專利名稱：對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高分子化學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法。
背景技術(shù)：
刺激響應(yīng)型聚合物納米粒子是一類可以在外界信號刺激下(包括pH、溫度、磁場、光等)發(fā)生結(jié)構(gòu)、形狀、性能改變的納米粒子。這些載藥的納米粒子到達(dá)病灶部位后通過外界信號刺激進(jìn)行控制釋放藥物，從而可提高治療效果，并降低腫瘤細(xì)胞的抗藥性。 然而，大多數(shù)刺激響應(yīng)納米粒子還不適于體內(nèi)藥物控釋。主要由于一些刺激信號超出人體生理忍受度，如采用對人體有損傷作用的光(Lendlein A，Jiang H，Junger 0，Langer R.Light-induced shape-memory polymers. Nature2005 ；434(7035) :879-82)， ■罾冑的溫度等(Wang C, Stewart RJ, KopeCek J. Hybridhydrogels assembled from synthetic polymers and coiled—coil protein domains. Naturel999 ；397 (6718) :417-20)。此夕卜，由于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的在PH，溫度上的差別較小(如pH相差1 2，溫度相差2 5°C )， 從而，不能有效應(yīng)用于體內(nèi)刺激響應(yīng)藥物控制釋放。因此，利用生物相容性良好的，生物可降解的小分子誘導(dǎo)控制載藥納米粒子的藥物釋放時(shí)當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。最近，發(fā)展了一種對細(xì)胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽還原敏感的納米載藥體系，如文獻(xiàn)(Li YL, Zhu L，Liu R，Cheng R，Meng FH, Cui SJ, Ji SJ, Zhong ZY.Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficientlydeliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells. Angew. Chem. Int. Edit. 2009 ；48 (52), 9914-18)所報(bào)導(dǎo)的。但是，此類納米粒子的合成需要多步完成，存在著較大的挑戰(zhàn)性，并且在體外實(shí)驗(yàn)中使用了還原性較強(qiáng)的二硫蘇糖醇，可顯示出一定的還原敏感性；用于體內(nèi)時(shí)，二硫蘇糖醇具有一定的生物毒性，不便采用，而體內(nèi)自身的谷胱甘肽的還原性較弱，因此，此種還原敏感的納米粒子在體內(nèi)使用時(shí)的敏感響應(yīng)度還有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的快速釋放、生物相容性良好、反應(yīng)條件溫和的對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，其特征在于，該方法以環(huán)糊精和疏水性生物可降解的剛性高分子接枝的聚己內(nèi)酯為原料，通過主-客及親-疏水相互作用自組裝形成超分子聚合物膠束藥物載體。該方法具體包括以下步驟(1)疏水性生物可降解的剛性高分子接枝聚己內(nèi)酯共聚物制備將疏水性生物可降解的剛性高分子溶于無水甲苯后加入到干燥的聚合管，再加入己內(nèi)酯和辛酸亞錫，抽真空，充氬氣，反復(fù)三次后封管，控制溫度為100 120°C反應(yīng)20 30h，再利用二氯甲烷溶解產(chǎn)物并用甲醇和石油醚混合溶劑沉淀得到接枝共聚物；(2)超分子聚合物膠束的制備將環(huán)糊精溶于去離子水中，然后逐滴滴入步驟(1)得到的接枝共聚物的四氫呋喃溶液，再攪拌反應(yīng)20 30h，離心去除沉淀，最后經(jīng)透析得到產(chǎn)品。所述步驟(1)中的疏水性生物可降解的剛性高分子選自乙基纖維素、經(jīng)疏水性修飾的甲殼素或葡聚糖。所述步驟(1)中的己內(nèi)酯的分子量為3000 50000。所述步驟(1)中的疏水性生物可降解的剛性高分子和己內(nèi)酯的重量比為1 2 3 I0所述步驟(1)中的辛酸亞錫的加入量為己內(nèi)酯的0. 1 0. 5wt%。所述步驟O)中的環(huán)糊精選自甲基化環(huán)糊精、馬來酸酐修飾環(huán)糊精或丙烯酰氯修飾環(huán)糊精。所述步驟O)中環(huán)糊精與接枝共聚物的重量比為1 2 1。所述步驟O)中環(huán)糊精的濃度為10 20mg/ml，接枝共聚物的四氫呋喃溶液的濃度為8 10mg/ml。另外，得到的超分子聚合物膠束藥物載體匹配的氨基酸小分子與環(huán)糊精的復(fù)合作用大于環(huán)糊精與聚己內(nèi)酯大分子的，因而氨基酸可以誘發(fā)該超分子聚合物膠束迅速解離， 釋放出藥物。所述的氨基酸包括含苯環(huán)氨基酸，如苯丙氨酸，絡(luò)氨酸等人體必需氨基酸，或是被苯環(huán)修飾的氨基酸被FDA批準(zhǔn)的可作為口服試劑的，均可用于誘發(fā)該超分子聚合物膠束的刺激響應(yīng)。所述的超分子聚合物膠束藥物載體可以同時(shí)負(fù)載一種或一種以上抗癌藥用于化療，或者是負(fù)載光敏劑分子用于光動(dòng)力治療。所述的超分子聚合物膠束藥物載體可以通過調(diào)節(jié)氨基酸的量來控制藥物釋放速率，從而實(shí)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的控制釋放。此腫瘤細(xì)胞包括乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、 宮頸癌細(xì)胞等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明由于環(huán)糊精與含苯環(huán)的氨基酸小分子之間的主客復(fù)合作用較其與聚己內(nèi)酯之間復(fù)合作用力強(qiáng)，利用此差異，在氨基酸觸發(fā)下，該載藥超分子聚合物膠束可以迅速解離，釋放出所負(fù)載的藥物，從而實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的快速釋放，該方法所用原料生物相容性良好，所需反應(yīng)條件溫和，所用觸發(fā)控釋的分子為氨基酸類小分子，隸屬人體必需氨基酸，可口服，具有良好的生物安全性，此種控釋機(jī)制的敏感藥物載體有望進(jìn)一步開發(fā)使之用于臨床。


圖1為EC-g-PCL/MAh- α -⑶超分子聚合物膠束的透射電鏡圖；圖2為EC-g-PCL/MAh- α -⑶超分子聚合物膠束在L-苯丙氨酸存在下的粒徑變化圖；圖3為負(fù)載光敏劑THPP的EC-g-PCL/MAh- α -⑶超分子聚合物膠束在L-苯丙氨酸溶液(a)中的紫外光譜圖以及累積藥物釋放量-時(shí)間曲線圖；圖4為負(fù)載光敏劑THPP的EC-g-PCL/MAh- α -⑶超分子聚合物膠束在純水(b)中的紫外光譜圖以及累積藥物釋放量-時(shí)間曲線圖；圖5為不同濃度的負(fù)載THPP的EC-g-PCL/MAh- α -⑶超分子聚合物膠束在L-苯丙氨酸存在及不存在條件下與人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的細(xì)胞孵化后的暗毒性比較圖；圖6為不同濃度的負(fù)載THPP的EC-g-PCL/MAh- α -⑶超分子聚合物膠束在L-苯丙氨酸存在及不存在條件下與人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的細(xì)胞孵化后的光照毒性比較圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1一種對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，該方法包括以下步驟(1)乙基纖維素接枝聚己內(nèi)酯共聚物(EC-g-PCL)制備將乙基纖維素(EC)溶于5ml無水甲苯后加入到干燥的聚合管，再加入己內(nèi)酯(CL) 和辛酸亞錫(Sn(Oct)2)，CL與EC的投料比為1 1，辛酸亞錫的加入量為CL的0. 2wt%，抽真空，充氬氣，反復(fù)三次后封管。控制反應(yīng)溫度為110°C反應(yīng)Mh，利用二氯甲烷溶解產(chǎn)物， 再用甲醇和石油醚混合溶劑沉淀得到接枝共聚物EC-g-PCL ；(2)超分子聚合物膠束的制備將含尿素的α-環(huán)糊精(α-⑶)(200mg)溶于去離子水(10ml)，然后逐滴滴入 EC-g-PCL(IOOmg)的四氫呋喃溶液(IOml)中，再攪拌反應(yīng)Mh，離心去少許沉淀后，透析得到超分子聚合物膠束。該膠束經(jīng)透射電鏡測定，其透射電鏡圖如圖1所示，粒徑為90nm左
右ο實(shí)施例
苯丙氨酸刺激響應(yīng)載藥膠束粒徑變化特性將L-苯丙氨酸(0. 015mM)加入到超分子聚合物膠束水溶液(0. Tmgmr1)中，使用粒徑儀測定不同時(shí)間聚合物膠束粒徑的變化，如圖2所示。當(dāng)加入苯丙氨酸池后，膠束的粒徑由205nm增加到Mlnm，當(dāng)時(shí)間增至24h后，膠束的粒徑超過5 μ m,而未加L-苯丙氨酸的經(jīng)24h后粒徑無明顯變化，證明了此膠束對L-苯丙氨酸的刺激敏感性。實(shí)施例3載藥膠束的制備及體外釋藥特性將含尿素的α -環(huán)糊精(α -⑶)溶于去離子水，然后逐滴滴入含EC_g_PCL和光敏劑THPP的四氫呋喃溶液中，攪拌反應(yīng)Mh。離心去少許沉淀后，透析得到載藥納米膠束，其載藥量和藥物包封率通過紫外分光光度計(jì)測得。對于α -⑶/EC-g-PCL膠束理論載藥量為 2. 07wt%，藥物包封率為43. Owt %。對于MAh-α -⑶，膠束理論載藥量為3. 65wt%，藥物包封率為62. 5wt%。載藥量=(膠束中THPP質(zhì)量/載藥膠束聚合物質(zhì)量)X 100%,包封率=(膠束中的THPP質(zhì)量/所投THPP質(zhì)量)X 100 %。通過在純水和L-苯丙氨酸溶液中考察此膠束的體外敏感釋藥特性。透析后，取4mL負(fù)載THPP的超分子聚合物膠束透析液分別置于200mL的L-苯丙氨酸水溶液和200mL純水中，于37°C，150rpm搖床中進(jìn)行藥物釋放。定時(shí)取2mL溶液，每次補(bǔ)加相應(yīng)的2mL L-苯丙氨酸水溶液或純水。待釋藥一定時(shí)間之后，通過紫外分光光度計(jì)檢測光敏劑THPP釋放量。 根據(jù)THPP水溶液在其特征吸收峰275nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線C(mg/mL) = A/0. 0187 (Α為275nm 紫外光波長下的吸收強(qiáng)度)，定量檢測不同時(shí)間內(nèi)所取水樣中THPP的濃度。圖3為負(fù)載光敏劑THPP的EC-g-PCL/MAh- α -⑶超分子聚合物膠束在L-苯丙氨酸溶液(a)中的紫外光譜圖以及累積藥物釋放量-時(shí)間曲線圖，圖4為負(fù)載光敏劑THPP 的EC-g-PCL/MAh-α-CD超分子聚合物膠束在純水(b)中的紫外光譜圖以及累積藥物釋放量-時(shí)間曲線圖。由圖3 4可知，該載藥膠束在水溶液中釋藥緩慢，而該載藥膠束在L-苯丙氨酸(0. 015mM)水溶液中釋放速率明顯加快，50%多的藥物在1. 5h內(nèi)釋放出來，6h內(nèi)超過85%的藥物釋放出來，而在純水中，在300h內(nèi)不足的藥物釋放出來。由此說明由于 L-苯丙氨酸觸發(fā)了此載藥膠束的快速釋放藥物。證明該載藥膠束對苯丙氨酸有良好的刺激敏感響應(yīng)性。實(shí)施例4光動(dòng)力治療實(shí)驗(yàn)本實(shí)例以負(fù)載THPP的超分子聚合物膠束在苯丙氨酸溶液存在下的光動(dòng)力治療效率為例。首先將人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)以5000個(gè)/孔接種在96孔板中，培養(yǎng)Mh。再用載 THPP的超分子聚合物膠束的DMEM溶液替換每孔中的的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 后，分別加入濃度為1.5mM和3. OmM的L-苯丙氨酸溶液，繼續(xù)培養(yǎng)Mi。之后，用經(jīng)400nm濾光片過濾的氙光， 以一定劑量的光輻照孔板數(shù)分鐘。照射結(jié)束后吸棄培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4h。 培育結(jié)束后用MTT法檢測細(xì)胞的成活率，暗毒性比較圖如圖5所示，光照毒性比較圖如圖6 所示。結(jié)果顯示，負(fù)載THPP的超分子聚合物膠束在L-苯丙氨酸存在下無明顯暗毒性，細(xì)胞成活率均在100%以上。在氙燈輻照下，L-苯丙氨酸存在下的細(xì)胞成活率較無L-苯丙氨酸的低，且增加L-苯丙氨酸的濃度，細(xì)胞成活率進(jìn)一步降低，這與L-苯丙氨酸觸發(fā)超分子聚合物膠束的快速釋放光敏劑，從而提高其光動(dòng)力治療效果。實(shí)施例5對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，以環(huán)糊精和疏水性生物可降解的剛性高分子接枝的聚己內(nèi)酯為原料，通過主-客及親-疏水相互作用自組裝形成超分子聚合物膠束藥物載體，具體包括以下步驟(1)疏水性生物可降解的剛性高分子接枝聚己內(nèi)酯共聚物制備將經(jīng)疏水性修飾的甲殼素溶于無水甲苯后加入到干燥的聚合管，再加入分子量為 3000的己內(nèi)酯和辛酸亞錫，控制疏水性修飾的甲殼素和己內(nèi)酯的重量比為1 2，辛酸亞錫的加入量為己內(nèi)酯的0. lwt%，抽真空，充氬氣，反復(fù)三次后封管，控制溫度為100°C反應(yīng) 30h，再利用二氯甲烷溶解產(chǎn)物并用甲醇和石油醚混合溶劑沉淀得到接枝共聚物；(2)超分子聚合物膠束的制備將經(jīng)馬來酸酐修飾的環(huán)糊精溶于去離子水中，控制環(huán)糊精的濃度為10mg/ml，然后逐滴滴入步驟(1)得到的接枝共聚物的四氫呋喃溶液，接枝共聚物的濃度為8mg/ml，經(jīng)馬來酸酐修飾的環(huán)糊精與接枝共聚物的重量比為1 1，再攪拌反應(yīng)20h，離心去除沉淀，最后經(jīng)透析得到產(chǎn)品。實(shí)施例6對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，以環(huán)糊精和疏水性生物可降解的剛性高分子接枝的聚己內(nèi)酯為原料，通過主-客及親-疏水相互作用自組裝形成超分子聚合物膠束藥物載體，具體包括以下步驟(1)疏水性生物可降解的剛性高分子接枝聚己內(nèi)酯共聚物制備將經(jīng)疏水性修飾的葡聚糖溶于無水甲苯后加入到干燥的聚合管，再加入分子量為 50000的己內(nèi)酯和辛酸亞錫，控制疏水性修飾的葡萄糖和己內(nèi)酯的重量比為3 1，辛酸亞錫的加入量為己內(nèi)酯的0. 5wt%，抽真空，充氬氣，反復(fù)三次后封管，控制溫度為120°C反應(yīng) 30h，再利用二氯甲烷溶解產(chǎn)物并用甲醇和石油醚混合溶劑沉淀得到接枝共聚物；(2)超分子聚合物膠束的制備將甲基化環(huán)糊精溶于去離子水中，控制環(huán)糊精的濃度為20mg/ml，然后逐滴滴入步驟(1)得到的接枝共聚物的四氫呋喃溶液，接枝共聚物的濃度為10mg/ml，甲基化環(huán)糊精與接枝共聚物的重量比為2 1，再攪拌反應(yīng)30h，離心去除沉淀，最后經(jīng)透析得到產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，其特征在于，該方法以環(huán)糊精和疏水性生物可降解的剛性高分子接枝的聚己內(nèi)酯為原料，通過主-客及親-疏水相互作用自組裝形成超分子聚合物膠束藥物載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟(1)疏水性生物可降解的剛性高分子接枝聚己內(nèi)酯共聚物制備將疏水性生物可降解的剛性高分子溶于無水甲苯后加入到干燥的聚合管，再加入己內(nèi)酯和辛酸亞錫，抽真空，充氬氣，反復(fù)三次后封管，控制溫度為100 120°C反應(yīng)20 30h， 再利用二氯甲烷溶解產(chǎn)物并用甲醇和石油醚混合溶劑沉淀得到接枝共聚物；(2)超分子聚合物膠束的制備將環(huán)糊精溶于去離子水中，然后逐滴滴入步驟(1)得到的接枝共聚物的四氫呋喃溶液，再攪拌反應(yīng)20 30h，離心去除沉淀，最后經(jīng)透析得到產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的疏水性生物可降解的剛性高分子選自乙基纖維素、經(jīng)疏水性修飾的甲殼素或葡聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的己內(nèi)酯的分子量為3000 50000。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法， 其特征在于，所述步驟(1)中的疏水性生物可降解的剛性高分子和己內(nèi)酯的重量比為 1 2 3 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的辛酸亞錫的加入量為己內(nèi)酯的0. 1 0. 5wt%。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，其特征在于，所述步驟O)中的環(huán)糊精選自甲基化環(huán)糊精、馬來酸酐修飾環(huán)糊精或丙烯酰氯修飾環(huán)糊精。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，其特征在于，所述步驟O)中環(huán)糊精與接枝共聚物的重量比為1 2 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中環(huán)糊精的濃度為10 20mg/ml，接枝共聚物的四氫呋喃溶液的濃度為8 10mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及對氨基酸敏感的超分子聚合物膠束藥物載體的制備方法，以環(huán)糊精和疏水性生物可降解的剛性高分子接枝的聚己內(nèi)酯為原料，通過主-客及親-疏水相互作用自組裝形成超分子聚合物膠束藥物載體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明由于環(huán)糊精與含苯環(huán)的氨基酸小分子之間的主客復(fù)合作用較其與聚己內(nèi)酯之間復(fù)合作用力強(qiáng)，利用此差異，在氨基酸觸發(fā)下，該載藥超分子聚合物膠束可以迅速解離，釋放出所負(fù)載的藥物，從而實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的快速釋放，該方法所用原料生物相容性良好，所需反應(yīng)條件溫和，所用觸發(fā)控釋的分子為氨基酸類小分子，隸屬人體必需氨基酸，可口服，具有良好的生物安全性，此種控釋機(jī)制的敏感藥物載體有望進(jìn)一步開發(fā)使之用于臨床。
文檔編號C08J3/03GK102399369SQ20101028137
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者徐夢, 時(shí)東陸, 李永勇, 董海青 申請人:同濟(jì)大學(xué)