專利名稱：一種具有免疫增強活性的茶樹菇胞內(nèi)粗多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有免疫增強活性的茶樹菇胞內(nèi)粗多糖的制備方法。屬生物工程 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
茶樹菇屬擔子菌綱，糞銹傘科，田菇屬，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年來發(fā)展起 來的一種食用菌新品種。茶樹菇營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，含有人體必需的氨基酸，并且有 豐富的B族維生素和鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等礦質(zhì)元素。中醫(yī)認為該菇性平、甘溫、無毒，具有 較高的藥用價值，有清熱、平肝、明目、健脾的功效。其提取物多糖對小白鼠肉瘤S-180和艾 氏腹水癌的抑制率高達80-90%，是一種集營養(yǎng)、保健、理療于一身的綠色食品。研究表明， 茶樹菇深層發(fā)酵獲得的菌絲體所含的主要營養(yǎng)成分以及氨基酸與人工栽培的子實體相似。 為深層發(fā)酵茶樹菇產(chǎn)多糖提供了理論依據(jù)。目前，人們獲得真菌多糖的途徑主要是從真菌子實體提取而得，但隨著需求量的 增大，野生資源有限，人工栽培周期長且容易污染雜菌，受病蟲害侵蝕，而菌絲體培養(yǎng)周期 短，染菌少，故應(yīng)該探索在生物反應(yīng)器內(nèi)進行液體深層發(fā)酵以獲取胞內(nèi)多糖的途徑，為開辟 工業(yè)化液體深層發(fā)酵生產(chǎn)真菌多糖提供可靠依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有免疫增強活性的茶樹菇胞內(nèi)粗多糖的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為將茶樹菇子實體通過組織分離法接入固體斜面培養(yǎng)基上培 養(yǎng)，待長好后移至搖瓶種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的種子液接入搖瓶發(fā)酵液體培養(yǎng) 基培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，離心獲得濕菌絲體，勻漿，濕菌絲體經(jīng)過勻漿，熱水浸提，上清液濃縮， 乙醇沉淀，脫蛋白，脫色，透析后冷凍干燥得到茶樹菇胞內(nèi)粗多糖。本發(fā)明發(fā)明的茶樹菇胞內(nèi)粗多糖經(jīng)初步的研究確認，基本無毒，具有顯著的免疫 增強活性?？梢宰鳛樵蠎?yīng)用于保健食品等領(lǐng)域。具體來說，首先，我們發(fā)現(xiàn)市售茶樹菇可以經(jīng)過組織分離法在平板上長出菌絲體。 通過深層發(fā)酵獲得濕菌絲體經(jīng)過勻漿，熱水浸提，上清液濃縮，乙醇沉淀，脫蛋白，脫色，透 析后冷凍干燥得到茶樹菇胞內(nèi)粗多糖。由此奠定了以茶樹菇為原料通過深層發(fā)酵獲得胞內(nèi) 粗多糖的基礎(chǔ)。上述過程中，斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，搖瓶種子培養(yǎng)基為PDA1L加磷酸二氫 鉀lg，硫酸鎂0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，pH6. 0，發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉2g/100mL、酵母粉 0. 3g/100mL、磷酸二氫鉀 0. 2g/100mL、硫酸鎂 0. 05g/100mL,培養(yǎng)條件為起始 pH6. 0，250mL 三角瓶裝培養(yǎng)基100mL于25°C，150r/min，振蕩培養(yǎng)7d，多糖提取方法為將濕菌絲體勻漿， 熱水80°C -90°C浸提，加水量為4倍體積濕菌絲體，總提取時間為10h，提取3次，提取液濃 縮后加入3倍體積95%乙醇在4°C醇析，沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后Sevage法去除游離蛋白， H202脫色、蒸餾水透析，冷凍干燥后得到茶樹菇胞內(nèi)粗多糖。
具體實施例方式下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。實例一1.菌種培養(yǎng)出發(fā)菌種為市售茶樹菇(Agrocybe aegirit)；(1)組織分離法斜面培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基，含1. 5% 2. 0%瓊脂，pH自然；組織分離方法將子實體外表用酒精進行表面消毒后，放入超凈工作臺上，用消毒 過的刀片與鑷子切取菌柄與菌蓋交界處組織塊接入斜面培養(yǎng)基上，PH自然，置于25°C溫度 下暗培養(yǎng)，5d后菌絲開始萌發(fā)，每隔2d檢查1次，除去污染，選擇菌絲生長速度快和長勢強 的試管作為純母種；(2)搖瓶種子培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基PDA1L加磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg， pH6. 0 ；培養(yǎng)方法從斜面菌種中取3 4塊黃豆大小相同的菌塊，接種于搖瓶種子培養(yǎng)基 中，250mL三角瓶裝培養(yǎng)基100mL于25°C，150r/min，振蕩培養(yǎng)7d ；(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉2g/100mL、酵母粉0. 3g/100mL、磷酸二氫鉀0. 2g/100mL、硫酸 鎂 0.05g/100mL ；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的種子以15%的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中25°C，150r/ min,振蕩培養(yǎng)7d ；2.胞內(nèi)粗多糖的提取濕菌絲體經(jīng)過勻漿，熱水浸提，提取溫度80°C -90°C，加水量為4倍體積濕菌絲體， 總提取時間為10h，提取3次，提取液濃縮后加入3倍體積95%乙醇在4°C醇析。SOOOrpm離 心得沉淀物，沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后按多糖溶液1/5的體積加入氯仿，然后加入氯仿體積 1/5的正丁醇，混合后振蕩20min。蛋白質(zhì)與氯仿-正丁醇生成凝膠，4000rpm離心20min， 收集上清液，反復(fù)操作8次至氯仿-正丁醇層不渾濁為止。然后在上清液中加入95%乙醇 置4°C冰箱過夜，次日離心收集沉淀。沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后將5%的多糖溶液用NaOH調(diào) pH至9. 0，然后滴加20%的H202 (用量為多糖溶液體積的15% )，保持PH8. 0-9. 0，4h后終 止反應(yīng)，加入95%乙醇置4°C冰箱過夜，次日離心收集沉淀。沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后取50mL 裝入透析袋中，扎緊袋口，懸浮于蒸餾水中，透析48h，中間每隔12小時換水一次。冷凍干燥 后得到茶樹菇胞內(nèi)粗多糖。實例二對茶樹菇菌絲體樣品進行了氨基酸組成，單糖組成的測定，測定結(jié)果表明，茶樹 菇發(fā)酵菌絲體含有17種氨基酸，其總量為16. 441g/100g菌絲體干重，必需氨基酸總量為 6. 787g/100g菌絲體干重，占氨基酸總量的41. 28%,以谷氨酸和天冬氨酸含量最高。茶樹 菇菌絲體含有較高的Ca、Fe、Zn等人體易缺少的微量元素，有害重金屬元素的含量較少。該 多糖所含單糖以葡萄糖為主，用苯酚_硫酸法測得多糖含量為63. 4%。茶樹菇菌絲體氨基
4酸組成及含量見表1，茶樹菇菌絲體微量元素含量見表2，茶樹菇胞內(nèi)多糖主要單糖組成及 相對質(zhì)量分數(shù)見表3。 表1茶樹菇菌絲體氨基酸組成及含量 表2茶樹菇菌絲體微量元素含量
表3茶樹菇胞內(nèi)多糖主要單糖組成及相對質(zhì)量分數(shù)
實例三5
以健康昆明種小白鼠(雌雄各半，4周齡，體重18_22g，由無錫市惠山江南實驗動 物場提供批準號SCXK(蘇)2002-0006)20只，隨機分為2組空白對照組，發(fā)酵液多糖 試驗組?？瞻讓φ战M腹腔注射0. 5mL/只生理鹽水，發(fā)酵液多糖試驗組設(shè)兩個計量組，分別 腹腔注射100mg/kg和200mg/kg無菌生理鹽水稀釋的多糖溶液。給藥后，觀察小鼠72h內(nèi) 是否死亡，以及未來7d內(nèi)的進食情況和體重變化。小鼠腹腔注射發(fā)酵液多糖兩種劑量后，觀察一周。結(jié)果見表4和表5。多糖試驗 組，給藥后lh小鼠活動減少，4h后逐漸恢復(fù)正常活動，給藥后2d內(nèi)進食量比對照組少，以后 的5d內(nèi)小鼠食欲、精神、毛色均正常，7d后，脫頸處死，肉眼尸檢未見心、肝、脾、肺、腎、等主 要臟器病變和中毒現(xiàn)象。觀察期7d內(nèi)每日稱重，多糖試驗組小鼠的體重在給藥后2d內(nèi)下 降.說明這兩天小鼠的進食量減少，以后的5d內(nèi)，體重逐漸恢復(fù)并不斷增加，增長率超過空 白對照組。研究結(jié)果表明，在大劑量腹腔注射菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖的情況下，未出現(xiàn)小 鼠死亡，也未有明顯毒性反應(yīng)。說明茶樹菇胞內(nèi)多糖無毒性或毒性很小，其最大安全劑量在 200mg/kg 以上。表4胞內(nèi)多糖對小鼠體重的影響 實例四以健康昆明種小白鼠(雌雄各半，4周齡，體重18_22g，由無錫市惠山江南實驗動 物場提供批準號SCXK(蘇)2002-0006)25只，對所得到的胞內(nèi)多糖進行免疫增強功能 測試，所得結(jié)果見表6 9。表6茶樹菇胞內(nèi)多糖對小鼠吞噬細胞吞噬功能的影響
6 方差分析，P < 0. 01 ；與對照組比較P < 0. 01結(jié)果表明，用藥組小鼠的吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)與對照組比較均有不同程度增加。 說明茶樹菇胞內(nèi)多糖不僅能促進小鼠巨噬細胞增生，而且能激活吞噬活性，提高單核吞噬 細胞系統(tǒng)的吞噬功能。表7茶樹菇胞內(nèi)多糖對小鼠抗菌活力的影響 方差分析，P < 0. 01 ；與對照組比較P < 0. 01 ；不同劑量組間比較P < 0. 01由表7結(jié)果可知，各劑量組與空白對照組比較，均有顯著性差異，茶樹菇胞內(nèi)多糖 能提高小鼠抗菌活力。各劑量組之間比較也有顯著性差異，其中中劑量組更能有效提高小 鼠抗菌活力。表8茶樹菇胞內(nèi)多糖對小鼠血清溶血素的影響 方差分析，P < 0. 01 ；與對照組比較P < 0. 01溶血素(IgM)是反映體液免疫功能狀況的一種方法，如果用藥后溶血素生成增 多，則出現(xiàn)紅細胞溶血時的吸光度值增高，表明用藥后機體的體液免疫作用增強。由表8結(jié) 果可知，各劑量組與空白對照組比較，均有顯著性差異(P< 0.01)，這說明，茶樹菇胞內(nèi)多 糖對血清溶血素(IgM)的生成都有十分明顯的影響，表現(xiàn)出較好的體液免疫增強作用。表9茶樹菇胞內(nèi)多糖對小鼠血清溶菌酶活性的影響 方差分析，P < 0. 01 ；與對照組比較P < 0. 01 ；不同劑量組間比較P < 0. 05結(jié)果表明，茶樹菇胞內(nèi)多糖對小鼠血清溶菌酶活性的影響與對照組比較均有顯著 性差異，各劑量組之間也有差異且劑量越高，越能增強小鼠血清溶菌酶活性。
權(quán)利要求
一種具有免疫增強活性的茶樹菇胞內(nèi)粗多糖，其特征在于外觀為白色粉末，是茶樹菇通過深層發(fā)酵獲得的濕菌絲體經(jīng)過勻漿，熱水浸提，離心，上清液濃縮，乙醇沉淀，脫蛋白，脫色，透析后冷凍干燥得到的。無毒，具有顯著的免疫增強活性；茶樹菇發(fā)酵菌絲體含有17種氨基酸，其總量為16.441g/100g菌絲體干重，必需氨基酸總量為6.787g/100g菌絲體干重，占氨基酸總量的41.28％，以谷氨酸和天冬氨酸含量最高；茶樹菇菌絲體含有較高的Ca、Fe、Zn等人體易缺少的微量元素，有害重金屬元素的含量較少；該多糖所含單糖以葡萄糖為主，用苯酚-硫酸法測得多糖含量為63.4％。
2.權(quán)利要求1所述的茶樹菇胞外多糖的制備方法。該方法由下列步驟組成(1)菌種培養(yǎng)出發(fā)菌種為市售茶樹菇(Agrocybe aegirit)；①組織分離法斜面培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基，含1. 5% 2. 0%瓊脂，pH自然；組織分離方法將子實體外 表用酒精進行表面消毒后，放入超凈工作臺上，用消毒過的刀片與鑷子切取菌柄與菌蓋交 界處組織塊接入斜面培養(yǎng)基上，PH自然，置于25°C溫度下暗培養(yǎng)，5d后菌絲開始萌發(fā)，每隔 2d檢查1次，除去污染，選擇菌絲生長速度快和長勢強的試管作為純母種；②搖瓶種子培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基:PDA1L加磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，pH6. 0 ；培養(yǎng)方法從斜面菌種中取3 4塊黃豆大小相同的菌塊，接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中， 250mL三角瓶裝培養(yǎng)基100mL于25°C，150r/min,振蕩培養(yǎng)7d ；③搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉2g/100mL、酵母粉0. 3g/100mL、磷酸二氫鉀0. 2g/100mL、硫酸鎂 0.05g/100mL ；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的種子以15%的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中25°C，150r/min， 振蕩培養(yǎng)7d ；(2)胞內(nèi)粗多糖的提取濕菌絲體勻漿，熱水80°C-90°C浸提，加水量為4倍體積濕菌絲體，總提取時間為10h， 提取3次，提取液濃縮后加入3倍體積95%乙醇在4°C醇析，沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后Sevage 法去除游離蛋白，H202脫色、蒸餾水透析，冷凍干燥后得到茶樹菇胞內(nèi)粗多糖。
3.如權(quán)利要求2所述的茶樹菇胞內(nèi)多糖的制備方法，其特征在于所述的Sevage法去除 游離蛋白是按多糖溶液1/5的體積加入氯仿，然后加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合后振蕩 20mi ；蛋白質(zhì)與氯仿-正丁醇生成凝膠，4000rpm離心20min，收集上清液，反復(fù)操作8次至 氯仿-正丁醇層不渾濁為止。
4.如權(quán)利要求2所述的茶樹菇胞內(nèi)多糖的制備方法，其特征在于所述的H202脫色是將 5%的多糖溶液用NaOH調(diào)pH至9. 0，然后滴加20%的H202 (用量為多糖溶液體積的15% )， 保持PH8. 0-9. 0，4h后終止反應(yīng)，加入95%乙醇置4°C冰箱過夜，次日離心收集沉淀。
5.如權(quán)利要求2所述的茶樹菇胞內(nèi)多糖的制備方法，其特征在于所述的透析是指4°C 醇析過夜后的離心沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后取50mL裝入透析袋中，扎緊袋口，懸浮于蒸餾水 中，透析48h，中間每隔12小時換水一次。
6.權(quán)利要求1所述的胞內(nèi)多糖具有免疫增強功能。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有免疫增強活性的茶樹菇胞內(nèi)粗多糖的制備方法。該茶樹菇胞內(nèi)粗多糖為白色粉末，是茶樹菇通過深層發(fā)酵獲得的濕菌絲體經(jīng)過勻漿，熱水浸提，離心，上清液濃縮，乙醇沉淀，脫蛋白，脫色，透析后冷凍干燥得到的。茶樹菇發(fā)酵菌絲體含有17種氨基酸，其總量為16.441g/100g菌絲體干重，必需氨基酸總量為6.787g/100g菌絲體干重，占氨基酸總量的41.28％，以谷氨酸和天冬氨酸含量最高。茶樹菇菌絲體含有較高的Ca、Fe、Zn等人體易缺少的微量元素，有害重金屬元素的含量較少。該多糖所含單糖以葡萄糖為主，用苯酚-硫酸法測得多糖含量為63.4％。具有免疫增強活性，可應(yīng)用于制備具有增強免疫力，抗疲勞功能的保健品。
文檔編號C08B37/00GK101856372SQ20101019544
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月9日
發(fā)明者鄧超, 鄔敏辰, 陳敬華 申請人:江南大學