專利名稱：水溶性殼聚糖西弗堿衍生物及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水溶性殼聚糖西弗堿衍生物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
殼聚糖是甲克素脫乙酰化后的一種天然的生物高分子多糖，來源豐富，僅次于木 質(zhì)素。它含有大量的游離氨基，這一特性使之成為自然界中位數(shù)不多的帶正電荷的生物高 分子，也賦予了它獨特的生物活性。殼聚糖無毒性，具有良好的生物相容性，抑菌性，可降解 性、促進傷口愈合能力等等。在醫(yī)療保健、農(nóng)業(yè)、化工等行業(yè)具有很大的價值。但是強烈的 分子內(nèi)氫鍵導(dǎo)致分子量大于5000的殼聚糖難以溶于水，只能溶于烯酸溶液中，這大大限制 了殼聚糖的應(yīng)用。然而殼聚糖分子中具有氨基和羥基，可以對特定部位進行化學(xué)修飾，通過在重復(fù) 單元中引入基團，就可以大大削弱殼聚糖分子內(nèi)的氫鍵作用，增加它的溶解性，從而拓寬其 應(yīng)用范圍并賦予其新的功能。業(yè)界公認的能較好地修飾得到水溶性殼聚糖的方法有以下幾 種酰化，羧甲基化，磺化，季胺化，醚化等等。水溶性殼聚糖是殼聚糖衍生物中一種非常重要的衍生物，除了賦予殼聚糖良好的 溶解性之外，還可以作為一種重要的中間體。目前水溶性殼聚糖作為一種非常具有應(yīng)用價 值的生物材料，已經(jīng)在食品、化工及醫(yī)藥行業(yè)作為輔料直接使用(1)羧甲基殼聚糖具有較好的抑菌性和保濕性等特點，主要應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝 品領(lǐng)域中。(2)季胺化殼聚糖修飾率0. 45以上的衍生物都具有良好的水溶性，還具有良好 的抑菌性和螯合金屬的能力，主要用于環(huán)境保護和日用品中。(3)磺化殼聚糖低分子量的磺化殼聚糖具有凝血作用，現(xiàn)已應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，但 是磺化殼聚糖不具有清除DPPH自由基的能力。(4)?；瘹ぞ厶且阴；?0%左右的殼聚糖具有良好的水溶性，此類物質(zhì)的應(yīng)用 領(lǐng)域現(xiàn)在開發(fā)的比較少，主要作為農(nóng)業(yè)土壤改良劑或者作為食品領(lǐng)域中的增稠劑，但是與 原料殼聚糖相比，其抗DPPH自由基的能力更弱。然而現(xiàn)有的化學(xué)修飾原料殼聚糖的方法都多多少少在過程中使用到了有毒的有 機試劑、催化劑等等，給殼聚糖衍生物的安全使用帶來了隱患。所以本發(fā)明的初衷在于找到 一條安全、綠色的反應(yīng)路線，同時具備能夠低成本、大規(guī)模地生產(chǎn)水溶性殼聚糖能力。同時， 我們考慮到影響人類身體健康的主要因素之一是從體內(nèi)和環(huán)境中的有害自由基的增加開 始的，所以研究開發(fā)具有抗氧化活性等能力的安全無毒的殼聚糖衍生物，對于減緩衰老、增 進人類健康具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題在于提供一種新型的水溶性殼聚糖衍生物，該水 溶性殼聚糖衍生物在溶液中具有良好的溶解性，在保留一定的抑菌活性的同時還具有DPPH自由基清除能力。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種水溶性殼聚糖西弗堿衍生物，是由殼聚糖和還原糖經(jīng)西弗堿反應(yīng)制得；所述 殼聚糖的平均分子量為5000D 1000000D ；所述殼聚糖西弗堿衍生物的結(jié)構(gòu)如式(I)所
示式(I)中，R為還原糖形成的結(jié)構(gòu)式；χ、y、ζ代表聚合度，即分子鏈中相應(yīng)結(jié)構(gòu)單 元數(shù)，其中 x/ (x+y) = 0. 3 0. 99 ；z/(x+y) = 0. 1 0. 99。進一步，本發(fā)明所述的還原糖優(yōu)選下列之一果糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、鼠李糖、 阿拉伯糖、甘露糖。本發(fā)明更優(yōu)選的還原糖為果糖、乳糖或甘露糖。本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題在于提供一種安全、綠色、簡單、成本低廉、能夠 大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物的制備方法。為解決第二個技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種水溶性殼聚糖西弗堿衍生物的制備方法，包括如下步驟取原料殼聚糖溶于 質(zhì)量百分比為0. 5 20. 0%的酸溶液中，加入還原糖在溫度為20 120°C、壓力為1 5大 氣壓的條件下充分攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物透析除去雜質(zhì)，濃縮后經(jīng)冷凍干燥或者真空 干燥即得到所述的殼聚糖西弗堿衍生物；所述的殼聚糖的平均分子量為5000 1000000， 殼聚糖的脫乙酰度為30 99%。進一步，所述的殼聚糖以其中含有的氨基摩爾數(shù)計與所述還原性糖的投料摩爾比 為1 0. 5 100. 0，優(yōu)選為1 1 3。進一步，所述的酸溶液中的酸為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、鹽酸、硝酸、硫酸或磷酸， 優(yōu)選乙酸。進一步，優(yōu)選反應(yīng)溫度為40 80°C ；優(yōu)選反應(yīng)壓力為1大氣壓。本發(fā)明在420nm波長下紫外分光光度計測定反應(yīng)程度，反應(yīng)時間一般在48 96 小時。本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題在于提供所述的殼聚糖西弗堿衍生物的兩種應(yīng) 用，即所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物作為抑菌劑和抗氧化劑的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在如下方法A)本發(fā)明所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物是一種重要的殼聚糖衍生物，在pH 1 13的溶液中具有良好的溶解性，保留了一定的抑菌活性的同時還具有DPPH自由基清除 能力，可以作為食品保鮮劑、抑菌劑，也可以作為化妝品和護膚品的具有抗氧化活性的添加劑以及天然的染料。B)安全、綠色、簡單、成本低廉能夠大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn) 具體實施例方式下面以具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限 于此
實施例1 取3g脫乙酰度為0. 96的原料殼聚糖(分子量100000D)溶于2% (重量百分比， 下同)的醋酸溶液中，充分溶解后加入3. 3g甘露糖，于一個大氣壓、60°C充分攪拌反應(yīng)48 小時，在420nm波長下測定其反應(yīng)程度(取反應(yīng)不同時間的反應(yīng)液，通過0. 45 μ m的濾膜后 稀釋4倍，置于玻璃比色皿中測420nm波長下的吸收值)。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物透析除去雜質(zhì)， 濃縮至原體積1/3后冷凍干燥或者真空干燥即得到所需的殼聚糖西弗堿衍生物。用酸堿滴定或者膠體滴定的方式確定其修飾率為35%，用H NMR和IR確定其結(jié) 構(gòu)。1H NMR(D2O) δ = 1. 96 (NHCOCH3) ； δ = 2. 84 (Η2) ； δ = 4. 5，3. 46-3. 77 (殼聚糖骨架 Η1，Η3，Η4，Η5，Η6 以及接枝的甘露糖上的 H)。IR :3430cm_1 和 2930cm-1 (-NH, -OH and-CH-的 伸縮振動)，1635cm-1 (西弗堿C = N), 1384cm—1 (酰胺III帶)，1156cm-1 (殼聚糖重復(fù)單元間 的C-0-C)，1073和1033CHT1 (殼聚糖骨架上的C-O伸縮振動)。衍生物抑菌圈直徑列于表1 中。實施例2:取Ig脫乙酰度為0. 90的原料殼聚糖(分子量100000D)溶于1. 2% (重量百分 比，下同)的醋酸溶液中，充分溶解后加入1. Ig果糖，于一個大氣壓、70°c充分攪拌反應(yīng)96 小時，在420nm波長下測定其反應(yīng)程度(取反應(yīng)不同時間的反應(yīng)液，通過0. 45 μ m的濾膜后 稀釋4倍，置于玻璃比色皿中測420nm波長下的吸收值)。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物透析除去雜質(zhì)， 濃縮至原體積1/3后冷凍干燥或者真空干燥即得到所需的殼聚糖西弗堿衍生物。用酸堿滴定或者膠體滴定的方式確定其修飾率為48%，用H NMR和IR確定其結(jié) 構(gòu)。1H NMR(D2O) δ = 1. 96 (NHCOCH3) ； δ = 2. 84 (Η2) ； δ = 4. 5，3. 46-3. 77 (殼聚糖骨架 Hl, Η3, Η4, Η5, Η6 以及接枝的果糖上的 H)。IR :3430cm_1 和 2930cm-1 (-NH, -OH and-CH-的 伸縮振動)，1635cm-1 (西弗堿C = N), 1384cm—1 (酰胺III帶)，1156cm-1 (殼聚糖重復(fù)單元間 的C-0-C)，1073和1033cm—1 (殼聚糖骨架上的C-O伸縮振動)。衍生物的抑菌圈直徑列于 表1中，DPPH自由基的半清除濃度列于表2中，溶解度列于表3中。實施例3 取300g脫乙酰度為0. 90的原料殼聚糖(分子量100000D)溶于1. 14% (重量百 分比，下同)的醋酸溶液中，充分溶解后加入330g乳糖，于一個大氣壓、70°C充分攪拌反應(yīng) 96小時，在420nm波長下測定其反應(yīng)程度(取反應(yīng)不同時間的反應(yīng)液，通過0. 45 μ m的濾膜 后稀釋4倍，置于玻璃比色皿中測420nm波長下的吸收值)。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物透析除去雜 質(zhì)，濃縮至原體積1/3后冷凍干燥或者真空干燥即得到所需的殼聚糖西弗堿衍生物。用酸堿滴定或者膠體滴定的方式確定其修飾率為56%，用H NMR和IR確定其結(jié) 構(gòu)。1H NMR(D2O) δ = 1. 96 (NHCOCH3) ； δ = 2. 84 (Η2) ； δ = 4. 5，3. 46-3. 77 (殼聚糖骨架 Hl, Η3, Η4, Η5, Η6 以及接枝的乳糖上的 H)。IR :3430cm_1 和 2930cm-1 (-NH, -OH and-CH-的伸縮振動)，1635cm-1 (西弗堿C = N), 1384cm—1 (酰胺III帶)，1156cm-1 (殼聚糖重復(fù)單元間的C-0-C)，1073和1033cm—1 (殼聚糖骨架上的C-O伸縮振動)。衍生物的抑菌圈直徑列于 表1中，DPPH自由基的半清除濃度列于表2中，溶解度列于表3中。實施例4 取IOOg脫乙酰度為0. 90的原料殼聚糖(分子量100000D)溶于1 % (重量百分 比，下同)的醋酸溶液中，充分溶解后加入IlOg麥芽糖，于一個大氣壓、60°C充分攪拌反應(yīng) 24小時，在420nm波長下測定其反應(yīng)程度(取反應(yīng)不同時間的反應(yīng)液，通過0. 45 μ m的濾膜 后稀釋4倍，置于玻璃比色皿中測420nm波長下的吸收值)。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物透析除去雜 質(zhì)，濃縮至原體積1/3后冷凍干燥或者真空干燥即得到所需的殼聚糖西弗堿衍生物。用酸堿滴定或者膠體滴定的方式確定其修飾率為23%，用H NMR和IR確定其結(jié) 構(gòu)。1H NMR(D2O) δ = 1. 96 (NHCOCH3) ； δ = 2. 84 (Η2) ； δ = 4. 5，3. 46-3. 77 (殼聚糖骨架 Η1，Η3，Η4，Η5，Η6 以及接枝的麥芽糖上的 H)。IR :3430cm_1 和 2930cm-1 (-NH, -OH and-CH-的 伸縮振動)，1635cm-1 (西弗堿C = N), 1384cm—1 (酰胺III帶)，1156cm-1 (殼聚糖重復(fù)單元間 的C-0-C)，1073和1033CHT1 (殼聚糖骨架上的C-O伸縮振動)。衍生物抑菌圈直徑列于表1 中，溶解度列于表3中。實施列5 我們對實施例2和實施例3制得的殼聚糖衍生物進行了體外對二苯代苦味?；?由基(DPPH ·)清除能力的測定實驗。試劑二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)購自上海百靈威公司，其余試劑均為國產(chǎn) 分析純。方法稱取一定量水溶性殼聚糖西弗堿衍生物樣品放入試管中，分別加入一定體 積的水溶液溶解，配得藥物母液濃度為2mg/mL，以此溶液配成藥物濃度為0. 2,0. 4,0. 6、 0. 8、1.0、1.5、2. Omg/mL的溶液。加各濃度的樣品溶液100 μ L和0. lmmol/L DPPH溶液 100 μ L于96孔板中(樣品實際反應(yīng)濃度為50 μ g/mL、16. 7 μ g/mL、5. 6 μ g/mL)，每份設(shè)5個 平行。樣品加入后中速振蕩30s，在室溫(25°C)和517nm波長下測定其吸光值(Ap)；室溫下 放置20min后再測定依次；同時測定不加DPPH的樣品空白吸收光(A。 100 μ L樣品+100 μ L 甲醇)和加DPPH但不加樣品的吸光值(Amax =IOOyL DPPH+100 μ L甲醇)。U 100 μ g/mLVc 作為對照測定抑制率(IR% )。部分結(jié)果列于表2中。從實驗結(jié)果看，殼聚糖西弗堿衍生物由于含有大量的-OH 而具有良好的清除DPPH自由基的能力。原理二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其 醇溶液呈深紫色，在517nm處有一吸收峰。當反應(yīng)系統(tǒng)中存在自由基清除劑時，它可以和 DPPH ·的單電子配對而使517nm處的吸收峰漸漸消退，而且這種顏色變淺的程度與配對電 子數(shù)成化學(xué)計量關(guān)系。因此根據(jù)消退速度和峰值改變程度可以用來檢測自由基的清除情 況，從而評價試驗樣品的抗氧化能力。與其它方法相比用DPPH ·篩選自由基清除劑具有簡 便，快速的優(yōu)點。實施列6 我們對實施列1、2、3、4制得的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物進行了抑菌能力的測
定實驗。
試驗菌大腸桿菌(Escherichi a coli，Ε. coli)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus, S. aureus)，由本系微生物實驗室提供。菌種的活化將受試菌接種于50mL液體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中，37°C 100r/min搖 床培養(yǎng)過夜。用稀釋平板計數(shù)法計數(shù)，制得CFU為IO7個/mL的菌懸液備用。
取0. ImL CFU為107個/mL的菌懸液涂布于LB培養(yǎng)皿上，取Φ IOmm的牛津杯放 置于培養(yǎng)皿上，在牛津杯中加入0. 2ml的衍生物的0. 6%乙酸溶液，每板2個牛津杯，37°C培 養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后測抑菌圈直徑。數(shù)據(jù)列于表1中。對比例1 取抗壞血酸進行比較，DPPH半清除濃度列于表2中。對比例2 取原料殼聚糖進行比較，DPPH半清除濃度列于表2中，溶解度列于表3 中。表 權(quán)利要求
一種水溶性殼聚糖西弗堿衍生物，其特征在于所述殼聚糖西弗堿衍生物是由殼聚糖和還原糖經(jīng)西弗堿反應(yīng)制得；所述殼聚糖的平均分子量為5000D～1000000D；所述殼聚糖西弗堿衍生物的結(jié)構(gòu)如式(I)所示式(I)中，R為還原糖形成的結(jié)構(gòu)式；x、y、z表示聚合度，其中x/(x+y)＝0.3～0.99，z/(x+y)＝0.1～0.99。FDA0000022690430000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物，其特征在于所述的還原糖選自 下列之一果糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖。
3.—種如權(quán)利要求1所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物的制備方法，其特征在于所述 制備方法為取原料殼聚糖溶于質(zhì)量百分比為0. 5 20. 0%的酸溶液中，加入還原糖在溫 度為20 120°C、壓力為1 5大氣壓的條件下充分攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物透析除去雜 質(zhì)，濃縮后經(jīng)冷凍干燥或者真空干燥即得到所述的殼聚糖西弗堿衍生物；所述的殼聚糖的 平均分子量為5000D 1000000D，殼聚糖的脫乙酰度為30 99%。
4.如權(quán)利要求3所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物的制備方法，其特征在于所述的 殼聚糖以其中含有的氨基摩爾數(shù)計與所述還原性糖的投料摩爾比為1 0.5 100.0。
5.如權(quán)利要求3所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物的制備方法，其特征在于所述的 殼聚糖以其中含有的氨基摩爾數(shù)計與所述還原性糖的投料摩爾比為1 3 1。
6.如權(quán)利要求3所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物的制備方法，其特征在于所述的 酸為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、鹽酸、硝酸、硫酸或磷酸。
7.如權(quán)利要求3所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物的制備方法，其特征在于所述反 應(yīng)在40 80°C的溫度條件下進行。
8.如權(quán)利要求3所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物的制備方法，其特征在于所述反 應(yīng)在1大氣壓的壓力條件下進行。
9.如權(quán)利要求1所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物作為抑菌劑的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求1所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物作為抗氧化劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水溶性殼聚糖西弗堿衍生物及其制備和應(yīng)用，所述殼聚糖西弗堿衍生物是由殼聚糖和還原糖經(jīng)西弗堿反應(yīng)制得；所述殼聚糖的平均分子量為5000D～1000000D；所述殼聚糖西弗堿衍生物的結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，R為還原糖形成的結(jié)構(gòu)式；x、y、z表示聚合度，其中x/(x+y)＝0.3～0.99，z/(x+y)＝0.1～0.99。本發(fā)明所述的水溶性殼聚糖西弗堿衍生物在溶液中具有良好的溶解性，在保留一定的抑菌活性的同時還具有DPPH自由基清除能力，可用作抑菌劑和抗氧化劑。
文檔編號C08B37/08GK101875704SQ20101020935
公開日2010年11月3日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者應(yīng)國清, 易喻, 熊文說, 王鴻 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)