酐開環(huán)聚合，經(jīng)脫芐基保護后再與活化的二異丙基胺基乙醇反應(yīng)以進行酸敏修飾，得到可降解的酸敏感兩親性嵌段共聚物。本發(fā)明共聚物具有良好的酸敏感性、生物相容性和生物可降解性，可在水溶液中自組裝并形成納米級的藥物載體，在靶向治療和診斷領(lǐng)域有著重大的研究價值和應(yīng)用前景。
文檔編號C08G69/40GK101831068SQ201010192970
公開日2010年9月15日 申請日期2010年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月7日
發(fā)明者帥心濤, 李皓, 李芬 申請人:中山大學(xué)