專利名稱：分子印記聚合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及設(shè)計分子印記聚合物(MIP，molecularly imprinted polymer)的方法，上述聚合物可用于從各種生物工藝原料和廢棄物中提取生物活性化合物。本發(fā)明進一步涉及通過本發(fā)明的方法設(shè)計的MIP。
背景技術(shù)：
可以將分子印記聚合物(MIP)設(shè)計成具有可變水平的交聯(lián)以產(chǎn)生具有受控剛性或柔性的聚合物(取決于功能要求)，其包含可以設(shè)計成對任何目標(biāo)分析物具有特異性的空腔(結(jié)合位點)。利用模板的純樣品，可以制備MIP，其對于模板化合物是特異的或?qū)τ诰哂蓄愃苹瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的其它分子是選擇性的。MIP是具有高選擇性和特異性的聚合物網(wǎng)絡(luò)，上述選擇性和特異性可以被比喻為抗體對其抗原的選擇性和特異性。MIP提供了如下優(yōu)點， MIP可以增強對溫度、極端pH條件、溶劑、蛋白酶、以及降解或變性過程的抗性，其使它們可以成為用于從復(fù)雜原料中預(yù)濃縮、提取以及分離潛在附加價值生物分子的可再利用材料。強有力的流行病學(xué)證據(jù)表明水果和蔬菜對心血管病、胃腸道癌、白內(nèi)障以及其它疾病的健康益處。植物化學(xué)物質(zhì)是對這種效應(yīng)的主要部分作出貢獻的候選物。雖然關(guān)于攝取機制、代謝以及在體內(nèi)這些分子如何施加它們的生物效應(yīng)的知識是不明確的，但由這些生物活性化合物提供的健康益處是廣泛承認和接受的。具有相當(dāng)大興趣的一類植物化學(xué)物質(zhì)是多酚，其中白藜蘆醇是一個實例。其它有興趣的類是查耳酮類、吲哚類、香豆素類、黃烷酮類和黃烷醇類、花色素苷類以及植物甾醇類和植物留烷醇類。關(guān)于白藜蘆醇和它的類似物或植物留醇和它們的類似物，幾乎沒有發(fā)表的文獻來檢查產(chǎn)生具有所需要的特異性的MIP的方式。存在的文獻僅主要強調(diào)分離的分析模式。在一種制備分離范圍內(nèi)試圖使用所產(chǎn)生的MIP的情況下，并沒有試圖最優(yōu)化MIP性能或解決較大規(guī)模使用所面臨的一些關(guān)鍵挑戰(zhàn)。例如，Xiang等1的工作是基于以下想法，非共價分子印記技術(shù)不適合于溶解在極性溶劑中的模板，如白藜蘆醇，因此必要的是，丙烯酰胺用作單體，而在Ma等2的工作中并沒有注意控制衍生MIP的選擇性，其結(jié)果是，白藜蘆醇衍生物、 反式虎杖苷以及大黃素更加有力地結(jié)合于MIP，盡管它們的葡糖苷化結(jié)構(gòu)或修飾結(jié)構(gòu)。Cao 等3的工作在很大程度上簡單地重新敘述Xiang等1或Ma等2的相同結(jié)論，考慮到使用非常類似的方法和相同的一組測試化合物，出現(xiàn)上述情況并不奇怪。因此需要開發(fā)特異性MIP， 其已針對特定模板或模板類型進行修改(tailor)和最優(yōu)化，具有適用于工業(yè)型應(yīng)用的衍生的分子印記聚合物。具體來說，需要制備適宜的MIP，其相容于目前由制造業(yè)采用的系統(tǒng)， 允許分離在食品及同類行業(yè)中具有商業(yè)價值的目標(biāo)化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人利用白藜蘆醇作為模板已設(shè)計了白藜蘆醇選擇性MIP (在此文件中描述為MIP 8)。利用白藜蘆醇類似物模板，包括白藜蘆醇的亞胺類似物(本發(fā)明的發(fā)明人稱作“綠色白藜蘆醇”)、以及酰胺類似物，他們還設(shè)計了若干其它分子印記聚合物。他們已證明了他們的MIP 8在固相提取技術(shù)中的應(yīng)用，其允許從葡萄籽和花生餅粉提取物選擇性富集白藜蘆醇。此結(jié)果可與借助于現(xiàn)有技術(shù)的MIP系統(tǒng)獲得的低純化系數(shù)形成對比，如由Ma等2、Xiang等1或Cao等3描述的那些系統(tǒng)。此外，他們已證明了按比例增加分子印記固相技術(shù)的能力，從而說明上述過程的可擴展性。在第一方面， 本發(fā)明提供了用于制備分子印記聚合物(MIP)的方法，其中分子印記聚合物對于化合物具有所期望水平的特異性，上述方法包括以下步驟在有模板分子和致孔劑(porogen)存在的情況下聚合包含一個或多個非共價鍵合位點的單體和交聯(lián)劑，隨后除去模板，其中模板在結(jié)構(gòu)上類似于化合物或包含結(jié)構(gòu)上類似于化合物的部分，以及其中模板包含一個或多個非共價鍵合位點，其中所述非共價鍵合位點互補于單體的非共價鍵合位點，以及進一步其中模板具有比化合物更多或更少的非共價鍵合位點，從而與如果將化合物本身用作模板相比，MIP對于化合物具有不同水平的特異性。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了用于制備分子印記聚合物(MIP)的方法，其中分子印記聚合物對于化合物具有所期望水平的特異性，上述方法包括以下步驟在有模板和致孔劑存在的情況下聚合包含一個或多個氫鍵合位點的單體和交聯(lián)劑，隨后除去模板， 其中模板在結(jié)構(gòu)上類似于化合物或包含結(jié)構(gòu)上類似于化合物的部分，以及其中模板包含互補于單體的一個或多個氫鍵合位點的一個或多個氫鍵合位點，以及進一步其中模板具有比化合物更多或更少的氫鍵合位點，從而與如果將化合物本身用作模板相比MIP對于化合物具有不同水平的特異性。在第二方面，本發(fā)明提供了用于引導(dǎo)用于分子印記聚合物(MIP)的單體的選擇的方法，其中分子印記聚合物將印記有(imprinted with)包含一個或多個非共價鍵合位點的模板，其中MIP是通過在有模板和致孔劑存在的情況下聚合所選單體和交聯(lián)劑以及隨后除去模板來制備，所述方法包括以下步驟提供一組具有一個或多個非共價鍵合位點的單體， 其中非共價鍵合位點互補于模板的非共價鍵合位點，評估在單體組的每種單體和模板之間形成的復(fù)合物的生成能，以及利用復(fù)合物的生成能作為選擇因素以從若干單體來選擇所選單體。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了用于引導(dǎo)用于分子印記聚合物(MIP)的單體的選擇的方法，其中分子印記聚合物將印記有包含一個或多個氫鍵合位點的模板，其中MIP 是通過在有模板和致孔劑存在的情況下聚合所選單體和交聯(lián)劑以及隨后除去模板來制備， 所述方法包括以下步驟提供一組具有一個或多個氫鍵合位點的單體，其中氫鍵合位點互補于模板的氫鍵合位點，評估在單體組的每種單體和模板之間形成的氫鍵合復(fù)合物的生成能，以及利用氫鍵合復(fù)合物的生成能作為選擇因素以從若干單體選擇所選單體。在第三方面，本發(fā)明提供了用于在分子印記聚合物(MIP)的制備中選擇單體與模板的比率的方法，其中分子印記聚合物將印記有模板，其中MIP是通過在有模板和致孔劑存在的情況下聚合單體和交聯(lián)劑以及隨后除去模板來制備，所述方法包括以下步驟評估在模板和不同數(shù)目的單體之間形成的復(fù)合物的生成能，以及利用復(fù)合物的生成能作為選擇因素來選擇單體與模板的比率。在第四方面，提供了一種用于制備MIP的預(yù)聚合復(fù)合物，其包含一種或多種單體以及一種模板，該些單體各自包含一個或多個非共價鍵合位點，其中模板包含互補于單體的一個或多個非共價鍵合位點的一個或多個非共價鍵合位點。在一種實施方式中，提供了一種用于制備MIP的預(yù)聚合氫鍵合復(fù)合物，其包含一種或多種單體以及一種模板，該些單體各自包含一個或多個氫鍵合位點，其中模板包含互補于單體的一個或多個氫鍵合位點的一個或多個氫鍵合位點。在第五方面，提供了按照第一方面的方法制備的MIP。在一種實施方式中，通過第二方面的方法來選擇包含一個或多個非共價鍵合位點的單體。在第六方面，提供了通過在有模板和致孔劑存在的情況下聚合單體和交聯(lián)劑以及隨后除去模板而制備的MIP，其中通過第二方面的方法來引導(dǎo)單體的選擇或通過第三方面的方法來選擇單體與模板的比率。在第七方面，提供了用于設(shè)計包含反式乙烯接頭的化合物的類似物的方法，該方法包括用亞胺、酰胺或仲胺接頭替代反式乙烯接頭。優(yōu)選地，用亞胺接頭替代反式乙烯接頭。亞胺接頭結(jié)構(gòu)上等效于乙烯接頭，但合成
要簡單得多。在第八方面，提供了用于制備MIP的方法，其中MIP對于具有反式乙烯接頭的化合物具有特異性，上述方法包括以下步驟在有模板和致孔劑存在的情況下聚合單體和交聯(lián)劑以及隨后除去模板，其中模板是化合物的類似物。在第九方面，本發(fā)明提供了印記有多酚或其類似物的分子印記聚合物(MIP)，其中 MIP包含聚合的4-乙烯基吡啶以及聚合的交聯(lián)劑。在第十方面，本發(fā)明提供了用于制備按照第九方面的MIP的方法，所述方法包括以下步驟(i)在有多酚或其類似物以及致孔劑存在的情況下聚合MIP ；以及(ii)從MIP除去多酚或其類似物。在第十一方面，本發(fā)明提供了用于從樣品提取一種或多種多酚的方法，其中通過將樣品暴露于按照第一方面的MIP。在一種優(yōu)選形式中，樣品是基于植物，以及源自食物如葡萄和它們的種子、外皮、 以及果汁(和葡萄酒)，蘋果、梨、漿果、以及其它水果，茶葉、花生(或花生餅粉)，以及谷物如小麥、玉米、稻米和它們的油，以及它們的副產(chǎn)物。在一種實施方式中，MIP被包封(encase，包圍)在可滲透網(wǎng)(mesh)中。在第十二方面，本發(fā)明提供了用于通過層析法至少部分分離樣品成分的方法，該方法包括以下步驟(i)制備包含按照第一方面的MIP的層析柱；(ii)使樣品通過上述柱； 以及(iii)從上述柱收集樣品的流分。在第十三方面，本發(fā)明提供了印記有一種或多種化合物的MIP，上述化合物選自由甾醇和留烷醇、以及它們的類似物或衍生物組成的組，其中所述MIP包含聚合單體。優(yōu)選地，衍生物是多酚酯如阿魏酸酯或沒食子酸酯。多酚提供氫鍵合和π-π鍵
6合位點。在第十四方面，本發(fā)明提供了用于制備按照第十三方面的MIP的方法，所述方法包括以下步驟(i)在有留醇或留烷醇、或它們的類似物或衍生物存在的情況下聚合MIP和致孔劑；以及(ii)從MIP中除去甾醇或甾烷醇、或它們的類似物或衍生物。在第十五方面，本發(fā)明提供了用于從樣品提取一種或多種留醇或留烷醇、或它們的類似物或衍生物的方法，其中通過將樣品暴露于按照第十三方面的MIP。在一種實施方式中，MIP被包住在可滲透網(wǎng)中。在第十六方面，本發(fā)明提供了通過層析法來至少部分分離樣品成分的方法，該方法包括以下步驟(i)制備包含按照第十三方面的MIP的層析柱；(ii)使樣品通過上述柱； 以及(iii)從上述柱收集樣品的流分。在研究本發(fā)明的功能聚合物的過程中，本發(fā)明的發(fā)明人已制備了若干新穎和創(chuàng)造性的化合物。本發(fā)明的第十七方面涉及這些新穎化合物。在第十八方面，提供了用于至少部分分離樣品的成分的方法，其中上述樣品包含兩種或更多種所述成分，所述方法包括將樣品順序地暴露于至少兩種MIP，其中每種MIP已印記有不同的模板。在第十九方面，提供了包封在可滲透網(wǎng)中的MIP。在第二十方面，提供了用于從樣品提取成分的方法，該方法包括將樣品暴露于按照第十九方面的MIP。在第二十一方面，提供了一種印記有(E)-5_[(4-羥基-苯基亞氨基)_甲基]-苯-1，3- 二醇或3，5- 二羥基-N- (4-羥苯基)苯甲酰胺的MIP。在第二十二方面，提供了用于從樣品提取白藜蘆醇的方法，所述方法包括將樣品暴露于按照第二十一方面的MIP。


圖1.白藜蘆醇-3-0-β-D-葡糖苷酸的結(jié)構(gòu)。圖2.生產(chǎn)用于形成“共價”MIP的(Ε)-544-(甲基丙烯酰氧基)苯乙烯基)_1， 3-亞苯基二甲基丙烯酸脂)。圖3.白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)(3Α)以及利用ΡΜ3計算顯示電子特性和可能的相互作用位點獲得的白藜蘆醇表面的計算機生成的模型(3Β)。圖4.分子模擬滴定結(jié)果，其示出在白藜蘆醇和4VP簇之間的估計的相互作用能， 其中使用ΡΜ3幾何形狀優(yōu)化計算，其示出在三當(dāng)量(eq)4VP處的一個不同的最低值。圖5.白藜蘆醇復(fù)合物的空間填充圖像，其中三個4VP單元通過每個芪羥基和吡啶基氮首基相互作用。計算并沒有考慮到溶劑，所以應(yīng)當(dāng)僅用作引導(dǎo)。圖6.對于在白藜蘆醇和功能單體丙烯酰胺(AAM)(圖6A)以及4_乙烯基苯甲酸 (4VBA)(圖6B)之間的復(fù)合物的估計的凈相互作用能(AEf)的模擬滴定數(shù)據(jù)，其中采用半經(jīng)驗計算并利用PM3力場。除此以外，還示出50mg聚合物在0. 5mM白藜蘆醇乙腈溶液中的靜態(tài)結(jié)合數(shù)據(jù)(圖6C和6D)。
圖7.在添加增加的摩爾當(dāng)量(equivalents)的功能單體4VP以后，白藜蘆醇的芳族-OH移動的低磁場移動。表明，正形成預(yù)聚合復(fù)合物，其可能通過與吡啶基N基團的H鍵合相互作用。圖8.聚合物MIP UMIP 2、MIP 3和MIP 4以及相應(yīng)NIP的重新結(jié)合數(shù)據(jù)，其示出來自白藜蘆醇乙腈溶液(0.05mM)的白藜蘆醇親和力。圖9.在使用0. 5mM白藜蘆醇乙腈溶液的結(jié)合測定中，與聚合物MIP UMIP 2、MIP 3、MIP 4, NIP 1以及NIP 2的白藜蘆醇結(jié)合親和力。圖 10.用以下 T FM XL 比率1 3 15 (MIP 8)、1 3 17 (MIP 10)、 1:3: 20 (MIP 9)、1 3 30 (MIP 2)以及 1 3 40 (MIP 5)制備的 MIP 以及它們的
各自的NIP對照材料的靜態(tài)重新結(jié)合數(shù)據(jù)。圖 11.多個 MIP 8 批次 A-J (LS3-37p84-17-4_08a-j)、K (LS3-26p62-l-4_08a)、 L(LS3-26p62-l-4-08b)以及M(ls2-6pl0-7-2-07)的靜態(tài)結(jié)合數(shù)據(jù)，其示出在乙腈中MIP生
產(chǎn)和結(jié)合性能的再現(xiàn)性。重復(fù)進行所有測量。圖12.在靜態(tài)條件下在CAN中高達5mM的白藜蘆醇濃度范圍內(nèi)，與MIP 8 (30mg) 的白藜蘆醇結(jié)合能力。利用懸浮混合器并以大約40rpm，混合樣品過夜(18小時)。然后離心樣品，并通過HPLC來分析等份的上層清液以確定游離白藜蘆醇濃度。圖13.在靜態(tài)條件下并在沒有競爭的情況下，MIP 8對于在乙腈中的各種白藜蘆醇類似物(0.5mM)的交叉反應(yīng)性結(jié)合數(shù)據(jù)。圖14.靜態(tài)結(jié)合數(shù)據(jù)，其比較在白藜蘆醇印記聚合物(MIP 8)和用白藜蘆醇類似物模板化MIP之間的白藜蘆醇親和力。圖15.來自MISPE結(jié)合測定的結(jié)果，其比較了在借助于用乙腈充分洗滌來除去非特異性結(jié)合以后并在動態(tài)SPE條件下交聯(lián)量的影響以及在致孔劑(MIPe)中乙醇的影響。圖16.在用A)裝載溶液以及B)水中的2X20% (ν/ν)乙醇洗滌以后，在水性條件下，白藜蘆醇(0. 5mM)與結(jié)合的白藜蘆醇&111016/^聚合物)的MISPE結(jié)合。圖17.在水性條件下，乙醇和水含量對白藜蘆醇的保留/結(jié)合的影響。利用分別在20、50以及80%乙醇(ν/ν)中的白藜蘆醇溶液(0. 5mM)，評估了與MIP 8的結(jié)合。所示數(shù)據(jù)是指在A)裝載和B)洗滌物，其包含ImL裝載溶液(即，20、50以及80%乙醇)，以及三個50%含水乙醇(ν/ν)的連續(xù)洗滌物以后，結(jié)合的初始白藜蘆醇溶液的百分比。圖18.說明，MIP 8能夠從復(fù)雜原料濃縮白藜蘆醇，其中復(fù)雜原料包含相對于可獲得的結(jié)合位點的多種潛在競爭物。示意圖Α)示出錐形(spiked)葡萄籽提取物的HPLC 示蹤，其中提取物包含遮蔽白藜蘆醇的大量未知物質(zhì)；B)示出在施加白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液 (0. 5mM)以后洗脫的白藜蘆醇(RT 2. 735分鐘)；C)示出在施加尖刺葡萄籽提取物以后洗脫自MISPE柱的白藜蘆醇(RT 2. 735分鐘)以及D)示出在尖刺葡萄籽施加于各自的NISPE 柱以后的結(jié)果導(dǎo)致在2. 735分鐘處沒有可觀測峰，這表明沒有保留白藜蘆醇。圖19.在利用非印記對照聚合物(NIP)作為固定相進行SPE處理以后，㈧未處理花生餅粉、(B)MISPE處理花生餅粉以及(C)花生餅粉提取物的色譜圖。圖20.在利用非印記對照聚合物(NIP)作為固定相進行SPE處理以后的色譜圖 A)未處理花生餅粉，其中白藜蘆醇濃度為大約0. 98yg/mL花生餅粉提取物，B)MISPE處理花生餅粉，其導(dǎo)致白藜蘆醇濃度為大約19. 5 μ g/mL,以及C)花生餅粉提取物。
圖21.膽固醇和常見的植物留醇β-谷留醇、豆留醇、菜油留醇和菜子留醇以及植物甾烷醇谷甾烷醇和菜油甾烷醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖22.存在于Y-谷維素(oryzanol)中的主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖23·ΜΙΡ19(黑色)和NIP19(灰色)(Ch:4_VP:交聯(lián)劑)的性能。圖M.MIP20(黑色)和NIP20(灰色)(Ch:MMA:交聯(lián)劑)的性能。圖25·ΜΙΡ20(黑色)和ΝΙΡ20 (灰色)的性能，其中使用豆甾醇作為再結(jié)合分子。圖沈』1 19(黑色)和ΝΙΡ19(灰色)的性能，其中使用豆甾醇作為再結(jié)合分子。圖27.ΜΙΡ22(黑色)和ΝΙΡ22 (灰色)的性能，其中使用豆留醇作為再結(jié)合分子。圖觀』1 21(黑色)和ΝΙΡ21(灰色)的性能，其中使用豆甾醇作為再結(jié)合分子。圖29. ΜΙΡ21 (黑色)和ΝΙΡ21 (灰色)的性能，其中使用膽固醇作為再結(jié)合分子。圖30.ΜΙΡ20(黑色)和ΝΙΡ20 (灰色)的性能，其中使用膽固醇作為再結(jié)合模板以及2個循環(huán)的再結(jié)合。圖31.植物甾醇轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的阿魏酸酯。圖32. ΜΙΡ23 (黑色)和ΝΙΡ23 (灰色)的性能，其中使用膽固醇阿魏酸酯作為再結(jié)合模板G-VP作為功能單體)。圖33. ΜΙΡ24 (黑色)和NIPM (灰色)的性能，其中使用膽固醇阿魏酸酯作為再結(jié)合模板(甲基丙烯酸作為功能單體)。圖34.共價聚合物(1 10 (FM EDGMA) :MIP7)(黑色)和ΝΙΡ7 (灰色)的性能。圖35.混雜聚合物MIP 26 (黑色)和NIP 26 (灰色)的性能，其中使用膽固醇作為再結(jié)個底物(先前描述的)。圖36.相對于功能單體的(E)-白藜蘆醇的模擬滴定數(shù)據(jù)4-乙烯基吡啶0VP， ·)、丙烯酰胺(AAM，^)、甲基丙烯酸(MAA，·)、甲基丙烯酸甲酯(MMA，+)以及苯乙烯 (Sty, Δ )，其示出對于1-6當(dāng)量的單體的預(yù)測Ei值。圖37. (A)靜態(tài)結(jié)合等溫線，多批次，(E)-白藜蘆醇和多批次Pl的結(jié)合。測量結(jié)果是基于重復(fù)測量，最少重復(fù)3次。誤差條線表示標(biāo)準(zhǔn)平均誤差(SEM)。(B)MIP對于(E)-白藜蘆醇的選擇性能力插圖示出在&壯(^虹(1(34)方式中的結(jié)合數(shù)據(jù)。圖38.在靜態(tài)條件下，印記和非印記聚合物與(E)-白藜蘆醇的結(jié)合性能。圖39.來自單一分析物測定的靜態(tài)結(jié)合，其示出MIP Pl (黑色)和NIP對照附(灰色)對于(E)-白藜蘆醇1和7種多羥基二苯乙烯結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合分析物的量/克聚合物。圖40.烯烴1、酰胺2、以及亞胺3，與MIPkes的單一分析物選擇基結(jié)合。圖41.通過MIPKES、MIP_以及MIPws來識別￠)-白藜蘆醇。圖42.MIPKES與(E)-白藜蘆醇的相對結(jié)合能力。將(E)-白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液 (0. 5ymol)加載到 MIPkes (IOOmg)，分別在乙腈(黑色)或 Et0H/H20(l 1，ν/ν)(灰色) 中。隨后利用裝載溶劑洗滌每個柱并依據(jù)5點校正曲線確定留在柱上的(E)-白藜蘆醇量。圖43.花生餅粉提取物和MISPE洗脫液的RP-HPLC色譜圖未處理花生餅粉提取物(前線)、來自MIPkes MISPE柱的洗脫液(中線)以及來自NISPE柱的洗脫液(背線)。 在321nm處獲得色譜圖。在= 12. 2分鐘處洗脫(E)-白藜蘆醇。圖44. (A) (E)-白藜蘆醇結(jié)合于MIPgffi的靜態(tài)結(jié)合等溫線；
9(B)MIPstis(A)和MIPkes(^)對于(E)-白藜蘆醇的選擇性親和力的比較，表示為選擇性 (MIP-NIP)。圖45. MIPees, MIPgffi以及它們的各自的NIP對照聚合物對于(E)-白藜蘆醇1、3， 5-二羥基-N-(4-羥苯基)苯甲酰胺2、兒茶素3以及(E)-云杉新甙4的交叉反應(yīng)性研究。圖46.使用K0H/H20(8 2v/v)作為流動相溶劑B的RP-HPLC色譜圖，其中UV-Vis 檢測是在321nm處㈧花生餅粉提取物以及來自(B)MIPKES、(C)MIPgffi以及(D)NIPkes對照柱的洗脫液。在艮=12. 2分鐘處洗脫(E)-白藜蘆醇。通過LC-ESI-MS來證實(E)-白藜蘆醇的鑒別。圖47.示意性示出對獲自復(fù)雜食物來源的提取物進行相繼MISPE處理的構(gòu)想，從而多種生物活性成分可以分離自單一來源。圖48. RP-HPLC色譜圖(A)在K0H/H20(1 lv/v)中的花生餅粉提取物 (10g/500mL)以及由(B)MIPkes然后由((鴻^^^捕獲的分子的酸洗脫。通過在λ = 321nm 處的UV-Vis檢測來獲得色譜圖。在= 17分鐘處洗脫(E)-白藜蘆醇。圖49. RP-HPLC色譜圖㈧白藜蘆醇耗盡的花生餅粉提取物，獲自第一輪MISPE 處理以及由(B)MIPkes然后由(C)MIPgtis捕獲的分子的酸洗脫。通過在λ =321nm處的 UV-Vis檢測來獲得色譜圖。在= 15分鐘處進行A型原花青素洗脫。圖50.示意性示出用于從供料提取物分離多種目標(biāo)化合物的相繼SPE方式MIP柱的構(gòu)造。所有不想要的物質(zhì)通過每個MIP柱并留下結(jié)合于它們的相自的MISPE柱的多種目標(biāo)物質(zhì)，然后可以對其洗脫以各自產(chǎn)生高純度的各自的目標(biāo)化合物。
具體實施例方式MIP的形成通常包括以下步驟將模板和單體(通常過量)混合在一起以形成預(yù)聚合復(fù)合物，其包含伴隨有若干單體分子的單模板；然后通過借助于交聯(lián)劑來聚合單體以將預(yù)聚合復(fù)合物交聯(lián)成聚合物；以及隨后從交聯(lián)復(fù)合物除去模板。復(fù)合物的交聯(lián)單體包含表面和空腔，其互補于模板的形狀。通常在有致孔劑存在的情況下進行交聯(lián)反應(yīng)，其中致孔劑確保MIP具有包含若干孔的開放式結(jié)構(gòu)。這些孔便于溶液的分子移動通過MIP以致分子能夠相互作用于表面和空腔。具有和模板相同或類似形狀的分析物將比溶液中的其它分子更加有力地相互作用于MIP，以致MIP可以用來捕獲、濃縮和/或分離分析物。可以采用各種不同類型的制備方法，例如，(a)整體型制備、(b)通過研磨和篩分制備的顆粒、(c)沉淀聚合過程。本發(fā)明的發(fā)明人已合成了一系列基于白藜蘆醇的化合物以產(chǎn)生化合物庫，其可以存在于粗生物工藝原料中，以及其已用作模板來產(chǎn)生和研究MIP，其作為源自植物和其它生物來源的生物活性物質(zhì)的特制的親和吸附劑?？梢院铣伤羞@些分子以加入可變的功能特性(基于疏水性、親水性以及其它物理化學(xué)參數(shù))，從而產(chǎn)生具有限定物質(zhì)組成的分子?？梢栽O(shè)計、合成以及衍生這些化合物，使其具有各種不同的功能，從而包括(除了別的以外) 分布在各自的腳手架上的各種點的氨基、羧基、羥基、烷基或芳基取代基，進而產(chǎn)生化合物類似物的子集，其可以用作用于MIP的設(shè)計和表征的模板?？梢曰诹Ⅲw效應(yīng)和電子方面的考慮來選擇這些功能。具有增加數(shù)目的極性官能團或“點”的化合物更有可能有益于探測和限定所產(chǎn)生的MIP空腔。在MIP模板化過程中，增加可用于相互作用于功能單體分子的點的數(shù)目會潛在地增加為任何限定模板形成的空腔的特異性。作為本發(fā)明的方法的一般性的說明，本發(fā)明的發(fā)明人還已說明了，當(dāng)和甾醇或甾烷醇本身相比時，用多酚酸，如沒食子酸和阿魏酸，酯化的留醇和留烷醇可以用作具有另外 “點”的模板。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了的，所使用的技術(shù)適用于不同于白藜蘆醇(甾醇和甾烷醇)的分子。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了用于制備對于化合物具有所期望水平的特異性的分子印記聚合物(MIP)的方法，該方法包括以下步驟在有模板和致孔劑存在的情況下聚合包含一個或多個非共價鍵合位點的單體和交聯(lián)劑，以及隨后除去模板，其中模板結(jié)構(gòu)上類似于上述化合物或包括結(jié)構(gòu)上類似于上述化合物的部分，以及其中模板包含一個或多個非共價鍵合位點，其中所述非共價鍵合位點互補于單體的非共價鍵合位點，以及進一步其中模板具有比上述化合物更多或更少的非共價鍵合位點，從而與如果將化合物本身用作模板相比，對于上述化合物，MIP具有不同水平的特異性。術(shù)語‘非共價鍵合位點’是指能夠非共價鍵合相互作用的分子的基團或區(qū)域。非共價鍵合相互作用的實例包括氫鍵合相互作用、η-η鍵合相互作用、李斯特(Lifshitz)力相互作用以及范德華相互作用。優(yōu)選地，非共價鍵合位點是氫鍵合位點或π-π鍵合相互作用位點。更優(yōu)選地，非共價鍵合位點是氫鍵合位點。術(shù)語“互補的”是指在模板上的位點能夠經(jīng)由非共價鍵合相互作用結(jié)合于在單體上的位點，以及反過來也一樣。在模板包含結(jié)構(gòu)上類似于化合物的一部分的情況下，非共價鍵合位點可以位于 (i)上述部分上，(ii)模板的其余部分上，或(iii)如果存在兩個或更多非共價鍵合位點， 則位于上述部分上和模板的其余部分上。例如，如將在實施例中看到的，本發(fā)明的發(fā)明人已使用甾醇和甾烷醇的阿魏酸酯來制備根據(jù)本發(fā)明的MIP。這些化合物包含結(jié)構(gòu)上類似于留醇或留烷醇的部分(即留醇或甾烷醇本身)，并且分子的其余部分提供非共價鍵合位點。阿魏酸部分提供兩個氫鍵合位點和π-ji鍵合相互作用位點。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了用于制備對于化合物具有所期望水平的特異性的分子印記聚合物(MIP)的方法，該方法包括以下步驟在有模板和致孔劑存在的情況下聚合包含一個或多個氫鍵合位點的單體和交聯(lián)劑，以及隨后除去模板，其中模板結(jié)構(gòu)上類似于上述化合物或包含結(jié)構(gòu)上類似于上述化合物的一部分，以及其中模板包含互補于單體的一個或多個氫鍵合位點的一個或多個氫鍵合位點，以及進一步其中模板具有比上述化合物更多或更少的氫鍵合位點，從而與如果將化合物本身用作模板相比，對于上述化合物， MIP具有不同水平的特異性。在一種實施方式中，模板的氫鍵合位點是酚式羥基基團。在另一種實施方式中，單體的氫鍵合位點是吡啶氮。在一種優(yōu)選形式中，模板進一步包含一個或多個π-Ji鍵合相互作用位點以及單體進一步包含一個或多個互補的^I-JI鍵合相互作用位點。在一種實施方式中，模板的π-Ji鍵合相互作用位點是酚的芳環(huán)。在另一種實施方式中，單體的π-π鍵合相互作用位點是吡啶的芳環(huán)。本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，利用模板形成的MIP，其中上述模板結(jié)構(gòu)上類似于化合物或包含結(jié)構(gòu)上類似于化合物的部分以及進一步其中模板包含比化合物更多的氫鍵合位點， 與如果將化合物本身用作模板相比，將傾向于對化合物(以及對具有非常密切相關(guān)結(jié)構(gòu)的化合物)更具特異性。這是由于在模板上的另外的氫鍵合位點將會將更多單體單元吸引到預(yù)聚合復(fù)合物，以致通過模板形成的空腔將更緊密地符合模板，因而也更緊密地符合化合物，并在偶然空腔的打開使得模板的一個結(jié)合位點在聚合物中沒有互補的結(jié)合位點的情況下補償潛在結(jié)合位點的缺失。因此，在一種實施方式中，模板具有比化合物更多的氫鍵合位點，從而與如果化合物本身用作模板相比，對于化合物，MIP具有更高水平的特異性。另外，如果利用模板來形成MIP，其中模板結(jié)構(gòu)上類似于化合物或包含結(jié)構(gòu)上類似于化合物的一部分，以及模板包含比化合物更少的氫鍵合位點，那么與如果將化合物本身用作模板相比，MIP將傾向于對于化合物是較少特異的。雖然MIP對于化合物本身是較少特異的，但它對于化合物將仍然具有一定程度的特異性，從而同樣用于具有一些結(jié)構(gòu)相似性的化合物。這提供了一種方式，用于從復(fù)雜原料提取可能有用的化合物的類。必要時，包含上述化合物類的提取混合物可以經(jīng)受進一步的純化技術(shù)，如用更具選擇性的MIP進行提取，以分離子類或單獨的分子。因此，在另一種實施方式中，模板具有比化合物更少的氫鍵合位點，從而與如果將化合物本身用作模板相比，對于化合物，MIP具有更低水平的特異性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了的，本發(fā)明的方法便于形成MIP，其對于沒有或具有很少氫鍵合位點的化合物顯示改善水平的特異性，其中通過使用適當(dāng)選擇的確實具有更多氫鍵合位點的結(jié)構(gòu)類似化合物作為模板。這提供了一種有用的方式來分離否則難以從復(fù)雜混合物提取的化合物。就相對豐度而言，在食物、精細化工和制藥行業(yè)內(nèi)的大多數(shù)作為高價值產(chǎn)物的感興趣的化合物有可能包含至少一個氫鍵合位點。一些污染物，尤其是有毒或有害化合物，如多環(huán)芳族化合物，有可能屬于那些缺乏氫鍵合位點的家族，因此在有些情況下必須開發(fā)分子間相互作用的其它方式。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了的，氫鍵合的方式同樣適用于其它類型的非共價鍵合并可以用來設(shè)計對于化合物如多環(huán)烴具有選擇性的MIP。在第二方面，本發(fā)明提供了用于引導(dǎo)用于分子印記聚合物(MIP)(其將印記有包含一個或多個非共價鍵合位點的模板)的單體的選擇的方法，其中MIP是通過在有模板和致孔劑存在的情況下聚合所選單體和交聯(lián)劑并隨后除去模板來制備，所述方法包括以下步驟提供一組具有一個或多個非共價鍵合位點的單體，其中非共價鍵合位點互補于模板的非共價鍵合位點；評估在單體組的每種單體和模板之間形成的復(fù)合物的生成能；以及利用復(fù)合物的生成能作為選擇因素來從若干單體選擇所選單體。分子印記聚合物(MIP)的設(shè)計需要選擇將有利地相互作用于所期望的模板物質(zhì)的單體物質(zhì)，以致在模板和單體之間形成預(yù)聚合復(fù)合物。工具的使用，如預(yù)聚合復(fù)合物的分子模擬和NMR光譜，便于選擇適當(dāng)?shù)膯误w，其中通過進行'虛擬屏幕'，其可以減少為實現(xiàn)最優(yōu)化MIP開發(fā)所需要的實際聚合物制備的數(shù)目。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了用于引導(dǎo)用于分子印記聚合物(MIP)的單體的選擇的方法，上述分子印記聚合物將印記有包含一個或多個氫鍵合位點的模板，其中MIP 是通過在有模板和致孔劑存在的情況下聚合所選單體和交聯(lián)劑以及隨后除去模板來制備， 所述方法包括以下步驟提供一組具有一個或多個氫鍵合位點的單體，其中上述氫鍵合位點互補于模板的氫鍵合位點；評估在單體組的每種單體和模板之間形成的氫鍵合復(fù)合物的生成能；以及利用氫鍵合復(fù)合物的生成能作為選擇因素以從若干單體來選擇所選單體。在第三方面，本發(fā)明提供了用于在將印記有模板的分子印記聚合物(MIP)的制備中選擇單體與模板的比率的方法，其中MIP是通過在有模板和致孔劑存在的情況下聚合單體和交聯(lián)劑以及隨后除去模板來制備，所述方法包括以下步驟評估在模板和不同數(shù)目的單體之間形成的復(fù)合物的生成能；以及利用復(fù)合物的生成能作為選擇因素來選擇單體與模板的比率。在第二和第三方面的一種優(yōu)選形式中，通過分子模擬技術(shù)來評估復(fù)合物的生成能。例如，PM3幾何優(yōu)化可以用來產(chǎn)生復(fù)合物的理論生成能值。在第二和第三方面的另一種優(yōu)選形式中，通過NMR光譜技術(shù)來評估生成能。例如， 在酚式羥基基團的情況下，上述基團的1H NMR信號的低磁場移動的大小反映了氫鍵合相互作用的強度。通常，低磁場移動將是約0. 5至約1. 5ppm，雖然，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了的， NMR溶劑的選擇將是確定移動大小的重要因素。在第四方面，提供了用于制備MIP的預(yù)聚合復(fù)合物，其包含一種或多種單體，各自包含一個或多個非共價鍵合位點，以及模板，其中模板包含互補于單體的一個或多個非共價鍵合位點的一個或多個非共價鍵合位點。在一種優(yōu)選形式中，通過按照第二方面的方法來選擇單體。在另一種優(yōu)選形式中，通過第三方面的方法來選擇單體與模板的比率。在一種實施方式中，提供了用于制備MIP的預(yù)聚合氫鍵合復(fù)合物，其包含一種或多種單體，各自包含一個或多個氫鍵合位點，以及模板，其中模板包含互補于單體的一個或多個氫鍵合位點的一個或多個氫鍵合位點。在第五方面，提供了按照第一方面的方法制備的MIP。在一種實施方式中，通過第二方面的方法來選擇包含一個或多個非共價鍵合位點的單體。在第六方面，提供了一種MIP，其是通過在有模板和致孔劑存在的情況下聚合單體和交聯(lián)劑以及隨后除去模板來制備，其中通過第二方面的方法來引導(dǎo)單體的選擇或通過第三方面的方法來選擇單體與模板的比率。在本發(fā)明的方法和MIP中所使用的單體包括那些促進或便于氫鍵合相互作用和/ 或JI-JI鍵合相互作用的單體并且包括其中R選自由Ch烷基、酰胺、腈、羧酸、伯胺或仲胺、CO2Cy烷基、CyOH、丙烯酸羥烷基酯、苯、芐胺、萘、蒽、吡啶、嘧啶、嘌呤、N-咪唑組成的組；以及
權(quán)利要求
1.一種用于制備對于化合物具有所期望水平的特異性的分子印記聚合物(MIP)的方法，所述方法包括以下步驟在有模板和致孔劑存在的條件下聚合包含一個或多個非共價鍵合位點的單體和交聯(lián)劑，以及隨后除去所述模板，其中所述模板結(jié)構(gòu)上類似于所述化合物或包含結(jié)構(gòu)上類似于所述化合物的部分，以及其中所述模板包含一個或多個非共價鍵合位點，其中所述非共價鍵合位點互補于所述單體的非共價鍵合位點，以及進一步其中所述模板具有比所述化合物更多或更少的非共價鍵合位點，從而與如果將所述化合物本身用作所述模板相比，所述MIP對于所述化合物具有不同水平的特異性。
2.一種引導(dǎo)用在分子印記聚合物(MIP)中的單體的選擇的方法，所述分子印記聚合物將印記有包含一個或多個非共價鍵合位點的模板，其中所述MIP將如下制備通過在有模板和致孔劑存在的情況下聚合所選單體和交聯(lián)劑，并隨后除去所述模板，所述方法包括以下步驟提供一組具有一個或非共價鍵合位點的單體，所述非共價鍵合位點互補于所述模板的非共價鍵合位點，評估在所述單體組的每種單體和所述模板之間形成的復(fù)合物的生成能，以及利用所述復(fù)合物的所述生成能作為在所述選擇中的一個因素來從若干所述單體中選擇所選單體。
3.一種用于在分子印記聚合物(MIP)的制備中選擇單體與模板的比率的方法，其中所述分子印記聚合物將印記有所述模板，其中所述MIP將如下制備通過在有所述模板和致孔劑存在的情況下聚合單體和交聯(lián)劑，以及隨后除去所述模板，所述方法包括以下步驟評估在所述模板和不同數(shù)目的所述單體之間形成的復(fù)合物的生成能，以及利用所述復(fù)合物的所述生成能作為在所述選擇中的一個因素來選擇單體與模板的比率。
4.一種用于制備MIP的預(yù)聚合復(fù)合物，包含各自包含一個或多個非共價鍵合位點的一種或多種單體以及模板，其中所述模板包含與所述單體的一個或多個非共價鍵合位點互補的一個或多個非共價鍵合位點。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備的MIP。
6.一種通過在有模板和致孔劑存在的情況下聚合單體和交聯(lián)劑以及隨后除去所述模板來制備的MIP，其中所述單體的選擇是通過權(quán)利要求2所述的方法來引導(dǎo)的。
7.一種用于設(shè)計包含反式乙烯接頭的化合物的類似物的方法，所述方法包括用亞胺、 酰胺或仲胺接頭替代所述反式乙烯接頭。
8.一種用于制備對于具有反式乙烯接頭的化合物具有特異性的MIP的方法，所述方法包括以下步驟在有模板和致孔劑存在的情況下聚合單體和交聯(lián)劑，并隨后除去所述模板， 其中所述模板是所述化合物的類似物，以及進一步其中所述類似物是根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法進行設(shè)計的。
9.一種印記有多酚或其類似物的分子印記聚合物(MIP)，其中，所述MIP包含聚合的 4-乙烯基吡啶以及聚合的交聯(lián)劑。
10.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求9所述的MIP的方法，所述方法包括以下步驟(i)在有所述多酚或其類似物以及致孔劑存在的情況下聚合所述MIP ；以及( )從所述MIP中除去所述多酚或其類似物。
11.一種用于通過將樣品暴露于根據(jù)權(quán)利要求1所述的MIP以從所述樣品中提取一種或多種多酚的方法。
12.一種用于通過層析法至少部分地分離樣品的成分的方法，所述方法包括以下步驟(i)制備包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的MIP的層析柱；(ii)使所述樣品通過所述柱；以及 (iii)從所述柱中收集所述樣品的流分。
13.一種用一種或多種化合物印記的MIP，所述化合物選自由留醇和留烷醇、以及它們的類似物或衍生物組成的組，其中所述MIP包含聚合的單體。
14.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求13所述的MIP的方法，所述方法包括以下步驟(i)在有所述留醇或留烷醇、或它們的類似物或衍生物、以及致孔劑存在的情況下，聚合所述MIP;以及( )從所述MIP中除去所述留醇或留烷醇、或它們的類似物或衍生物。
15.一種通過將樣品暴露于根據(jù)權(quán)利要求13所述的MIP而從所述樣品中提取一種或多種甾醇或留烷醇、或它們的類似物或衍生物的方法。
16.一種通過層析法至少部分地分離樣品的成分的方法，所述方法包括以下步驟(i) 制備包含根據(jù)權(quán)利要求13所述的MIP的層析柱；(ii)使所述樣品通過所述柱；以及(iii) 從所述柱中收集所述樣品的流分。
17.—種如本文描述的新型化合物。
18.—種至少部分地分離包含兩種或更多種成分的樣品中的所述成分的方法，所述方法包括將所述樣品順序地暴露于至少兩種MIP，其中每種MIP已印記有不同的模板。
19.一種包封在可滲透網(wǎng)中的MIP。
20.一種用于從樣品中提取成分的方法，包括將所述樣品暴露于根據(jù)權(quán)利要求19所述的 MIP。
21.—種印記有(E)-5-[(4-羥基-苯基亞氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇或3，5_ 二羥基-N-(4-羥苯基)苯甲酰胺的MIP，其中所述MIP包含聚合的單體。
22.一種用于從樣品中提取白藜蘆醇的方法，所述方法包括將所述樣品暴露于根據(jù)權(quán)利要求21所述的MIP。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于設(shè)計分子印記聚合物(MIP)的方法，上述分子印記聚合物可用于從各種生物工藝原料和廢棄物中提取生物活性化合物。本發(fā)明進一步涉及通過本發(fā)明的方法設(shè)計的MIP。
文檔編號C08F26/06GK102369223SQ201080014560
公開日2012年3月7日 申請日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月29日
發(fā)明者亞米爾·喬杜里, 克利·路易斯·圖克, 史蒂文·朗福德, 巴西爾·達尼勒克, 拉赫蘭·施瓦茨, 米爾頓·T·W·赫爾恩, 維多利亞·塔瑪拉·佩克約諾克, 西蒙·哈里斯, 賴因哈德·英厄馬爾·博伊森 申請人:國家科學(xué)和工業(yè)研究組織, 莫納什大學(xué)