專利名稱：透明質(zhì)酸及/或其鹽的提純方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸及/或其鹽的提純方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸，除了作為化妝品的保濕劑以外，還可用作眼科、骨科、皮膚科等的藥劑制品。透明質(zhì)酸可以從動物組織，例如，可以從雞的雞 冠、牛眼玻 璃體等的提取物制造而得，但因為作為雜質(zhì)的硫酸軟骨素等的混入，或因組織內(nèi)含有透明質(zhì)酸酶等使其容易被低分子量化，也進行具有透明質(zhì)酸生產(chǎn)能力的微生物的培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中制造透明質(zhì)酸(發(fā)酵法)(非專利文獻I以及專利文獻I)。使用提取法或發(fā)酵法制造得到的透明質(zhì)酸中，存在蛋白質(zhì)或致熱源等雜質(zhì)，因而對將這些雜質(zhì)分離去除后得到高純度制品的方法進行了研究。特別是在制造的初期階段的雜質(zhì)的去除，能夠減輕之后的提純工序的負荷，有望開發(fā)出得到能夠作為藥劑制品使用的高純度制品的方法。作為高純度提純透明質(zhì)酸的方法，為了去除例如蛋白質(zhì)、核酸等副產(chǎn)品以及來源于培養(yǎng)基的無機鹽類，已知將含有透明質(zhì)酸及其鹽和雜質(zhì)的透明質(zhì)酸溶液，通過帶正電的過濾器后，加入水溶性有機溶劑，使透明質(zhì)酸鈉析出·沉淀，提取上清液實現(xiàn)提純的方法(非專利文獻2)。非專利文獻I :Journal of General Microbiology, 85, 372-375，1976專利文獻I :日本國專利公報“特公平4-12960號公報”專利文獻2 日本國專利公報“特開平9-324001號公報”

發(fā)明內(nèi)容
然而，要得到工業(yè)規(guī)模下能夠作為藥劑制品使用的高純度的透明質(zhì)酸類，上述方法也還存在透明質(zhì)酸的回收率低等問題。鑒于上述情況，本發(fā)明旨在提供一種簡便且高收率的，用于工業(yè)規(guī)模下的高純度的透明質(zhì)酸類的提純方法。本發(fā)明人等為了達到上述目的，對從含有透明質(zhì)酸及其鹽和雜質(zhì)的透明質(zhì)酸溶液中高效地分離去除雜質(zhì)，簡便且高效地提純得到高純度的透明質(zhì)酸類的方法，進行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將透明質(zhì)酸類溶液調(diào)節(jié)至酸性端PH后，經(jīng)超濾膜進行透析處理，能夠有效地去除核酸、致熱源、蛋白質(zhì)、乳酸、無機鹽類等，完成了本發(fā)明。換句話說，本發(fā)明提供一種透明質(zhì)酸及/或其鹽的提純方法，包括將含有透明質(zhì)酸及其鹽和雜質(zhì)的透明質(zhì)酸溶液調(diào)節(jié)至酸性端PH后、經(jīng)超濾膜進行透析處理的工序。該制造方法能夠有效地去除雜質(zhì)。
具體實施例方式〔用語說明〕本說明書中的“透明質(zhì)酸及/或其鹽”和“透明質(zhì)酸類”為同義，可以交換使用，表示游離的透明質(zhì)酸、以及、在不損害本發(fā)明目的的范圍內(nèi)可以使用的任意的透明質(zhì)酸鹽(并非限定于此，例如，鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋰鹽等的金屬鹽，鹽酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽等酸加成物等)或水合物，或以上這些的混合物。在此，透明質(zhì)酸是指，N-乙酰-D-葡糖胺與D-葡萄糖醛酸相結(jié)合的雙糖單元重復(fù)相連成鏈的高分子量的多糖類，各種鹽主要是指葡萄糖醛酸部分呈鹽的形式。透明質(zhì)酸通過可以折疊的鏈部分與D-葡萄糖醛酸部分的羧基的負電荷的相互作用，使其容易向空間擴展，因而能夠與大量的水結(jié)合形成凝膠。此外，即使是低濃度，由于分子間作用力強，所以具有較高的粘性。從這樣的作用出發(fā)，例如，具有濕潤關(guān)節(jié)的作用、軟化皮膚的作用等，生理上也擔當這樣的角色。透明質(zhì)酸類中，也已知分子量約為200萬Da的透明質(zhì)酸鈉，與分子量約為80萬Da的物質(zhì)相比，作為藥劑制品，對于變形性膝關(guān)節(jié)病、肩周炎、慢性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等的治療能發(fā)揮優(yōu)良的療效(薬理△治療，Vol. 22, No. 9, 289(1994);薬理i治療，Vol. 22, No. 9，319(1994))。此外，在其他方面，已知被用于外科手術(shù)后的粘連的預(yù)防,還已知作為皮膚科領(lǐng)域、眼科領(lǐng)域中的藥劑制品的效果，一部分已經(jīng)被普遍用于臨床。作為藥劑制品被使用時，優(yōu)選使用平均分子量為100萬以上的透明質(zhì)酸類。進而，考慮到獲取和處理的容易程度時，優(yōu)選平均分子量為100萬 500萬Da的透明質(zhì)酸類作為藥劑制品，特別優(yōu) 選平均分子量為150萬 400萬Da的透明質(zhì)酸類。此外，如此高分子量的透明質(zhì)酸類用于化妝品用途時，從其高保濕力來說，也能發(fā)揮優(yōu)良的效果。本說明書中的“平均分子量”除特別注明外，表示透明質(zhì)酸類平均分子量時，均為粘度平均分子量。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過常用方法來求得粘度平均分子量。優(yōu)選能夠使用各國藥典等一般使用的測定方法求得，更優(yōu)選能夠使用日本藥典中所使用的測定方法求得。作為一個例子，例如，期望透明質(zhì)酸鈉具有接近本申請的發(fā)明的平均分子量(150萬 390萬)時，并非限定于此，其平均分子量，使用特性粘度[η ]，可以根據(jù)下列公式求得。式I
I
/[ ] X Io5^Fr 平均分子量=ψ···η_____8____________)作為藥劑制品，作為溶解透明質(zhì)酸類的注射用溶解劑，可以酌情使用在注射用水、生理鹽水等中，加入了含有如酸、堿、磷酸鹽的緩沖劑的PH調(diào)節(jié)劑等的通常使用的注射用溶解劑(例如，各國藥典認可的注射用溶解劑)。這些透明質(zhì)酸類，可以是通過從動物組織中提取的提取法制造而得的，也可以是利用生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物菌株使之發(fā)酵而得的發(fā)酵法制造的。然而，因為從動物組織中提取得到的提取物中，其他粘多糖等雜質(zhì)比較多，透明質(zhì)酸類的分子量也小，所以優(yōu)選使用通過發(fā)酵法得到的。適用于本發(fā)明的發(fā)酵法的一個例子中，例如使用鏈球菌屬微生物，能夠通過已知方法得到透明質(zhì)酸類。通過發(fā)酵法得到的發(fā)酵液用于本發(fā)明的方法等時，優(yōu)選使用經(jīng)已知方法，例如，離心分離或過濾處理等進行了除菌的溶液。根據(jù)不同情況，也可以使用加入乙醇等水溶性有機溶劑析出提純透明質(zhì)酸的溶液。此外，也可以使用經(jīng)氧化鋁等處理過的溶液。本說明書中的“鏈球菌”包括，能夠生產(chǎn)透明質(zhì)酸的鏈球菌屬(Streptococcus)的任意細菌·其突變株。特別是，優(yōu)選使用如專利文獻2中記載的馬鏈球菌FM-100 (微工研菌寄第9027號)、如日本特開平2-234689號公報中所述的馬鏈球菌FM-300 (微工研菌寄第2319號)能夠即高收率又穩(wěn)定地生產(chǎn)透明質(zhì)酸的突變株。作為適用于透明質(zhì)酸生產(chǎn)的鏈球菌屬的細菌的例子，此外，雖然并不限定于此，可以列舉出，例如，馬鏈球菌(Streptococcusequi)、獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)、似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、化胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)以及其突變株等。本說明書中的“超濾膜”是指，孔徑為O. 001 0. 01 μ m的過濾膜及/或截留分子量為1000 300000左右的過濾膜。超濾膜的材料，大致可以分為無機膜和有機膜，進一步劃分為疏水性和親水性。作為疏水性的有機膜，并非限定于此，可以列舉出聚砜、聚醚砜、聚醚、聚偏二氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯等。作為親水性的有機膜，并非限定于此，可以列舉出聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰亞胺、醋酸纖維素等。其濾芯形狀包括，平膜、管狀膜、螺旋膜、中空纖維(中空絲)膜等、所有模塊形式。作為過濾方式，包括全量過濾方式和錯流方式。全量過濾方式是指，對供應(yīng)到膜的水的全部進行過濾的方式。與此相對的，錯流方式是指，通過使水流相對于膜面平行流動， 抑制供應(yīng)至膜的水中含有的懸浮物質(zhì)或膠體在膜面上堆積的現(xiàn)象的同時進行過濾的方式。錯流方式，并非限定于此，包括一次通過方式、反沖洗方式以及回流方式。一次通過方式是指，如圖I的A所示，經(jīng)過超濾膜的透過液不進行再利用的過濾方式。反沖洗方式是指，如圖I的B所示，包括經(jīng)過超濾膜的透過液存儲到透過液罐中，從透過液罐輸送至超濾膜，沖洗過濾膜表面附著的透明質(zhì)酸類的工序的過濾方式?；亓鞣绞绞侵?，如圖I的C所示，包括通過關(guān)閉透過液閥門使經(jīng)過超濾膜的透過液回流，沖洗過濾膜表面附著的透明質(zhì)酸類的工序的過濾方式。本說明書中的“雜質(zhì)”是指，除了透明質(zhì)酸類、水以及其它溶劑成分、無機鹽以外的物質(zhì)，特別是，使用作為最終產(chǎn)品的透明質(zhì)酸類時可能帶來不良影響的物質(zhì)(致熱源等)。作為主要的雜質(zhì)源，可以列舉出在透明質(zhì)酸類生產(chǎn)階段中來自組織、微生物或培養(yǎng)液(培養(yǎng)基)的物質(zhì)、或者、在此后的提純階段等中混入的物質(zhì)。本說明書中，作為雜質(zhì)的例子，雖然并不限定于此，可以列舉出，組織或菌體、蛋白質(zhì)、核酸、多糖類、低分子化合物、或者內(nèi)毒素等。在作為雜質(zhì)的組織或菌體中，雖然并不限定于此，分別包括，來自提取法所用的作為提取原料的組織的組織片等，或發(fā)酵法所用微生物的菌體或菌體片等。作為雜質(zhì)的蛋白質(zhì)中，雖然并不限定于此，包括來自上述組織、菌的蛋白質(zhì)，或在生產(chǎn)后的工序中混入的蛋白質(zhì)等。作為雜質(zhì)的內(nèi)毒素，雖然并不限定于此，包括來自上述菌的脂多糖類等。本說明書中的“低分子化合物”是指，與透明質(zhì)酸類相比，分子量較小的化合物，雖然并不限定于此，例如，分子量2000Da以下、或者分子量1000Da、或分子量500Da以下的化合物。像這樣的低分子化合物包括，各種氨基酸、有機酸(例如、乳酸)、糖(例如、葡萄糖)
坐寸ο本說明書中的“去除”，不僅包括完全去除目標物質(zhì)的情況，還包括部分去除(減少該物質(zhì)的量)的情況。本說明書中的“提純”，包括去除任意的或特定的雜質(zhì)。關(guān)于本說明書中各數(shù)值范圍，分別包括用“ ”表示的上限值以及下限值?！矊嵤┓绞健潮景l(fā)明，雖然并不限于此，例如，涉及以下的實施狀態(tài)。
實施狀態(tài)I.透明質(zhì)酸及/或其鹽的提純方法，包括將含有透明質(zhì)酸及/或其鹽和雜質(zhì)的透明質(zhì)酸溶液調(diào)節(jié)至酸性端PH后，經(jīng)超濾膜進行透析處理從而去除雜質(zhì)的工序。實施狀態(tài)2.在滿足下列式子的超濾膜的截留分子量與經(jīng)超濾膜進行透析處理時的pH關(guān)系的條件下，pH彡-5X10_5X(截留分子量)+ 4. 4978經(jīng)超濾膜進行透析處理的，如實施狀態(tài)I所述的方法。實施狀態(tài)3.超濾膜的截留分子量為25000 35000的，透析處理時的pH為3. 3以下的，實施狀態(tài)I或2所述的方法。 上述超濾膜的截留分子量為12000 14000的，透析處理時的pH為3. 9以下的、實施狀態(tài)I或2所述的方法。實施狀態(tài)4.上述超濾膜的截留分子量為9000 11000的，透析處理時的pH為4. I以下的，實施狀態(tài)I或2所述的方法。實施狀態(tài)5.上述超濾膜的截留分子量為6000 8000的，透析處理時的pH為4. 2以下的，實施狀態(tài)I或2所述的方法。實施狀態(tài)6.上述超濾膜的截留分子量為4000 5000的，透析處理時的pH為4. 3以下的，實施狀態(tài)I或2所述的方法。實施狀態(tài)7.上述超濾膜為疏水性有機膜的，實施狀態(tài)I至6任何一項所述的方法。實施狀態(tài)8.上述處理的過濾方式為回流方式的，實施狀態(tài)I至7任何一項所述的方法。實施狀態(tài)9.上述處理時的過濾流速為20 50L/m2 · hr的，實施狀態(tài)I至8任何一項所述的方法。實施狀態(tài)10.上述雜質(zhì)包括，菌體、蛋白質(zhì)、核酸、低分子化合物、或內(nèi)毒素的，實施狀態(tài)I至9任何一項所述的方法。實施狀態(tài)11.提純后的上述透明質(zhì)酸及/或其鹽的平均分子量為350萬 700萬Da的，實施狀態(tài)I至10任何一項所述的方法。實施狀態(tài)12.上述透明質(zhì)酸類溶液中，透明質(zhì)酸及/或其鹽的濃度為I 5g/L的，實施狀態(tài)I至11任何一項所述的方法。接下來，對本發(fā)明的狀態(tài)進行說明。本發(fā)明的狀態(tài)(例如、實施狀態(tài)I)為透明質(zhì)酸及/或其鹽的提純方法，包括將含有透明質(zhì)酸及/或其鹽和雜質(zhì)的透明質(zhì)酸溶液調(diào)節(jié)至酸性端PH后，經(jīng)超濾膜進行透析處理從而去除雜質(zhì)的工序。該提純方法，通過將其pH調(diào)節(jié)至酸性端，減少經(jīng)超濾膜過濾時透明質(zhì)酸類的損失，可以高效地去除雜質(zhì)。滿足下列式子的超濾膜的截留分子量與經(jīng)超濾膜進行透析處理時的pH關(guān)系的條件下，pH彡-5X10_5X(截留分子量)+ 4. 4978經(jīng)超濾膜進行透析處理，能夠?qū)嵸|(zhì)上不損失透明質(zhì)酸類而進行提純。作為滿足上式的超濾膜的截留分子量和經(jīng)超濾膜進行透析處理時的pH，例如，可以列舉出，對于截留分子量為35000的超濾膜pH為2. 7，對于截留分子量為30000的超濾膜pH為3. 0，對于截留分子量為25000的超濾膜pH為3. 3，對于截留分子量為20000的超濾膜pH為3. 5，對于截留分子量為14000的超濾膜pH為3. 8，對于截留分子量為13000的超濾膜pH為3. 9，對于截留分子量為12000的超濾膜pH為3. 9，對于截留分子量為11000的超濾膜pH為4. 0，對于截留分子量為10000的超濾膜pH為4. 0，對于截留分子量為9000的超濾膜pH為4. 1，對于截留分子量為8000的超濾膜pH為4. 1，對于截留分子量為7000的超濾膜pH為4. 2，對于截留分子量為6000的超濾膜pH為4. 2，對于截留分子量為5000的超濾膜pH為4. 3，對于截留分子量為4000的超濾膜pH為4. 3。 在此，“實質(zhì)上不損失透明質(zhì)酸類”是指，透明質(zhì)酸類的損失率為3%以下(回收率為97%以上)。使用截留分子量高的膜，引起透明質(zhì)酸類通過超濾膜的損失風(fēng)險變大，另一方面，使用截留分子量低的膜，降低了蛋白質(zhì)等相對高分子雜質(zhì)的去除效率。通過上述實施方式的方法，無論使用截留分子量高的膜，或截留分子量低的膜，通過調(diào)節(jié)PH至適合于膜的截留分子量的PH，都能夠在不損失透明質(zhì)酸類的情況下去除雜質(zhì)，因此上述狀態(tài)的方法中對所使用的超濾膜的截留分子量，不作特別限定。例如使用具有25000 35000的截留分子量的超濾膜時，通過調(diào)節(jié)PH至3. 3以下能夠在不損失透明質(zhì)酸類的情況下進行提純。使用具有12000 14000的截留分子量的超濾膜時，通過調(diào)節(jié)pH至3. 9以下能夠在不損失透明質(zhì)酸類的情況下進行提純。使用具有9000 11000的截留分子量的超濾膜時，通過調(diào)節(jié)pH至4. I以下能夠在不損失透明質(zhì)酸類的情況下進行提純。使用具有6000 8000的截留分子量的超濾膜時，通過調(diào)節(jié)PH至4. 2以下能夠在不損失透明質(zhì)酸類的情況下進行提純。使用具有4000 5000的截留分子量的超濾膜時，通過調(diào)節(jié)pH至4. 3以下能夠在不損失透明質(zhì)酸類的情況下進行提純。在此，超濾膜的截留分子量，可以通過使用如表I所示的標志性物質(zhì)進行過濾，通過分別調(diào)查截留率為90%時對應(yīng)的分子量來決定。表I用于測定截留分子量的標志性物質(zhì)
Itl分子量I推測分子直徑(mn)
蔗糖340Π
棉子糖590O維生素 B12 ~1360~ Τ
桿菌肽 Ti
胰島素5700
細胞色素C13000
肌紅蛋白17000Γο
~Cl-胰凝乳蛋白酶原25000Γ6
~胃蛋白酶35000570~卵白蛋白430005 6
牛血清白蛋白660006.4
醛縮酶1420008 2
~Y -球蛋白1500008Λ上述狀態(tài)的方法中所使用的超濾膜的材料，并無特別限定，但從去除雜質(zhì)的角度出發(fā)，優(yōu)選疏水性有機膜，更優(yōu)選聚砜、聚醚砜、聚醚、聚偏二氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯。作為上述狀態(tài)的方法中所使用的超濾膜，可以使用例如、PM-IO, ΡΜ-50、ΡΜ-100 (Koch公司制造)、NTU-3050 (日東電工株式會社制造)、IRIS3065 (羅納·普朗克公司制造)、FS-10 (旭化成株式會社制造)、MU-6303 (Kuraray株式會社制造)、DUS0400 (Daicel化學(xué)工業(yè)株式會社制造)、SLP_3053 (旭化成化學(xué)株式會社制造)等，但并不只限制于此。上述狀態(tài)的方法中的過濾方式，并非特別限定，從水的膜過濾流速易于穩(wěn)定、延長過濾膜壽命等角度出發(fā)，優(yōu)選錯流方式，其中特別優(yōu)選回流方式。上述狀態(tài)的方法中，用超濾膜處理時透明質(zhì)酸類溶液的過濾流速，雖然因透明質(zhì)酸類溶液的性狀或超濾膜的種類而有所不同，不能統(tǒng)一規(guī)定，但例如，工業(yè)規(guī)模中透明質(zhì)酸類的提純，優(yōu)選20L/m2 · hr以上,更優(yōu)選25L/m2 · hr以上,特別優(yōu)選30L/m2 · hr以上。從透明質(zhì)酸類被切斷而引起分子量下降的角度出發(fā)，透明質(zhì)酸類溶液的過濾中的過濾流速，優(yōu)選100L/m2 · hr以下，更優(yōu)選50L/m2 · hr以下。上述狀態(tài)的方法中，并不限定用于輸送溶液的壓力，優(yōu)選經(jīng)過普通加壓使之通過過濾膜。特別優(yōu)選用泵等加壓輸送的方法。對于輸送溶液時用泵施加壓力，只要是不發(fā)生過濾膜破損或堵塞孔等使其性能惡化的現(xiàn)象就不作特別限定。作為對過濾膜施加的壓力，優(yōu)選 O. OlMPa 以上 O. 30MPa,更優(yōu)選 O. 03MPa 以上 O. 20MPa,特別優(yōu)選 O. 05MPa 以上 O. IOMPa0進而，上述狀態(tài)的方法中，提純時能夠降低透明質(zhì)酸類分子量的下降，特別是，在高分子量(例如，提純后的平均分子量為350萬 700萬Da)的透明質(zhì)酸類的提純中，能夠發(fā)揮優(yōu)良效果。此外，對于歷來難于處理的較高濃度(例如，O. I 20g/L、0. 5 15g/L、I 10g/L)的透明質(zhì)酸類溶液，也能夠有效地進行處理。此外，上述狀態(tài)的方法，能夠抑制透明質(zhì)酸類的損失為低損失的同時，還能夠有效地分離 去除雜質(zhì)，作為雜質(zhì)，不僅包括通常超濾膜能夠去除的低分子化合物(例如、氨基酸、糖、有機酸)，還包括高分子化合物(例如、核酸、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì))。此外，上述狀態(tài)的方法，還能夠?qū)怂?、?nèi)毒素及/或蛋白質(zhì)的去除發(fā)揮優(yōu)良效果。使用上述狀態(tài)的方法時的透明質(zhì)酸類溶液的透明質(zhì)酸類濃度，從因溶液粘度高所帶來的處理困難，以及透明質(zhì)酸類的溶解度的角度出發(fā)，并非限定于此，優(yōu)選0. I 20g/L，最優(yōu)選I 10g/L。此外，上述狀態(tài)的方法中，為了降低透明質(zhì)酸類溶液的粘度，可以使透明質(zhì)酸類溶液與氯化鈉等鹽類共存。這種情況下，為了無損于提純效果，優(yōu)選避免與高濃度的鹽共存。作為這樣的鹽的共存的具體例子，可以列舉出在透明質(zhì)酸類溶液中加入0. I 5重量％的氯化鈉。
使用上述狀態(tài)的方法時透明質(zhì)酸類溶液的溫度，并非限定于此，優(yōu)選0 80°C。溫度在80°C以下時，能夠強烈抑制處理中的透明質(zhì)酸類的分解以及分子量的下降。此外，進行超濾透析處理時，作為膜的預(yù)處理，優(yōu)選使用2%以下的堿(例如、氫氧化鈉水溶液)、過氧化物(例如、次氯酸鈉水溶液)、表面活性劑、檸檬酸、檸檬酸銨 加酶洗滌劑等的藥劑對膜實施洗凈處理的化學(xué)方法，或，刷、海綿球、空氣噴射法等的物理方法進行。本發(fā)明的其他狀態(tài)為，上述第一狀態(tài)中所述エ序以外，還可以包括使透明質(zhì)酸類溶液與無機吸附劑、有機吸附劑及/或活性炭相接觸的エ序。此外，考慮到在之后必要的分離 提純エ序等，優(yōu)選避免有必要追加提純エ序的成分的混入。即，為了避免新雜質(zhì)的混入的本發(fā)明的其它狀態(tài)為，上述第一狀態(tài)中，不包括使透明質(zhì)酸類溶液在超濾后與無機吸附劑或有機吸附劑相接觸的エ序的提純方法。本發(fā)明的其他狀態(tài)為，上述第一狀態(tài)中，不包括使透明質(zhì)酸類溶液與無機吸附劑或有機吸附劑相接觸的エ序。本發(fā)明中，因為超濾也能夠起到充分的提純效果，所以在重視避免新雜質(zhì)混入時，優(yōu)選超濾單獨處理。當然，這種情況下，除超濾以外，也可以進行其他的提純處理等的エ序。此外，本發(fā)明的其他狀態(tài)為，上述狀態(tài)中的透明質(zhì)酸類為經(jīng)馬鏈球菌FM-100(微エ研條寄第9027號)或馬鏈球菌FM-300 (微エ研條寄第2319號)生產(chǎn)而得的。使用經(jīng)這些微生物生產(chǎn)而得的透明質(zhì)酸類作為提純對象，能夠得到雜質(zhì)較少、分子量高的透明質(zhì)酸類提純物，特別是作為醫(yī)藥品使用時，能夠發(fā)揮優(yōu)良效果。通過使用上述狀態(tài)的提純方法，能夠減輕透明質(zhì)酸類的分離 提純エ序的負擔，因此涉及上述狀態(tài)的提純方法，在制造的エ業(yè)過程的較初期階段的應(yīng)用是特別有效的。而且，上述實施狀態(tài)、方式中進行說明的提純方法等，并不限定本發(fā)明，只是意圖舉例說明而披露的。本發(fā)明的技術(shù)范圍，是通過專利權(quán)利要求的所述范圍確定的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在專利權(quán)利要求的范圍內(nèi)所記載的發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)，進行各種設(shè)計上的變更。例如，上述提純方法，也可以是包括其他エ序，或者在上述提純方法之后繼續(xù)實施其他エ序 方法的制造透明質(zhì)酸類等的方法。作為這樣的エ序 方法，可以列舉出，例如，培養(yǎng)產(chǎn)生透明質(zhì)酸的微生物菌株的エ序，從產(chǎn)生透明質(zhì)酸的微生物菌株的培養(yǎng)液中制造培養(yǎng)濾液的エ序，離心分離提純對象溶液的エ序、中和對象溶液的エ序、將提純對象溶液精密過濾的エ序、將對象溶液進行透析處理的エ序、向提純對象溶液中加入芳香族系吸附樹脂并攪拌以及過濾的エ序、用色譜法對對象溶液進行提純的エ序、將活性炭從對象溶液中分離的エ序、從對象溶液中去除活性炭的エ序、加入有機溶劑使透明質(zhì)酸類沉淀的エ序、使透明質(zhì)酸類結(jié)晶的エ序、將透明質(zhì)酸類干燥的エ序等?！矊嵤├辰酉聛?，通過實施例對本發(fā)明進行更加具體的說明，但本發(fā)明并不限于此。實施例I取使用馬鏈球菌FM-100 (微エ研菌寄第9027號)培養(yǎng)的培養(yǎng)液45L，用純水稀釋至80L(透明質(zhì)酸鈉濃度2. Og/1)，經(jīng)離心分離去除菌體。將得到的粗制透明質(zhì)酸的pH調(diào)節(jié) 至2. 9后，使用截留分子量為30000、材料為聚砜的超濾膜(Koch公司制造^PM-IOO) 2m2，過濾流速為30L/m2 hr、反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍稀釋操作，透析次數(shù)為10次，用回流方式進行處理。得到的溶液80L中溶解食鹽2. 4kg，調(diào)節(jié)pH至7后用こ醇240L析出、用こ醇8L清洗，在40°C下進行真空干燥得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯不于表2中。實施例2實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至2.9后，使用截留分子量為30000、材料為聚醚砜的超濾膜(旭化成株式會社制造^S-IO) 5m2,過濾流速為30L/m2 *hr,反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍純水稀釋操作，透析次數(shù)為11次、用回流方式進行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯示于表2中。實施例3實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至3.3后，使用截留分子量為20000、材料為聚砜的超濾膜(日東電エ株式會社制造 NTU-3050)3m2，過濾流速為30L/m2 hr，反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍純水稀釋操作，透析次數(shù)為8次、用回流方式進行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯示于表2中。實施例4實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至2.9后，使用截留分子量為30000、材料為聚偏ニ氟こ烯的超濾膜(羅納 普朗克公司制造41^133065) 5m2，過濾流速為30L/m2 hr，反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍純水稀釋操作，透析次數(shù)為9次、用回流方式進行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯示于表2中。實施例5實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至2.7后，使用截留分子量為40000、材料為聚醚砜的超濾膜(Daicel化學(xué)エ業(yè)株式會社制造 DUS0400) 5m2，過濾流速為30L/m2 hr，反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍純水稀釋操作，透析次數(shù)11次，用回流方式進行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉150g。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯示于表2中。實施例6實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至3.7后，使用截留分子量為13000、材料為聚砜的超濾膜(Kuraray株式會社制造 MU-6303) 5m2,過濾流速為30L/m2 hr，反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍純水稀釋操作，透析次數(shù)為11次，用回流方式進行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯示于表2中。實施例7實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至3.7后，使用截留分子量為10000、材料為聚砜的超濾膜(旭化成化學(xué)公司制造 SLP-3053)4. 5m2，過濾流速為30L/m2 hr，反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍純水稀釋操作，透析次數(shù)為11次，用回流方式進 行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯示于表2中。對比例I實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至5.5后，使用截留分子量為10000、材料為聚砜的疏水性超濾膜(Koch公司制造 PM-10) 2m2,過濾流速為30L/m2 hr,反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍稀釋操作，透析次數(shù)為15次，用回流方式進行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯不于表2中。對比例2實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至3.6后，使用截留分子量為20000、材料為醋酸纖維素的親水性超濾膜(DDS公司制造 CA600PP)4. 5m2，過濾流速為30L/m2 hr，反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍純水稀釋操作，透析次數(shù)為10次，用回流方式進行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯示于表2中。對比例3實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至3.3后，使用截留分子量20000、材料為醋酸聚酰亞胺的親水性超濾膜(日東電エ株式會社制造,1^-4220)51112,過濾流速為30L/m2 hr，反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍純水稀釋操作，透析次數(shù)為9次，用回流方式進行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯示于表2中。對比例4實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至3.7后，使用截留分子量為13000、材料為醋酸聚砜的疏水性超濾膜(Kuraray株式會社制造,11-6303) 5m2,過濾流速為5L/m2 hr，反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍純水稀釋操作，透析次數(shù)為11次，用一次通過方式進行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯示于表2中。對比例5實施例I中使用的粗制透明質(zhì)酸，將其pH調(diào)節(jié)至3.7后，使用截留分子量為13000、材料為醋酸聚砜的疏水性超濾膜(Kuraray株式會社制造 MU-6303) 5m2,過濾流速為15L/m2 hr，反復(fù)進行體積比2倍的濃縮、等倍純水稀釋操作，透析次數(shù)為11次，用反沖洗方式進行處理。對得到的溶液進行與實施例I相同的處理，得到透明質(zhì)酸鈉。分析結(jié)果以及透明質(zhì)酸的回收率顯示于表2中。表2
權(quán)利要求
1.一種透明質(zhì)酸及/或其鹽的提純方法，包括將含有高分子量的透明質(zhì)酸及/或其鹽和雜質(zhì)的透明質(zhì)酸溶液，經(jīng)超濾膜進行透析處理從而去除雜質(zhì)的工序。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述雜質(zhì)包括，菌體、蛋白質(zhì)、核酸、低分子化合物、或內(nèi)毒素。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述透明質(zhì)酸及/或其鹽的分子量為150萬 400 萬 Da。
4.如權(quán)利要求I 3中任意一項所述的方法，其中，所述透明質(zhì)酸類溶液中的透明質(zhì)酸及/或其鹽的濃度為I 10g/L。
5.如權(quán)利要求I 4中任意一項所述的方法，其中，處理時的透明質(zhì)酸溶液的溫度為O 80。。。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種透明質(zhì)酸及/或其鹽的提純法，包括將含有高分子透明質(zhì)酸及其鹽和雜質(zhì)的透明質(zhì)酸溶液，經(jīng)超濾膜進行透析處理的工序。通過本發(fā)明的方法，能夠簡便、高收率且工業(yè)規(guī)模地制造出去除了蛋白質(zhì)、核酸、乳酸、金屬等的高品質(zhì)的透明質(zhì)酸及/或其鹽。
文檔編號C08B37/08GK102812050SQ20108006551
公開日2012年12月5日 申請日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者香坂昌信, 石毛克己, 星加博光, 酒井晴子 申請人:電氣化學(xué)工業(yè)株式會社