專利名稱：一種肝素衍生的多糖混合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及肝素衍生的多糖混合物的制備方法。
背景技術(shù)：
肝素是動(dòng)物來源(豬或牛)的硫酸多糖混合物，由于它們具有良好的抗血栓形成性質(zhì)，因而得到了廣泛應(yīng)用，例如制備抗血栓形成藥物、治療心血管疾病的藥物、和治療腦血管疾病的藥物等。然而，肝素有許多缺陷，這些缺陷限制肝素的應(yīng)用。一個(gè)主要缺陷是肝素用藥過多可致自發(fā)性出血，故每次注射前應(yīng)測定凝血時(shí)間。此外，肝素還可引起過敏反應(yīng)、血小板減少、骨質(zhì)疏松和自發(fā)性骨折。肝素自發(fā)性出血危險(xiǎn)很大，臨床使用中必須監(jiān)測凝血時(shí)間，這給醫(yī)生和患者均帶來很大不便。同時(shí)，血小板減少和骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)也讓醫(yī)生在使用中有所顧忌。低分子肝素使用過程中無須監(jiān)測凝血時(shí)間，并且大大降低了肝素長期使用產(chǎn)生的上述不良反應(yīng)。 目前，上市的低分子肝素有依諾肝素鈉、達(dá)肝素鈉、帕肝素鈉、亭扎肝素鈉及貝米肝素鈉等， 而貝米肝素鈉更以其高效低毒的特點(diǎn)，被稱為第二代低分子肝素。貝米肝素鈉是由西班牙Laboratories Farmaceuticos Rovi公司開發(fā)，其重均分子量為3000 4200道爾頓，分子量小于2000道爾頓的含量不高于35%，分子量為2000 6000道爾頓的含量為50% 75%，分子量大于6000道爾頓的含量不高于15%。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過用芐基三甲基氫氧化銨對肝素芐乙氧銨鹽進(jìn)行降解而制備貝米肝素鈉。然而，其制備方法存在以下缺陷工藝繁鎖，需要多個(gè)分離步驟，和/或得率低。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高效的、操作簡便的制備低分子量肝素的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效的、操作簡便的制備低分子量肝素的方法以及用該方法制備的高純度肝素衍生的多糖混合物的制備方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備低分子量肝素的方法，所述方法包括(a)提供一溶于惰性介質(zhì)中的肝素季銨鹽的溶液；(b)向所述溶液分批加入氫氧化季銨堿進(jìn)行降解反應(yīng)，形成重均分子量為 3000-4200道爾頓的低分子量肝素，其中在各分批加入之間不包括分離肝素的步驟，并且步驟(b)的總時(shí)間為48-240小時(shí)；和(c)從步驟(b)所述的溶液中分離或純化出所述的重均分子量為3000-4200道爾頓的低分子量肝素。在另一優(yōu)選例中，所述肝素季銨鹽是肝素芐乙氧銨鹽。在另一優(yōu)選例中，所述氫氧化季銨堿包括芐基三甲基氫氧化銨。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，將反應(yīng)溫度維持在10 80°C，較佳地20 60°C， 更佳地25 50°C。
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在另一優(yōu)選例中，步驟(b)的總時(shí)間為60-180小時(shí)，更佳地為80-160小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，所述的肝素季銨鹽與氫氧化季銨堿的總投料的重量比為1.2 1 6 1，較佳地1.8 1 4 1，更佳地2 1 3 1。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，所述肝素芐乙氧銨鹽與芐基三甲基氫氧化銨的投料重量比為1.2 1 6 1，較佳地1.8 1 4 1，更佳地2 1 3 1。在另一優(yōu)選例中，氫氧化季銨堿分2 8次加入，更佳地為分3 6次加入。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)步驟(b)中將反應(yīng)溫度維持在< 35°C時(shí)，氫氧化季銨堿分4-8 次加入；當(dāng)步驟(b)中將反應(yīng)溫度維持在> 35°C時(shí)，氫氧化季銨堿分3-6次加入。在另一優(yōu)選例中，各分批加入氫氧化季銨堿的量基本相同，即各分批加入量為 0. 25F-2F (較佳地為0. 5F-1. 5F)之間，其中F = T/n，式中F為氫氧化季銨堿的平均加入量， T為氫氧化季銨堿的總加料量，η為分批次數(shù)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，氫氧化季銨堿(較佳地為芐基三甲基氫氧化銨) 分批加入的時(shí)間間隔為8 48小時(shí)，較佳地為分12 40小時(shí)，更佳地為分18 32小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，所述的低分子量肝素是貝米肝素鈉。在另一優(yōu)選例中，所述的低分子量肝素是具有下述特性的貝米肝素鈉分子量低于2000道爾頓的含量低于總重量的35% ；分子量位于2000-6000道爾頓的含量為總重量的50% -75% ；分子量高于6000道爾頓的含量低于總重量的15% ；在另一優(yōu)選例中，所述的低分子量肝素的抗凝血因子與抗凝血因子IIa的活性比值為6-10 (較佳地約為7-9，最佳地7. 5-8. 5)。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種低分子量肝素，所述的低分子量肝素是具有下述特性的貝米肝素鈉重均分子量為3000-4200道爾頓；分子量低于2000道爾頓的含量低于總重量的35% ；分子量位于2000-6000道爾頓的含量為總重量的50% -75% ；分子量高于6000道爾頓的含量低于總重量的15% ；抗凝血因子fe與抗凝血因子IIa的活性比值為6-10 ；并且所述的低分子肝素是用本發(fā)明第一方面中所述的方法制備的。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再 --累述。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過改進(jìn)肝素衍生多糖混合物的制備方法，意外地發(fā)現(xiàn)，在同一體系中通過分批添加氫氧化季銨堿進(jìn)行降解反應(yīng)，可以高效、簡便、穩(wěn)定地制備重均分子量為3000-4200道爾頓的低分子量肝素，并且在各分批加入之間不必包括分離肝素的步驟。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的混合物”和“本發(fā)明的肝素衍生的多糖混合物”可互換使用。而術(shù)語“肝素”是指分子量范圍2000 30000道爾頓的多糖。
制備方法本發(fā)明提供了一種肝素衍生的多糖混合物的制備方法，包括步驟(a)提供一溶于惰性介質(zhì)中的肝素季銨鹽的溶液；(b)在合適的降解反應(yīng)溫度下，分批加入季銨堿，使得肝素季銨鹽在季銨堿作用下被降解，從而形成降解的肝素衍生的多糖；和(c)從反應(yīng)體系中分離或純化出本發(fā)明所述的肝素衍生的多糖混合物。該方法的一個(gè)主要特點(diǎn)是在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，因此各批次之間不包括分離肝素衍生多糖的步驟。適用于本發(fā)明的惰性溶劑沒有特別限制，較佳地是非羥基化惰性溶劑，代表性例子包括(但并不限于)指二氯甲烷、甲酰胺、二甲基甲酰胺或其它非羥基極性溶劑，優(yōu)選二氯甲烷。在另一優(yōu)選例中，所述的肝素季銨鹽優(yōu)先選用長鏈銨如三氯、雙氯甲銨鹽及聯(lián)苯胺等，更佳地為肝素芐乙氧銨鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的季銨堿優(yōu)選以芐基三甲基氫氧化銨的溶液形式加入，如溶于甲醇、乙醇或異丙醇等溶劑或醇/水混合溶劑所形成的溶液(濃度通常為20-60% (w/ ν))，如芐基三甲基氫氧化銨甲醇溶液(如25%、40%或50%濃度等，w/v)。在步驟(c)中，可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的已知方法分離純化，代表性的方法包括(但并不限于)醇沉、活性炭吸附、凝膠過濾和超濾等，從而分離獲得符合要求的肝素衍生的多糖混合物。在另一優(yōu)選例中，在步驟(C)中還可包括對制得的所述的肝素衍生的多糖混合物用硼氫化鈉或過氧化氫進(jìn)行除雜質(zhì)及脫色處理。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的制備方法包括步驟1、在惰性溶劑(如二氯甲烷)中，分批次加入季銨堿(如芐基三甲基氫氧化銨)， 對肝素季銨鹽(如肝素芐乙氧銨鹽)進(jìn)行降解。其中，降解反應(yīng)的溫度和時(shí)間沒有特別限制，通常反應(yīng)溫度可以為10 80°C ；反應(yīng)時(shí)間通常為2 10天。2、對于制得的肝素衍生多糖，可以用常規(guī)方法進(jìn)行分離和純化，如醇沉、活性炭吸附、凝膠過濾和超濾等，并可通過硼氫化鈉或雙氧水除去雜質(zhì)及脫色。肝素衍生的多糖混合物本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的方法制備的肝素衍生的多糖混合物(也稱為低分子量肝素)。通過本方法制備的低分子肝素，具有如下特征重均分子量為3000 4200道爾頓，特征值約為3600道爾頓；分子量低于2000道爾頓的含量低于35%，分子量在2000-6000道爾頓的含量為50% -75 %，分子量高于6000 道爾頓的含量低于15% ；和抗凝血因子與抗凝血因子IIa的活性比值為6-10，較佳地為7_9，最佳地 7. 5-8. 5。此外，在本發(fā)明的肝素衍生的多糖混合物的構(gòu)成多糖中，在其一端具有不飽和的 4，5-葡萄糖醛酸2-0-硫酸酯結(jié)構(gòu)單元。這些多糖混合物可以呈堿金屬鹽或堿土金屬鹽形式，其中，優(yōu)選鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽
5和鎂鹽。一種常用方法是對形成的低分子量肝素的鈉鹽進(jìn)行鹽置換處理。例如，用氯化鈣處理可獲得所需低分子量肝素鈣鹽。藥物組合物和施用方法本發(fā)明的肝素衍生的多糖混合物可以用作抗血栓形成劑，預(yù)防靜脈血栓栓塞性疾病(預(yù)防靜脈內(nèi)血栓形成)，特別是與骨科或普外手術(shù)有關(guān)的血栓形成。治療已形成的深靜脈栓塞，伴或不伴有肺栓塞。治療不穩(wěn)定心絞痛及非Q波心梗，用于血液透析體外循環(huán)中， 防止血栓形成。此外，本發(fā)明的肝素衍生的多糖混合物還可用于治療或輔助治療心血管疾病和腦
血管疾病。因此，本發(fā)明還提供一種藥物組合物，它含有作為活性組分的本發(fā)明的肝素衍生的多糖混合物和藥學(xué)上可接受的載體。通常，在藥物組合物中，本發(fā)明的肝素衍生的多糖混合物的含量為0. 01-50wt%，更佳地為0. l-30wt%。一種優(yōu)選的藥物組合物劑型為注射劑 (包括溶液和凍干劑)。本發(fā)明的藥物組合物可用常規(guī)方法制備和施用。一種優(yōu)選的施用方法是皮下或靜脈內(nèi)給藥。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)制備方法在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，省略了多個(gè)分離步驟，操作簡單；(b)收率高；(c)制備工藝的穩(wěn)定性高；(d)制得的低分子量肝素(如貝米肝素鈉)不僅純度高，而且完全符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件(如《歐洲藥典》或《美國藥典》中所述的條件)，或按照制造廠商所建議的條件。通用測定方法分子量與分子量分布以及抗凝血因子和抗凝血因子IIa效價(jià)均采用歐洲藥典或美國藥典中常規(guī)的低分子肝素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中所述的方法進(jìn)行。實(shí)施例1肝素芐乙氧銨鹽(原料)的制備向芐索氯銨O50g)的水溶液(1250ml)中，加入含市售的肝素鈉(IOOg)的水 (1000ml)溶液。攪拌下放置30分鐘，形成肝素芐乙氧銨鹽沉淀。然后，將反應(yīng)混合物在室溫下過濾，獲得濾餅，用水洗滌后真空干燥，獲得肝素芐乙氧銨鹽295克(白色)。實(shí)施例2肝素衍生的多糖混合物的制備1、肝素衍生的多糖混合物將實(shí)施例1得到的肝素芐乙氧銨鹽(IOg)溶于二氯甲烷(50ml)中，并加熱至20°C 并維持此反應(yīng)溫度。向此溶液中共加入芐基三甲基氫氧化銨(40%，w/v)甲醇溶液9. 6ml， 加入方法為分6次加入，每次加入1. 6ml，分批時(shí)間間隔為M小時(shí)，從而使肝素逐漸降解。 其中最后一次加入后，再反應(yīng)M小時(shí)，故總反應(yīng)時(shí)間為144小時(shí)。向反應(yīng)混合物中加入60ml的10%醋酸鈉甲醇溶液，并攪拌，析出沉淀，過濾獲得
6濾餅，甲醇洗滌后，真空干燥，獲得肝素衍生的多糖混合物(淺黃色，2. 9g)。2、純化用常規(guī)方法進(jìn)行純化，方法如下將上一步驟制備的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成濃度約3% 5%的水溶液。用IM NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 4士0. 1。將硼氫化鈉(按50g/kg肝素衍生的多糖混合物計(jì))加入到該溶液中，靜置1個(gè)小時(shí)，然后用3M鹽酸將pH調(diào)節(jié)至3. 5-4. 0以消除過多的硼氫化物。靜置30分鐘，并用2M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。加入氯化鈉，使溶液中鹽濃度達(dá)10%， 然后加入溶液體積3倍體積的甲醇，析出沉淀，過濾獲得濾餅，用甲醇洗滌后，真空干燥，從而得到純化的肝素衍生的多糖混合物(類白色，2.6g)。以肝素鈉計(jì)算，收率為76.7%。經(jīng)測定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性質(zhì)如下
測量值標(biāo)準(zhǔn)重均分子量(道爾頓)3，6183000-4200分子量大于6000道爾頓的組分含量12%< 15%分子量小于2000道爾頓的組分含量30%< 35%分子量介于2000 6000道爾頓的組分含量58%50-75%抗凝血因子)(a活性(IU/毫克)101. 380-120抗凝血因子IIa活性(IU/毫克)13. 2抗凝血因子)(ει活性/抗凝血因子Πει活性比7. 7約等于8采用本發(fā)明制備方法制備的多糖混合物，完全符合上市貝米肝素鈉的質(zhì)量要求。 同時(shí)，該制備方法得率高，無須繁瑣的后續(xù)處理步驟，有利于降低成本和能耗，大大增強(qiáng)了產(chǎn)品的競爭力。實(shí)施例3肝素衍生的多糖混合物的制備1、肝素衍生的多糖混合物將實(shí)施例1得到的肝素芐乙氧銨鹽(IOg)溶于二氯甲烷(50ml)中，并加熱至25°C 并維持此反應(yīng)溫度。向此溶液中共加入芐基三甲基氫氧化銨(40%，w/v)甲醇溶液9. 0ml， 加入方法為分5次加入，依次加入1. 8ml、1. 2ml,2. 8ml、1. 4ml、1. 8ml，時(shí)間間隔為24小時(shí)， 從而使肝素逐漸降解。其中最后一次加入后，再反應(yīng)M小時(shí)，故總反應(yīng)時(shí)間為120小時(shí)。向反應(yīng)混合物中加入60ml的10%醋酸鈉甲醇溶液，并攪拌，析出沉淀，過濾獲得濾餅，甲醇洗滌后，真空干燥，獲得肝素衍生的多糖混合物(淺黃色，2. Sg)。2、純化將上一步驟制備的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成濃度約3% 5%的水溶液。用IM NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 4士0. 1。將硼氫化鈉(按50g/kg肝素衍生的多糖混合物計(jì))加入到該溶液中，靜置1個(gè)小時(shí)，然后用3M鹽酸將pH調(diào)節(jié)至3. 5-4. 0以消除過多的硼氫化物。靜置30分鐘，并用2M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。加入氯化鈉，使溶液中鹽濃度達(dá)10%， 然后加入溶液體積4倍體積的甲醇，析出沉淀，過濾獲得濾餅，用甲醇洗滌后，真空干燥，從而得到純化的肝素衍生的多糖混合物(類白色，2.5g)。以肝素鈉計(jì)算，收率為73.7%。經(jīng)測定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性質(zhì)如下
權(quán)利要求
1.一種制備低分子量肝素的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)提供一溶于惰性介質(zhì)中的肝素季銨鹽的溶液；(b)向所述溶液分批加入氫氧化季銨堿進(jìn)行降解反應(yīng)，形成重均分子量為3000-4200 道爾頓的低分子量肝素，其中在各分批加入之間不包括分離肝素的步驟，并且步驟(b)的總時(shí)間為48-240小時(shí)；和(c)從步驟(b)所述的溶液中分離或純化出所述的重均分子量為3000-4200道爾頓的低分子量肝素。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述肝素季銨鹽是肝素芐乙氧銨鹽。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述氫氧化季銨堿包括芐基三甲基氫氧化銨。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟(b)中，將反應(yīng)溫度維持在10 800C，較佳地20 60°C，更佳地25 50°C。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟(b)中，所述的肝素季銨鹽與氫氧化季銨堿的總投料的重量比為1.2 1 6 1，較佳地1.8 1 4 1，更佳地2 1 3 I0
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，氫氧化季銨堿分2 8次加入，更佳地為分3 6次加入。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟(b)中，氫氧化季銨堿(較佳地為芐基三甲基氫氧化銨)分批加入的時(shí)間間隔為8 48小時(shí)，較佳地為分12 40小時(shí)， 更佳地為分18 32小時(shí)。
8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的低分子量肝素是貝米肝素鈉。
9.如權(quán)利要求1所述的制備方法，所述的低分子量肝素是具有下述特性的貝米肝素鈉分子量低于2000道爾頓的含量低于總重量的35% ； 分子量位于2000-6000道爾頓的含量為總重量的50% -75% ； 分子量高于6000道爾頓的含量低于總重量的15% ；在另一優(yōu)選例中，所述的低分子量肝素的抗凝血因子)(a與抗凝血因子IIa的活性比值為 6-10。
10.一種低分子量肝素，其特征在于，所述的低分子量肝素是具有下述特性的貝米肝素鈉重均分子量為3000-4200道爾頓；分子量低于2000道爾頓的含量低于總重量的35% ；分子量位于2000-6000道爾頓的含量為總重量的50% -75% ；分子量高于6000道爾頓的含量低于總重量的15% ；抗凝血因子fe與抗凝血因子IIa的活性比值為6-10 ；并且所述的低分子肝素是用權(quán)利要求1所述的方法制備的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肝素衍生的多糖混合物的制備方法。該制備方法包括步驟提供一溶于惰性介質(zhì)中的肝素季銨鹽的溶液；向所述溶液分批加入氫氧化季銨堿進(jìn)行降解反應(yīng)；分離或純化出重均分子量為3000-4200道爾頓的低分子量肝素。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明方法制備的肝素衍生的多糖混合物。本發(fā)明方法可簡便、高效和穩(wěn)定地制備低分子量肝素。
文檔編號C08B37/10GK102399306SQ201010276279
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者徐學(xué)明, 王海青, 賈龍, 顧玉蘭 申請人:上海喜恩醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司